CN101863975B - HBV preS1 B细胞表位肽及其制备的杂交瘤细胞株与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及SEQ ID NO：2所示的肽段在制备乙型肝炎病毒(HBV)诊断制剂中的应用，由SEQ ID NO：2所示的肽段制备的抗HBV的杂交瘤细胞株CCTCCNO：C201012，由上述的杂交瘤细胞株分泌的抗HBV preS1单克隆抗体，所述分泌的抗HBV preS1单克隆抗体亚类属于IgG1，轻链是κ型。应用该特异性单克隆抗体作为捕获抗体，则显著提高HBV LHBs的检出率，有效避免检测中的假阴性结果。

Description

HBV preS1 B细胞表位肽及其制备的杂交瘤细胞株与应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及一种抗HBV preS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

背景技术

病毒性肝炎是我国最突出的公共卫生问题之一，是和艾滋病、肺结核和血吸虫病并列的危害最严重的四大传染病。在各型病毒性肝炎中，人类乙型肝炎是全球流行最广的病毒性感染疾病之一，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是其主要病因。乙型肝炎病毒感染的治疗尚未有突破性的进展，由HBV造成的大众健康问题也远没有得到解决。HBV可以导致急性、慢性肝炎。成年人急性感染大多可自愈，而慢性感染却会导致严重的后果，出现如肝硬化、肝细胞癌以及慢性肝功能衰竭等后遗症。乙型病毒性肝炎是目前影响我国人民生活并导致相关经济、社会问题的严重进展性疾病。据统计，全球有4亿人感染HBV，平均每年约有100万人死于HBV相关的肝癌。在中国，每年约有50万人死于HBV感染导致的晚期肝硬化和肝癌。由于目前尚缺乏切实有效的病毒性肝炎治疗措施及手段，故病毒性肝炎的预防显得尤为重要，而针对病毒性肝炎感染的有效筛查、监测、诊断将对该类疾病的预防起着十分重要的作用。

致病性的HBV颗粒是一种直径约为42nm的球形DNA被膜病毒颗粒，其被膜外壳的主要成分是乙肝表面抗原(HBsAg)和来自宿主的脂质。HBsAg包括三种相关的被膜糖蛋白，即大蛋白(LHBs)、中蛋白(MHBs)和主蛋白(SHBs)。这三种被膜蛋白均为同一个S阅读框(ORF-S)的翻译产物。HBV基因组有4个开放读码框，其中编码病毒外壳蛋白的S区分为preS1、preS2以及S区，分别编码包膜上的preS1、preS2和HBsAg。preS1抗原位于病毒颗粒的表面，具有很强的免疫原性，介导宿主的免疫应答。它是肝细胞特异的无涎糖蛋白受体，该片段相当保守。如果机体缺乏有效的针对preS1抗原的免疫反应就不能清除HBV，就有可能发展为慢性肝炎或HBV携带者。LHBs抗原的水平与HBV DNA的载量平衡，研究认为血清LHBs与HBV DNA有一致性，基本能反映HBV感染者体内病毒复制情况。夏世邦等对乙肝患者血清同时作了HBV DNA PCR分析及HBV LHBs抗原的ELISA检测，结果显示两种方法检测结果一致性很好，同时也发现两种方法存在着一定的交叉阳性和交叉阴性现象。因此，在实际工作中两种方法可协同检测相互补充。李琴等也认为LHBs抗原反映HBV复制情况较常用的HBeAg更敏感。因此，LHBs抗原是判断慢性乙型肝炎患者HBV病毒复制状况非常有价值的指标，特别是在前C区发生突变导致HBeAg检测阴性的情况下。Brahm等也证实慢性乙型肝炎患者经干扰素治疗后，完全应答时LHBs抗原阴转，LHBs抗原的阴转可作为预测干扰素有效的指标之一。Pichoud等也报道部分慢性乙型肝炎患者经抗病毒治疗后HBeAg转换，但用定量PCR方法仍可检测到活跃的HBV复制。LHBs检测在抗HBe抗体阳性的慢性乙型肝炎患者中可以准确反映病毒在体内是否继续复制，弥补因HBeAg的缺失而造成的误诊。因此，高寿征等认为LHBs一方面可以作为病毒复制的指标，另一方面对评价药物疗效可能是一项有用的指标。

在三种被膜蛋白中，LHBs与有感染性的完整病毒颗粒密切相关，它在病毒表面的含量最高，约占20％左右。而在无感染性的棒状和球形亚病毒颗粒中，LHBs的含量则很少或没有。众多实验结果表明，LHBs在病毒颗粒的装配、感染以及肝癌发生中起重要作用。LHBs与其它表面被膜蛋白的不同之处在于它具有N端的preS1区域。因此，研究这一区域的生物功能及免疫特性具有重要的意义。病毒感染必须通过它与细胞的接触，HBV的嗜肝性感染提示了肝细胞膜表面存在与病毒颗粒特异性结合的受体。因为LHBs的preS1区暴露于病毒颗粒外表面，且抗preS1抗体能中和HBV病毒颗粒，因此可以推测，HBV结合肝细胞表面受体的功能是由LHBs的preS1区完成的。对LHBs抗原及其抗体的检测具有明确的临床意义。病人血清中LHBs的出现是与HBV DNA密切相关的，Klinkert等用HBV感染大猩猩，结果显示LHBs在感染早期就被检出(感染后5周)。因此LHBs抗原可作为一个新的血清学指标，它的出现提示病毒颗粒的存在，这种检测方法也可以用来评估抗病毒疗法的效果。

