ES2323634T3 - Proteinas quimericas l1 del virus del paliloma humano 16 que contienen un peptido l2, particulas tipo virus preparadas a partir de estas proteinas y un metodo para preparar las particulas. - Google Patents
Proteinas quimericas l1 del virus del paliloma humano 16 que contienen un peptido l2, particulas tipo virus preparadas a partir de estas proteinas y un metodo para preparar las particulas. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para producir un polipéptido L1 quimérico del virus de papiloma humano (HPV) que contiene un péptido L2 del HPV, preferiblemente un polipéptido o péptido del HPV-16, comprendiendo el método las etapas de: introducir una secuencia de ADN que codifica para el péptido L2 en una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido L1; introducir la secuencia de ADN que incluye las secuencias para el polipéptido L1 y el péptido L2 en una célula huésped en la cual se puede expresar la secuencia de ADN; causar la expresión de la secuencia de ADN, preferiblemente o bien en un sistema de expresión de procariota o en un sistema de expresión de eucariota; y recuperar al polipéptido quimérico L1 resultante que incluye al péptido L2
Description
Proteínas quiméricas L1 del virus del papiloma
humano 16 que contienen un péptido L2, partículas tipo virus
preparadas a partir de estas proteínas y un método para preparar las
partículas.
La invención se relaciona con un método para
preparar polipéptidos, y en particular partículas tipo virus (VLP)
o capsómeros del virus del papiloma humano.
Los virus del papiloma son un grupo de virus de
ADN pequeño, que inducen verrugas y otras lesiones en una variedad
de vertebrados superiores incluidos los humanos.
Los virus del papiloma (PV) son miembros del
género Papillomavirus, familia Papillomaviridae, y
contienen un genoma circular de ADN bicatenario con un tamaño
típico de 7.900 pares de bases (Seedorf y colaboradores, 1985).
Todos los PV tienen una organización genómica similar, con una
región génica temprana que codifica proteínas involucradas en la
replicación del ADN y en la transformación celular, y una región
tardía que codifica las proteínas de la cápside viral (Figura 1).
Una región no codificadora conocida como la región larga de control
(LCR) contiene elementos de control para transcripción y
replicación.
Los virus del papiloma codifican dos proteínas
virales estructurales, L1 y L2. El virión contiene 360 moléculas L1
1 dispuestas como 72 capsómeros, cada uno de los cuales es un
pentámero compuesto de cinco moléculas L1 (Baker y colaboradores,
1991). La proporción de moléculas L1 a L2 ha sido estimada
aproximadamente en 30:1 (Doobar y colaboradores, 1987), lo que
sugiere que cada virión contendría aproximadamente doce moléculas
L2. El mayor número de moléculas L1 por virión ha conducido a
denominar a L1 como a la proteína "principal" de la cápside y
a denominar a L2 como a la proteína "secundaria" de la
cápside.
L1 de HPV-16 es codificada por
un gen de 1.518 kb, dando lugar a una proteína de 504 aminoácidos.
L1 1 tiene un peso molecular de 55 a 58 kD (Browne y colaboradores,
1988). Los dominios de L1 probablemente median el enlazamiento
celular y contengan determinantes antigénicos que median las
respuestas inmunes de las células T y del anticuerpo al virus.
Entre los virus del papiloma humano genital
(HPV) existen HPV de bajo riesgo (por ejemplo, HPV 6 y HPV 11) que
causan verrugas genitales y lesiones cervicales que usualmente
retroceden o no progresan hasta malignidad, y genotipos de alto
riesgo (u oncogénicos) (por ejemplo, HPV 16 y HPV 18), que están
asociados en gran medida con lesiones cervicales y carcinomas. Los
HPV han sido considerados también como los agentes etiológicos en
varios otros cánceres anogenitales y del tracto aerodigestivo
(Breitburd y colaboradores, 1999). Un cuerpo apremiante de
evidencia clínica, molecular, experimental y epidemiológica ha
establecido que ciertos tipos de HPV son la causa principal del
cáncer cervical (Lowy y colaboradores, 1994; IARC, 1995).
