CN1328287C - Hpv16 l1蛋白模拟肽及其用于制备hpv16诊断试剂和疫苗的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了4段HPV16L1蛋白模拟肽及其用于制备HPV16诊断试剂和疫苗的用途。

Description

HPV16 L1蛋白模拟肽及其用于制备HPV16诊断试剂和疫苗的用途

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及多肽或蛋白质模拟表位的筛选和应用，特别涉及HPV16 L1蛋白模拟肽及其用于制备HPV16诊断试剂和疫苗的用途。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是包含8000 bp双链DNA基因组的无胞膜小DNA病毒(Favre M，Ramoz N，Orth G.Humanpapillomaviruses：general features.Clin Dermatol.1997；15(2)：181-198)，HPV L1蛋白(HPV L1 protein)是构成直径55nm的HPV病毒衣壳的主要成分，大小为58kD，能在体外自行组装成与天然HPV病毒颗粒相似的二十面体结构的复杂空间构象——病毒样颗粒(virus like particle，VLP)，是诱发宿主保护性体液免疫反应的重要病毒结构蛋白，而成为目前HPV疫苗研究的首选靶蛋白，尽管HPV L1 VLP疫苗也已经通过一期临床试验(KevinA.Ault，Anna R.Giuliano，Robert P.Edwards，et al.A phase I study toevaluate a human papillomavirus(HPV)type 18 L1 VLP vaccine.Vaccine.2004；22：3004-3007)但是，由于HPV LiVLP制备困难，成本高昂，这一疫苗并不能被广大发展中国家所接受，而恰恰在发展中国家HPV感染及其所导致的恶性肿瘤的发病率却居高不下(F.Xavier Bosch a，Nubia Mun.The viraletiology of cervical cancer Virus Research 2002；89：183-190)。因此，发展适应这一现状的低价高效疫苗刻不容缓。已有研究证实蛋白质分子的主要活性由其活性表位承担，除线型表位(linear epitope)外，由蛋白质通过非共价键相互作用而折叠成特定天然构像时将不同线性位置的氨基酸残基聚集道统一部位形成一定空间结构的构像表位(conformation epitope)在天然蛋白分子活性中发挥更为重要的作用，但是构像表位很获得，而近年来通过筛选化学组合肽库(chemistry combination library或噬菌体展示肽库(phage display library)捕获其构像表位为构像表位的发现和研究提供了一条捷径(张明娟，杨军，吕卓人.噬菌体肽文库的筛选.临床检验杂志，2002；20(4)：247-248)并取得了大量成果。

目前应用最广的噬菌体随机肽库最早由Scatt(Scott JK，Smith GP.Searching for peptide li-gands with an epitope library.Science，1990；249(1)：386-390.)于1990年建立，通过将不同短肽的基因序列插入噬菌体单链DNA中，使表达的外源随机序列多肽与丝状噬菌体的表面外壳蛋白的N端融合形成具有一定的空间构象的融合蛋白，呈现于噬菌体表面，并可作为任何靶抗原表位的模拟肽(minotope)。长期以来，噬菌体肽库技术因其在抗原表位的分析中的特殊优势，在基因疫苗、多肽疫苗和重组疫苗的研究中发挥着巨大的作用(Matthew A.S，Deborah S，Kenichi M，et al.HSV-1amplicon peptide display vector.J Vir Meth.2002；107：71-79)。目前，噬菌体随机肽库的随机多样性可达10⁷-10⁹，短肽长度已由最初的6肽、7肽发展到9肽、15肽，直到38肽、40肽。本发明将利用噬菌体随机肽库(phagerandom peptide library)技术筛选HPV16 L1蛋白抗原表位(epitope)，并将其用于HPV16感染的诊断和疫苗的研究。

尽管申请人筛选出的模拟小肽其序列与天然已知分子并无相似之处，但这样并不能说明它没有同天然分子相类似的功能，也不能否认其不具有与天然分子类似或相同的作用。如从噬菌体表面随机短肽库中筛选出模拟环状小肽(U.S.Patent No.5,835,382)，虽然其序列与天然EPO的序列亦无相似之处，但是它的确能够与EPO受体高亲合力结合，并且模拟促红细胞生成素(EPO)的功能。与此类似，筛选出的HPV16 L1蛋白抗原表位模拟肽将会在HPV16感染的诊断和研制疫苗方面具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HPV16L1蛋白模拟肽的氨基酸序列及其该氨基酸序列用于制备HPV16感染的诊断试剂和HPV16多肽疫苗中的用途，达到诊断和预防HPV16感染的目的。