国内HBV感染患者血清中检测到的主要是adr亚型，所以它的preS1为含119个氨基酸残基的较长序列。众多的研究结果表明preS1区域有大量的B细胞和T细胞免疫表位。目前，已有很多实验室对带有preS1区的疫苗进行了大量的研究。遗憾的是，对引入preS1片段的序列位置和长度还没有取得共识。有些候选疫苗引入preS1全部序列，有些则引入preS1部分序列，如preS1(21-47)，preS1(12-52)或preS1(1-42)。包含不同长度和不同序列preS1片段的候选疫苗所产生的抗preS1免疫反应也会有很大差别。因此，深入研究preS1的免疫表位仍有重要意义。preS1区域有大量的B细胞和T细胞免疫表位，可作为乙肝疫苗中的一种很有效的成分。Neurath等指出抗preS1(12-47)抗体能中和大猩猩的HBV感染。直接用这个肽段也有保护作用。在SHBs颗粒中加入preS1区域能显著地增强小鼠和人的免疫应答。Ferrari等发现血源性疫苗尽管只含有痕量的preS1，但其接受者体内却有很多对preS1特异的辅助T细胞，并且它能产生可被检测的抗preS1反应。而且这个抗preS1抗体对抗preS1单抗与肝细胞的结合有竞争作用。含有PreS1的HBs颗粒能诱导那些对SHBs疫苗不反应者产生抗preS1和抗SHBs反应。

大量的研究结果证实：检测血清中的LHBs抗原对于诊断HBV感染具有重要的价值。Delfini等人发现95％的急性HBV感染者在感染者早期就可以在血清中检出LHBs，LHBs几乎与HBeAg同时消失，而且LHBs与高水平的血清ALT活性和HBcAg-IgM有很好的相关性，提示LHBs可以用作急性乙型肝炎的早期诊断指标。LHBs抗原阴转越早则预后越好，是病毒清除的最早迹象；反之如果LHBs持续阳性则意味着感染的慢性化，因此监测感染者血清LHBs的水平有助于判断预后。Le Guillou DB等人通过定量分析HBV感染者血清LHBs水平并与HBVDNA的荧光定量PCR结果比较，发现二者之间存在很好的相关性，表明血清LHBs水平和HBV DNA一样，可以反映血清中HBV的存在及相应的病毒载量。目前国内实验室主要是用国产的ELSIA试剂盒，但是这些试剂盒所用的原料抗体生产工艺仍较为复杂，产量难以提升，部分来自国外的抗体成本较高。国内的preS1单克隆抗体目前成功的很少，其效价和特异性均有待于进一步提高。

LHBs免疫检测的首要关键问题是如何获得其特异性抗体，即特异性针对preS1的抗体，而且最好拥有针对不同抗原决定簇的preS1特异性抗体。所以进行预测选择preS1区域的B细胞免疫表位尤为重要。

发明内容

本发明的目的之一在于提供SEQ ID NO：2所示的肽段在制备HBV诊断制剂中的应用。

根据所述的应用，所述HBV诊断制剂包含抗HBV preS1单克隆抗体。

本发明还提供一种抗HBV的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201012，SEQ IDNO：2所示的肽段制备。

所述的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201012为抗HBV preS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

所述杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201012由SEQ ID NO：2所示的肽段免疫Balb/c小鼠后脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。

本发明还提供由上述的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201012分泌的抗HBVpreS1单克隆抗体。

本发明还提供一种抗HBV的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201011，其由SEQID NO：1所示肽段免疫Balb/c小鼠后脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生，分泌抗HBV preS1单克隆抗体。

所述的抗HBV preS1单克隆抗体的亚类属于IgG1，轻链是κ型。

本发明还提供上述的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201012在制备HBV诊断制剂中的应用。其中，所述抗HBV制剂为抗HBV preS1单克隆抗体。

本发明还提供一种抗HBV制剂，其具有由SEQ ID NO：2所示的肽段制备的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201012分泌的抗HBV preS1单克隆抗体和SEQ IDNO：1所示肽段制备的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201011分泌的抗HBV preS1单克隆抗体。

