CN103555668A - 杂交瘤细胞株及其产生的抗Wnt5a单克隆抗体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞株及其产生的抗Wnt5a单克隆抗体与应用，具体而言，本发明通过分子克隆和单克隆抗体技术，筛选了一株可分泌特异识别wnt5a的单克隆抗体的杂交瘤细胞株Wnt5a。由杂交瘤细胞株Wnt5a所分泌的单克隆抗体可用于人体骨髓和血液中白血病变的临床检测。

Description

杂交瘤细胞株及其产生的抗Wnt5a单克隆抗体与应用

技术领域

本发明涉及免疫化学、肿瘤生物学和细胞生物学领域。具体而言，本发明涉及制备一种与人体细胞增殖、分化、黏附和迁移过程有关的分泌蛋白wnt5a，相结合的单克隆抗体的杂交瘤；由该杂交瘤产生的抗wnt5a单克隆抗体及其相应产品可应用于人白血病的诊断试剂或相关领域。

背景技术

白血病是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤，约占肿瘤总发病率的3%左右。我国白血病患者约为3～4人/10万人口，小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高，每年至少以3万到4万的速度增加。

目前，世界上治疗白血病的主要方法是化疗、骨髓移植和靶向治疗等几种。从医学角度看，至今白血病的治疗没有一种完全有效的手段，尤其是容易复发。目前试验室诊断白血病最完善的方法是WHO制定的MICM分型诊断法，即细胞形态学（Morphology），免疫学（Immunology），细胞遗传学（Cytogenetic）和分子生物学（Molecular biology）检查方法，目前主要包括：外周血和骨髓显微镜下形态；单克隆抗体鉴别细胞表面分化标记；染色体检查；基因诊断等。其中骨髓细胞形态学检查仍为最经典最可靠的方法，但要准确分型诊断还需辅以其它方法，即ICM方法。在白血病疗效和预后的判别方面也常以外周血和骨髓形态学检查结果为标准，但该方法结果判断存在主观误差，检验者判断个体差异大，不便标准化；并且细胞形态学改变总落后于基因水平和蛋白质水平的改变，故不利于早期诊断；骨髓标本采集有创伤性在监控白血病疗效和预后判断时，需反复抽取病人骨髓进行前后对照检查，给病人造成很大痛苦，并且技术要求高，取材不便，每次抽取也存在部位差异，不能真实的反应病人的病情变化。寻找新的可作为诊断白血病的标志物、对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后的评价具有较高应用价值。

Wnt5a是Wnt蛋白家族成员之一，是一种分泌性蛋白，在细胞增殖、分化、黏附和迁移中发挥作用。它不但与胚胎发育有关，它的异常表达与肿瘤发生有关，但在不同肿瘤中，Wnt5a表达失调不一致。如在人类胰腺癌、胃癌、肺癌、黑素瘤中过表达，在体外促进肿瘤细胞增殖和迁移，表现出癌基因的活性。而在甲状腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌和血液肿瘤中，Wnt5a表达下调或缺失，表现出抑癌基因的活性。综合已有的研究，导致Wnt5a抑癌和抗癌“两面性”的原因至少有三方面：1、Wnt信号是多通路、多受体、多转录因子的开放式途径，决定了其作用机制的复杂性。2、肿瘤存在高度异质性，Wnt5a在不同肿瘤或不同组织类型中发挥不同功能。3、Wnt5a介导的信号有细胞特异性，即Wnt5a与不同细胞表面表达的不同受体组合，转导不同信号，发挥不同生理功能。Wnt5a在肿瘤发生中的作用和机理仍不清楚。目前有研究发现：Wnt5a主要激活非经典Wnt信号通路发挥作用，在发育的组织、骨髓基质细胞和造血细胞中有表达，可促进造血干/祖细胞分化发育。

