CN109266740A

CN109266740A - 用于肺癌诊断或预后的标志物及诊断试剂

Info

Publication number: CN109266740A
Application number: CN201710574961.7A
Authority: CN
Inventors: 曾嵘; 陈海泉; 吴庆庆; 罗晓阳; 李辰
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS; Fudan University Shanghai Cancer Center
Current assignee: Fudan University Shanghai Cancer Center; Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2017-07-14
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2019-01-25

Abstract

本发明涉及用于肺癌诊断或预后的标志物及诊断试剂。本发明首次揭示小细胞肺癌的两大亚类(肺鳞状细胞癌，肺腺癌)治疗后较早(<＝12个月)出现疾病进展的患者中DDX56会发生显著性地上升，其表达上升显著性影响患者的总生存期。因此，DDX56可以作为指示肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期疾病复发的诊断标志物。

Description

用于肺癌诊断或预后的标志物及诊断试剂

技术领域

本发明属于诊断标志物领域，更具体地，本发明涉及用于肺癌诊断或预后的标志物及诊断试剂。

背景技术

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因，每年造成近140万人死亡。尽管过去十年肺癌的诊断和治疗改善，但总体5年患者生存率仍然低于16％。近85％的肺癌病例为非小细胞肺癌(NSCLC)。肺鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma,SCC)是NSCLC中第二常见的类型，占所有病例的约30％。NSCLC的早期治疗主要通过手术切除。然而，在切除的患者中，预后差异很大。即使切除成功，肺鳞状细胞癌患者的5年生存率也显著低于腺癌。为了评估肿瘤预后风险和治疗结果，研究者已经提出了许多预后生物标志物用于NSCLC，但尚未成功转化为临床应用。因此，迫切需要可靠的评估预后和治疗结果的预后标志物。

定量蛋白质组学被广泛用于各种癌症的生物标志物的发现。经典的蛋白质组学生物标志物的研究方法是比较肿瘤与正常(或肿瘤相邻正常)组织之间的蛋白质的差异表达。然而，由于肺部是气体与血液交换的场所，肺组织包含平均约450毫升血液，占整个循环系统的总血量的9％。正常肺组织中高血液的含量可以显著影响蛋白质组学数据的分析。与肿瘤样本相比，血液中高含量的蛋白质如血红蛋白和白蛋白会被鉴定为在正常组织中显著上调。为了克服这个问题，激光捕获显微切割(LCM)已被用于一些蛋白质组学研究肺癌。然而，LCM耗时且需要专门的设备。De Petris等开发了新的样品制备方法，从肺组织中去除血液污染物进行蛋白质组学分析，但该方法需要复杂的样品制备步骤和大量样品材料。

因此，本领域需要探索新的、有效的手段来找寻肺癌发生、发展进程中相关的标志物，从而微肺癌的临床诊断、预后提供新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供用于肺癌诊断或预后的标志物及诊断试剂。

在本发明的第一方面，提供DDX56蛋白或其编码基因在制备诊断试剂中的用途，所述的诊断试剂用于对肺癌进行诊断或预后。

在本发明的另一方面，提供一种特异性识别DDX56蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于制备对肺癌进行诊断或预后的诊断试剂或诊断试剂盒。

在一个优选例中，所述的肺癌包括：非小细胞肺癌，肺鳞状细胞癌，肺腺癌。

在另一优选例中，所述的对肺癌进行诊断或预后是：对肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期复发(较佳地为治疗后的早期复发)进行诊断或预后。

在另一优选例中，所述的对肺癌进行诊断或预后是：对肺鳞状细胞癌或肺腺癌患者的总生存期进行预后。

在另一优选例中，所述的诊断试剂选自：

特异性扩增DDX56蛋白的编码基因的引物；或

特异性识别DDX56蛋白的编码基因或其转录本的探针；或

特异性抗DDX56蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的诊断试剂是特异性抗DDX56蛋白的抗体。

在本发明的另一方面，提供一种用于对肺癌进行诊断或预后的试剂盒，所述的试剂盒中含有：检测DDX56蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。

在一个优选例中，所述的试剂盒中，所述的检测DDX56蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自：