本发明具体通过下述技术方案完成本发明的目的：

1.抗HBV preS1单克隆抗体的制备：通过生物信息学分析，综合考虑蛋白质的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，预测HBV LHBs中preS1区段中的潜在B细胞表位，发现除了已经被人们广泛应用的27aa-59aa(肽1)外，还发现了一个新的B细胞表位区域83aa-111aa(肽2)，人工合成上述两种B细胞表位多肽，与BSA交联后通过新型免疫程免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗preS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株并检测其细胞培养上清的效价。之后对杂交瘤细胞核型分析，明确染色体数目，证实杂交瘤确实是小鼠脾细胞和SP2/0融合而成，再进行抗体亚类鉴定和抗体的特异性实验，证实得到的抗体是特异性针对HBVpreS1的。

2.HBV preS1重组蛋白的制备：从GENBANK中获得人HBV adr亚型preS1编码序列，通过密码子偏性改造，同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列，进行preS1全长基因的合成制备；将preS1基因与载体连接，获得preS1重组质粒；将preS1重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达获得preS1重组蛋白；鉴定重组蛋白的可溶性后纯化重组蛋白并进行纯度、浓度和活性鉴定，得到了高纯度的HBV preS1重组蛋白，可以用于筛选抗preS1杂交瘤细胞。

3.制备抗HBV HBsAg特异性兔多克隆抗体：用从HBV感染者血清中分离纯化得到的HBV HBsAg免疫新西兰大白兔，经过多次免疫，待兔血清中的抗HBsAg抗体达到较高效价后放血，经过抗原亲和层析纯化后得到了高效价、高亲和力的HBsAg特异性的多克隆抗体。

4.建立了HBV LHBs的ELISA检测体系：应用抗HBV preS1抗体为捕获抗体，抗HBsAg抗体为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法，针对两个B细胞表位肽的单克隆抗体都可以作为单独作为捕获抗体，如果混合两种表位特异性的抗体作为捕获抗体则可以显著提高HBV LHBs的检出率，与HBsAg的检测结果高度符合，从而减少了假阴性检测结果。

本发明通过HBV preS1蛋白中用于HBV感染诊断的新靶点，制备了抗HBVpreS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201011，CCTCC NO：C201012，可以分泌相应的检测用抗体，提高HBV的检测特异性，且优化了基于ELISA的HBV LHBs检测体系。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为PET32a-preS1及PET32a用Xho1及Nco1双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果分析图；

其中，M，DNA marker；1、2，PET32a-preS1；3，PET32a；

图2为重组preS1蛋白诱导表达与SDS-PAGE电泳图；

其中，M为分子量标准；1～7为BL21-pET32a-PreS1IPTG诱导表达；8，BL21-pET32a-PreS1未诱导表达；9，BL21-pET32a IPTG诱导表达对照；

图3为preS1可溶性表达鉴定；

其中，M为分子量标准；1为破菌后上清；2为破菌后沉淀；

图4为重组preS1蛋白纯化图；

图5为重组preS1蛋白过分子筛纯化图；

图6为纯化后重组preS1蛋白的SDS-PAGE鉴定；

其中，M为分子量标准；1为纯化产物；2为未诱导重组菌阴性对照；3为重组菌诱导6小时阳性对照；

图7为纯化后重组preS1蛋白的HPLC鉴定；

图8为重组preS1蛋白的Western blot鉴定；

其中，1、2和3分别代表0、2和5μg重组preS1；

图9为ELISA鉴定单克隆抗体1-E6检测preS1重组蛋白；

其中，左1孔为空白对照，左2～12孔分别为抗体稀释倍数1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000、1∶256000、1∶512000、1∶1024000；

图10为ELISA鉴定单克隆抗体2-D8检测preS1重组蛋白；

其中，左1孔为空白对照，左2～12孔分别为抗体稀释倍数1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000、1∶256000、1∶512000、1∶1024000；

图11为Western blot鉴定单克隆抗体1-E6结合preS1重组蛋白；

其中，1、2、3和4分别代表HBV preS1抗原的上样量为1、2、4和8μg；

图12为Western blot鉴定单克隆抗体2-D8结合preS1重组蛋白；

其中，1、2和3分别代表HBV preS1抗原的上样量为0、4和8μg；

图13为标准ELISA检测临床标本中HBV LHBs结果(与HBsAg比较)；

图14为标准ELISA检测临床标本中HBV LHBs结果(与HBV DNA比较)。

具体实施方式

本发明通过生物信息学分析，综合考虑蛋白质的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，预测乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白(LHBs)前S1(preS1)区段中的潜在B细胞表位，除了已经被人们广泛应用的27aa-59aa(肽1)外，还发现了一个新的B细胞表位区域83aa-111aa(肽2)是潜在的B细胞表位区段。运用杂交瘤技术成功建立了分泌抗HBV preS1肽1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1-E6(CCTCC NO：C201011)和分泌抗HBV preS1肽2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2-D8(CCTCC NO：C201012)。经过亚类分析证实这些抗体均为IgG₁，轻链是κ型。免疫印迹和ELISA结果表明：两株单克隆抗体均能以高亲和力与HBV preS1特异性结合，与其它所测蛋白无交叉反应。制备的杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC(中国武汉，武汉大学)，保藏编号分别为C201011和C201012，培养物名称分别为“杂交瘤细胞株5-preS1(1-E6)”和“杂交瘤细胞株5-preS1(2-D8)”，保藏日均为2010年4月20日。