HPV 16 está presente en la mayoría de los casos
del cáncer cervical y tres tipos adicionales (HPV 18, 31 y 45)
están presentes en aproximadamente un 30% adicional de los casos
(IARC, 1999).
Aunque la incidencia del cáncer cervical está
disminuyendo en los EU, es la neoplasia maligna más frecuente en
mujeres en países en desarrollo, con aproximadamente 500.000 nuevos
casos diagnosticados cada año.
Tradicionalmente, la mayoría de las vacunas
profilácticas han consistido de virus vivos atenuados de virus
inactivados con formalina. Los viriones del virus de papiloma son
altamente inmunogénicos, induciendo títulos altos (> 100.000) de
anticuerpos de neutralización cuando se los inocula sistémicamente
(Doretzky y colaboradores, 1980; Kimbauer y colaboradores, 1991,
1992). Sin embargo, debido a las dificultades y a los riegos
involucrados en la generación de grandes cantidades de estas
vacunas tradicionales, se ha hecho un gran énfasis en el desarrollo
de subunidades de proteína viral o de vacunas de partículas tipo
virus (VLP).
La mejor proteína candidata para una vacuna
profiláctica contra HPV es la proteína principal L1 de la cápside,
que se autoensambla en las VLP (Schiller y Lowy, 2001). Estas VLP
están muy bien caracterizadas, y morfológicamente parecen
indistinguibles de todos los viriones (Chen y colaboradores, 2001;
Rose y colaboradores, 1993). La inyección de las VLP en animales
experimentales induce anticuerpos neutralizadores (Rose y
colaboradores, 1998); los ensayos preliminares en humanos de
vacunas inyectadas de VLP han demostrado también que estas son bien
toleradas y son altamente inmunogénicas, y en el último caso,
estimularon respuestas robustas de células B y T (Evans y
colaboradores, 2001; Harro y colaboradores, 2001).
Una vacuna profiláctica barata ye efectiva
contra tipos oncogénicos de los HPV mucotrópicos podría tener un
impacto potencial sobre el agobio del cáncer en el mundo,
especialmente contra HPV 16.
Un epítopo común de neutralización para los HPV
tipos 6 y 16 ha sido encontrado en la región (aa) 108 - 120 de la
proteína secundaria de la cápside del HPV 16, L2 (Kawana y
colaboradores, 1998, 1999). Los ratones Balb/c que fueron
inmunizados en forma nasal con un péptido sintético correspondiente
al epítopo produjeron una respuesta inmune que resultó en
anticuerpos IgA e IgG que reaccionan en forma cruzada con las
cápsides L1/L2 del HPV 6, 16 y 18 (Kawana y colaboradores, 2001).
La inmunización de conejos con cualquiera de los dos péptidos que
se superponen derivados de la región 94 - 122 de la secuencia L2 ya
sea virus del papiloma oral de conejo (ROPV) o virus del papiloma
del conejo común (CRPV) dio como resultado sueros que reaccionaron
con el análogo purificado L2, específicamente el L2 reconocido en
células infectadas y en virus neutralizado in vitro. Los
conejos inmunizados con péptidos del CRPV fueron inmunes al reto del
CRPV (Embers y colaboradores, 2002).
Los inventores decidieron por lo tanto
investigar adicionalmente la presentación de este epítopo L2 sobre
las VLP L1 quiméricas como vacuna por sí mismas, y como modelo para
la presentación de otras secuencias de péptidos inmunogénicos.
En relación con el estado del arte, Müller y
colaboradores (1997, Virology, vol. 234 (1), páginas 93 - 111)
describen proteínas quiméricas L1 del HPV 16 que tienen insertada
una secuencia E7 del HPV-16 ya sea en la posición
C-terminal o en una posición intermedia.
Además, Slupetzlay y colaboradores (2001, J.
