CN103983687A - 人源hsf2作为溃疡性结肠炎特异性诊断分子标记物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人源HSF2作为溃疡性结肠炎特异性诊断分子标记物的应用，属于生物医学技术领域。本发明的技术方案包括三部分内容：1、通过蛋白质组学双向凝胶电泳和质谱技术检测UC病人和健康志愿者血清中的差异蛋白质。2、免疫组化法检测不同程度UC病人结肠粘膜HSF2的表达量。3、实时定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测不同程度的UC病人结肠粘膜HSF2的表达量。用本发明方法比较40例UC病人和40例健康志愿者的血清，发现UC病人血清中HSF2的表达明显升高；通过免疫组化法、实时定量PCR和蛋白免疫印迹检测UC病人结肠粘膜中HSF2的表达，发现随着UC疾病程度的加重，HSF2的表达逐渐增加。因此，HSF2能作为特异性诊断溃疡性结肠炎的分子标记物被应用。

Description

人源HSF2作为溃疡性结肠炎特异性诊断分子标记物的应用

技术领域：

本发明涉及一种人源HSF2作为溃疡性结肠炎特异性诊断分子标记物的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种以反复腹痛、粘液脓血便等为特征的慢性非特异性结肠炎症。近15年来，我国UC患病数逐年增多，至少已过2O万。该疾病现正成为我国消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要病因。其发病人群多为青壮年，加之其病程迁延，且与结肠癌的发病存在一定关系，严重影响了患者生活质量和社会生产力。有研究表明，30年以上病史的患者每年患结直肠癌的风险高达20％，已引起临床学者的高度重视。诊断上，主要依靠患者临床表现、内镜特点及病理支持。内镜检查及活检作为有创手段，不仅患者痛苦大，而且其临床及内镜表现缺乏特异性，加之国内病理医师广泛对UC认识不足，常造成误诊；治疗上，部分患者对某些药物产生抵抗或无效，其严重副作用也显著降低患者的生活质量。

UC的发病机制尚未明确，目前认为是多因素相互作用的结果，主要包括遗传，感染，环境和免疫因素。对其病因和发病机制的认识概括为：环境因素作用于遗传易感者，在肠道菌丛(或者目前尚未明确的特异性微生物)的参与下，启动了肠道免疫和非免疫系统，最终导致免疫反应和炎症过程。研究表明，热休克因子1(Heat shock factor1,HSF1)和热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)介导炎症性肠病的保护作用，它们通过炎症因子基因中的热休克元件以及影响炎症相关的转录因子的途径产生抗炎作用，但是对于热休克因子2(Heat shock factor2,HSF2)在UC中发挥的作用国内外都尚未有任何报道。

寻找UC的特异性诊断标记物已成为国内外研究的热点，目前仍未发现UC特异性诊断标记物。因此，寻找UC患者特异性的生物标记物作为诊断的分子标志、开发其针对性的生物制剂作为治疗靶点显得尤为重要。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种人源HSF2作为溃疡性结肠炎特异性诊断分子标记物的应用。

本发明的作为溃疡性结肠炎特异性诊断分子标记物的应用的人源HSF2，其分子量为58293.18道尔顿，等电点为4.70，全序列一级结构为：

MKQSSNVPAF LSKLWTLVEE THTNEFITWS QNGQSFLVLD EQRFAKEILP KYFKHNNMASFVRQLNMYGF RKVVHIDSGI VKQERDGPVE FQHPYFKQGQ DDLLENIKRK VSSSKPEENKIRQEDLTKII SSAQKVQIKQ ETIESRLSEL KSENESLWKE VSELRAKHAQ QQQVIRKIVQFIVTLVQNNQ LVSLKRKRPL LLNTNGAQKK NLFQHIVKEP TDNHHHKVPH SRTEGLKPRERISDDIIIYD VTDDNADEEN IPVIPETNED VISDPSNCSQ YPDIVIVEDD NEDEYAPVIQSGEQNEPARE SLSSGSDGSS PLMSSAVQLN GSSSLTSEDP VTMMDSILND NINLLGKVELLDYLDSIDCS LEDFQAMLSG RQFSIDPDLL VDSENKGLET TKNNVVQPVS EEGRKSKSKPDKQLIQYTAF PLLAFLDGNP ASSVEQASTT ASSEVLSSVD KPIEVDELLD SSLDPEPTQSKLVRLEPLTE AEASEATLFY LCELAPAPLD SDMPLLDS。

