CN104714032A - 用于产后子痫诊断的标志物及其检测试剂 - Google Patents

用于产后子痫诊断的标志物及其检测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于产后子痫诊断的标志物，所述标志物为WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种或两种的组合，并公开了一种用于产后子痫临床诊断的试剂，包括抗WNT4抗体和抗WNT5A抗体中的一种或两种、HRP rabbit anti-goat抗体，以及抗β-actin抗体。本发明制备的检测试剂，具有敏感性强、特异性高等优点，可广泛用于产后子痫的初步调查和健康普查，为临床诊断提供可靠依据。

Description

用于产后子痫诊断的标志物及其检测试剂
技术领域
本发明涉及一种用于产后子痫诊断的标志物及其检测试剂。
背景技术
子痫是指孕妇妊娠晚期或临产时或新产后，眩晕头痛，突然昏不知人，两目上视，手足抽搐，全身强直、少顷即醒，醒后复发，甚至昏迷不醒的疾病，被称为“子痫”，又称“妊娠痫征”。妊娠子痫是由先兆子痫症状和体征加剧发展而来的。子痫可发生于妊娠期、分娩期或产后24小时内，被分别称为产前子痫、产时子痫和产后子痫，是产科四大死亡原因之一。一旦发生，母儿并发症及死亡率明显增加，故应特别重视，紧急处理。孕妇一旦发生子痫，凶多吉少，死亡率极高。
子痫已成为当今全球性的医学社会问题之一，如何有效地实现早期预测和/或诊断仍是非常棘手的问题。目前对于产后子痫的诊断还没有有效的分子。这一方面是由于这些疾病具有很明显的复杂性和异质性，患者的病情轻重、病程急缓、发病早晚以及遗传背景等均会导致临床表征的巨大差异；另一个重要因素是对疾病的发病机制和发生发展基础的认识还非常有限。随着对这些疾病表征认识的不断深入，加之现代生物学技术的飞速发展，妊娠重大疾病的发病机制研究也面临着全新的机遇和挑战。开展相关疾病机理的深入而系统的研究，将发现可用于疾病的预测、诊断、治疗和预后的关键生物靶标分子，这是最大限度地降低妊娠重大疾病造成的母儿危害、提高女性健康水平的重要途径，也将为从生命早期宫内发育的环节上防治糖尿病、高血压等成年慢性疾病提供关键的科学依据。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种用于产后子痫诊断的标志物—WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种或两种的组合。
本发明还提供了一种以WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种或两种的组合为标志物制备的用于产后子痫诊断的试剂。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明以正常妊娠妇女和产后子痫患者的蜕膜组织为材料进行研究，通过免疫组化检测WNT4、WNT5A在蜕膜组织中的表达情况；通过Real-time PCR、Western blot分别检测蜕膜组织中WNT4、WNT5A在mRNA和蛋白质水平的表达量，结果发现，与正常妊娠妇女组相比，产后子痫患者的蜕膜组织中，WNT4、WNT5A在mRNA和蛋白质水平的表达量明显降低，推测这可能会导致蜕膜损伤，进而会引发产后子痫。因此，WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种或两种的组合可以作为产后子痫预防和/或诊断的标志物。
优选的，以WNT4蛋白和WNT5A蛋白的组合作为产后子痫预防和/或诊断的标志物。
一种用于产后子痫临床诊断的试剂盒，包括抗WNT4抗体和抗WNT5A抗体中的一种或两种、HRP rabbit anti-goat抗体，以及抗β-actin抗体。