Wnt5a与白血病的研究报道不多，发明人曾以半定量RT-PCR检测白血病和治疗缓解病例中Wnt5a表达，其表达阳性率：急性髓细胞白血病AML和慢性髓细胞白血病CML为10%（5/50），急性淋巴细胞白血病ALL和慢性淋巴细胞白血病CLL为7.7%（1/13），而经治疗缓解的髓细胞白血病病例为62.50%，缓解的淋巴细胞白血病病例为71.4%，正常人为88.9%（24/27）。显示Wnt5a在髓细胞白血病和淋巴细胞白血病中均有表达缺失或下调，而在治疗缓解病例中则表达恢复并接近正常人水平。

综上所述，Wnt5a可作为分子标志物应用于诊断白血病的新肿瘤标志物、评价治疗效果的良好指标、筛选抗肿瘤药物的良好靶标，也是基因治疗的新靶点，对肿瘤防治具有重要的理论意义和潜在的应用价值。因此，一种高特异性和灵敏度的Wnt5a抗体是生产临床诊断试剂所必需的。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能专一性针对Wnt5a的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其制备方法。

本发明所述的杂交瘤细胞株，其保藏号为：CCTCC C2013112。

本发明还提供由上述的杂交瘤细胞株分泌产生的抗Wnt5a的单克隆抗体。

本发明所述的单克隆抗体可以用于制备检测人外周血细胞系和骨髓中wnt5a的表达差异的制剂，用于制备检测人外周血细胞系和骨髓中wnt5a的免疫印迹试剂，或用于制备检测人体骨髓和血液中白血病变制剂，或用于制备检测人白血病的诊断试剂。

本发明还提供上述的杂交瘤细胞株的制备方法，主要包含步骤：

1）以人脐带血有核细胞的总RNA为模板，根据SEQ ID NO:1所示的Wnt5a序列设计引物序列，扩增获得目的Wnt5a抗原序列；

2）将所述目的Wnt5a抗原序列酶切后与原核表达载体连接后诱导表达Wnt5a抗原蛋白；

3）根据表达的Wnt5a抗原蛋白合成多肽SEQ ID NO:4-9，并分别偶联KLH；

4）将偶联后的多肽免疫小鼠；

5）吸取骨髓瘤细胞悬液和来源于偶联后的多肽免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞悬液进行细胞融合；

6）培养融合后的细胞，测杂交瘤效价，筛选阳性细胞株，获得所述杂交瘤细胞株。

本发明人通过原核表达该蛋白，免疫Balb/c小鼠并经过融合、克隆筛选、制备腹水、亲和层析技术纯化腹水获得了鼠源单克隆抗体。免疫印迹试验检测八组白血病病人骨髓细胞中及六种髓系白血病细胞系中Wnt5a的表达情况的试验显示：在所有的八组白血病病人骨髓细胞和白血病细胞系中，Wnt5a在正常组织中全部高表达，在肿瘤细胞中基本不表达。当以正常组织中Wnt5a的表达作为阳性对照时，6种特定肿瘤细胞系中均无Wnt5a的表达。

本发明的杂交瘤细胞株Wnt5a分泌产生的单克隆抗体，为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。该抗体不仅与重组的Wnt5a抗原具有极强的特异性和敏感性，而且与人体组织细胞和外周血中的Wnt5a有极强的特异性和敏感性。本发明中杂交瘤细胞株Wnt5a产生的单克隆抗体可应用于免疫印迹，免疫荧光和免疫组化等免疫学试验技术中。而且，以本发明中的杂交瘤细胞株Wnt5a单克隆抗体为主体制作的白血病标志物诊断试剂将对白血病的早期诊断和治疗监测有较好的应用前景。本发明中杂交瘤细胞株Wnt5a分泌的单克隆抗体可应用于研究亚细胞定位，蛋白相互作用等信号通路的科学研究中。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1表示纯化后的wnt5a单克隆抗体纯度。

图2表示本发明单克隆抗体进行免疫印迹实验检测八对白血病组织中及六种白血病细胞系中Wnt5a的表达情况的实验结果。实验结果可见Wnt5a在所有的正常组织中高表达，在肿瘤组织中基本不表达，当以正常组织中白血病的表达作为阳性对照时，在6种白血病细胞系中均无Wnt5a的表达。