本发明从GENBANK中获得人HBV adr亚型preS1编码序列，通过密码子偏性改造，同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列，进行preS1全长基因的合成制备，与载体连接，构建preS1重组质粒，获得preS1重组质粒；preS1重组质粒转化大肠杆菌，进行preS1重组蛋白的表达，获得preS1重组蛋白；通过可溶性鉴定，纯化，以及对其浓度、纯度，活性鉴定，获得了preS1重组蛋白用作抗体筛选和鉴定。

本发明用从HBV感染者血清中分离纯化得到的HBV HBsAg免疫新西兰大白兔，经过多次免疫，待兔血清中的抗HBsAg抗体达到较高效价后放血，经过抗原亲和层析纯化后得到了高效价、高亲和力的HBsAg特异性的多克隆抗体。

本发明建立了HBV LHBs的ELISA检测体系：应用抗HBV preS1抗体为捕获抗体，抗HBsAg抗体为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法，针对两个B细胞表位肽的单克隆抗体都可以单独作为捕获抗体，如果混合两种表位特异性的抗体作为捕获抗体则可以显著提高HBV LHBs的检出率，与HBsAg的检测结果高度符合，从而减少了假阴性检测结果。

材料和来源

实验动物：Balb/C小鼠和新西兰大白兔购自中国科学院实验动物中心(中国北京)

菌株和质粒：大肠杆菌克隆菌株DH5a和大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)均为申请人实验室保存，pET-28a和pET-32a为申请人实验室保存。

酶及试剂盒：限制性内切酶Nco1及Sal1，Xho1及Nco1和质粒抽提试剂盒购自Promega公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司

其它试剂：HRP-山羊抗小鼠IgG购自北京鼎国公司

实施例1.生物信息学分析及检测靶点的确定

1)从GENEBANK中查找HBV adr血清型preS1蛋白的氨基酸序列，该蛋白由119个氨基酸残基组成。

2)在线分析preS1蛋白中潜在的B细胞表位区域，综合考虑蛋白质的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，对各区段进行分析评分，选取得分最高的两个区域作为候选B细胞表位区域，分别为27aa-59aa(肽1，氨基酸序列为SEQ ID NO：1表示：DHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVG)和83aa-111aa(肽2，氨基酸序列为SEQ ID NO：2表示：GILTTVPTAPPPASTNRQSGRQPTPISPP)。其中肽1为广泛应用的B细胞表位区域，肽2的应用尚未见报道。

实施例2.HBV preS1重组蛋白的制备

1)preS1编码序列全基因合成

GenBANK中获得人HBV adr亚型preS1编码序列，通过密码子偏性改造，同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列，密码子偏性改造后的人HBV adr亚型preS1编码序列为(SEQ ID NO：3)：

catgccatgg gtggttggtc ttccaaacct cgccaaggca tgggcacgaa tctgtctgtt     60

ccgaatcctc tgggtttctt tccggatcac cagctggacc ctgcgttcgg tgccaacagc    120

aacaatccag attgggactt caacccgaac aaggatcact ggccagaggc aaatcaggta    180

ggtgcgggtg cattcggccc aggtttcacc ccaccacacg gcggtctgct gggctggagc    240

cctcaggctc agggcatcct gaccaccgtg ccaaccgcac ctcctcctgc ctccaccaat    300

cgtcagagcg gtcgtcagcc tactccaatc tctccacctc tgcgtgacag ccatcctcag    360

gcctaatagg tcgacgcct                                                 379

委托上海生工生物工程有限公司进行全基因合成。

2)preS1重组质粒构建及酶切鉴定

将pET-28a载体及preS1全长基因分别用Nco1和Sal1双酶切消化4h后用T₄DNA连接酶4℃过夜连接，取一无菌离心管，加入已制备好的感受态DH5α菌200μl，冰浴，吸取1μl连接产物加入管中，转化DH5α菌，轻拍管壁混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800μl室温的2×YT培养液混匀，37℃摇床220rpm振荡培养1h，分别将50μl、200μl及剩下的全部转化菌液涂于3个含卡拉霉素的2×YT培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于2×YT培养基扩大培养。