采用该诊断试剂盒进行产后子痫临床诊断的方法，在孕妇剖宫产分娩出胎盘后，采集蜕膜组织，提取蜕膜组织中的全蛋白，进行凝胶电泳，根据蛋白Marker条带和WNT4、WNT5A及β-actin分子量，切下含有目的蛋白的胶条，放到转移缓冲液中，用以后续转膜；根据切下的待转膜的胶条的大小，剪取适当大小的聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，将PVDF膜放入甲醇中，活化30s；将活化的膜放入三蒸水中清洗2分钟；将膜放入转移缓冲液中，和胶条一起浸泡15分钟进行渗透；渗透完毕后，打开转膜夹，从正极到负极依次按照1层海绵、2层滤纸、PVDF膜、胶条、2层滤纸、1层海绵的顺序铺到转膜夹上；各层都铺放整齐后，将转膜夹扣紧，放到转膜槽中，倒入转移缓冲液，注意缓冲液要没过海绵；接通电源，设定为120mA恒流，转膜50分钟，一定要注意确认电源的正负极，及蛋白是由胶向PVDF膜的方向转移；封闭：转膜结束后，将PVDF膜取出，膜上会有清晰的蛋白Marker条带，然后将膜放入5％的脱脂奶粉中，在摇床上轻摇封闭1.5小时；
一抗孵育：将PVDF膜从封闭液中取出，分别放入所对应的一抗工作液中，用封口机封好后，放入4℃冰箱孵育过夜；
洗膜：第二天早上，将孵育的膜从冰箱拿出，室温下平衡30分钟，然后将PVDF膜放入1×TBST中，轻摇清洗4次，每次15分钟；
二抗孵育：将PVDF膜分别放入所对应的二抗工作液中，室温下在摇床上轻摇孵育1小时，注意：β-actin不需要二抗孵育；
洗膜：二抗孵育结束后，用1×TBST轻摇清洗4次，每次15分钟；
显影：
(1)根据PVDF膜的大小，配制适量的ECL反应液(分为A液和B液)，用移液枪分别吸取等量的A液和B液混匀，约100ulECL反应液/cm2膜，注意避光；
(2)用吸水纸吸干PVDF膜上的液体，然后将膜正面向上放到干净的一次性PE手套上，在膜上滴加配好的ECL反应液，保证反应液将膜完全覆盖，避光反应约3分钟左右，期间可将膜正反颠倒，保证膜充分接触反应液。
图像结果处理：
(1)将显影得到的蛋白条带图像用Quantiscan软件处理，得到条带的灰度值，即Net Area的读数；
(2)记录所有研究对象WNT4、WNT5A及β-actin条带的灰度值，然后计算目的蛋白与β-actin的灰度值比值。
结果判定：
以阴性蜕膜组织(正常健康妊娠女性的蜕膜组织)为对照，待检测孕妇的蜕膜组织的WNT4蛋白的相对表达量与阴性对照的比值小于0.72，WNT5A蛋白的相对表达量与阴性对照的比值小于0.56，满足上述两个条件之一，即判定为阳性。
本发明的有益效果：
本发明通过检测出WNT4、WNT5A在产后子痫患者蜕膜组织中的低表达，提供了一种新的产后子痫临床诊断的标志物—WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种或两种的组合，进一步的，以该检测标志物制备的检测试剂，具有敏感性强、特异性高等优点，可广泛用于临床类产后子痫初步调查和健康普查，为临床诊断提供可靠依据。
附图说明
图1为WNT4和WNT5A蛋白在两组蜕膜中的表达分布情况,A、C和E为NP组蜕膜组织切片，B、D和F为产后子痫组蜕膜组织切片，褐色显示的是靶蛋白，标数字1的代表放大倍数为200×，标数字2的代表放大倍数为400×，箭头所指为蜕膜细胞；NP，正常妊娠组；NC，阴性对照；标尺＝50μm；SPE，产后子痫组；
图2为WNT4和WNT5A蛋白表达水平实验结果；
图3A为WNT4mRNA水平的表达实验结果；B为WNT5A mRNA水平的表达实验结果。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：用于产后子痫临床诊断标志物的发现与验证
1.1研究对象的选择及分组