图3A至图3C表示采用本发明的单克隆抗体进行免疫组化实验检测白血病配对组织中的表达的实验结果。具体可见Wnt5a在正常组织中高表达，但在白血病组织中低表达或不表达。其中图3A是健康人和髓系白血病的对照，图3B是20例髓系标本IHC实验结果，图3C是10例健康人组织标本IHC实验结果。

具体实施方式

实施例1：Wnt5a抗原的制备

Wnt5a抗原是以人脐带血有核细胞的总RNA为模板，根据Wnt5a序列(SEQID NO:1)设计引物序列，引物两端连入EcoR I和Sal I酶切位点

上游引物:（SEQ ID NO:2）

5'-CCGGAATTCATGAAGAAGTCCATTGGAATATTAAG-3'

下游引物:（SEQ ID NO:3）

5'-ACGCGTCGACCTACTTGCACACAAACTGGTCC-3'

RT-PCR扩增出去除Wnt5a信号肽序列的基因（PCR参数：42℃2小时，95℃5min；94℃5min；58.8℃30s；72℃60s，共35个循环；72℃后延伸5分钟）经Sal I和EcoR I（Takara购买）双酶切后与原核表达载体pET-42a(+)连接，转化感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆提取质粒进行测序（英骏公司），验证序列无误。选择测序正确的阳性菌，经LB培养基在终浓度1mmol/L IPTG条件下，37℃160rpm诱导表达4小时。收集菌体，经超声破碎后4℃4000rpm离心15min后，弃沉淀后再4℃12000rpm离心20min，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果显示表达的产物为可溶性蛋白。

大量培养细菌后进行诱导表达，提取Wnt5a蛋白经Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，50mM咪唑洗脱Wnt5a蛋白，SDS-PAGE电泳，切取条带进行MALDI-TOF/TOF鉴定，证实表达产物为Wnt5a。

实施例2：抗Wnt5a杂交瘤的制备

1.多肽合成与偶联

合成多肽，共6条；通过软件分析wnt5a蛋白序列，选取6段特异性表位，每段10-20个氨基酸左右（中科亚光合成）。

合成6条多肽：

A1（SEQ ID NO:4）：LGMNNPVQMSEVYIIGAQPLC

A2（SEQ ID NO:5）：HLYQDHMQYIGEGAKTGIKEC

A3（SEQ ID NO:6）：CSRAARPKDLPRDWLWGG

A4（SEQ ID NO:7）：NSRFNSPTTQDLVYIDPSPDYC

A5（SEQ ID NO:8）：CSQLAGLSQGQKKL

A6（SEQ ID NO:9）：GRGYDQFKTVQTERC

每条多肽分别偶联至血蓝蛋白KLH，偶联方式为SULFO-GMBS。

2.动物免疫

分别偶联KLH后，把A1；A2；A5混合免疫；混合免疫3只小鼠；A3；A4；A6分别单独免疫3只小鼠；抗原浓度3mg/ml，免疫缓冲剂为8M尿素。选取12只6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠免疫。抗原乳化选用双注射器互推法。首次免疫时，将Wnt5a与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合，每只小鼠按60μg Wnt5a的量皮内多点加腹腔注射。第28和第42天分别进行第二次第三次免疫，佐剂改用不完全弗氏佐剂，注射体积和途径不变，剂量改为30μg.第3次免疫后间接ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg Wnt5a，3天后进行细胞融合。

3.细胞融合

融合前将PEG1500置于37℃培养箱中预温，吸取1×10⁷个sp2/0骨髓瘤细胞悬液和1×10⁸个来源于SPF级Balb/c小鼠脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1:10)至一个50m1离心管中，补加30m1IMDM不完全培养基，充分混匀，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50%PEG1500(Roche)溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在l min左右加完，然后静置90s，逐滴加入37℃预温的不完全培养基IMDM8ml终止融合，2min之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5min，取出离心管，1000rpm离心5min，弃去上清，加入10ml HAT(SIGMA)培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，按100μl/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃，5%CO₂培养箱中培养。

4.挑克隆

融合后第5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100μl，第10天可用间接ELISA法测杂交瘤效价，第14天换HT(SIGMA)培养基（含饲养细胞和1%HT液体）的96孔板中。放入5%CO₂细胞培养箱。