Gen. Virol, vol. 82, páginas 2799 - 2804) describen proteínas
quiméricas L1 del HPV-16 que tienen insertadas en
diferentes bucles de la superficie de la cápside al epítopo
LELDKWAS del péptido de la célula B de 8aa del gp41 del
VIH-1.
De acuerdo con una primera modalidad de la
invención, se provee un método parta producir un polipéptido L1 del
virus de papiloma humano quimérico (HPV) que contiene un péptido L2
del HPV, comprendiendo el método las etapas de:
- \quad
- introducir una secuencia de ADN que codifica para el péptido L2 en una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido L1;
- \quad
- introducir la secuencia de ADN que incluye las secuencias para el polipéptido L1 y el péptido L2 en una célula huésped en la cual se puede expresar la secuencia de ADN;
- \quad
- causar la expresión de la secuencia de ADN; y
- \quad
- recuperar al polipéptido quimérico L1 resultante que incluye al péptido L2.
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido L1 del HPV y/o el péptido L2 del
HPV pueden ser un polipéptido o péptido del
HPV-16.
El péptido L2 del HPV puede tener la siguiente
secuencia de aminoácidos: LVEETSFIDAGAP (SEQ ID NO: 1), o una
secuencia que sea una modificación o derivada de la misma, con la
condición de que la secuencia derivada o modificada sea una
secuencia que tenga al menos 80% de homología con la secuencia de la
SEQ ID NO: 1 y que codifique para un péptido que produzca una
respuesta inmunogénica contra el HPV.
Uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN
para L1 puede ser suprimida en el punto de introducción de la
secuencia de ADN para L2, y típicamente el número de nucleótidos
suprimidos de la secuencia para L1 corresponderá con el número de
nucleótidos insertados para L2.
La expresión de la proteína podría ser o bien en
un sistema de expresión procariota o en uno eucariota.
Para el propósito del método descrito, el
polipéptido quimérico puede tener la secuencia de aminoácidos
establecida en cualquiera de las Figuras 6, 8, 10, 12 y 14 (SEQ ID
NOS: 5, 7, 9, 11 y 13), o una secuencia que sea al menos 80%
homóloga con cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID
NOS: 5, 7, 9, 11 y 13 y que es capaz de producir una respuesta
inmunogénica contra el HPV. Igualmente, en el método, la secuencia
de ADN que codifica para el polipéptido quimérico puede ser la
secuencia de ADN establecida en cualquiera de las Figuras 5, 7, 9,
11 y 13 (SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 y 12), o una secuencia que tiene al
menos 80% de homología con cualquiera de estas secuencias y que
codifica para un polipéptido capaz de producir una respuesta
inmunogénica contra el HPV.
El polipéptido quimérico L1 puede ensamblarse
dentro de las partículas tipo virus y/o los capsómeros. La partícula
tipo virus o el capsómero pueden ser inmunogénicos.
De acuerdo a una segunda modalidad de la
invención, se provee una secuencia quimérica de ADN para el L1 del
HPV dentro de la cual ha sido insertada la secuencia de ADN que
codifica para el anterior péptido L2 del HPV (SEQ ID NO: 1), siendo
la secuencia resultante de L1 del HPV, capaz de expresar al péptido
L2 del HPV.
Se pueden suprimir uno o más nucleótidos de la
secuencia de ADN para L1 en el punto de introducción de la
secuencia de ADN para L2, y típicamente el número de nucleótidos
suprimidos de la secuencia de L1 corresponderá con el número de
nucleótidos insertados para L2.
\newpage
La secuencia quimérica de ácido nucleico puede
ser una secuencia como la establecida en cualquiera de las Figuras
5, 7, 9, 11 y 13 o una secuencia de ADN que es una modificación o
derivada de la misma, con la condición de que la secuencia
modificada o derivada de ADN tenga al menos una homología del 80%
con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 y
12 y codifique para un péptido quimérico L1 que presenta un péptido
L2 del HPV, siendo el péptido quimérico L1 capaz de producir una
respuesta inmunogénica contra HPV.