本实施例的研究对象均为2014年1月至2015年1月期间，在济南市山东大学齐鲁医院妇产科进行剖宫产手术终止妊娠的女性，共40例。其中包括产后子痫患者(SPE组)20人，作为产后子痫组，该组平均年龄为29.40±1.111，平均孕周为36.78±0.625。正常健康妊娠女性20人，作为正常妊娠组(NP组)，该组平均年龄为28.73±0.639，平均孕周为39.10±0.233。
1.2蜕膜组织标本的采集及处理
1.2.1组织采集：在孕妇剖宫产分娩出胎盘后，用无菌纱布擦拭胎盘附着部位的子宫壁，然后从纱布上取下擦拭下来的组织，用无菌滤纸反复吸净组织上的血液，再放入无菌小瓶中，作好标记，然后迅速放入小型液氮罐中以备带回实验室做进一步处理，整个操作过程要迅速。
1.2.2组织处理：
将组织带回实验室后，从液氮罐里取出组织，保持在冰冻状态下做如下处理：
(1)分出一块约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的组织块放入包埋剂OCT中，然后放回液氮罐保存，用于后续冰冻切片。
(2)迅速分出约80mg组织，放入1mlRIPA裂解液中，并放到-80℃冰箱保存，用于后续提蛋白。
(3)迅速分出约40mg组织，放入1mlTRIzol中，并保存于-80℃冰箱，用于后续提RNA。
1.3 WNT4及WNT5A在蜕膜组织中的表达分布研究
1.3.1试剂材料：
APES，DAB试剂盒，HRP goat anti-rabbit，HRP rabbit anti-goat均购于北京中杉金桥生物科技有限公司；包埋剂OCT购于美国SAKURA Finetek公司；BSA购于Promega公司；Triton X-100购于Amresco公司；抗WNT4抗体，抗WNT5A抗体均购买于美国Santa CruzBiotechnology公司；NaCl，KCl，Na2HP04，KH2PO,30％H2O2，甲醇，无水乙醇，丙酮，二甲苯等均为国产分析纯。
1.3.2溶液配制：
(1)配制10×PBS：分别取NaCl 40.03g，KCl 1.005g，Na2HP047.7g，KH2PO40.95g，加入烧杯中，然后加入三蒸水约400ml，再调节pH到7.4，最后用三蒸水定容至500ml即可。
(2)配制3％Triton X-100：分别取100％Triton X-1002.82ml，PBS 7.28ml，加入小烧杯中，然后置于37℃-40℃水浴锅中水浴2-3h，使其充分混匀，最后加入三蒸水定容至100ml即可，注意要放到4℃冰箱保存。
(3)配制3％H2O2：取30％H2O24ml，再加入甲醇36ml即可。要注意现用现配，且配制时注意避光。
(4)配制5％BSA：取BSA 0.5g，加入10ml的1×PBS，使其充分溶解即可，放入4℃冰箱保存。
(5)配制WNT4一抗工作液：用抗WNT4抗体和1％BSA按1:50比例稀释成一抗工作液，要现用现配。
(6)配制WNT4二抗工作液：用HRP rabbit anti-goat抗体和1％BSA按1:100比例稀释成二抗工作液，要现用现配。
(7)配制WNT5A一抗工作液：用抗WNT5A抗体和1％BSA按1:100比例稀释成一抗工作液，要现用现配。
(8)配制WNT5A二抗工作液：用HRP goat anti-rabbit抗体和1％BSA按1:200比例稀释成二抗工作液，要现用现配。
(9)配制DAB显色液：按照说明书配制即可，要现用现配，配制及使用时要注意避光。
1.3.4冰冻切片及免疫组化处理：
1.3.4.1载玻片的处理
(1)向大烧杯中加入适量的100％酒精，然后将载玻片放入酒精中浸泡4-6小时，以洗净玻片进行后续步骤；
(2)按照APES说明书方法处理载玻片，此处不再赘述。
1.3.4.2组织处理及冰冻切片
(1)用锡箔纸做一个直径约1cm的圆柱形小容器，向其中倒入包埋剂OCT备用；