为实现上述之目的，本发明采取如下技术方案：采用真核表达系统或非真核表达系统或昆虫杆状病毒系统制备HPV16L1病毒样颗粒(virus-likepartical，VLP)，用HPV16L1蛋白作为抗原或者采用表达HPV16L1蛋白的真核表达载体通过基因免疫方法免疫动物获得抗HPV16L1特异性的多克隆抗体。通过“吸咐-洗脱-扩增”的方法，用抗HPV16L1多克隆抗体筛选噬菌体随机肽库(phage random peptide library)，随机选取可与抗HPV16L1多克隆抗体特异性结合的噬菌体，经扩增、DNA的提取、测序和同源性分析，确定HPV16L1蛋白模拟肽的氨基酸序列。采用ELISA法直接利用展示HPV16L1蛋白模拟肽的噬菌体菌株克隆检测HPV16感染患者或者实验动物血清、体液、组织中抗HPV16L1抗体，或作为HPV16多肽疫苗用于HPV16感染的预防。HPV16L1病毒样颗粒(virus-like partical，VLP)通过真核表达系统或非真核表达系统制备，采用PCR或内切酶等方法获得HPV16L1基因序列，通过分子克隆技术将其克隆入真核表达载体或或非真核表达载体，并经过相应的转染相应的宿主细胞，表达HPV16L1蛋白，非变性条件纯化HPV16L1蛋白(方法详见分子克隆)。

用纯化的HPV16L1蛋白或表达HPV16L1蛋白的真核表达载体免疫哺乳动物或非哺乳动物，经过1次以上肌肉注射途径或非肌肉注射途径免疫之后，抽取被免疫动物血清，经常规方法纯化抗体-70℃保存备用。

采用通过“吸咐-洗脱-扩增”的方法，用抗HPV16L1多克隆抗体筛选噬菌体随机肽库(phage random peptide library)(方法详见Ph.D.-12^TMPhage Display Peptide Library Kit说明书)，随机选取可与抗HPV16L1多克隆抗体特异性结合的噬菌体，经扩增、DNA的提取、测序和同源性分析，确定HPV16L1蛋白模拟肽的氨基酸序列。

利用常规免疫学方法(如噬菌体ELISA法、或免疫斑点等方法)，直接以展示HPV16L1蛋白模拟肽的噬菌体作为抗原，通过测定模拟肽与抗HPV16L1抗体的结合能力确定筛选模拟肽的特异性(方法详见Ph.D.-12^TM Phage DisplayPeptide Library Kit说明书)，或用于检测HPV16感染患者或者实验动物血清、体液、组织中抗HPV16L1抗体。

直接将展示HPV16L1蛋白不同抗原表位模拟肽的噬菌体克隆单独和混合作为免疫原直接免疫哺乳类(包括人类)或非哺乳类动物，获得抗HPV16L1蛋白的特异性抗体，达到预防HPV16感染的目的。

本发明经过上述方案获得了4段HPV16L1蛋白模拟肽(HPV16L1 minotope，HLM)氨基酸序列(编号为HLM_1～4)(图1)：

HLM₁：Thr Asn Leu Asp Leu Tyr Gly

HLM₂：Ile Phe Asp Asn His Pro

HLM₃：Leu Thr Phe Lys Pro Gln

HLM₄：Gly Ile Asp Ser

且展示上述模拟肽的噬菌体载体或非噬菌体载体均可作为抗原用于通过免疫学方法检测HPV16感染患者或者接受HPV16L1蛋白免疫的哺乳类(包括人类)或非哺乳类动物血清、体液、组织中抗HPV16L1抗体。

直接将展示上述模拟肽的噬菌体载体或非噬菌体载体克隆均可单独和混合作为免疫原通过常规免疫途径免疫哺乳类(包括人类)或非哺乳类动物，可诱导产生抗HPV16L1蛋白的特异性抗体，用于HPV16预防性疫苗的研制。