本发明的技术方案包括三部分内容：1、通过蛋白质组学双向凝胶电泳(two-dimensionalgel electrophoresis,2-DE)和质谱技术(Mass Speetrum,Ms)检测UC病人和健康志愿者血清中的差异蛋白质。2、免疫组化法检测不同程度UC病人结肠粘膜HSF2的表达量。3、实时定量PCR(real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blotting)技术检测不同程度的UC病人结肠粘膜HSF2的表达量。

本发明通过双相凝胶电泳和质谱技术比较40例溃疡性结肠炎(UC)病人和40例健康志愿者的血清，发现UC病人血清中HSF2的表达明显升高；通过免疫组化法、实时定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测UC病人结肠粘膜中HSF2的表达，发现随着疾病的加重(轻、中、重三级)，HSF2的表达增加；因此，HSF2能作为特异性诊断溃疡性结肠炎的分子标记物被应用。

附图说明：

图1.溃疡性结肠炎(UC)病人与健康志愿者血清中蛋白质表达的差异分析。A为阴性对照组，B为UC病人组。箭头所示为差异表达蛋白HSF2。

图2.免疫组化检测HSF2在不同程度UC病人粘膜组织中的差异表达分析。A为阴性对照，B、C和D分别任对应轻、中、重度UC病人的HSF2表达水平。HSF2表达特征为胞质或胞核显棕黄色或棕色颗粒。

图3.实时定量PCR和蛋白免疫印迹检测HSF2在不同程度UC病人粘膜组织中的差异表达分析。A为实时定量PCR检测HSF2的结果，相对量以GAPDH为内参。B为蛋白免疫印迹检测HSF2的结果，相对量以β-actin为内参。

具体实施方式：

实施例一：溃疡性结肠炎(UC)病人与健康志愿者血清中蛋白质表达的差异分析。

1、血清标本收集与处理

取研究对象的空腹静脉血5ml，室温放置30min，2000rpm离心20min，收集血清(不能溶血)。同组40例血清样品，每例取30ul混合均匀。然后使用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清样品中的白蛋白和IgG。再用蛋白沉淀试剂盒对样品蛋白进行浓缩。

2、第一向固相梯度等电聚焦电泳及胶条的平衡:

(1)从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT，不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管)，置室温溶解。在小管中加入0.01g DTT，25μl Bio-Lyte的量加，充分混匀。从小管中取出400μl水化上样缓冲液，加入100μl样品，充分混匀。其中水化缓冲液与样品的体积百分比不得小于4:1。

(2)沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。

(3)分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。

(4)在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油3ml，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

(5)对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

3、第二向SDS-PAGE电泳

(1)按常规方法配制10％的丙烯酰胺凝胶块。将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水、乙醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。

(2)待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇，用MilliQ水冲洗。

(3)在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，减少凝胶染色时出现的纵条纹。

(4)将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入胶条平衡缓冲液(I)6ml。将溶涨盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

(5)第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液(I)。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液(II)6ml，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

(6)第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液(II)。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

(7)将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

(8)在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流5mA/gel，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流至30mA/gel，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即停止电泳。

4、硝酸银染色

(1)固定：乙酸25ml、乙醇100ml、MilliQ water125ml(＞＝120min,through one night)

(2)敏化：乙醇75ml、Na₂S₂O₃0.5g、NaAC17g、MilliQ water175ml(＞＝60min)充分洗去敏化液

(3)漂洗：MilliQ water250ml；3times×5min

(4)银染：AgNO₃0.625g、MilliQ water250ml(30min)

(5)漂洗：MilliQ water250ml，2times×1min

(6)显影：Na₂CO₃6.25g、甲醛100ul、MilliQ water250ml(2min-10min)

(7)终止：EDTA3.65g、MilliQ water250ml(10min)

