CN105445460A - 一种抗乙肝病毒HBx单克隆抗体及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学生物工程技术领域,本发明提供了抗乙肝病毒HBx单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的重组蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以及该单克隆抗体用于western?blot和免疫组织化学检测样本中HBx的表达和在用于制备乙型病毒性肝炎、与乙肝相关肝癌的预后评估制剂中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物工程技术领域,具体涉及一种抗乙肝病毒HBx单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的重组蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以及该单克隆抗体在用于检测样本中HBx的表达和用于制备检测乙型病毒性肝炎、与乙肝相关肝癌样本中HBx检测,以及病情预后评估的制剂中的应用。
背景技术
统计资料表明,肝癌术后5年复发率接近60%,肝癌治疗后的复发转移是目前影响肝癌疗效的重要因素(1.ShermanM.Recurrenceofhepatocellularcarcinoma.NEnglJMed2008;359:2045-2047.)。肝癌复发转移是一个十分复杂的问题,国内外研究发现不少的癌基因、生长因子和炎症因子等与肝癌细胞侵袭性相关,多种细胞外基质成分也有重要作用(2.MannCD,NealCP,GarceaG,MansonMM,DennisonAR,BerryDP.Prognosticmolecularmarkersinhepatocellularcarcinoma:asystematicreview.EurJCancer2007;43:979-992.),且可能与原发瘤的基因特性有关(3.RoesslerS,JiaHL,BudhuA,ForguesM,YeQH,LeeJS,etal.Auniquemetastasisgenesignatureenablespredictionoftumorrelapseinearly-stagehepatocellularcarcinomapatients.CancerRes2010;70:10202-10212.;4.YeQH,QinLX,ForguesM,HeP,KimJW,PengAC,etal.PredictinghepatitisBvirus-positivemetastatichepatocellularcarcinomasusinggeneexpressionprofilingandsupervisedmachinelearning.NatMed2003;9:416-423.)。我国属于肝癌高流行区,全世界半数左右的肝癌病人集中在我国,流行病学研究表明,乙肝病毒感染与我国肝癌发生密切相关(5.JemalA,BrayF,CenterMM,FerlayJ,WardE,FormanD.Globalcancerstatistics.CACancerJClin2011;61:69-90.)。因此,研究乙型病毒性肝炎背景下肝癌发生发展的机制显得尤为重要。文献报导,乙肝病毒生活史与宿主细胞密不可分,乙肝病毒需要依赖宿主细胞才能完成复制;乙肝病毒不但能够整合到宿主细胞基因组,引起插入突变;而且乙肝病毒表达的蛋白能够与宿主细胞组成成分相互作用,从而干扰宿主细胞的正常代谢和功能(6.FallotG,NeuveutC,BuendiaMA.DiverserolesofhepatitisBvirusinlivercancer.CurrOpinVirol2012;2:467-473.)。
乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),基因组长约3.2kb,为部分双链环状DNA。其基因组共有四个开放读码框,编码以下一些蛋白:Core蛋白和pre-core蛋白,Pol蛋白,X蛋白,以及S蛋白(L,M,S)(7.SeegerC,MasonWS.HepatitisBvirusbiology.MicrobiolMolBiolRev2000;64:51-68.)。越来越多的研究表明,乙肝病毒X蛋白(HBx)与肝癌的发生发展密切相关,HBx是一个仅有17kDa的可溶性蛋白,同时存在于细胞核和胞质。虽然HBx不能直接与DNA结合,但是HBx在宿主细胞中发挥的作用却十分广泛,参与调控与细胞生存、凋亡相关的多种基因表达,比如c-jun,c-fos,ASC-2,c-Myc,pituitarytumor-transforminggene1(PTTG1)等(8.TwuJS,LaiMY,ChenDS,RobinsonWS.Activationofprotooncogenec-junbytheXproteinofhepatitisBvirus.Virology1993;192:346-350.;9.KalraN,KumarV.TheXproteinofhepatitisBvirusbindstotheFboxproteinSkp2andinhibitstheubiquitinationandproteasomaldegradationofc-Myc.FEBSLett2006;580:431-436.;10.Molina-JimenezF,BenedictoI,MurataM,Martin-VilchezS,SekiT,AntonioPintor-ToroJ,etal.Expressionofpituitarytumor-transforminggene1(PTTG1)/securininhepatitisBvirus(HBV)-associatedliverdiseases:evidenceforanHBVXprotein-mediatedinhibitionofPTTG1ubiquitinationanddegradation.Hepatology2010;51:777-787.;11.KongHJ,ParkMJ,HongS,YuHJ,LeeYC,ChoiYH,etal.HepatitisBvirusXproteinregulatestransactivationactivityandproteinstabilityofthecancer-amplifiedtranscriptioncoactivatorASC-2.Hepatology2003;38:1258-1266.)。HBx还能促进细胞中转录因子的活性,比如AP-1(12.TanakaY,KanaiF,IchimuraT,TateishiK,AsaokaY,GulengB,etal.ThehepatitisBvirusXproteinenhancesAP-1activationthroughinteractionwithJab1.Oncogene2006;25:633-642.;13.KekuleAS,LauerU,WeissL,LuberB,HofschneiderPH.HepatitisBvirustransactivatorHBxusesatumourpromotersignallingpathway.Nature1993;361:742-745.),NF-κB(14.ChirilloP,FalcoM,PuriPL,ArtiniM,BalsanoC,LevreroM,etal.HepatitisBviruspXactivatesNF-kappaB-dependenttranscriptionthroughaRaf-independentpathway.JVirol1996;70:641-646.),androgenreceptor(AR)(15.ChiuCM,YehSH,ChenPJ,KuoTJ,ChangCJ,YangWJ,etal.HepatitisBvirusXproteinenhancesandrogenreceptor-responsivegeneexpressiondependingonandrogenlevel.ProcNatlAcadSciUSA2007;104:2571-2578.),C/EBP(16.ChoiBH,ParkGT,RhoHM.InteractionofhepatitisBviralXproteinandCCAAT/enhancer-bindingproteinalphasynergisticallyactivatesthehepatitisBviralenhancerII/pregenomicpromoter.JBiolChem1999;274:2858-2865.)。另一个重要的发现是,HBx能够影响线粒体的钙离子释放,该过程是HBV复制所需的关键环节(17.BouchardMJ,WangLH,SchneiderRJ.CalciumsignalingbyHBxproteininhepatitisBvirusDNAreplication.Science2001;294:2376-2378.),由于钙离子是多种细胞中一种重要的信号分子,所以HBx成为介导HBV与宿主细胞相互作用的关键分子(18.NassalM.Ca2+:thecluetohepatitisBvirusXproteinfunction?Hepatology2002;36:755)。
综上,HBx是HBV病毒一种重要的功能调控蛋白,与乙型病毒性肝炎病程以及乙肝相关肝癌的发生、发展及耐药复发有密切联系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗乙肝病毒HBx单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的重组蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以及该单克隆抗体的应用。
本发明研究发现在HBx转基因小鼠DEN诱癌模型中,HBx蛋白可以诱导肝前体细胞的成瘤能力(19.ChaoWetal.HepatitisBVirusX(HBx)InducesTumorigenicityofHepaticProgenitorCellsin3,5-Diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine-TreatedHBxTransgenicMice.JHepatol.2012)。该研究还发现在肝癌患者样本中,HBx的表达与肝癌前提细胞的比例呈现正相关,提示HBx可能与乙肝相关肝癌患者的进展及耐药性及预后密切相关。
因此,本发明进一步设想应用HBx的单克隆抗体特异识别反映出乙型病毒性肝炎或者与乙肝相关肝癌患者组织样本中HBx的本底表达水平,就能对患者的病情预后作出预判分析,阻断HBx的作用就有可能对那些肝脏HBx表达水平较高的患者起到个性化的治疗效果。
本发明的第一方面提供了一种用于制备HBx单克隆抗体的多肽(重组蛋白),其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
MAARVCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLSSPSSSTVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLAAMTTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA(SEQIDNO:1)
本发明按照上述氨基酸序列构建了原核表达质粒,在pET28a(+)中进行表达,纯化后得到了重组蛋白,用于制备HBx的单克隆抗体。
本发明的第二方面,提供了一种抗乙肝病毒HBx单克隆抗体,是由保藏编号为CCTCCNo:C2014206的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明提供了一种杂交瘤细胞株,其保藏编号为CCTCCNo:C2014206。
本发明的杂交瘤细胞株,命名为Hyb-αX336.54。
本发明的第三方面,提供了一种如上述所述的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体(鼠抗乙肝病毒HBx单克隆抗体)的制备方法,该方法的步骤如下:
a)重组表达如SEQIDNO:1所示的蛋白;
b)将上述蛋白作为免疫原免疫小鼠;
c)取免疫鼠的脾细胞融合;
d)经多轮筛选出合成多肽反应阳性的细胞克隆,作为抗乙肝病毒HBx单克隆抗体的杂交瘤细胞株;
e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体,将腹水进行纯化,得到抗乙肝病毒HBx的单克隆抗体。
所述的步骤a),针对HBx的编码框氨基酸全序列设计并合成引物进行PCR克隆,获得HBx的全长序列,序列如SEQIDNO:2所示。
将上述PCR得到的cDNA片段导入pET28a(+)重组载体中,将该载体转化BL21(DE3)经诱导、裂解、纯化后得到重组HBx蛋白(如SEQIDNO:1所示)。
所述的步骤b),将上述重组蛋白分别与弗氏佐剂混合,作为免疫原免疫小鼠。
所述的步骤c),取免疫鼠的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合;与小数的骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合,经筛选后即可获得杂交瘤细胞。
本发明的杂交瘤细胞株,也称杂交瘤细胞系Hyb-αX336.54(即保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期2015年1月24日,保藏编号CCTCCNo:C2014206),所制备的单克隆抗体是一种免疫球蛋白,可特异性结合乙肝病毒HBx蛋白。
本发明的第四方面,提供了一种如上所述的用于制备抗乙肝病毒HBx单克隆抗体的多肽(重组蛋白)、抗乙肝病毒HBx单克隆抗体、分泌抗乙肝病毒HBx单克隆抗体的杂交瘤细胞株的应用。
具体是在制备检测乙型病毒性肝炎(乙型病毒性肝炎患者样本中HBx表达)的试剂或试剂盒中的应用。
或者是在制备检测与乙肝相关肝癌(特别是HBx稳定整合的肝细胞癌样本中HBx表达)预后判别的试剂或试剂盒中的应用。
所述的检测乙型病毒性肝炎或与乙肝相关肝癌预后判别的试剂或试剂盒,优选WesternBlot或免疫组织化学的试剂或试剂盒。
本发明为乙型病毒性肝炎或与乙肝相关肝癌样本中HBx表达提供了新的检测方法,也为HBx的临床个性化治疗应用提供了新的思路。
附图说明
图1.是单克隆抗体WesternBlot检测乙肝病毒HBx蛋白的扫描图;其中,泳道1为转染pcDNA3.1的细胞裂解液(30μg),泳道2为转染pcDNA3.1A-HBx的细胞裂解液(30μg)。
图2.是ABCAM公司商业化HBx抗体的多克隆抗体WesternBlot检测乙肝病毒HBx蛋白的扫描图;其中,泳道1为转染pcDNA3.1的细胞裂解液(30μg),泳道2为转染pcDNA3.1A-HBx的细胞裂解液(30μg)。
图3是用单克隆抗体免疫组织化学检测小鼠转移瘤中HBx蛋白的图片;其中,a为定殖于小鼠肺的肝转移瘤;b为正常小鼠肺组织。
本发明的杂交瘤细胞株,命名为Hyb-αX336.54,保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),地址:中国武汉武汉大学,保藏日期2015年1月24日,保藏编号CCTCCNo:C2014206。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1.抗乙肝病毒HBx的单克隆抗体的重组蛋白的制备
1.原核表达载体的构建
HBx有154个氨基酸,根据其cDNA序列信息委托百奇生物科技(上海)有限公司设计了PCR引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示:
上游引物:CCGGAATTCATGGCTGCTAGGGTATG(SEQIDNO:3)
下游引物:CCGCTCGAGGGCAGAGGTGAAAAAG(SEQIDNO:4)
PCR获得HBx的cDNA序列如SEQIDNO:2所示,通过分子克隆的方式将HBx的cDNA克隆到表达载体pET28a(+),目的基因和载体分别进行EcoRI和XhoI双酶切后,用T4DNA连接酶进行连接,16℃连接4h,转化DH5α。取菌落PCR阳性克隆测序,将序列100%匹配的质粒进行表达。方法可参见J·萨姆布鲁克等著,金冬雁等译《分子克隆实验指南(第二版)》工具书。