附图说明

图1是本发明的4段HPV16L1蛋白模拟肽的氨基酸序列。

图2是本发明的pFB-HPV16L1重组质粒的酶切鉴定：Lane 1 DNA marker；Lane 2 HPV16L1 PCR产物；Lane 3，5，7 pFB-hpv16L1质粒；Lane 4，6，8Xbal+HindIII酶切pFB-HPV16L1质粒。

图3 Westen blot检测纯化HPV16L1蛋白：Lane 1 Sf-9 cells对照；Lane 2，3，4非变性条件下纯化的HPV16L1蛋白；Lane 5蛋白Maker。

图4是本发明的同源性分析确定HPV16L1抗原模拟肽：图中字母为标准单字母氨基酸代码。I展示HLM1模拟肽(Thr Asn Leu Asp Leu Tyr Gly)的噬菌体克隆同源性分析，16.7^#为展示该模拟肽的噬菌体克隆；II展示HLM₂模拟肽(Ile Phe Asp Asn His Pro)的噬菌体克隆同源性分析，16.20^#为展示该模拟肽的噬菌体克隆；III展示HLM₃模拟肽(Leu Thr Phe Lys Pro Gln)的噬菌体克隆同源性分析。16.14^#为展示该模拟肽的噬菌体克隆；IV展示HLM₄模拟肽(Gly Ile Asp Ser)的噬菌体克隆同源性分析，16.S32^#为展示该模拟肽的噬菌体克隆。

图4是本发明的将展示上述HPV16L1抗原模拟肽的噬菌体克隆作为抗原采用免疫斑点法检测小鼠HPV16L1抗体：1展示HLM₁模拟肽的噬菌体克隆(16.7^#)；2展示HLM₂模拟肽的噬菌体克隆(16.20^#)；3展示HLM₃模拟肽的噬菌体克隆(16.14^#)；4展示HLM₄模拟肽的噬菌体克隆(16.S32^#)；5不含任何模拟肽的噬菌体克隆作阴性对照。

图5是本发明的ELISA法检测噬菌体免疫后小鼠血清抗HPV16L1抗体：1不含任何模拟肽的噬菌体克隆作阴性对照；2展示HLM₁模拟肽的噬菌体克隆(16.7^#)免疫组；3展示HLM₂模拟肽的噬菌体克隆(16.20^#)免疫组；4展示HLM₃模拟肽的噬菌体克隆(16.14^#)免疫组；5展示HLM₄模拟肽的噬菌体(16.S32^#)免疫组；6展示HLM₁、HLM₂、HLM₃、HLM₄模拟肽的噬菌体克隆(16.7^#、16.20^#、16.14^#、16.S32^#)混合物免疫组。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步的详细说明，所述的实施例用于描述本发明，而不是限制本发明。

实施例中采用的质粒、菌种、噬菌体随机肽库、宿主菌、细胞、实验动物及主要试剂如下：

pT-L1质粒(重组pGEM-T质粒，含HPV16L1基因)由本室构建并保存(郑滨，王健伟，姜惠英，等.利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型L1蛋白.中华实验和临床病毒学杂志.2001；15(4)：314-316.)。

杆状病毒表达系统的穿梭载体pFastBac-^TMHTb、DH10Bac感受态细胞、Sf-9细胞购自Invitrogen公司。Grace`s培养基、cellfectin转染试剂购自GIBCO公司。噬菌体随机十二肽库(Ph.D.12^TMPhage Display Peptide Library)和E.coli ER2738(Cat.8110S)购自New England Biolabs公司：新西兰大白兔、C57BL/6小鼠、Balb/C小鼠由西安交通大学医学动物实验中心提供；RNase、Xbal、HindIII、Nco I、Sal I限制性内切酶购自宝生物(大连)公司；ProteinG MagneticBeads购自New England BioLabs公司；HPV-16L1单克隆抗体购自Neomarker公司；HRP-IgG购自DAKO公司；PCR beads购于phamasia公司。

本实施例中涉及到的各种试剂的配置和方法参见《分子克隆》、《GIBCO公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作手册》《ProBondTM纯化系统说明书》、《New England BioLabs公司Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit说明书》等。