(2)将从医院取回来的组织从液氮罐里取出，保持在冰冻状态下分出一块约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的组织块，并快速放入OCT中，做好标记，然后放回液氮罐中冰冻保存；
(3)用冰冻切片机切片，厚度为5μm，将切好的片子放到-20℃冰箱保存，用于后续实验。
1.3.4.3免疫组化步骤
(1)选片：将已经切好的片子在-20℃冰箱中放置一天，第二天从中选取几张形态较好的片子进行免疫组化染色；
(2)固定：将选好的片子放入-20℃丙酮，固定10分钟；
(3)清洗：将片子从丙酮中取出，用1×PBS中清洗3次，每次5分钟，注意：PBS清洗第一次时，先反复浸湿几次，使温度平衡；
(4)通透：将清洗后的片子放入0.3％Triton X-100，通透30分钟；
(5)清洗：将片子放入PBS中清洗3次，每次5分钟；
(6)双氧水浸泡：清洗后，将片子放入刚配制好的3％H2O2中，避光浸泡20分钟，以去除内源性的过氧化氢酶；
(7)清洗：操作同(5)；
(8)封闭：将清洗好的片子取出后，用免疫组化笔围绕组织在载玻片上画圈，然后在圈有组织的圆中加入5％BSA覆盖住组织，室温封闭30分钟，注意此过程要保持组织湿润；
(9)一抗孵育：配制WNT4和WNT5A的一抗工作液，取出封闭好的片子，轻轻甩掉片子上的封闭液，在2张片子上分别加入WNT4一抗工作液和WNT5A一抗工作液，在另2张片子上都加上1％BSA，作为阴性对照，将4张片子都做好标记，然后放入4℃冰箱孵育过夜，第二天从冰箱拿出后，室温放置10分钟；
(10)清洗：操作同(5)；
(11)二抗孵育：将WNT4二抗工作液加到WNT4一抗工作液处理的片子及1张作阴性对照处理的片子上，室温孵育2小时；将WNT5A二抗工作液加到WNT5A一抗工作液处理的片子及另1张作阴性对照处理的片子上，室温孵育1小时；
(12)清洗：操作同(5)；
(13)DAB显色：从PBS中取出片子，加入DAB显色液，边染色边观察显色情况；
(14)水洗：正常显色后用自来水轻轻冲洗玻片，将残留的DAB显色液冲洗干净，注意水流要轻，防止把玻片上的组织冲走；
(15)复染：用苏木精染液复染约20s，随后用自来水冲洗，终止染色；
(16)脱水：分别用75％、85％、95％、100％酒精逐级脱水，每级5分钟；
(17)透明：用两级二甲苯逐级透明，每级5分钟，如果将片子放入二甲苯后有水雾现象，说明脱水不彻底；
(18)封片、镜检：在玻片上滴一滴中性树胶，从一端轻轻盖上盖玻片，要防止出现气泡，在光学显微镜下观察染色结果，放到通风处晾干；
(19)拍照、记录：用光学显微镜观察并拍照，做好记录。
WNT4和WNT5A蛋白在两组蜕膜中的表达分布情况见图1，由图1可以看出，WNT4和WNT5A在两组的蜕膜组织中均有表达。比较图1A和B可以看出，相对于NP组，WNT4在产后子痫组中的显色略浅。同样WNT5A在产后子痫组的显色也略浅于NP组(图1C,D)。阴性对照没有着色。
1.4WNT4和WNT5A在蛋白及mRNA水平的表达变化
1.4.1试剂材料：
(一)Western blot所用试剂
抗β-actin抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司；0.45μm PVDF，ImmobilonWestern HRP底物膜均购于美国Millipore公司；脱脂奶粉购于内蒙古伊利实业集团股份有限公司；RIPA裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术公司；5×SDS蛋白电泳上样缓冲液，丽春红购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Tween-20，过硫酸铵(APS)，TEMED，丙烯酰胺(Acr)，甲叉双丙烯酰胺(Bic)均购于北京中生瑞泰科技有限公司；PMSF，SDS,Tris，甘氨酸(Gly)，抗体洗脱液均购于北京索莱宝科技有限公司；蛋白marker购于北京全式金生物技术有限公司。