(8)漂洗：MilliQ water250ml3times×5min

5.图像采集及图谱分析

用Umax PowerLook1100透射扫描仪获取染色后2-DE凝胶图像，TIF文件格式保存，用PDQuest7.1.0软件包分析扫描后的图像。分析包括蛋白质斑点的检测、量化、背景去除和点的匹配。蛋白质斑点自动检测后，每个蛋白质斑点得到指定的SSP号码，再进行点的编辑去除一些杂点，蛋白质斑点匹配前选取正常人2-DE凝胶中作为参考胶(Referenee gle)，并建立一些匹配点(Landmark)，然后自动匹配其它蛋白质斑点，与参考胶中不匹配的点自动加到参考胶中。蛋白质斑点的量被定义为构成这个点的所有象素强度值的总和，为了准确反应蛋白质斑点的量的变化，将每个点的含量表示为百分含量(％Vol)，即一个蛋白质斑点的量占该胶内所有蛋白质斑点总量的百分数，也称相对含量。选取表达量2倍以上的点作为后续质谱分析的候选蛋白质点。

6、质谱分析

(1)质谱样品制备(以下所有操作均在层流室内进行):

超净工作台准备:将通风打开，用酒精洗瓶将工作台面冲洗一遍后，吹干酒精(超过10min)。将胶用去离子水洗10min×3次。用切胶专用枪，直径1.5mm的枪头从胶上取点，尽可能将目的点取完整。取出的蛋白质点置于预先编号的96孔板中，每孔加入去离子水50ul，超声10min×3次。每个孔里加50ul的乙睛，胶粒在常温下脱水5分钟，将乙睛吸去。加入50ul10mM的DTT，56℃还原一小时。吸掉液体后再加入50ul55mM碘乙酰胺，避光常温放置45分钟。用50ul25mM碳酸氢胺洗5分钟，用50ul乙睛脱水，真空干燥。每个胶粒加入5ul10ng/50ul的胰酶溶液，冰箱中放置30分钟后，吸去多余的酶，覆盖10ul25mM碳酸氢胺，37℃过夜。用10ul的2％的TFA终止酶解反应。

(2)质谱样品点样

点样前所用器械均用酒精消毒。脱盐:酶切后样品溶液用C18ZipTips脱盐，10ul60％ACN/0.1％TFA洗脱后浓缩至2ul。取0.3ul样品和相同体积的α-氰基-β-羚基肉桂酸(HCCA)混合后点于384孔的MALDI靶上，同时点上已知肽混合物作为外标，室温下自然干燥。肽质量指纹图谱(PMF)的检测:用BIFLEX IV型MALDI-TOF质谱仪进行检测。在延迟解吸和反射模式下进行谱图采集，电离模式为阳离子模式，参数:2000-3000Da-RP，氮激光波长337nm，加速电压设置19KV。每一个PMF大约是由200次轰击垒加而成，外标采用布鲁克公司肽混合物标准品。洗靶:检测结束后，用0.1％TFA洗靶30s-1min后吸弃。

(3)结果数据库查询:

将肽质量指纹谱用Matrix science网站提供的Mascot搜索引擎进行数据库检索。所用检索软件为Mascot2.1。检索条件:蛋白质数据库选择SwissProt库，物种的来源选择Homosapiens，作用的酶选胰酶并允许1个missed cleavages，固定修饰为carbamidomethyl(c)，可变修饰为oxidation(M)，肽片段分子量最大允许误差范围为100ppm，离子种类选择为MH⁺和单同位素峰。

(4)结果判定：选取结果时综合考虑匹配的片段数、覆盖率、实际分子量、等电点与理论分子量及等电点之间的误差因素。仅接受匹配片段>4个且Mascot p值<0.05的结果。

实施例二：免疫组化检测HSF2在不同程度UC病人粘膜组织中的差异表达分析。1、切片制作

所有活检组织自-80℃冰箱取出后解冻，用冰冻切片包埋剂包埋后液氮冰冻，于-20℃恒温冰冻切片机行快速切片，每片厚度为5微米，同一块活检组织切3张组织片，贴于一张防脱玻片上，置于4℃丙酮中固定15分钟后取出，待丙酮完全挥发干后迅速置入-20℃冰箱保存。