5.筛选

a.一筛：挑克隆后3天左右，观察细胞量大约占底面积2/3时，取100μL上清ELISA筛选。阳性克隆进行换液，添加200μL完全培养基（含1%HT液体）。

b.二筛：2天后重复步骤a进行二次筛选。阳性株转入预先准备好培养基（含饲养细胞和1%HT液体）的24孔板。

c.三筛：5天后，用含标签His的其它重组蛋白包板，取100μL上清ELISA筛选。符合要求的克隆转入6孔板或细胞培养瓶扩大培养。

6.细胞冻存

对数生长期细胞占满底面积80％左右即可冻存。收集上清且去除死细胞等杂质，上清存于-20℃。直接将冻存细胞放4℃半小时，然后放-20℃两小时，转-80℃冻存过夜，次日放液氮罐。

7.杂交瘤细胞株保存：发明人将符合要求的克隆：杂交瘤细胞株Wnt5a，于2013年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏号为CCTCC NO:C2013112。

实施例3：由保藏号为CCTCC C2013112的杂交瘤细胞系制备抗Wnt5a单克隆抗体

发明人将杂交瘤细胞株Wnt5a用于制备鼠抗Wnt5a单克隆抗体，具体操作步骤如下：

1.细胞复苏

从-80℃冰箱或液氮罐中迅速取出冻存管；迅速放入37℃水浴锅中快速搅动，使冻存液在2分钟内全部融化成液体。往15mL离心管中加入3mL血清培养基，将冻存液吸入离心管，1500转/分钟，离心5分钟。弃上清，用完全培养基悬起细胞，培养于6孔板（3mL）或瓶（5mL）中。

2.腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起；计数大约5×10⁵，1mL。悬浮的细胞腹腔注射SFP级，状态良好的6周龄的成年BALB/c雌性小鼠，一般7-10天后便可收集腹水。第一次可收集3mL左右，每隔2、3天可重复取，最终可收集8mL/只。每次取出的腹水4000转/分钟，离心10分钟；中间为腹水。小心吸出腹水收集于离心管中，4℃保存。

3.单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF（GE Healthcare，17-5079-01）亲和层析柱纯化单克隆抗体。

将腹水在4℃条件下，10000转/分钟离心10分钟,去除脂类物质。离心后吸取上清，并用偶联缓冲液以1：3（腹水:偶连液）稀释，用0.45μm膜过滤。滤液上样到偶联缓冲液平衡过的层析柱。用偶联缓冲液洗过柱子后，用洗脱缓冲液洗脱抗体，收集于事先装有中和液的收集管中。结果经SDS-PAGE显示纯度>90%（图1）。

实施例4：ELISA法鉴定单克隆抗体亚类

1.实验操作

用100mM PBS（pH7.4）稀释包被羊抗鼠IgG(中杉金桥)稀释至0.5μg/mL，每孔加100μL，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05%Tween的PBS(PBST）洗3次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1小时。倾空液体，用PBST清洗3次。每孔加入0.1mL杂交瘤上清，37℃孵育1小时。倾空液体用PBST清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体0.1mL每孔，分别加入适当的孔中，37℃用孵育1小时。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μL底物溶液，10-20分钟内测405nm波长下的OD值。

2.实验结果

实验结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2a型鼠源单克隆抗体。

实施例5：ELISA法测定单克隆抗体亲和常数

1.实验步骤：

包被免疫用重组Wnt5a，包被浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜，1×PBST洗3次。每孔加200μL封闭液（2%脱脂奶粉in PBS）37℃封闭2小时，1×PBST洗3次。抗Wnt5a单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1小时，1×PBST洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗(中杉金桥1：2500稀释)1：20000稀释，每孔100μL，37℃孵育1小时，1×PBST洗3次。显色液100μL/孔，显色10分钟，终止液(0.5M硫酸)50μL/孔终止反应。用酶标仪测定吸光值。