(二)Real-time PCR所用试剂
TRIzol，快速反转录试剂盒，SuperReal荧光定量试剂盒，Taq DNA聚合酶，6×DNA LoadingBuffer,溴化乙锭均购买于天根生化科技有限公司；引物合成由Invitrogen公司完成；DEPC购买于购于北京索莱宝科技有限公司；dNTPs购于Promega公司；PCR8联管购于无锡国盛生物工程有限公司；氯仿，异丙醇，Na2EDTA·2H2O均为国产分析纯。
1.4.2溶液配制：
(一)Western blot溶液配制
(1)配制10xPMSF(10mM PMSF)：取PMSF 0.174g，加入异丙醇100ml即可，用封口膜封住后放在-20℃冰箱保存。
(2)配制30％Acr溶液：分别取Acr 14.6g，Bic 0.4g，然后加入三蒸水约30ml，放入水浴锅中37℃水浴溶解，充分溶解后加三蒸水定容至50ml，过滤除去不溶物即可，倒入避光容器中，放在4℃冰箱保存，可保存一个月。
(3)配制10％SDS溶液：称取SDS 2.0g，加入三蒸37℃水浴水溶解并定容至20ml即可，要室温保存。
(4)配制10％APS：称取APS 0.01g放入EP管中，加入三蒸水100ul使其溶解即可，要现用现配，注意：APS粉末易潮解，保存是要注意防潮。
(5)配制1.5M Tris-HCl：称取18.171g的Tris，加入50ml三蒸水使其溶解，然后用浓HCl调节pH值至8.8，最后用三蒸水定容至100ml即可，放入4℃冰箱保存。
(6)配制1.0M Tris-HCl：称取12.114g的Tris，加入50ml三蒸水使其溶解，然后用浓HCl调节pH值至6.8，最后用三蒸水定容至100ml即可，放入4℃冰箱保存。
(8)配制5×电泳缓冲液：分别称取Tris 7.6g，Gly 47g，SDS 2.5g，加入烧杯中，然后用三蒸水溶解并定容至500ml即可，放在4℃冰箱，可保存4周左右。使用时稀释。
(9)配制1×转移缓冲液：分别称取Tris 1.5g，Gly 7.2g，加入三蒸水约350ml使其充分溶解，再加入甲醇75ml，最后用三蒸水定容至500ml即可，可在常温保存一周左右，最多可重复使用3次。
(10)配制50×TBS：称取Tris 60.5g，加入400ml三蒸水使其充分溶解，用浓HCl将pH调节至7.5，再用三蒸水定容至500ml，放于室温条件下保存即可。
(11)配制1×TBST：称取NaCl 8g，量取50×TBS 20ml，用移液枪吸取Tween-201ml，再加入三蒸水使其充分溶解混匀，并定容至1000ml，室温保存即可。
(12)配制5％脱脂奶粉：称取脱脂奶粉2g，加入1×TBST 40ml，使其充分溶解，注意：配好的脱脂奶粉可放于4℃冰箱保存，但因其容易变质，所以最好现用现配。
(13)配制WNT4一抗工作液：用抗WNT4抗体和2.5％脱脂奶粉按1:1000比例稀释成一抗工作液，要现用现配。
(14)配制WNT4二抗工作液：用HRP rabbit anti-goat抗体和2.5％脱脂奶粉按1:5000比例稀释成二抗工作液，要现用现配。
(15)配制WNT5A一抗工作液：用抗WNT5A抗体和2.5％脱脂奶粉按1:2000比例稀释成一抗工作液，要现用现配。
(16)配制WNT5A二抗工作液：用HRP goat anti-rabbit抗体和2.5％脱脂奶粉按1:5000比例稀释成二抗工作液，要现用现配。
(17)配制β-actin一抗工作液：用抗β-actin抗体和2.5％脱脂奶粉按1:5000比例稀释成一抗工作液，要现用现配。