2、免疫组化实验步骤

(1)将玻片放置在60℃烤箱过夜。第二天将切片拿出来，趁温度仍高的时候放置在二甲苯液体Ⅰ和Ⅱ中脱蜡，各15分钟。

(2)然后分别浸泡在无水酒精Ⅰ和Ⅱ，95％，80％，70％浓度的酒精中，各两分钟。

(3)蒸馏水冲洗15分钟，每隔3分钟冲洗一次。

(4)将5g柠檬酸抗原修复液置于高压锅中，待煮沸的时候将切片浸泡在其中，盖好高压锅盖。从冒气的时候开始计时，2分钟后停止，待自然冷却后用蒸馏水冲洗两次。

(5)用专业油笔将切片上的组织隔开，划线的时候距离标本3-5mm。

(6)用PBS缓冲液冲洗15分钟，每3分钟冲洗一次。

(7)添加一抗鼠抗HSF2抗体稀释液200μl(一抗原液0.5μl加199.5μl新鲜的PBST配制而成)后，将玻片放入湿盒中，然后盖好湿盒的盖子，放入37℃温箱中，80分钟后取出来。

(8)用PBS缓冲液冲洗10分钟。

(9)添加二抗酶标羊抗鼠IgG抗体稀释液400μl(二抗原液1μl加399μl新鲜的PBST配制而成)后，盖好湿盒的盖子，放入37℃温箱中，20分钟后取出来。

(10)用PBS缓冲液冲洗10分钟，每三分钟冲洗一次。

(11)加DAB显色液，静置5分钟，适时终止染色，用蒸馏水快速冲洗两次。

(12)自来水流水冲洗10分钟。

(13)蒸馏水快洗一次，然后放置在苏木素瓶中复染2分半钟。

(14)自来水快速冲洗，将苏木素洗净，在1％盐酸酒精中快速洗刷，2-3秒。

(15)自来水流水冲洗冲洗15分钟。

(16)浸泡在1％盐酸酒精中20秒。然后在不同浓度的乙醇中脱水，浓度分别为95％Ⅰ，95％Ⅱ，100％Ⅰ，100％Ⅱ，各2分钟。

(17)二甲苯透明：分别为二甲苯Ⅰ和Ⅱ，各2分钟。

(18)中性树脂封片，显微镜下观察实验结果。

实施例三：实时定量PCR和蛋白免疫印迹检测HSF2在不同程度UC病人粘膜组织中的差异表达分析。

(一)实时荧光定量PCR检测HSF2的差异表达

1、样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的肠粘膜细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用DEPC水配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

2、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR

①β-actin阳性模板的标准梯度制备，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)以备用。

②反应体系如下：

标准品反应体系：SYBR Green1染料10μl；阳性模板上游引物F0.5μl；

阳性模板下游引物R0.5μl；dNTP0.5μl；Taq酶1μl；阳性模板DNA5μl；

ddH2O32.5μl；总体积50μl。轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

管家基因反应体系：SYBR Green1染料10μl；内参照上游引物F0.5μl；

内参照下游引物R0.5μl；dNTP0.5μl；Taq酶1μl；待测样品cDNA5μl；

ddH2O32.5μl；总体积50μl。轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。

3、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

反应体系：10×PCR缓冲液2.5ul；MgCl2溶液1.5ul；上游引物F0.5ul；

下游引物R0.5ul；dNTP混合液3ul；Taq聚合酶1ul；cDNA1ul；加水至总体积为25ul。轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

35个PCR循环(94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟)；72？C延伸5分钟。

②PCR产物与DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

③将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

4、待测样品的待测基因实时定量PCR

①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。

体系配置如下：SYBR Green1染料10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；

dNTP1ul；Taq聚合酶2ul；待测样品cDNA5ul；ddH2O30ul；总体积50ul；轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

(二)蛋白免疫印迹检测HSF2的差异表达

1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离肠粘膜破碎样品蛋白质

2、转PVDF膜：把固定盒夹紧，放入槽内，再置入冰盒(事先制冰)，倒入转膜缓冲液，约500ml，在电泳槽内放入转子，使转膜时温度保持<4℃，盖上盖子，设定电压为100V(350mA)，时间为1小时。

3、包被封闭非特异性蛋白：取出膜，放于封闭液中，37℃、振荡1小时(或室温、振荡2小时)。PBST漂洗1次，每次5min，备用。

4、抗体反应：

一抗鼠抗HSF2抗体包被：在饭盒内，将膜浸入1:400稀释(一抗原液0.5μl加199.5μl新鲜的PBST配制成总体积为200μl的抗体稀释液)的IL-6蛋白一抗之中，或1:6000稀释[一抗浓溶液(1：100)5μl加295μl新鲜的PBST配制成总体积为300μl的抗体稀释液]的β-actin一抗之中4℃过夜(或37℃2小时)。用镊子将膜转移到干净的培养皿中，用PBST漂洗6次，每次10分钟。