沉淀菌体，12000rpm，离心1min，弃上清，尽量吸干，用150μl预冷的溶液Ⅰ将上述细菌沉淀重悬，剧烈振荡，新鲜配制的溶液Ⅱ300μl轻轻颠倒混匀5次，冰浴3-5min，使其澄清，加入预冷的溶液Ⅲ150μl，轻轻混匀后冰浴10min，使蛋白质均匀分布于水相中，加入预冷的溶液Ⅳ150μl，轻轻混匀，12000rpm离心10min。小心吸取水相(约400μl)移于另一1.5ml离心管中，加入2μl RNaseA(10μg/ml)，55℃水浴10min。再加400μlTris-酚及400μl氯仿，涡振混匀，12000rpm离心10min。取上清至另一装有600μl异丙醇的1.5ml离心管中，来回颠倒几次，4℃12000rpm离心10min，弃上清。用70％乙醇1ml洗涤DNA 2次，12000rpm离心3min，弃上清，室温干燥10-20min，加入TE 20μl溶解质粒DNA，-20℃保存。

取10μl质粒用Nco1和Sal1双酶切后跑1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切反应体系为：preS1重组质粒DNA 10μl，BamH I 1μl，Nde I 1μl，10×buffer K 2μl，ddH₂O 6μl，离心30s，37℃水浴4h，取酶切产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳，未见非特异片段。改用Xho1及Nco1双酶切PET28a-preS1及PET32a，将切下preS1片段连入PET32a，重新转化DH5α菌，重复上述步骤，最后Xho1及Nco1双酶切PET32a-preS1后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，在约360bp处可见特异性条带，表明pET32a质粒中已插入大小约为357bp的片段(图1)。

3)preS1重组质粒插入片断测序

将PET32a-preS1重组质粒送往上海博亚公司测序，并应用Blast工具将测序结果与GenBank的preS1序列进行同源性分析。测序的结果显示，插入片段长度为357bp，与GenBank中报道的preS1序列完全一致。

4)preS1重组蛋白的诱导表达及鉴定

(1)转化BL21菌

取上次提取的preS1重组质粒转化BL21(DE3)菌，涂布于含羧苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养，用碱裂解法提取质粒，取质粒用Xho1及Nco1双酶切4h，酶切体系同前，并取酶切产物10μl行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定与设计值一致。

(2)preS1重组蛋白的诱导表达

将扩大培养的转化PET32a-preS1重组质粒的BL21菌，用LB固体培养基筛选单克隆菌落，将转化菌扩大培养，测细菌OD值达0.6-0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h收集诱导的细菌。结果表明，IPTG诱导的细菌出现分子量约为12.5kD的特异性蛋白条带，与预期preS1的分子量值相符(图2)。再将IPTG诱导6h的BL21重组菌用裂菌液破菌，离心后分别取上清和沉淀电泳，未诱导的菌液和诱导6h的菌液分别做阴性和阳性对照，结果在上清中与阳性对照preS1蛋白条带相对应的位置发现特异蛋白条带，而细菌裂解物沉淀中沉淀无此蛋白条带，证实preS1蛋白为可溶性表达(图3)。

5)preS1重组蛋白的纯化

挑取单克隆重组LB菌，将高表达菌株在发酵罐内扩大培养并诱导，将得到的表达菌用20mmol/L pH 5.8的PBS混匀后超声破菌，10000×g离心30min取上清，初纯化选择装填SP Sepharose Fast Flow的阳离子交换柱，缓冲液(20m mol/LPBS，pH 5.8)平衡后将上清上柱，用0～50％梯度的洗脱液(1mol/L NaCl，20mmol/L PBS，pH 5.8)洗脱10个柱床体积，100％的洗脱液再洗脱5个柱床体积(图4)。得到的初纯品上样过分子筛(图5)，收集得到成品蛋白，然后分别取样行SDS-PAGE电泳(图6)，IPTG未诱导的重组菌作阴性对照，诱导6h的重组菌为阳性对照，纯化后纯度达到95％以上。

6)preS1重组蛋白浓度、纯度鉴定

(1)Lowry法(Folin酚法)测定preS1蛋白质含量

制备标准曲线：

在650nm波长下，以空白管为对照调零，分别测定各管的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，只作标准曲线。

将待测蛋白稀释后，紫外分光光度计测定A₂₆₀值和A₂₈₀值。根据公式，蛋白浓度C＝(1.45×A₂₈₀-0.75×A₂₆₀)×稀释倍数，计算出待测蛋白的粗略浓度，然后将蛋白样品用蒸馏水稀释至25-250μg范围，按照上表的操作程序反应，测定出650nm吸光度值，然后在标准曲线上查出相应的浓度，在乘以稀释倍数计为待测蛋白的浓度，多管计算平均值，测得浓度为1.145g/ml。

(2)纯化产物用高效液相色谱法(HPLC)进行纯度测定和preS1得率计算。

将纯化的蛋白用HPLC分析其纯度，可知经SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱初纯化后preS1蛋白的纯度达92.62％以上，再次过分子筛纯化后preS1纯度可达95.40％(图7)。经计算，1g湿菌可得到53mg纯度为95.40％的preS1蛋白，得率约为17.7％。