1.技术方案及其路线

1.1HPV16L1蛋白的制备

1.1.1重组pFB-HPV16L1辅助表达载体的构建

1.1.1.1HPV16L1片段的获得及回收纯化：以Xbal+HindIII消化pT-L1质粒(重组pGEM-T质粒，含HPV16L1基因)，酶切体系50μl，37℃反应2h，将酶切产物行1.0％低熔点琼脂糖凝胶电泳。长波紫外灯下对照DNA分子量标准，迅速切下HPV16L1 1450bp条带，加入pH8.0的TE至总体积500μl，70℃水浴5～10min至低熔点胶完全熔化，其间间断摇动数次，等体积酚、酚/氯仿、氯仿于室温各抽提一次，两倍体积的无水乙醇、0.2体积的乙酸氨沉淀水相，75％乙醇洗涤沉淀，室温风干，溶于10～20μl去离子水，4℃备用。

1.1.1.2 pFastBac-Htb质粒的制备：取-70℃冻存的含pFastBac-Htb质粒的菌株DH5α划线接种于含50μg/ml Amp的LB-琼脂培养皿上，37℃倒置培养过夜或16～20h。挑取单菌落于10ml含50μg/ml Amp的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜。采用碱裂解小量质粒提取法提取质粒DNA，对pFastBac-Htb质粒行Xbal+HindIII双酶切4h或过夜，紫外灯下观察酶切完全后，于0.7％低熔点琼脂糖凝胶回收pFastBac-Htb大片段，方法同上，洗涤后的沉淀物溶于去离子水中备用。

1.1.1.3连接反应：将纯化回收的HPV16L1片段和回收的线性化的pFastBac-Htb连接，连接体系10μl，目的片段和载体的比例为3～4∶1，连接酶1μl，14～16℃连接16h以上。连接产物命名为pFB-HPV16L1。转化DH5α宿主菌，提取质粒进行酶切鉴定(图2)。

1.1.2重组杆状病毒辅助表达载体的转座反应(具体方法参照GIBCO公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作手册)

1.1.2.1 DH10Bac感受态细胞的制备：挑取单菌落DH10Bac菌株接种于不含抗生素的2ml LB液体培养基中37℃剧烈振荡培养过夜。取100μl菌液重新接种于50ml LB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养2-3h，测菌液于600nm的A值，当A₆₀₀＝0.3～0.4时，将菌液转移至预冷的50ml无菌离心管，4℃离心10min，用1/10菌液体积预冷的1×TSS溶液重悬菌体沉淀，冰浴15min，用无菌的1.5或2.0ml Eppendorf管分装感受态细胞，每管100μl，-70℃速冻备用。

1.1.2.2重组杆状病毒辅助表达载体的转座反应：首先制备Luria Agar选择性平板(熔化1.5％LB固体培养基，室温放凉至40℃，快速加入下列物质至终浓度分别为卡那霉素50μg/ml，庆大霉素7μg/ml，四环素10μg/ml，X-gal 200mg/ml，IPTG 40mg/ml)，然后从一70℃冰箱取出保存的DH10Bac感受态细胞置冰上溶融化。100ml感受态细胞加入1ng重组辅助表达载体，冰浴30min，42℃热休克90s，置冰上2min；加入900μl S.O.C培养基混匀，37℃，200rpm，振荡培养3h，分别取150μl、100μl、50μl菌液用无菌弯管玻棒涂布于Luria Agar选择性平板，37℃倒置培养48h。

1.1.3分离重组Bacmid DNA

1.1.3.1从上述选择性培养基上挑取白斑悬于2ml选择性LB培养液(卡那霉素50μg/ml，庆大霉素7μg/ml，四环素10μg/ml)，37℃，200rpm，振摇培养24h。

1.1.3.2将1.5ml菌液转于1.5ml Eppendorf管中，14，000g，离心1min，弃上清，将沉淀悬于0.3ml溶液I，加入0.3ml溶液II，轻轻混匀，室温5min，缓慢加入0.3ml 3Mol/L乙酸钾(pH5.5)，边加边混匀，置冰浴10min，14,000g，离心10min，同时标好另一干净Eppendorf管，加入0.8ml异丙醇；轻轻将上清转至已加好异丙醇的新管中，注意不要混有蛋白沉淀，将离心管颠倒数次混匀，置冰浴10min，14,000g，室温离心15min，弃净上清，分别用70％和100％乙醇各洗涤1次；室温晾干，溶于40μl无菌TE缓冲液，4℃短期保存或-20℃冻存。

1.1.4 HPV16L1蛋白的表达

1.1.4.1用重组Bacmid DNA转染Sf-9细胞及重组杆状病毒的收获：在35mm培养皿中分种约9×10⁵个Sf-9细胞，每平皿中含2ml完全培养液，27℃培养至少1h，使细胞完全贴壁，在无菌Eppendorf管中配置以下溶液：