De acuerdo a una tercera modalidad de la
invención, se provee un vector que incluye la secuencia de ácido
nucleico descrita anteriormente.
De acuerdo a una cuarta modalidad de la
invención, se provee una célula huésped que incluye al vector
descrito anteriormente.
De acuerdo aún con una modalidad adicional de la
invención, se provee un polipéptido quimérico L1 del HPV que
incluye al anterior péptido L2 del HPV (SEQ ID NO: 1).
El polipéptido quimérico puede ser una partícula
o capsómero quimérico tipo virus L1 del HPV.
De acuerdo a una modalidad adicional de la
invención, se provee un polipéptido del HPV que tiene la secuencia
de aminoácidos establecida en cualquiera de las Figuras 6, 8, 10, 12
y 14 (SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 y 13), o una secuencia que es una
modificación o derivada de la misma, siendo la modificación o la
derivada una secuencia que es al menos 80% homóloga con cualquiera
de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 y 13
y es un péptido quimérico L1 que presenta un péptido L2 del HPV
siendo el péptido quimérico L1 capaz de producir una respuesta
inmunogénica contra HPV.
De acuerdo a otra modalidad de la invención, se
provee un método para producir un polipéptido quimérico L1 del
virus de papiloma humano (HPV) que contiene un péptido heterólogo,
comprendiendo el método las etapas de:
- \quad
- introducir una secuencia de ADN que codifica para el péptido heterólogo en una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido L1 por medio del reemplazo de las posiciones de los nucleótidos 241-279, 391 - 429, 520-558, 1240 - 1278 ó 1291 - 1329 con dichas secuencias de ADN que codifican para dicho péptido heterólogo;
- \quad
- introducir la secuencia de ADN que incluye las secuencias para el polipéptido L1 y el péptido heterólogo en una célula huésped en la cual se puede expresar la secuencia de ADN;
- \quad
- provocar la expresión de la secuencia de ADN; y
- \quad
- recuperar al polipéptido quimérico resultante L1 que incluye al péptido heterólogo.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia del péptido heterólogo puede ser
cualquier otra secuencia del HPV, o se puede derivar de cualquier
epítopo antigénico, célula B o célula T específica.
Uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN
para L1 en el punto de introducción de la secuencia de ADN
heterólogo pueden ser suprimidos, y típicamente el número de
nucleótidos suprimidos de la secuencia de L1 corresponderá con el
número de nucleótidos heterólogos insertados.
De acuerdo aún a una modalidad adicional de la
invención, se provee una vacuna que incluye al polipéptido
quimérico L1 del HPV o una secuencia de ADN que codifica para el
polipéptido, sustancialmente como se describió anteriormente. La
vacuna puede ser para tratamiento profiláctico o terapéutico de la
infección con el HPV, en particular HPV 6, 16 y 18.
Preferiblemente, la vacuna será capaz de inducir
una respuesta inmunogénica para HPV y para el péptido introducido
en un huésped adecuado.
La vacuna puede incluir además un excipiente y/o
adyuvante farmacéutico.