特异性扩增DDX56蛋白的编码基因的引物；或

特异性识别DDX56蛋白的编码基因或其转录本的探针；或

特异性抗DDX56蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：

核酸抽提试剂；和/或

聚合酶链反应试剂；和/或

蛋白免疫印迹试剂；和/或

酶链免疫反应试剂。

在本发明的另一方面，提供一种对肺癌进行诊断或预后(包括对肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期复发进行诊断或预后，或对肺鳞状细胞癌或肺腺癌患者的总生存期进行预后)的方法，所述方法包括：检测待测样品中的DDX56蛋白或其编码基因的表达情况，若检测为DDX56表达量显著升高，则该待测样品的提供者为肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期复发高风险者，或总生存期预后不理想者。

在一个优选例中，所述的待测样品是肿瘤组织，所述的DDX56表达量显著升高是指肿瘤组织与邻旁正常组织相比，表达量显著升高(如升高20％以上，较佳地升高30％以上，更佳地升高50％以上)。

在另一个优选例中，所述的待测样品是肿瘤组织，所述的DDX56表达量显著升高是指肿瘤组织与一个DDX56标准表达值相比，表达量显著升高(如升高20％以上，较佳地升高30％以上，更佳地升高50％以上)。其中，所述的DDX56标准表达值是DDX5在非“肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期复发”阶段时的平均表达值(可以是根据相当数量的人群取样后，统计，计算平均值获得)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、定量蛋白质组学实验方案分析肺鳞状细胞癌患者治疗后较早出现疾病进展(ER，<＝12个月)组和匹配的较晚出现疾病进展(LR，>＝30个月)组的肿瘤组织中差异表达蛋白质。在队列1中，手术后疾病早期复发(10个月内)的患者与另一例晚期复发(>30个月)的患者基于类似的临床和病理特征进行配对。20个配对患者的肿瘤组织用于iTRAQ标记的蛋白质组学分析。每两对匹配的蛋白质组样品用iTRAQ试剂标记两次(正向和反向标记)，正反iTRAQ标记的样品1：1：1：1的比例混合。每个混合的iTRAQ标记蛋白质组样品经过pH梯度洗脱的SCX色谱分离成6个组分，然后通过LC-MS/MS分析。

图2、用IPA程序分析了136个差异表达基因的前2个重要疾病和功能网络。

A、“细胞运动，炎症反应，毛发与皮肤发育与功能”网络(得分＝43)。

B、“癌症，血液病，细胞发育”网络。显示重要焦点分子之间的分子相互作用。节点(基因)颜色的强度表示上调(红色)或下调(绿色)调节的程度。

图3、通过蛋白质组学分析鉴定的上调或下调基因的基因本体(GO)分类。72个上调基因(A)和64个下调基因(B)的生物过程(上图)和分子功能(下图)类别中的前5个GO条款。

图4、通过使用SurvExpress和KMplot对DDX56的在线生存分析。使用SurvExpress程序基于已发表的130例肺鳞状细胞癌患者microarray基因表达数据，对DDX56(A)进行生存分析，单独的DDX56的表达与SCC患者的总生存期(OS)显著相关。分别使用KMplot程序在肺腺癌(B)中单独使用DDX56进行存活分析，结果显示高DDX56基因表达与肺腺癌较差患者的总生存期(OS)也显著相关。

图5、Western blot分析队列1患者的肿瘤组织和相邻正常组织中DDX56的表达。免疫印迹的信号强度使用β-肌动蛋白归一化。

A、20例匹配的ER和LR患者的肿瘤组织中DDX56表达的蛋白质印迹分析，DDX56的Western印迹信号为平均值±SEM(n＝10)(左下图)。P＝0.046，paired Student’s t test。

B、20例匹配的ER和LR患者的邻近正常组织中DDX56表达的蛋白质印迹分析，DDX56的Western印迹信号为平均值±SEM(n＝10)(右下图)。P＝0.42，paired Student’s ttest。

图6、组织微阵列(TMA)分析显示高DDX56蛋白表达水平与SCC患者预后不良相关。DDX56免疫组化染色的分级是由一位对所有患者临床病理资料不知情的病理学专家完成分，共有32个SCC TMA核心被分为阴性，弱染色，中度染色和强染色。

A、显示DDX56免疫组织化结果的代表性图谱。

B、Kaplan-Meier分析比较肿瘤分级为DDX56阴性和弱染色(低DDX56)与分级为DDX56中度和强染色(高DDX56)，显示高DDX56表达患者的总生存期显著低于低DDX56表达组(P＝0.0338)。