A液：5μl lBacmid DNA加95μl高压去离子水

B液：6μl cellfectine加94μl高压去离子水

A液与B液轻轻混匀，室温放置30min

将Sf-9细胞用无血清、无抗生素的TNM-FH洗涤3次，弃尽溶液，逐滴加入AB混合液，补加0.8ml无血清、无抗生素的TNM-FH，27℃培养5h弃上清，换2ml完全培养基，27℃过夜，换维持液，继续培养48h(共培养72h)。收集培养上清，500g离心10min，将上清分成小份作为原毒种。4℃避光可保存半年，-70℃可长期保存。

1.1.4.2 PCR法检测HPV16L1基因在重组杆状病毒中的整合：取0.75ml重组杆状病毒培养上清，加入0.75ml PEG 8000[20％(W/V)PEG，1mol/L NaCl]，混合后室温放置30min，14000g离10min，弃上清，沉淀悬于100μl去离子水，加10μl蛋白酶K(10mg/ml)，50℃作用1h，等体积酚-氯仿抽提后乙醇沉淀，-20℃过夜。次日14000g离心，弃上清，沉淀晾干后溶于10μl取离子水中。取2μl作模板，分别以HPV16L1上下游引物和M13/pUC上下游引物(M13/pUC上游引物：CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG；下游引物：AGC GGATAA CAA TTT CAC ACA GG)进行PCR扩增，鉴定L1基因在重组杆状病毒中的整合。循环参数为95℃，30秒，55℃，30秒，72℃，90秒，循环35次，72℃延伸10min。取5μlPCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳，对产物进行鉴定。

1.1.4.3 HPV16L1蛋白的表达和鉴定：培养Sf9细胞至80-90％汇合时，弃上清，加入含重组Bac/B-HPV16L1杆状病毒毒株(包含HPV16L1基因)有的Grace`s培养液200μl，再加入5ml含2％胎牛血清的Grace`s维持培养液，27℃培养72h，收集细胞，。27℃培养Sf-9细胞至80％细胞融合时，弃上清，加入5-6ml维持培养液，再加入重组杆状病毒毒种400μl/瓶，继续培养72h，2000g离心，10min，收集病毒感染细胞。

1.1.4.4 HPV16L1蛋白的纯化和检测：ProBon^TMColumn非变性条件纯化HPV16L1蛋白(方法详见ProBondTM纯化系统说明书)；取150μl树脂移入2ml EP管，800×g离心2min，弃上清，加入700μl去离子水，重复洗涤2次；加入700μl非变性结合液，重复洗涤2次；将2×10⁷接毒细胞重悬于1ml非变性结合液，用液氮反复冻融2次，3000×g离心15min，将上清移入已准备好的树脂中，轻柔混匀20min，800×g离心2min，弃上清；加入500μl非变性结合液，重复洗涤2次；加入500μl非变性洗涤液，重复洗涤2次。加入250μl 50mM非变性-咪唑洗脱液，轻柔混匀5min，800×g离心2min，收集上清；加入250μl 200mM非变性-咪唑洗脱液，轻柔混匀5min，800×g离心2min，收集上清；加入250μl 350mM非变性-咪唑洗脱液，轻柔混匀5min，800×g离心2min，收集上清；加入250μl 500mM非变性-咪唑洗脱液，轻柔混匀5min，800×g离心2min，收集上清。取20μl样品，加入等量2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后置沸水中5min，取20μl样品做12％SDS-PAGE。Western blot检测纯化蛋白：样品经12％SDS-PAGE电泳，用Bio-Rad蛋白转印系统，70V电压，200mA电流，4℃转印PVDF膜90min，5％脱脂奶室温封闭2h，1∶200稀释的抗HPV16L1单克隆抗体室温孵育2h，TBST(含0.5％Tween-20的TBS)洗，10min×3，1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG室温孵育20min，TBST洗10min×3，DAB显色(图3)。