二抗酶标羊抗鼠IgG抗体包被：在培养皿内，将膜浸入1:400稀释(二抗原液1μl加399μl新鲜的PBST配制成总体积为400μl的抗体稀释液)的二抗之中，室温振荡2小时。用镊子将膜转移到干净的培养皿中，用PBST漂洗6次，每次10分钟。5、显色：DAB显色浓缩液一滴，加入2mlPBST,2μl过氧化氢，混匀后，加到PVDF膜上，随时观察，5-10sec，显出棕色条带，立即用双蒸水冲洗终止显色，然后把膜转移到装有PBS的浅托盘内，拍摄照片。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  昆明医科大学第一附属医院

 

<120>  人源HSF2作为溃疡性结肠炎特异性诊断分子标记物的应用

<130>  1

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  2643

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

<400>  1

acttgtccgt cacgtgcggc cgcccggcct ctcggccttg ccgcgcgcct ggcggggttg        60

ggggggcggg gaccaagatc tgctgcgcct gcgttgtggg cgttctcggg gagctgctgc       120

cgtagctgcc gccgccgcta ccaccgcgtt cgggtgtaga atttggaatc cctgcgccgc       180

gttaacaatg aagcagagtt cgaacgtgcc ggctttcctc agcaagctgt ggacgcttgt       240

ggaggaaacc cacactaacg agttcatcac ctggagccag aatggccaaa gttttctggt       300

cttggatgag caacgatttg caaaagaaat tcttcccaaa tatttcaagc acaataatat       360

ggcaagcttt gtgaggcaac tgaatatgta tggtttccgt aaagtagtac atatcgactc       420

tggaattgta aagcaagaaa gagatggtcc tgtagaattt cagcatcctt acttcaaaca       480

aggacaggat gacttgttgg agaacattaa aaggaaggtt tcatcttcaa aaccagaaga       540

aaataaaatt cgtcaggaag atttaacaaa aattataagt agtgctcaga aggttcagat       600

aaaacaggaa actattgagt ccaggctttc tgaattaaaa agtgagaatg agtccctttg       660

gaaggaggtg tcagaattac gagcaaagca tgcacaacag caacaagtta ttcgaaagat       720

tgtccagttt attgttacat tggttcaaaa taaccaactt gtgagtttaa aacgtaaaag       780

gcctctactt ctaaacacta atggagccca aaagaagaac ctgtttcagc acatagtcaa       840

agaaccaact gataatcatc atcataaagt tccacacagt aggactgaag gtttaaagcc       900

aagggagagg atttcagatg acatcattat ttatgatgtt actgatgata atgcagatga       960

agaaaatatc ccagttattc cagaaactaa tgaggatgtt atatctgatc cctccaactg      1020

tagccagtac cctgatattg tcatcgttga agatgacaat gaagatgagt atgcacctgt      1080

cattcagagt ggagagcaga atgaaccagc cagagaatcc ctaagttcag gcagtgatgg      1140

cagcagccct ctcatgtcta gtgctgtcca gctaaatggc tcatccagtc tgacctcaga      1200

agatccagtg accatgatgg attccatttt gaatgataac atcaatcttt tgggaaaggt      1260

tgagctgttg gattatcttg acagtattga ctgcagttta gaggacttcc aggccatgct      1320

atcaggaaga caatttagca tagacccaga tctcctggtt gattctgaga ataaaggatt      1380

agaaactacc aagaacaatg tagttcagcc agtttcggaa gagggaagaa aatctaaatc      1440

caaaccagat aagcagctta tccagtatac cgcctttcca cttcttgcat tcctcgatgg      1500

gaaccctgct tcttctgttg aacaggcgag tacaacagca tcatcagaag ttttgtcctc      1560

tgtagataaa cccatagaag ttgatgagct tctggatagc agcctagacc cagaaccaac      1620

ccaaagtaag cttgttcgcc tggagccatt gactgaagct gaagctagtg aagctacact      1680

gttttattta tgtgaacttg ctcctgcacc tctggatagt gatatgccac ttttagatag      1740