La Figura 1 muestra una representación
diagramática de la organización genómica de HPV 16;
La Figura 2 muestra la estructura
monomérica de L1 del HPV 16;
La Figura 3 muestra la secuencia de
nucleótidos de la secuencia nativa del gen para L1 del HPV 16 dentro
de la cual se insertó el epítopo de L2 para producir los
constructos quiméricos de las Figuras 5 a 14 (SEQ ID NO: 2);
La Figura 4 muestra la secuencia de
aminoácidos de la Figura 3 (SEQ ID NO: 3);
La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos
del constructo quimérico A (SEQ ID NO: 4);
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos
del constructo quimérico A (SEQ ID NO: 5);
La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos
del constructo quimérico C (SEQ ID NO: 6);
La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos
del constructo quimérico C (SEQ ID NO: 7);
La Figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos
del constructo quimérico E (SEQ ID NO: 8);
La Figura 10 muestra la secuencia de
aminoácidos del constructo quimérico E (SEQ ID NO: 9);
La Figura 11 muestra la secuencia de
nucleótidos del constructo quimérico F (SEQ ID NO: 10);
La Figura 12 muestra la secuencia de
aminoácidos del constructo quimérico F (SEQ ID NO: 11);
La Figura 13 muestra la secuencia de
nucleótidos del constructo quimérico H (SEQ ID NO: 12);
La Figura 14 muestra la secuencia de
aminoácidos del constructo quimérico H (SEQ ID NO: 13);
La Figura 15 muestra una representación
diagramática del constructo quimérico A;
La Figura 16 muestra una representación
diagramática del constructo quimérico C;
La Figura 17 muestra una representación
diagramática del constructo quimérico E;
La Figura 18 muestra una representación
diagramática del constructo quimérico F;
La Figura 19 muestra una representación
diagramática del constructo quimérico H;
La Figura 20 muestra los datos obtenidos a
partir de las titulaciones de punto final de ratones inoculados con
las VLP quiméricas obtenidas del constructo A;
La Figura 21 muestra los datos obtenidos a
partir de las titulaciones de punto final de ratones inoculados con
las VLP quiméricas obtenidas del constructo C;
La Figura 22 muestra los datos obtenidos a
partir de las titulaciones de punto final de ratones inoculados con
las VLP quiméricas obtenidas del constructo E;
La Figura 23 muestra los datos obtenidos a
partir de las titulaciones de punto final de ratones inoculados con
las VLP quiméricas obtenidas del constructo F;
La Figura 24 muestra los datos obtenidos a
partir de las titulaciones de punto final de ratones inoculados con
las VLP quiméricas obtenidas del constructo H;
La Figura 25 muestra los datos obtenidos a
partir de las titulaciones de punto final de ratones inoculados con
las VLP obtenidas de una L1 no quimérica del HPV 16
(SA-opt);
La Figura 26 muestra la respuesta de los
ratones a los refuerzos después de la inmunización inicial;
La Figura 27 muestra la secuencia de
nucleótidos del péptido L2 que fue insertado en la secuencia L1 (SEQ
ID NO: 14); y
La Figura 28 muestra la secuencia de
aminoácidos del péptido L2 que fue insertado en la secuencia L1 (SEQ
ID NO: 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron los iniciadores que codifican al
péptido:
- LVEETSFIDAGAP
- (SEQ ID NO: 1)
que es un epítopo común de neutralización para
HPV 6 y 16 en la región (aa) 108 - 120 de la proteína secundaria de
la cápside del HPV, L2.
De acuerdo con la estructura monomérica de L1
del HPV 16 publicada por Chen y colaboradores (2000) (Figura 2), se
exponen diferentes bucles y de regiones superficiales cuando se
forman pentámeros y estructuras de orden superior.
Con base en el mapeo del epítopo del anticuerpo
V5 (anticuerpo de neutralización erigido para L1), se seleccionaron
diferentes regiones/bucles para la inserción del péptido L2 para
mantener la región de enlazamiento del anticuerpo V5 de las VLP de
L1.
Se ha mapeado la región antigénica principal
(región de enlazamiento V5) de la molécula L1 con los residuos
aminoácidos A266, (estando localizado F50 debajo del residuo
superficial V271) y S282 (Roden y colaboradores, 1996, White y
colaboradores, 1999). Con base en estos residuos, los inventores
decidieron no alterar el bucle B de la molécula, ya que esto
alteraría la región antigénica y posiblemente destruiría epítopos
vitales de L1.