1.2抗HPV16L1多克隆抗体的制备

双缩尿法定量HPV16L1蛋白。并于第1天用200μg HPV16L1蛋白加弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant，FCA)充分混匀后背部皮下多点注射免疫实验兔，第14天：用200μg HPV16L1蛋白加弗氏不完全佐剂(Freundsincomplete adjuvant，FIA)充分混匀后背部皮下多点注射免疫实验兔，第21天和第28天分别耳缘静脉注射200μg HPV16L1蛋白/只。第3次免疫后3天，耳缘静脉采血ELISA法检测血清抗体滴度。第4次免疫后3天行颈动脉采血，吸取血清后，加入终浓度为0.02％的叠氮钠，ELISA法检测抗体滴度，硫酸铵盐析法纯化IgG，冷冻抽干成粉末状，-70℃保存备用。

1.3噬菌体随机肽库的筛选

先取扩增并稀释后的噬菌体肽库(1.0×10¹¹pfu)，和300ng正常兔IgG溶液到2ml结合液中，37℃，振荡孵育50rpm，1h进行预吸附，加入SPA标记的磁珠50μl，37℃，振荡孵育50rpm 20min后，磁力吸附2min，取上清，用1/6体积2.5M PEG/NaCl沉淀，200μlTBS溶解，加入到含300ng抗HPV16L1的兔IgG溶液2ml结合液中，37℃，孵育1h，加入SPA标记的磁珠50μl，37℃，振荡孵育50rpm，20min，磁力吸附2min，TBST(TBS+0.1％Tween-20)冲洗，5min×3次，加入100μl 0.2M glycine-HCl(pH2.2)，1mg/mlBSA，轻轻摇晃10min，磁力吸附5min，收集洗脱液，加入1M Tris-HCl(pH9.1)中和，检测噬菌体滴度，留取20μl用于保存，对其余洗脱液加入到20ml ER2738培养液(已达对数生长期)中，在37℃，230rpm，孵育4.5h。1/6体积2.5M PEG/NaCl沉淀，200μlTBS溶解即为已扩增的噬菌体，检测噬菌体滴度，4℃保存，并检测噬菌体滴度，取等量噬菌体(1.0×10¹¹pfu)重复上述筛选过程3次，检测第3次洗脱液的噬菌体滴度。

1.4快速纯化噬菌体测序模板及测序

用无菌的木签，随机蘸取测定第3次洗脱液噬菌体滴度的双层琼脂培养皿中的蓝色噬菌体菌斑，投入含5ml已达指数生长期的ER2738培养液中，在37℃，剧烈震荡孵育230rpm，4.5h。离心后取上清液并再次离心，取80％上清，NaI法快速纯化噬菌体测序模板(方法详见Ph.D.-12^TMPhage DisplayPeptide Library Kit说明书)，琼脂糖凝胶电泳检测，上海华诺生物科技有限公司测序。

1.5序列分析

采用NCBI的Blastn和Blastp分析，并经同源性分析确定HPV16L1抗原表位(图4)。

1.6免疫斑点实验

选择上述经测序和Blastp分析的噬菌体菌株进行免疫斑点实验，方法如下：分别取1μl噬菌体点膜，未插入外源片段的噬菌体克隆作为阴性对照，5％脱脂奶室温封闭2h，1∶500稀释的抗HPV16L1多克隆抗体室温孵育2h，TBST(含0.5％Tween-20的TBS)洗，10min×3，1∶1000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG室温孵育20min，TBST洗10min×3，DAB显色。结果可见4组噬菌体均能与HPV16L1天然抗原诱导的抗体反应(图5)，说明直接使用展示本发明的4种不同HPV16 L1蛋白模拟肽的噬菌体载体作为抗原均可用于HPV16L1抗体的检测，可用于HPV16诊断试剂的研制。

1.7噬菌体免疫

按照Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit说明书方法扩增并纯化筛选出的阳性克隆，并测定滴度。6周龄雌性二级Balb/C小鼠随机分6组，每组3只，将纯化的阳性噬菌体分为6组，分别是：1组，展示HLM₁模拟肽噬菌体克隆(16.7^#)；2组，展示HLM₂模拟肽噬菌体克隆(16.20^#)；3组，展示HLM₃模拟肽噬菌体克隆(16.14^#)；4组，展示HLM4模拟肽噬菌体克隆(16.S32^#)；5组，展示HLM_1~4模拟肽的噬菌体克隆(16.7^#、16.20^#、16.14^#、16.S32^#)混合物；6组，阴性对照组，为一个无外源插入序列的M13噬菌体。第一次免疫时，每只小鼠用0.5ml福氏完全佐剂加入1×10¹³pfu噬菌体充分搅拌混匀，背部及腹股沟皮下多点注射免疫。21天后，每只动物以0.5ml，0.9％NaCl稀释1×10¹³pfu噬菌体，腹腔注射免疫第二针，以后每隔3周腹腔注射免疫一次，共免疫四次，后三次均不加佐剂。第四次免疫后5天，眼球静脉取血，断颈处死小鼠，检测血清抗体。