重组蛋白的表达与纯化
将序列100%匹配的质粒转化BL21(DE3),取单菌落接种25mlLB培养基中并加入相应抗生素。37℃过夜培养,取过夜的菌液按1:100接种至1L的LB液体培养基中,37℃培养至OD值>0.6,然后加入0.5mM的IPTG诱导4h,收集菌液。将菌液用细菌裂解液裂解后离心。收集沉淀用含8M尿素的BindingBuffer溶解沉淀,离心取上清。上清用Ni-NTA柱子纯化,最后的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。
实施例2.抗乙肝病毒HBx的单克隆抗体的制备和纯化
1.抗原的纯化
抗原采用原核重组蛋白,由百奇生物科技(上海)有限公司通过分子克隆、原核诱导表达、纯化后获得。方法如实施例1所示,重组蛋白序列如SEQIDNO:1所示。
2.单克隆抗体的制备和纯化
将上述1中纯化的重组蛋白100μg以PBS稀释后与等体积完全弗氏佐剂(CFA)混匀乳化,免疫5-6周龄的雌性BALB/c小鼠5只,双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后双腿进行肌肉注射,每个区域大约用1/8的免疫原,将剩余免疫原的1/2进行腹腔注射。2周后加强免疫50μg,完全弗氏佐剂,腹腔注射。4周后加强免疫50μg,不完全弗氏佐剂(IFA),腹腔注射。6周后加强免疫50μg,不完全弗氏佐剂(IFA),腹腔注射。第7周时尾静脉采血,ELISA测定效价,应用多重组抗原1.25μg/ml包被,10%FCS封闭,将血清稀释后加入,应用羊抗小鼠IgG标记HRP作为二抗,OPD显色,使用酶标仪(Bio-Rad550型)在492nm读数。
采血的ELISA结果OD值均大于1.0。取转染了乙肝病毒HBx蛋白表达载体质粒的细胞系293T1×106个,用细胞裂解液裂解后,常规WesternBlot检测。
在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(购自ATCC)。最后一次加强免疫3天后,取WesternBlot和免疫组化检测效果最好的小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞比例5:1,在PEG1500的作用下进行融合反应,植入96孔板,37℃、5%CO2条件下培养。培养14天后,镜下检测生长出克隆细孔为融合阳性孔,计算总融合率>95%。尽量选择单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测。ELISA阳性的克隆用WesternBlot和免疫组化检测,筛选出来的克隆亚克隆两次,每次WesternBlot和免疫组化检测效果最好的克隆。筛选得到3个克隆。
得到的杂交瘤细胞株:Hyb-αX336.54,即保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期2015年1月24日,保藏编号CCTCCNo:C2014206。
6-8周龄的雌性BALB/c小鼠用石蜡油腹腔注射10天后,取杂交瘤细胞以2×106个细胞/只进行腹腔注射。7-14天后从小鼠腹腔抽出富含抗体的腹水进行检测和纯化。纯化采用ProteinG亲和层析法。ProteinG亲和层析柱用PBS平衡柱子后取腹水过柱,然后用PBS洗柱至OD值接近零,以50nmol/L的甘氨酸盐酸溶液洗脱,收集洗脱液,测定各收集管的OD值,保留峰值区的洗脱液,透析纯化。
实施例3.抗乙肝病毒HBx的单克隆抗体的鉴定和检测应用
1.单克隆抗体的鉴定
(1)抗体效价鉴定
将抗原(4μg/ml)包被ELISA板,将纯化的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体按1:1000,1:2000,1:4000,1:8000,1:16000,1:32000,1:64000进行稀释,加入酶标板孔内,选用商业化HBx抗体(1mg/ml1:8000用牛奶稀释)作为系统操作的阳性对照,5%牛奶作为阴性对照。反应后加入羊抗鼠IgG-HRP,显色。阳性判定标准:样品检测孔OD450与阴性对照孔OD450之比(P/N)≥2.1,结果表明抗体效价大于64000(表1)。
表1抗体效价鉴定表
抗体(ug/ml) | 1/1000 | 1/2000 | 1/4000 | 1/8000 | 1/16000 | 1/32000 | 1/64000 | - | + |
OD值 | 4.2 | 3.995 | 4.181 | 4.2 | 3.727 | 2.504 | 2.119 | 0.104 | 2.955 |
(2)亚型鉴定
委托百奇生物科技(苏州)有限公司对本发明所得到的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体进行亚型鉴定,其亚型鉴定结果表明,单克隆抗体为IgG2b亚型,轻链为κ链,结果见表2
表2抗体亚型鉴定表
亚型 | Hyb-αX336.54 |
IgG1 | 0.074 |
IgG2a | 0.087 |
IgG2b | 2.026 |
IgG3 | 0.15 |
IgM | 0.084 |
IgA | 0.085 |
Igκ | 1.761 |
Igλ | 0.08 |
(3)单克隆抗体的WesternBlot检测应用