7)Western blot鉴定重组preS1蛋白分子

取最后纯化的preS1蛋白行15％SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，置于转膜缓冲液中平衡10min，18V恒压电转移0.5小时至PVDF膜上，用1×TBST洗膜4次，每次20min，再用1×TBS洗膜2次，每次20min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭1h，弃去封闭液，加入一抗即1∶1500稀释抗preS1阿尔法公司抗preS1抗体，4℃孵育过夜。次日，用1×TBST漂洗膜4次，每次20min，再用1×TBS洗膜2次，每次20min。加入1∶7500稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG，37℃孵育40min，用1×TBST漂洗膜4次，每次20min，再用1×TBS洗膜2次，每次20min。选用MilliporeImmobilon Western Chemiluminescent HRP Subscrate系统显色。于抗preS1单克隆抗体结合preS1蛋白处可见清晰条带(图8)

实施例3.抗HBV preS1单克隆抗体的制备

1)表位肽的合成与交联

化学合成HBV preS1B细胞表位肽，包括肽1和肽2，纯化后与BSA交联，得到preS1-肽1-BSA和preS1-肽2-BSA

2)preS1表位肽免疫Balb/c小鼠

将合成回来的preS1表位肽与BSA的交联产物从-80℃冰箱取出，溶解后过滤，Lowry法测定蛋白含量，pH5.8的20mmol/L PBS将其稀释到0.5mg/ml。选取15只6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠，分为A、B、C三组免疫。抗原乳化选用双注射器互推法。首次免疫时，将preS1表位肽-BSA与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合，每只小鼠按100μg preS1的量皮内多点加腹腔注射。第14和第28天分别进行第二次第三次免疫，佐剂改用不完全弗氏佐剂，抗原量、注射体积和途径不变，第3次免疫后间接ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg preS1，3天后细胞融合。

3)被免疫Balb/c小鼠血清效价测定

第3次免疫后10天从小鼠尾静脉取血检测血清抗体效价。将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用；用包被液将抗原稀释为最佳工作浓度5μg/ml，每孔加100μl抗原液，37℃温育1小时后，以胶带封口，于4℃过夜，倒尽板孔中液体，吸干孔内残余反应液，加满洗涤液过一次，再注满洗涤液缓缓晃动2min，倾去，反复五次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。自然干燥后以胶带封口，此为已知抗原包被的酶标板，加封闭液300μl，37℃孵育1～1.5小时，洗涤5次；采血及稀释血清：捏住鼠尾，75％酒精消毒后用剪刀在尾静脉剪一缺口，取血20μl，2000rpm离心30min，取上清1μl加入999μl抗体稀释液混匀，并进行倍比稀释，从1∶100至1∶3200，将稀释的被检血清每孔加入100μl，同时取小鼠免疫前血清1∶100稀释做阴性对照，抗体稀释液做空白对照。37℃孵育1～1.5小时，洗涤5次；将辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG稀释到1∶10000，每孔加100μl，37℃孵育1-1.5小时，洗涤5次；加邻苯二胺溶液100μl/孔，室温暗处10～15分钟，每孔加终止液100μl观察结果，OPD氧化后的产物呈橙红色，用酶联免疫检测仪记录492nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。血清效价达到1∶3200，可用于细胞融合。

3)小鼠脾细胞悬液和SP2/0细胞悬液的制备

取一只免疫好的Balb/c小鼠，摘除小鼠眼球放血处死，眼血离心后收集血清作ELISA的阳性对照，无菌操作取出脾脏，放入盛有10ml不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的结缔组织和脂肪组织，换一玻璃皿，将脾脏捞出，置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，不时用不完全培养基冲洗，使脾细胞穿过网孔进入溶液中，将脾细胞移至10ml玻璃离心管中，800rpm水平离心10min，去上清。同法用不完全培养基10ml洗涤细胞1次，离心收集沉淀的细胞，将细胞用10ml不完全培养基重悬混匀，细胞计数约为1×10⁸个细胞。

将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，将细胞转移到10ml离心管中，800rpm水平离心10min，弃上消，10ml完全培养液重悬沉淀，把细胞悬液转移到50ml培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的选择培养基筛选细胞一周；融合前2天，将1瓶细胞传至4瓶，则融合当天细胞正处于对数生长期，活力正好，细胞大小均匀，圆而透亮，融合当天，用弯头滴管将SP2/0细胞从管壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心，弃上清，沉淀用不完全培养基洗涤后，10ml不完全培养基重悬，细胞计数，约为5×10⁷。

4)滋养细胞的制备

取一只未免疫的Balb/c小鼠，摘眼球放血处死，75％乙醇浸泡消毒5min，剪开小鼠皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪一小口，弯头滴管吸取预冷的不完全培养基冲洗腹腔，将洗液吸至50ml离心管中。同法用不完全培养基冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下1000rpm水平离心10min，去上清，10ml不完全培养基重悬细胞并计数。