(18)配制一块1.5mm厚的10％分离胶(适合分离分子量在16-68kD之间的蛋白)的配方：分别吸取2.9ml的三蒸水，2.5ml的30％Acr，1.9ml的1.5M Tris，75ul的10％SDS，75ul的10％APS，3ul的TEMED，各种溶液边加边混匀，然后加入到制胶板中，此过程要尽量快速。
(19)配制一块5％的浓缩胶的配方：分别吸取1.05ml的三蒸水，250ul的30％Acr，190ul的1.0M Tris，15ul的10％SDS，15ul的10％APS，1.5ul的TEMED，各种溶液边加边混匀，然后加入到制胶板中，此过程要尽量快速。
(二)Real-time PCR溶液配制
(1)配制DEPC水：取1ml DEPC加入到1L三蒸水中，放在摇床上摇过夜，使DEPC溶于水中，然后高压灭菌1小时即可。
(2)配制75％无RNA酶酒精：取75ml无水乙醇，加DEPC水至100ml即可。
(3)配制50×TAE：分别称取Tris 121g,Na2EDTA·2H2O 18.6g，加入约300ml三蒸水使其充分溶解，再加入28.55ml的冰醋酸，混匀后调节pH值为8.0-8.5，最后用三蒸水定容至500ml即可。
(4)配制1×TAE：量取20ml 50×TAE，用三蒸水稀释到1L即可。
(三)蛋白提取及蛋白定量
(1)组织全蛋白提取
从-80℃冰箱取出存有组织的RIPA裂解液，待其解冻后开始提蛋白，操作步骤按照RIPA裂解液说明书操作，此处不再赘述。
(2)蛋白样品定量测定
利用碧云天公司生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒，对所得蛋白样品进行定量。操作步骤按照试剂盒说明书操作
1.4.3 Western blot实验步骤：
(一)SDS-PAGE
(1)将制胶板洗刷干净，并用去离子水冲洗后吹干，然后安装好制胶槽；
(2)按照配方配制10％的分离胶，配好混匀后用1ml的移液枪沿着制胶板的一侧缓慢注入；
(3)加完分离胶后，用三蒸水将制胶板上面剩余的空隙加满，注意：加三蒸水时要沿着制胶板上沿来回并缓慢注入，防止对胶面形成较大的冲击力；
(4)加完后静止约40分钟左右，分离胶凝好后在水与胶之间会形成可视界面；
(5)待胶凝好后，将上层水倒掉并用吸水纸擦干，然后按照配方配制5％的浓缩胶，以同样的方法沿一侧注入制胶板；
(6)加完浓缩胶后，迅速插入梳子，注意插梳子时不要插入气泡；
(7)静止1小时左右，待浓缩胶凝好后，沿垂直方向轻轻拔出梳子；
(8)准备蛋白样品：将测好浓度的蛋白样品，按总蛋白30ug吸取适量体积的蛋白样品，然后加入蛋白上样缓冲液，配好后在沸水浴中加热7分钟；
(9)将做好的胶放置到电泳架上，并倒入适量的电泳缓冲液，使缓冲液没过制胶板的凹槽，使加样孔中也流入电泳缓冲液；
(10)向加样孔中依次加入已变性好的蛋白样品以及蛋白Marker，注意加样时要缓慢，防止溢出，并记录好加样顺序；
(11)加样完成后，接通电源，设定为80V恒压开始电泳；
(12)蛋白样品到达浓缩胶与分离胶界限时，将电压改为120V，并将整个电泳槽放入冰水中，保持低温条件下电泳；
(13)以溴酚蓝为指示，待溴酚蓝跑至胶的底部时停止电泳；
(14)切胶：电泳结束后，根据蛋白Marker条带和WNT4、WNT5A及β-actin分子量，切下含有目的蛋白的胶条，放到转膜缓冲液中，用以后续转膜。
(二)免疫印迹
(1)根据切下的待转膜的胶条的大小，剪取适当大小的聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，注意不要用手直接接触膜，防止污染膜影响实验结果；
(2)将PVDF膜放入甲醇中，活化30s；
(3)将活化的膜放入三蒸水中清洗2分钟；
(4)将膜放入转膜缓冲液中，和胶条一起浸泡15分钟进行渗透；