图7、蛋白质表达量的箱线图。显示了log 2的分布转移10对匹配ER与LR SCC患者的归一化的蛋白质表达比率。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示了DDX56与肺鳞状细胞癌和肺腺癌患者的预后密切相关。大样本验证发现，肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期疾病复发患者中DDX56会发生显著性地上升，其表达上升显著性影响患者的总生存期。因此，DDX56可以作为指示肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期疾病复发的诊断标志物。

如本发明中所用，所述的“肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期复发”中的“早期复发”，是指术后10个月内发生复发。

如本发明中所用，所述的“肺鳞状细胞癌或肺腺癌晚期复发”中的“晚期复发”，是指术后>30个月发生复发。

肿瘤复发和转移是导致术后肺鳞状细胞癌患者生存率差的主要原因。找到与术后早期复发(ER)和转移风险有关的蛋白质生物标志物，不仅可以指导个性化治疗决策，并可帮助研究癌症早期复发的机制。在本发明中，本发明人使用蛋白质组学方法鉴定了早期复发(ER)和晚期复发(LR)组肺鳞状细胞癌患者肿瘤之间的一系列差异表达蛋白，从中确定了以DDX 56作为诊断标志物。并且，通过在线生存分析和IHC分析，确证了DDX56与肺鳞状细胞癌以及肺腺癌患者的总生存期(OS)显著相关。

DDX56核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，也可以是其变异体、片段或衍生物；DDX56的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且其变异体、片段或衍生物也包含在本发明中。

经典的蛋白质组学生物标志物的研究方法是比较肿瘤与正常(或肿瘤相邻正常)组织之间的蛋白质的差异表达。然而，正常肺组织中高血液的含量可以显著影响蛋白质组学数据的分析。与肿瘤样本相比，血液中高含量的蛋白质如血红蛋白和白蛋白会被鉴定为在正常组织中显著上调。激光捕获显微切割(LCM)尽管已被用于一些蛋白质组学研究肺癌，但其耗时且需要专门的设备。也有研究人员开发了新的样品制备方法从肺组织中去除血液污染物进行蛋白质组学分析，但该方法需要复杂的样品制备步骤和大量样品材料。

不同于上述现有技术中的思路，在本发明中，为了鉴定与早期复发相关的蛋白质，本发明人比较了配对的患者间的肿瘤组织之间的蛋白质表达差异，从而避免了肿瘤和正常肺组织之间血液含量的差异造成的影响。

为了更好地了解候选蛋白质的生物学背景，本发明人进行蛋白质网络和GO分析。IPA网络分析表明，本发明中显著差异表达的蛋白质与细胞运动有关。肿瘤细胞迁移是癌症转移的关键过程，结果暗示癌细胞迁移和转移可能导致SCC早期复发。ER患者组中显著下调/上调蛋白的GO富集分析显示，下调蛋白质主要与免疫应答有关，而上调蛋白质在RNA加工和mRNA加工等生物学过程中显示出显著的富集。结果表明RNA加工可能在SCC早期复发中起重要作用。在ER患者的上调蛋白中，根据文献和公共数据库，本发明人将前十名蛋白质手工评估为候选预后标志物，并通过在线生物标志物验证工具检测其在SCC中的预后效应。SurvExpress的生存分析显示，单独的DDX56的高基因表达水平与已发表的SCC数据集中的患者差的OS显著相关。此外，KMplot分析结果显示，DDX56基因高表达还与肺腺癌的预后不良相关。对相邻的正常组织进一步的Western blot验证显示，ER和匹配的LR患者组之间DDX56的差异表达仅出现在肿瘤组织中，而在相邻的正常组织中未观察到DDX56的差异表达。表明DDX56的表达升高是肺癌肿瘤特异性的。

在线的生存分析是基于基因表达的数据。为了验证DDX56在蛋白表达水平上的预后意义，本发明人进一步通过组织芯片的IHC染色检查了独立的SCC患者队列中DDX56的表达。组织微阵列分析也显示，DDX56的蛋白表达与SCC患者的OS显著相关，并独立于其他预后指标。因此，本发明人的研究结果表明，DDX56与SCC存活率和早期复发密切相关，其可作为预后标志。

基于本发明人的上述新发现，可以将DDX56作为肺鳞状细胞癌或肺腺癌诊断及预后的标志物进行肺鳞状细胞癌或肺腺癌(i)鉴别诊断、复发和/或复发可能性分析，(ii)生存期评估，以实现早期监测早期治疗。比如，可分离出由DDX56基因表达异常(表达异常升高)而导致肺鳞状细胞癌或肺腺癌的人群，从而可进行更有针对性的治疗。