1.8诱生抗体的ELISA检测

用稀释后的HPV16L1蛋白，包被ELISA板，4℃过夜，5％脱脂奶，37℃封闭1h，加入1∶100稀释的待检小鼠血清，37℃孵育1h，再加1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃，45min，OPD显色，正常鼠血清作阴性对照。结果上述展示不同HPV16L1蛋白模拟肽的噬菌体克隆作为免疫原单独或混合免疫小鼠均可诱导实验小鼠产生不同滴度的抗HPV16L1蛋白抗体，混合组产生的抗体滴度最高(图6)。说明本发明的4种不同HPV16L1蛋白抗原模拟肽均能够诱导实验动物产生免疫反应，可以用于HPV16疫苗的研制。

2.技术效果

本发明采用上述方案获得的展示HPV16L1蛋白模拟肽的噬菌体可直接用于检测HPV16感染患者血清、体液、组织中的抗HPV16L1蛋白抗体，或经HPV16L1蛋白免疫的哺乳类或非哺乳类动物免疫血清中的血清、体液、组织中的抗HPV16L1蛋白抗体，也可直接作为疫苗用于哺乳类和非哺乳类动物的免疫，产生抗病毒抗体，尤其是抗HPV16L1抗体。这些模拟肽的发现将会在HPV16的诊断试剂和预防性疫苗的研制方面具有巨大的潜在价值。

3.最佳实施方式

3.1 HPV16L1抗体检测试剂盒的构建

直接将本发明中发现的展示HPV16L1蛋白模拟肽的噬菌体作为抗原通过常规免疫学检测方法从而构建检测HPV16L1抗体的试剂盒，用于患者血清、体液、组织中的抗HPV16L1蛋白抗体，或经HPV16L1蛋白免疫的哺乳类或非哺乳类动物免疫血清中的血清、体液、组织中的抗HPV16L1蛋白抗体。

3.2 HPV16疫苗的制备

直接将本发明中发现的展示HPV16L1蛋白模拟肽的噬菌体作为免疫原通过常规免疫途径用于免疫哺乳类和非哺乳类动物，产生抗HPV抗体，尤其是抗HPV16L1抗体，从而达到预防HPV16感染的目的。

HPV16L1蛋白模拟肽氨基酸序列

HLM₁：Thr Asn Leu Asp Leu Tyr Gly

HLM₂：Ile Phe Asp Asn His Pro

HLM₃：Leu Thr Phe Lys Pro Gln

HLM₄：Gly Ile Asp Ser

Claims (8)

1.HPV16 L1蛋白模拟肽，其特征在于具体氨基酸序列选自下列之一：

Thr Asn Leu Asp Leu Tyr Gly；

Ile Phe Asp Asn His Pro；

Leu Thr Phe Lys Pro Gln；

Gly Ile Asp Ser。

2、如权利要求书1所述的HPV 16L1蛋白模拟肽，其特征在于，所述的模拟肽氨基酸序列是Thr Asn Leu Asp Leu Tyr Gly。

3.如权利要求书1所述的HPV 16L1蛋白模拟肽，其特征在于，所述的模拟肽氨基酸序列是Ile Phe Asp Asn His Pro。

4.如权利要求书1所述的HPV 16L1蛋白模拟肽，其特征在于，所述的模拟肽氨基酸序列是Leu Thr Phe Lys Pro Gln。

5.如权利要求书1所述的HPV 16L1蛋白模拟肽，其特征在于，所述的模拟肽氨基酸序列是Gly Ile Asp Ser。

6、权利要求1所述的HPV16 L1蛋白模拟肽用于制备HPV16诊断试剂和疫苗的用途。

7、如权利要求书6所述的用途，其特征在于，用于制备HPV16感染的诊断试剂。

8、如权利要求书6所述的用途，其特征在于，用于制备HPV16L1多肽预防性疫苗。

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