2.数据分析：找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。

150000为单个IgG抗体平均分子量值，抗体原始浓度单位为mg/mL。

3.结果：本发明单克隆抗体的亲和常数为3.45×10⁸。

实施例6：本发明的抗Wnt5a单克隆抗体的用途验证-免疫印迹法（WB）

本发明人进一步应用免疫印迹法WB测定Wnt5a在正常人外周血和6种白血病病人外周血中的蛋白表达。

1.实验步骤：

白血病病人外周血中有核细胞裂解液20μg样本上样于12%SDS-PA GE胶；电泳结束后，将胶在1×转移液中浸泡10分钟；PVDF膜甲醇处理后350mA，转膜70分钟；将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST封闭液中37℃封闭1小时；抗Wnt5a单克隆抗体（1：1000稀释）37℃孵育1小时或者4℃孵育过夜；相应羊抗鼠二抗（中杉金桥，1：2500稀释）室温孵育1小时；用ImageQuant ECL仪器曝光。

2.实验结果：

请参照图2，Wnt5a正常组织中全部高表达，在所有的八组白血病病人骨髓细胞中及六种髓系白血病细胞系中（标本来源于中国人民解放军第三军医大学第二附属医院血液科），基本不表达或低表达。当以正常组织中Wnt5a的表达作为阳性对照时，八组白血病病人骨髓细胞中及六种髓系白血病细胞系均无Wnt5a的表达。

实施例7:本发明的抗Wnt5a单克隆抗体的用途验证-免疫组化（IHC）

1.材料来源：

本发明具体实施方式所用白血病人骨髓标本来源于中国人民解放军第三军医大学第二附属医院血液科。样本取材是经新鲜骨髓标本收集有核细胞后均匀涂抹于防脱载玻片上，自然干燥后固定。标本均经病理证实，并有患者知情同意书。

2.实验步骤：

4%甲醛4℃固定30min，经PBS混匀洗片后，PBS浸泡5min。再用0.3%H₂O₂去离子水室温孵育5-10min,然后PBS洗3次×5分钟；5%脱脂奶粉，37℃封闭2小时；抗Wnt5a单克隆抗体（1：2000稀释），湿盒孵育4℃过夜；滴加羊抗鼠二抗（中杉金桥，PV-6002），室温孵育30分钟；DAB-H₂O₂（中杉金桥，ZLI-9031）显色，镜下控制3-5分钟，PBS漂洗，终止显色；苏木素（中杉金桥，ZLI-9040）复染45秒，然后1%盐酸酒精分化；自来水冲洗；80%、95%和100%乙醇脱水各2分钟，二甲苯透明，中性树胶封片。

3.实验结果：

请参照图3A至图3C，对免疫组化实验结果进行统计分析表明，在20例髓系白血病病例骨髓有核细胞中阴性或弱阳性表达(图3B)，Wnt5a在15例健康人骨髓有核细胞中全部强阳性表达（+++）(图3C)，p值小于0.01。即Wnt5a在正常组织中高表达，但在髓系白血病病例骨髓有核细胞中低表达或不表达。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞株，其保藏号为：CCTCC NO:C2013112。

2.一种抗Wnt5a的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测人外周血细胞系和骨髓中wnt5a的表达差异的制剂中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测人外周血细胞系和骨髓中wnt5a的免疫印迹试剂中的应用。

5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测人体骨髓和血液中白血病变制剂中的应用。

6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测人白血病的诊断试剂中的应用。

7.一种权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包含步骤：

1）以人脐带血有核细胞的总RNA为模板，根据SEQ ID NO:1所示的Wnt5a序列设计引物序列，扩增获得目的Wnt5a抗原序列；

2）将所述目的Wnt5a抗原序列酶切后与原核表达载体连接后诱导表达Wnt5a抗原蛋白；

3）根据表达的Wnt5a抗原蛋白合成多肽SEQ ID NO:4-9，并分别偶联KLH；

4）将偶联后的多肽免疫小鼠；

5）吸取骨髓瘤细胞悬液和来源于偶联后的多肽免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞悬液进行细胞融合；

6）培养融合后的细胞，测杂交瘤效价，筛选阳性细胞株，获得所述杂交瘤细胞株。

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