(5)渗透完毕后，打开转膜夹，从正极到负极依次按照1层海绵、2层滤纸、PVDF膜、胶条、2层滤纸、1层海绵的顺序铺到转膜夹上，注意这个过程要在转膜缓冲液中进行，并且各层之间不能有气泡，以防影响转膜；
(6)各层都铺放整齐后，将转膜夹扣紧，放到转膜槽中，倒入转膜缓冲液，注意缓冲液要没过海绵；
(7)接通电源，设定为120mA恒流，转膜50分钟，一定要注意确认电源的正负极，及蛋白是由胶向PVDF膜的方向转移；
(8)封闭：转膜结束后，将PVDF膜取出，膜上会有清晰的蛋白Marker条带，然后将膜放入5％的脱脂奶粉中，在摇床上轻摇封闭1.5小时；
(9)一抗孵育：将PVDF膜从封闭液中取出，分别放入所对应的一抗工作液中，用封口机封好后，放入4℃冰箱孵育过夜；
(10)洗膜：第二天早上，将孵育膜从冰箱拿出，室温下平衡30分钟，然后将PVDF膜放入1×TBST中，轻摇清洗4次，每次15分钟；
(11)二抗孵育：将PVDF膜分别放入所对应的二抗工作液中，室温下在摇床上轻摇孵育1小时，注意：β-actin不需要二抗孵育；
(12)洗膜：二抗孵育结束后，用1×TBST轻摇清洗4次，每次15分钟；
(三)显影
(1)根据PVDF膜的大小，配制适量的ECL反应液(分为A液和B液)，用移液枪分别吸取等量的A液和B液混匀，约100ulECL反应液/cm2膜，注意避光；
(2)用吸水纸吸干PVDF膜上的液体，然后将膜正面向上放到干净的一次性PE手套上，在膜上滴加配好的ECL反应液，保证反应液将膜完全覆盖，避光反应约3分钟左右，期间可将膜正反颠倒，保证膜充分接触反应液；
(4)反应结束后，用吸水纸轻轻将膜表面的反应液吸净，将正面向上放到凝胶成像仪中，设定曝光时间30s，将显影图像保存并记录。
(四)图像结果处理：
(1)将显影得到的蛋白条带图像用Quantiscan软件处理，得到条带的灰度值，即Net Area的读数；
(2)记录所有研究对象WNT4、WNT5A及β-actin条带的灰度值，然后计算目的蛋白与β-actin的灰度值比值；
(3)将所得的产后子痫组与NP组的结果用GraphPad Prism 6软件处理，做出柱形图并计算P值。
Western blot实验结果见图2，由图2可以看出，WNT4蛋白表达水平在产后子痫组明显低于NP组，同样，WNT5A蛋白在产后子痫组中表达也是降低的，二者均有显著差异(P＜0.05)。
1.4.4 Real-Time PCR步骤：
1.4.4.1设计引物
利用dnaman软件设计得到的引物序列见下表：
1.4.4.2组织处理
(1)将处理组织所用到的解剖工具等都进行高压灭菌去除RNA酶处理；
(2)将从医院取回来的组织从液氮罐里取出，保持在冰冻状态下迅速分出约40mg组织，放入1mlTRIzol中，做好标记并保存于-80℃冰箱，用于后续提RNA。
1.4.4.3组织RNA提取及RNA样品检测
(一)组织RNA提取
(1)将实验过程所用到的枪头、研磨杵、EP管、DEPC水进行高压灭菌去除RNA酶处理，实验前将实验台擦拭干净，实验过程要佩戴口罩，并常换一次性PE手套，防止RNA酶污染；
(2)将存于-80℃冰箱的放有组织块TRIzol取出，待其解冻后开始提RNA，操作步骤按TRIzol药品说明书操作，此处不再赘述。
(二)RNA样品质量检测
(1)将做好的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，向电泳槽中加入1×TAE，液体略高于胶面；
(2)铺一张干净的PE手套，根据样品数量，用枪在手套上滴相应数量的DNA LoadingBuffer，每滴约2-3ul，然后吸取1ul RNA样品与其混匀，记录好样品顺序；
(3)按照顺序，将混好的RNA液滴加到上样孔中，接通电源，电泳约30分钟，待蓝色指示剂电泳到中间即可；