ctaaatcccc aggaagtgga ctttacatgt atatattcat caaaatgatg aactatttat      1800

tttaaagtat catttggtac tttttttgta aattgctttg ttttgtttaa tcagatactg      1860

tggaataaaa gcaccttttg cttttctcac taaccacaca ctcttgcaga gctttcaggt      1920

gttactcagc tgcatagtta cgcagatgta atgcacatta ttggcgtatc tttaagttgg      1980

attcaaatgg ccatttttct ccaattttgg taaattggat atcttttttt tacaaatacg      2040

accattaacc tcagttaaat ttttgtttgt tttcctgttt gatgctgtct atttgcattg      2100

agtgtaagtc atttgaacta atggtataac tcctaaagct ttctctgctc cagttatttt      2160

tattaaatat ttttcacttg gcttattttt aaaactggga acataaagtg cctgtatctt      2220

gtaaaacttc atttgtttct tttggttcag agaagttcat ttatgttcaa agacgtttat      2280

tcatgttcaa caggaaagac aaagtgtacg tgaatgctcg ctgtctgata gggttccagc      2340

tccatatata tagaaagatc gggggtggga tgggatggag tgagccccat ccagttagtt      2400

ggactagttt taaataaagg ttttccggtt tgtgtttttt tgaaccatac tgtttagtaa      2460

aataaataca atgaatgttg agtactagtg tctgttatgt gtcttcttta gaggtgacac      2520

tcacatgaaa caattttttc ttctcatagg aagcagtagc tttaaactgt ctgtggttca      2580

ttattctcaa tatgaatcat accaagatat ttgtgcctca tctcgaaaat atattgtata      2640

ttg                                                                    2643

 

<210>  2

<211>  518

<212>  PRT

<213>  Homo sapiens

 

<400>  2

 

MKQSSNVPAF LSKLWTLVEE THTNEFITWS QNGQSFLVLD EQRFAKEILP KYFKHNNMAS        60

FVRQLNMYGF RKVVHIDSGI VKQERDGPVE FQHPYFKQGQ DDLLENIKRK VSSSKPEENK       120

IRQEDLTKII SSAQKVQIKQ ETIESRLSEL KSENESLWKE VSELRAKHAQ QQQVIRKIVQ       180

FIVTLVQNNQ LVSLKRKRPL LLNTNGAQKK NLFQHIVKEP TDNHHHKVPH SRTEGLKPRE       240

RISDDIIIYD VTDDNADEEN IPVIPETNED VISDPSNCSQ YPDIVIVEDD NEDEYAPVIQ       300

SGEQNEPARE SLSSGSDGSS PLMSSAVQLN GSSSLTSEDP VTMMDSILND NINLLGKVEL       360

LDYLDSIDCS LEDFQAMLSG RQFSIDPDLL VDSENKGLET TKNNVVQPVS EEGRKSKSKP       420

DKQLIQYTAF PLLAFLDGNP ASSVEQASTT ASSEVLSSVD KPIEVDELLD SSLDPEPTQS       480

KLVRLEPLTE AEASEATLFY LCELAPAPLD SDMPLLDS                               518

Claims (1)

1.分子量为58293.18道尔顿，等电点为4.70，全序列一级结构为MKQSSNVPAF LSKLWTLVEE THTNEFITWS QNGQSFLVLD EQRFAKEILP KYFKHNNMASFVRQLNMYGF RKVVHIDSGI VKQERDGPVE FQHPYFKQGQ DDLLENIKRK VSSSKPEENKIRQEDLTKII SSAQKVQIKQ ETIESRLSEL KSENESLWKE VSELRAKHAQ QQQVIRKIVQFIVTLVQNNQ LVSLKRKRPL LLNTNGAQKK NLFQHIVKEP TDNHHHKVPH SRTEGLKPRERISDDIIIYD VTDDNADEEN IPVIPETNED VISDPSNCSQ YPDIVIVEDD NEDEYAPVIQSGEQNEPARE SLSSGSDGSS PLMSSAVQLN GSSSLTSEDP VTMMDSILND NINLLGKVELLDYLDSIDCS LEDFQAMLSG RQFSIDPDLL VDSENKGLET TKNNVVQPVS EEGRKSKSKPDKQLIQYTAF PLLAFLDGNP ASSVEQASTT ASSEVLSSVD KPIEVDELLD SSLDPEPTQSKLVRLEPLTE AEASEATLFY LCELAPAPLD SDMPLLDS的人源HSF2作为溃疡性结肠炎特异性诊断分子标记物的应用。