因此，本发明提供了DDX56基因或蛋白的用途，用于制备诊断特别是预后评估肺鳞状细胞癌或肺腺癌的复发的试剂或试剂盒。

本发明还提供了DDX56基因或蛋白的用途，用于制备评估肺鳞状细胞癌或肺腺癌患者的生存期的试剂或试剂盒。

可采用各种本领域已知的技术来检测DDX56基因的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。

本发明还提供了用于在分析物中检测DDX56基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增DDX56的引物；或特异性识别DDX56的探针来确定DDX56基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合DDX56蛋白或其蛋白片段的抗体或配体来确定DDX56蛋白的表达情况。

在传统的方法中，检测可通过Southern印迹以及与标记的探针杂交来进行。Southern印迹所涉及的技术是本领域技术人员所熟知的(参见Sambrook等，1989)。常规的检测还有生物芯片、荧光显影技术、细胞流式计数等。

作为本发明的一种选择方式，所述的检测试剂是引物，其可特异性扩增出DDX56基因或基因片段。

针对DDX56基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与DDX56基因上特定位点发生特异性结合，而不与DDX56基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。设计探针的方法是本领域常规的，可见Sambrook等人，分子克隆实验室手册中所述。检测生物样品中是否存在DDX56蛋白或核酸的示范性方法包括获得测试受试者的生物样品，使该生物样品接触能与DDX56mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。该核酸探针可以是，例如DDX56基因的部分，如长至少15、30、50、100个核苷酸并能在严谨条件下与DDX56mRNA或基因组DNA充分杂交的核酸探针。用于本发明诊断试验的其它探针如本文所述。核酸探针与扩增的标记序列接触。该探针优选连接到一种发色团，但可被放射标记。在另一个实施例中，探针连接到一种结合伴侣上，如抗体或生物素，或另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。

利用特异性结合DDX56蛋白的抗体来检测分析物中DDX56蛋白存在情况的方法也是本领域人员熟知的技术，包括ELISA、Western印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光、同位素示踪等方法。本发明的抗体可以是对DDX56蛋白具有特异性的单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。所述单克隆抗体可以利用DDX56蛋白或蛋白片段或功能区，通过免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。

本发明的抗体也可以是对DDX56蛋白具有特异性的多克隆抗体。所述的多克隆抗体可通过常规的方法来制备，例如，可通过将所述的DDX56蛋白导入动物中来获得，例如，将DDX56蛋白与弗氏佐剂按照适当比例(如1:1)混合后免疫动物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述动物可选自兔、羊、牛等。

本发明还提供了用于在分析物中检测DDX56基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增DDX56基因的引物；特异性识别DDX56基因的探针；或特异性结合DDX56蛋白的抗体。在获得了特异性检测DDX56基因或蛋白表达水平的试剂后，可以方便地制备出用于特异性检测DDX56的检测试剂盒。

一种检测试剂盒是基因水平的检测试剂盒，其中可包括：特异性结合DDX56蛋白的抗体。所述试剂盒中，除了含有抗DDX56的抗体以外，还可以包含：携带有可检测信号分子的检测抗体(用于与DDX56特异性抗体结合)，以及疫组化试剂。所述的免疫组化试剂包括但不限于：显色试剂，二甲苯，乙醇，H₂O₂甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂等。所述的“可检测信号分子”是指用于确定待检测样品中DDX56蛋白或片段的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的特异性抗体和检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种可检测信号分子。例如，可检测信号分子可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。当采用如上所示的一些酶作为可检测信号分子时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导可检测信号分子的存在情况或者存在量。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的可检测信号分子的种类和特性，选择适宜的底物。所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或蛋白或核酸序列的分析软件等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

患者样本

样本来自复旦大学上海肿瘤医院SCC患者。其中患者队列1包括从2007年1月至2009年12月接受手术的20例患者。

本发明人收集了患者手术切除的肿瘤组织和相邻正常组织，并立即将其储存在液氮中，肿瘤组织用于蛋白质组学分析。患者队列2包括从2010年12月至2011年7月接受手术的50例患者，其肿瘤组织用于构建组织芯片并用于免疫组织化学分析的。患者的纳入标准为：确诊的SCC患者，无肿瘤远端转移或其他手术禁忌症。排除其他恶性肿瘤或慢性或急性炎症状况的患者。队列1中早期疾病复发(ER)组的患者在手术后10个月内出现复发，而晚期疾病复发(LR)组的患者在手术后30个月内复发。在蛋白质组学分析中，本发明人使用配对样本分析的方案，每个ER组患者根据相似的临床特征的与LR组患者配对，包括性别，吸烟史，年龄和病理特征，包括TNM分期。两组队列患者的临床资料见表1和表2。