5)骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合

融合前将PEG1500置于37℃培养箱中预温，吸取1×10⁷个骨髓瘤细胞悬液和1×10⁸个脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1∶10)至一个50ml离心管中，补加30ml不完全培养基，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50％PEG1500溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在1min左右加完，然后静置90s，逐滴加入37℃预温的不完全培养基30ml终止融合，3min之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5min，取出离心管，1000rpm离心5min，弃去上清，加入10ml HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，按100μl/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。

6)融合细胞的选择性培养

融合后第5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100μl，第10天可用间接ELISA法测杂交瘤效价，第14天换HT培养基培养。

7)杂交瘤细胞的筛选

融合后10～14天，待细胞长到满培养孔的1/4～1/2孔底时，采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆；以纯化后preS1重组蛋白包被酶标板(0.5μg/孔)，4℃过夜，洗涤缓冲液洗涤5次，每次5min，拍干液体，每孔加入封闭液300μl，37℃孵育2h，加入100μl细胞培养上清，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培上清，空白对照用洗涤液，37℃孵育2h；洗涤酶标板：每孔加入100μl 1∶10000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IG抗体，37℃孵育2h；洗涤，拍干液体，加新鲜配制的邻苯二胺溶液100μl/孔，室温暗处反应10～15分钟，加终止液每孔100μl终止反应，酶标仪检测492nm吸光度值。

结果为以preS1表位肽为抗原，先后免疫BALB/C小鼠15只，共融合5次，成功3次，经3次克隆化和ELISA筛选后，得到分泌抗preS1肽1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1-E6和分泌抗preS1肽2单克隆抗体的杂交瘤细胞株2-D8，其细胞培养上清效价达到1∶6400。这株杂交瘤细胞经数次冻存，体外传代培养3个月以上均能稳定分泌抗体。

8)阳性杂交瘤细胞的克隆化

筛选出阳性克隆后，立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，制备饲养细胞，用10ml不完全培养基重悬，收集阳性克隆细胞并计数，用不完全培养基将阳性克隆细胞稀释到100个/20ml，取一块预先已加有滋养细胞的96孔细胞培养板，加入200μl细胞悬液，将剩下的阳性克隆细胞转移到24孔板中扩大培养，收集细胞液氮冻存，同时将培养板在37℃，5％CO₂培养箱培养，第3天后显微镜下观察细胞生长情况，10天后可用ELISA法检测效价，并将最强的阳性克隆再次克隆化，直至细胞阳性率达100％，即可定株；测取定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价后再将定株的杂交瘤细胞扩大培养并冻存于液氮中。

9)杂交瘤细胞的核型分析

将定株的杂交瘤细胞培养至对数生长期后，取1瓶细胞制作染色体标本，新鲜Giemsa染色液染色，400倍油镜下观察染色体形态和数目，选择染色体分散、无重叠的视野，数码相机摄像存档。

将摄取的的染色体结果计数，2-D8和1-E6的染色体数目为84，接近小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞染色体数目的总和，说明这株杂交瘤细胞为小鼠脾细胞与Sp2/0细胞的融合体。大多数染色体为端着丝点染色体，并有中部和亚中部着丝点染色体，可知该细胞是由小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合而成。

10)抗preS1单克隆抗体亚类的鉴定

采用美国Roche公司Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit操作按说明书进行。取新鲜的杂交瘤细胞培养上清，用0.01M pH 7.4的PBS稀释至1∶10，取150μl已稀释的培养上清加入反应管中，室温静置30s，然后涡振10s使反应管底的乳胶完全溶解，将试纸条插入至反应管，使试纸条底部的黑色端完全浸入在液体里，室温静置5～10min，出现蓝色条带的区域所对应的亚类即为IgG的亚类。经单抗亚类鉴定试纸条测定，杂交瘤单克隆细胞株1-E6和2-D8分泌的IgG单克隆抗体亚类均属于IgG1，轻链是κ型。

11)ELISA鉴定抗preS1单克隆抗体

将纯化的PreS1抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出板子弃抗原，洗板。将单克隆抗体1E6作1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000......，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h，洗板，加入二抗，1∶3000HRP标记山羊抗小鼠IgG，按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔。结果可见，抗preS1单克隆抗体1-E6和2-D8呈现肉眼可见的浓度梯度(图9、图10)。

12)抗preS1单克隆抗体的Western blot鉴定

取最后纯化的preS1蛋白行15％SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，置于转膜缓冲液中平衡10min，18V恒压电转移0.5小时至PVDF膜上，用1×TBST洗膜4次，每次20min，再用1×TBS洗膜2次，每次20min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭1h，弃去封闭液，加入一抗即1∶1500抗preS1单克隆抗体，4℃孵育过夜。次日，用1×TBST漂洗膜4次，每次20min，再用1×TBS洗膜2次，每次20min。加入1∶7500稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG，37℃孵育40min，用1×TBST漂洗膜4次，每次20min，再用1×TBS洗膜2次，每次20min。选用Millipore Immobilon Western Chemiluminescent HRP Subscrate系统显色。于抗preS1单克隆抗体结合preS1蛋白处可见清晰条带(图11、图12)