(4)电泳完毕后，将琼脂糖凝胶放到紫外透射仪中观察，并拍照记录，正常RNA电泳条带为3条，从上到下依次是28S、18S、5S且28S的亮度是18s的两倍；
(三)RNA样品浓度测定
(1)利用TGem微量分光光度计检测所得RNA的浓度；
(2)记录每个样品的浓度值，单位为ng/ul，读数应大于200为宜；
(3)记录每个样品的A260/A280比值，读数应在1.8-2.2之间，大于2.2表示RNA有降解，小于1.8表示有蛋白污染，同时还要结合凝胶电泳的结果图来判断所得RNA样品的质量。
(4)检测完后，将RNA样品放到-80℃冰箱保存。
1.4.4.4 RNA反转录及cDNA检测
(一)RNA反转录
操作步骤按反转录试剂盒说明书操作，此处不再赘述。
得到cDNA后，可放于-20℃冰箱保存。
(二)cDNA检测
利用半定量PCR检测反转得到的cDNA质量。
(1)配制PCR反应体系：吸取无菌8.5ul，10×Taq Buffer 1.25ul，Taq DNA Ploymerase0.25ul，2.5mM dNTPs 1ul，cDNA模板0.5ul，5uM Primers 1ul，配成总体积12.5ul的PCR体系，充分混匀；
(2)将配制好的PCR体系放入PCR仪中，设定条件为：预变性94℃3min，循环条件94℃30s、59℃30s、72℃30s，40个循环，延伸72℃5min；
(3)根据样品的数量，做一块适宜大小的琼脂糖凝胶；
(4)PCR结束后取出，向PCR体系中加入2.5ul 6×DNA loading buffer，混匀；
(5)按照顺序，将混好的体系加到上样孔中，电泳，观察结果并拍照记录。
1.4.4.5 Real-Time PCR
(1)将试剂盒中的2×SuperReal Premix Plus在室温下解冻，然后轻轻颠倒混匀，瞬时离心后置于冰上；
(2)配制反应体系：无RNA酶水3ul，2×SuperReal Premix Plus 5ul，模板cDNA 1.4ul，5uM Primers 0.6ul，总体积为10ul，配制体系时要在冰上进行；
(3)将配制好的体系放入荧光定量PCR检测系统，设定循环条件为：预变性95℃15min，循环条件95℃10s、59℃20s、72℃20s，40个循环，延伸72℃5min；
(4)记录结果，统计分析。
1.4.4.6结果分析
(1)将实验得到的Ct值，根据标准曲线计算出所有研究对象的WNT4、WNT5A及β-actin的浓度，然后计算目的蛋白与β-actin的浓度比值；
(2)将所得的SPE组与NP组的结果用GraphPad Prism 6软件处理，做出柱形图并计算P值。
Real-Time PCR实验结果见图3，由图3A和图3B可以看出，WNT4基因表达水平在产后子痫组明显低于NP组，同样，WNT5A基因在产后子痫组中表达也是降低的，二者均有显著差异(P＜0.05)。
结果表明，WNT4和WNT5A蛋白在产后子痫患者蜕膜组织低表达，说明WNT4和WNT5A蛋白会导致蜕膜损伤，进而会引发产后子痫，因此，WNT4和WNT5A蛋白可以作为一种很好的诊断的标志物，可以用于产后子痫的临床诊断。

Claims (4)

1.一种用于产后子痫诊断的标志物，其特征在于，所述标志物为WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种或两种的组合。
2.如权利要求1所述的用于产后子痫诊断的标志物，其特征在于，所述标志物为WNT4蛋白和WNT5A蛋白的组合。
3.权利要求1或2所述的标志物在制备用于产后子痫诊断的试剂盒中的应用。
4.一种用于产后子痫临床诊断的试剂，其特征在于，包括抗WNT4抗体和抗WNT5A抗体中的一种或两种、HRP rabbit anti-goat抗体，以及抗β-actin抗体。
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