Las siguientes regiones de L1 fueron
seleccionadas por lo tanto para inserción del péptido L2:
- A:
- bucle E - F (SEQ ID NOS: 4 y 5)
- C:
- bucle D - E (SEQ ID NOS: 6 y 7)
- E:
- región entre la hélice h4 y la región J de L1 (SEQ ID NOS: 8 y 9)
- F:
- hélice h4 (SEQ ID NOS: 10 y 11)
- H:
- bucle interno C - D (SEQ ID NOS: 12 y 13)
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon los constructos quiméricos por
medio de PCR siendo diseñados los iniciadores con el extremo 3' que
codifica para el péptido L2. Se utilizó como molde el gen
SA-opt para L1 del HPV (Figuras 3 y 4) clonado en
el vector del plásmido pSK. Se utilizó la siguiente secuencia de ADN
para codificar al péptido L2:
- 5' - TTAGTGGAAGAAACTAGTTTTATTGATGCTGGTGCACCA - 3'
- (SEQ ID NO: 14).
Se insertó el péptido L2 en el gen por medio del
reemplazo de las regiones mostradas en la Tabla 1. Este método de
reemplazo de los nucleótidos existentes, en lugar de limitarse a
insertar los nucleótidos para L2 dentro de la secuencia de L1 sin
ningún reemplazo, es conveniente porque las alteraciones de la
estructura terciaria se mantienen en un mínimo, y la posibilidad de
efectos estéricos o de interferencias con el enlazamiento del
anticuerpo con secuencias cercanas debido a "bucles" extra de
péptidos se minimiza.
Se describe la posición del epítopo insertado de
L2 por los constructos quiméricos en las Figuras 15 a 19
respectivamente.
Los genes quiméricos de los constructos
secuenciados pSK fueron clonados dentro de un vector pFastbac1
(sitio Sal I/Xba I). Se utilizó el ADN de los clones de pFastbac1
para transfectar las células DH10bac para preparar clones
bacmid.
Los constructos quiméricos se expresaron en
células de insectos utilizando el sistema de expresión de
baculovirus Bac-to-Bac® (Life
Technologies).
El ADN de bacmid fue transferido dentro de
células de insectos sf21 (Spodoptera frugiperda)
utilizando Cellfectin. Se siguió el protocolo básico de
Bac-to-Bac® para amplificar al virus
recombinante e infectar las células de insecto sf21 para
expresión de las VLP quiméricas.
Se siguió el protocolo básico de purificación de
VLP de L1 del HPV. Se hicieron girar las células infectadas de
insecto a 3.000 rpm y se las resuspendió en solución salina
amortiguada con fosfato (PBS) con NaCl 0,5 M. Se sonicó la
suspensión 4 veces con intervalos de 5 segundos. Esta fue luego
colocada sobre un cojín de sacarosa al 40% y se precipitó a 100.000
x g durante 3 horas. Se resuspendió el precipitado en amortiguador
de CsCl (PBS con 0,4 g/ml de CsCl) y se resuspendió preparando a
través de agujas de calibre 18 y 26 para reducir la viscosidad
antes de la sonicación (4 veces con intervalos de 5 segundos). Se
centrifugó la suspensión a 100.000 x g a 10ºC durante 24 horas.
No se observaron bandas distintas en los
gradientes de CsCl. Se recogieron por lo tanto fracciones de 500
\mul y se las analizó por medio de ELISA utilizando anticuerpos
monoclonales V5 y D9 (epítopo lineal) específicos para
conformación. Se reunieron las fracciones que se encontró que
reaccionaban con los anticuerpos V5 y/o D9 y se dializó contra PBS
a 4ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Las transferencias Western demostraron que un
anticuerpo monoclonal L2 surgido contra el péptido en conejos
(obtenidos con el Dr. Neil Christensen del Jake Gittlen Cancer
Research Institute, The Milton S. Hershey Medical Centre, Hersey
Pennsylvania, EUA) enlazado a las partículas quiméricas L1 (55 kD),
mostrando que el epítopo L2 se expresa por medio de los constructos
quiméricos. La caracterización del anticuerpo de las VLP purificadas
se llevó a cabo por medio de ELISA utilizando un panel de
anticuerpos suministrado por el Dr. Neil Christensen (Chistensen y
colaboradores, 1996, 2001). La Tabla 2 resume los datos.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se da una breve descripción de
los anticuerpos y sus regiones de enlazamiento en la Tabla 3.