实施例4.抗HBV HBsAg兔多克隆抗体的制备

以纯化自HBV感染者血清的HBsAg为免疫原。免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合后完全乳化，背部脊柱两侧皮下多点免疫2只2.5kg左右雄性新西兰大白兔，每只兔子注射1ml，每点约0.1ml。首次免疫后3d等量免疫原配以弗氏完全佐剂再次免疫，其后28d以等量抗原配以弗氏不完全佐剂第3次免疫。第3次免疫后7d，兔耳缘静脉采血，ELISA检测抗血清效价，效价达10万以上时，颈动脉插管收集全血。全血37℃1小时后，4℃孵育过夜，10000rpm离心10min收集上清，-70℃备用。兔血清与上样缓冲液(100mmol/L磷酸钠，100mmol/L柠檬酸钠，pH 7.0)按1∶9稀释混匀上ProteinA柱，以上样缓冲液流洗至基线，上样，洗脱液(100mmol/L磷酸钠，100mmol/L柠檬酸钠，pH 3.0)，收集单峰(图3)。纯化产物再经抗原亲和纯化。HBsAg用buffer A(0.1mol/L碳酸氢钠，0.5mol/L氯化钠，pH 8.0)，按0.5∶1(Buffer/Sample)处理，将填料NHS-activated Sepharose^TM 4Fast Flow装柱，室温下将HBsAg偶联在柱上，经过纯化过量的抗原决定簇和大量清洗柱体后，备用。反复上样，保证特异性的抗HBsAg抗体充分与柱结合，用100mmol/L甘氨酸，pH 2.5洗脱，特异性抗体蛋白直接被洗脱收集入1mol/L Tris，pH 9.0，-20℃保存备用。同理纯化β-actin抗体。

实施例5.双抗体夹心ELISA法检测标准中的HBV LHBs

1)按照上述实施例3中描述的条件，应用抗HBV preS1单克隆抗体为捕获抗体，抗HBsAg兔多克隆抗体为检测抗体，建立检测HBV LHBs的双抗体夹心ELISA检测体系。包被时用①单克隆抗体1-E6；②单克隆抗体2-D8；③混合单克隆抗体1-E6和2-D8。抗体浓度及包被条件同实施例3中的相关描述。

2)ELISA操作过程参见上述实施例3的描述，标本为来自临床医院感染科的病人血清。同时检测或收集HBsAg检测结果并进行比对分析。结果表明：在测试的100份HBsAg阳性血清中，单独用preS1单克隆抗体1-E6作为捕获抗体时，检出33例阳性；单独用preS1单克隆抗体2-D8作为捕获抗体时，检出75例阳性；联合应用1-E6和2-D8为捕获抗体时，检出86例为阳性(图13)。在45例HBV DNA阳性(定量PCR结果)标本中，单独用preS1单克隆抗体1-E6作为捕获抗体时，检出21例阳性；单独用preS1单克隆抗体2-D8作为捕获抗体时，检出30例阳性；联合应用1-E6和2-D8为捕获抗体时，检出42例为阳性(图14)。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>HBV preS1 B细胞表位肽及其制备的杂交瘤细胞株与应用

<130>10P99019-CN

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>PRT

<213>preS1蛋白中的表位肽1的氨基酸序列

<400>1

Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp

1                5                   10                  15

Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly

             20                 25                   30

<210>2

<211>19

<212>PRT

<213>preS1蛋白中的表位肽2的氨基酸序列

<400>2

Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Thr Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln

1                5                   10                  15                  20

Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro

        25

<210>3

<211>379

<212>DNA

<213>密码子偏性改造后的人HBV adr亚型preS1编码序列

<400>3

catgccatgg gtggttggtc ttccaaacct cgccaaggca tgggcacgaa tctgtctgtt  60

ccgaatcctc tgggtttctt tccggatcac cagctggacc ctgcgttcgg tgccaacagc    120

aacaatccag attgggactt caacccgaac aaggatcact ggccagaggc aaatcaggta    180

ggtgcgggtg cattcggccc aggtttcacc ccaccacacg gcggtctgct gggctggagc    240

cctcaggctc agggcatcct gaccaccgtg ccaaccgcac ctcctcctgc ctccaccaat    300

cgtcagagcg gtcgtcagcc tactccaatc tctccacctc tgcgtgacag ccatcctcag    360

gcctaatagg tcgacgcct                                                 379

Claims (5)

1. 一种抗HBV的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC  NO: C201012。

2. 一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗HBV preS1单克隆抗体。

3. 权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备HBV诊断制剂中的应用。

4. 权利要求2所述的抗HBV preS1单克隆抗体在制备HBV诊断制剂中的应用。

5. 一种HBV诊断制剂，其特征在于，其具有由权利要求1所述的抗HBV的杂交瘤细胞株分泌的抗HBV preS1单克隆抗体。

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