变性的蛋白样品进行SDS-PAGE蛋白电泳;通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Schleicher&Schell公司);含0.5%BSA的TBST封闭1h,TBST洗一次,5min;含0.5%BSA的TBST稀释抗HBx单克隆抗体一抗(1μg/ml)或者ABCAM公司货号为Ab39716兔多克隆抗体(1:1000),孵育2h,TBST洗三次,每次5min;含0.5%BSA的TBST稀释IR-800标记的抗小鼠二抗,孵育1h,TBST洗四次,每次5min;用红外线激光扫描仪Odyssey扫描。结果可见单克隆抗体可以特异性识别表达HBx蛋白的细胞裂解液中HBx蛋白,而ABCAM的多克隆抗体在对照组中和表达HBx蛋白的样本中均有杂带,特异性较差。(图1、图2所示)。
结果说明:本发明的单克隆抗体能很好地识别乙肝病毒HBx分子,较现有多克隆抗体有更好的特异性和敏感性。
(4)单克隆抗体的免疫组织化学检测应用
用稳定表达HBx全长的SMMU-7721细胞系尾静脉注射构建小鼠肝细胞癌肺转移模型。待肺转移肿瘤形成后,取转移瘤进行石蜡包埋切片后用单克隆抗体进行免疫组织化学染色检测HBx蛋白。切片置于60℃恒温箱中烘烤20分钟并脱蜡;3%H2O2(80%甲醇)室温10分钟灭活内源性过氧化物酶,PBS洗3次各5分钟。0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)高压修复抗原,PBS洗3次各5分钟;山羊血清封闭,室温20分钟,甩去多余液体;滴加以抗体稀释液稀释的抗HBx单克隆抗体一抗(10μg/ml),室温孵育2h,PBS洗3次各5分钟;滴加HRP标记的二抗50μl,室温孵育1h,PBS洗3次各5分钟;DAB显色5-10分钟,在显微镜下掌握染色程度,PBS洗3次各5分钟;苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化,自来水冲洗10-15分钟;脱水、透明、封片、拍照。结果见图3。结果表明,在阳性组织(小鼠肺的肝转移瘤,图中a)中该单克隆抗体能较为特异地识别HBx分子,但在阴性对照组织(正常小鼠肺组织,图中b)中,该单克隆抗体未检测到信号,说明该单克隆抗体的敏感性和特异性均较好。说明该单克隆抗体或可以用于检测肝癌组织中的HBx,从而对肝癌病人的病情预后进行评估。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (12)
1.一种抗乙肝病毒HBx单克隆抗体,是由保藏编号为CCTCCNo:C2014206的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.一株杂交瘤细胞株,其保藏编号为CCTCCNo:C2014206。
3.一种如权利要求1所述的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体的制备方法,该方法的步骤如下:
a)重组表达如SEQIDNO:1所示的蛋白;
b)将上述蛋白作为免疫原免疫小鼠;
c)取免疫鼠的脾细胞融合;
d)经多轮筛选出与重组蛋白反应阳性的细胞克隆,作为抗乙肝病毒HBx单克隆抗体的杂交瘤细胞株;
e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体,将腹水进行纯化,得到抗乙肝病毒HBx的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体的制备方法,其特征在于:所述的步骤a),针对HBx的编码框氨基酸全序列设计并合成引物进行PCR克隆,获得HBx的全长序列,序列如SEQIDNO:2所示;将cDNA片段导入pET28a(+)重组载体中;将该载体转化BL21(DE3)经诱导、裂解、纯化后得到重组蛋白。
5.根据权利要求3所述的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体的制备方法,其特征在于:所述的步骤b),将上述重组蛋白分别与弗氏佐剂混合,作为免疫原免疫小鼠。
6.根据权利要求3所述的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体的制备方法,其特征在于:所述的步骤c),取免疫鼠的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合。
7.一种如权利要求1所述的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体在制备检测乙型病毒性肝炎或与乙肝相关肝癌预后判别的试剂或试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体在制备检测乙型病毒性肝炎、与乙肝相关肝癌样本中HBx表达,以及病情预后评估的试剂或试剂盒中的应用。
9.一种如权利要求2所述的杂交瘤细胞株在制备检测乙型病毒性肝炎或与乙肝相关肝癌预后判别的试剂或试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述的杂交瘤细胞株在制备检测乙型病毒性肝炎、与乙肝相关肝癌样本中HBx表达,以及病情预后评估的试剂或试剂盒中的应用。
11.一种如权利要求1所述的抗乙肝病毒HBx单克隆抗体在制备WesternBlot或免疫组化试剂或试剂盒中的应用。
12.一种如权利要求2所述的杂交瘤细胞株在制备WesternBlot或免疫组化试剂或试剂盒中的应用。
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