Los resultados por EM mostraron que las
partículas formadas a partir de los constructos quiméricos no son
idénticas a aquellas producidas por el gen para L1 del HPV de tipo
silvestre. Las partículas formadas están principalmente en estado
parcialmente roto o parcialmente disociado y generalmente se
consideran que se aglutinan juntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron seis grupos de 5 ratones Balb/c
para la experimentación en animales para determinar si la
inoculación con las VLP quiméricas produjo una respuesta inmune.
Las VLP quiméricas producidas a partir de 5 constructos quiméricos
y las VLP producidas a partir de L1 no quimérica del HPV 16
(SA-opt) fueron inyectadas con una concentración de
100 \mug en dos sitios subcutáneos. Los animales fueron inoculados
en las semanas 0, 2 y 4. Se tomaron muestras de sangre y lavados
vaginales en diferentes periodos de tiempo.
Se reunieron los sueros de los ratones de cada
grupo y se los analizó por medio de ELISA utilizando las VLP
producidas en células de insectos por baculovirus recombinantes. Se
llevaron a cabo titulaciones de punto final para cada grupo de
ratones para determinar el grado de respuesta y producir una mejor
reflexión de la respuesta (Figuras 20 a 26).
Los resultados indican que se logró una
respuesta inmune mayor.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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Claims (18)
1. Un método para producir un polipéptido L1
quimérico del virus de papiloma humano (HPV) que contiene un péptido
L2 del HPV, preferiblemente un polipéptido o péptido del
HPV-16, comprendiendo el método las etapas de:
- \quad
- introducir una secuencia de ADN que codifica para el péptido L2 en una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido L1;
- \quad
- introducir la secuencia de ADN que incluye las secuencias para el polipéptido L1 y el péptido L2 en una célula huésped en la cual se puede expresar la secuencia de ADN;
- \quad
- causar la expresión de la secuencia de ADN, preferiblemente o bien en un sistema de expresión de procariota o en un sistema de expresión de eucariota; y
- \quad
- recuperar al polipéptido quimérico L1 resultante que incluye al péptido L2.
2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1,
en donde el péptido L2 del HPV tiene la siguiente secuencia de
aminoácidos: LVEETSFIDAGAP (SEQ ID NO: 1), o una secuencia que sea
una modificación o derivada de la misma, con la condición de que la
secuencia derivada o modificada sea una secuencia que tenga al menos
80% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y que
codifique para un péptido capaz de producir una respuesta
inmunogénica contra el HPV.
3. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, en donde se suprimen uno o más nucleótidos
de la secuencia de ADN para L1 en el punto de introducción de la
secuencia de ADN para L2, y preferiblemente el número de
nucleótidos suprimido de la secuencia de ADN para L1 corresponde con
el número de nucleótidos insertados para L2.
4. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el polipéptido quimérico tiene una
secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las Figuras 6,
8, 10, 12 y 14 (SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 y 13), o una secuencia que
sea al menos 80% homóloga con cualquiera de las secuencias
establecidas en las SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 y 13 y que es capaz de
producir una respuesta inmunogénica contra el HPV.
5. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de ADN que codifica
para el polipéptido quimérico tiene una secuencia de ADN establecida
en cualquiera de las Figuras 5, 7, 9, 11 y 13 (SEQ ID NOS: 4, 6, 8,
10 y 12), o una secuencia que tiene al menos 80% de homología con
cualquiera de estas secuencias y que codifica para un polipéptido
capaz de producir una respuesta inmunogénica contra el HPV.
6. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde el polipéptido quimérico L1 es
capaz de ensamblarse dentro de las partículas tipo virus y/o los
capsómeros, preferiblemente las partículas inmunogénicas tipo virus
o los capsómeros.
7. Una secuencia de ADN para L1 quimérico del
virus de papiloma humano (HPV) dentro de la cual se ha insertado
una secuencia de ADN que codifica para un péptido L2 del HPV (SEQ ID
NO: 1), que es capaz de expresar al péptido L2 del HPV.
8. Una secuencia de ADN para L1 del HPV de
acuerdo a la reivindicación 7, en donde uno o más nucleótidos de la
secuencia de ADN para L1 han sido suprimidos en el punto de
introducción de la secuencia de ADN para L2, y preferiblemente el
número de nucleótidos suprimidos de la secuencia para L7 corresponde
con el número de nucleótidos insertados para L2.
9. Una secuencia de ADN del virus de papiloma
humano que tiene una secuencia de ADN establecida en cualquiera de
las Figuras 5, 7, 9, 11 y 13 (SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 y 12), o una
secuencia de ADN que es una modificación o derivada de la misma,
con la condición de que la secuencia modificada o derivada de ADN
tenga al menos 80% de homología con cualquiera de las SEQ ID NOS:
4, 6, 8, 10 y 12 y que codifique para un péptido quimérico L1 que
presente un péptido L2 del HPV, siendo el péptido quimérico L1 capaz
de producir una respuesta inmunogénica contra el HPV.
10. Un vector que incluye una secuencia de ADN
como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11. Una célula huésped que incluye un vector
como el reivindicado en la reivindicación 10.
12. Un polipéptido quimérico L1 del virus de
papiloma humano (HPV), preferiblemente una partícula quimérica L1
tipo virus del HPV o capsómero, incluido un péptido que tiene la
secuencia de aminoácidos: LVEETSFIDA GAP (SEQ. ID NO: 1).
13. Un polipéptido del virus de papiloma humano
(HPV) que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en
cualquiera de las Figuras 6, 8, 10, 12 y 14 (SEQ ID NOS: 5, 7, 9,
11 y 13), o una secuencia que sea una modificación o derivada de la
misma, con la condición de que la secuencia de aminoácidos
modificada o derivada tenga al menos 80% de homóloga con cualquiera
de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 y 13 y
sea un péptido quimérico L1 que presente un péptido L2 del HPV,
siendo capaz el péptido quimérico L1 de producir una respuesta
inmunogénica contra el HPV.
14. Un método para producir un polipéptido
quimérico L1 del virus de papiloma humano (HPV) que contiene un
péptido heterólogo, comprendiendo el método las etapas de:
- \quad
- introducir una secuencia de ADN que codifica para el péptido heterólogo en una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido L1 por medio del reemplazo de las posiciones de los nucleótidos 241-279, 391 - 429, 520-558, 1240 - 1278 ó 1291 - 1329 con dicha secuencia de ADN que codifica para dicho péptido heterólogo;
- \quad
- introducir la secuencia de ADN que incluye las secuencias para el polipéptido L1 y el péptido heterólogo en una célula huésped en la cual se puede expresar la secuencia de ADN;
- \quad
- provocar la expresión de la secuencia de ADN; y
- \quad
- recuperar al polipéptido quimérico resultante L1 que incluye al péptido heterólogo.
15. Un método de acuerdo a la reivindicación 14,
en donde la secuencia heteróloga del péptido es cualquier otras
secuencia del HPV o se deriva de cualquier epítopo antigénico,
célula B o célula T específica.
16. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15, en donde uno o más nucleótidos de la
secuencia de ADN para L1 se suprimen en el punto de introducción de
la secuencia de ADN heterólogo, y preferiblemente el número de
nucleótidos suprimidos de la secuencia de L1 corresponde con el
número de nucleótidos heterólogos insertados.
17. Una vacuna que incluye un polipéptido
quimérico L1 del virus del papiloma humano (HPV) como se describe en
cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13 o una secuencia de ADN
como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9,
preferiblemente para uso en el tratamiento terapéutico o
profiláctico de una infección con HPV, y más preferiblemente para
uso en el tratamiento de HPV 6, 16 ó 18.
18. Una vacuna de acuerdo a la reivindicación
17, que es capaz de inducir una respuesta inmunogénica para HPV y/o
para el péptido introducido en un huésped adecuado, y que comprende
además un excipiente y/o adyuvante farmacéutico.
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