表1

表2

质谱准备

组织匀浆使用SDT裂解缓冲液(4％SDS，0.1M Tris-HCl pH7.6,0.1M DTT)和Tissue Lyser II(Qiagen)组织匀浆仪。蛋白质浓度通过使用295nm的激发波长的350nm处的色氨酸荧光发射测定。使用经修改的过滤辅助样品制备(FASP)(与iTRAQ标记相容)用于组织消化。iTRAQ定量蛋白质组学方法用于确定两个患者组之间蛋白质的差异表达。为了减少不同iTRAQ通道的技术偏差，每两对样品用4-plex iTRAQ试剂(Applied Biosystems)以两个顺序(正向和反向)标记。

液相色谱-串联质谱

肿瘤组织样本的蛋白质组学分析使用UltiMate 3000 nano LC液相色谱仪(戴安，赛默飞世尔科技)串联Orbitrap LTQ Velos质谱仪(赛默飞世尔科技)。将iTRAQ标记的样品混合并使用SCX柱在Agilent 1100 HPLC上分级分离。使用pH梯度洗脱缓冲液洗脱分级。收集6个组分，脱盐。SCX分级分离的肽段冻干后复溶于0.1％FA溶液，C18反相色谱(75微米×150毫米C18，3微米直径)分离；使用240分钟梯度，在300纳升的流速/分钟LTQ Orbitrapvelos以30,000分辨率用于一级质谱扫描，7500分辨率用于一级质谱中前十个最强的母离子的二级质谱扫描。

质谱数据的数据库搜索和定量分析

使用Mascot 2.2.2(Matrix Science)软件进行蛋白质鉴定。每个MS/MS谱图搜索前向和反向人类IPI数据库(IPI.human.3.8.4)。在肽段和蛋白质水平上，最大假发现率(FDR)设置为0.01。使用Buildsummary软件获得肽段和蛋白质的定量比。

统计与生物信息学分析

以蛋白质比例的log2值进行肿瘤组织样品的统计分析。使用R程序(版本3.2.0)进行wilcoxon signed rank test检验以鉴定两个患者组之间的显著差异表达的蛋白质，并计算p值。使用DAVID Bioinformatics Resources 6.7进行GO富集分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。Pathway分析使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件(Ingenuity Systems Inc)进行。候选蛋白质预后效应的验证使用两个在线生物标志物验证工具(SurvExpress，http://bioinformatica.mty.itesm.mx:8080/Biomatec/SurvivaX.jsp和KMplot，http://kmplot.com/analysis/)及已发表的Microarray数据。数据集中的患者样本根据基因表达的中位数(SurvExpress)或自动选择的截止值(KMplot)分成两组。通过Kaplan-Meier生存曲线比较两组患者的整体生存情况。计算危险比和logrankP值。

组织微阵列(TMA)和免疫组织化学(IHC)

包含56个SCC肿瘤组织核心和4个癌旁组织核心的组织芯片(TMA)用于免疫组化分析。Dako REAL EnVision K5007试剂盒用于IHC染色。TMA切片脱蜡并再水化。内源性过氧化物酶用0.3％过氧化氢(v/v)淬灭。TMA切片在微波炉中加热10分钟进行抗原恢复。抗原恢复后，在4％马血清中将切片在室温下封闭1小时，然后切片与抗DDX56(1：200，sc-393078，Santa Cruz，CA，USA)在4℃温育过夜。用PBST溶液漂洗后，将切片孵育依次用HRP兔/小鼠二级抗体和DAB试剂(Dako公司真实的Envision，K5007，CA，USA)。最后，切片用苏木精QS(Vector Labs，H3404，CA，USA)进行复染。在这60个核心中，六个核心在处理过程中丢失。IHC染色由经验丰富的病理学家分级，对所有临床病理资料审视，-(阴性)，+(弱染色)，++(中度染色)和+++(强染色)。共计54个核心得分并列在表2中。

免疫印迹

组织匀浆使用SDT裂解缓冲液(4％SDS，0.1M Tris-HCl pH7.6，0.1M DTT)和Tissue Lyser II(Qiagen)组织匀浆仪。蛋白质浓度通过使用295nm的激发波长的350nm处的色氨酸荧光发射测定。提取的蛋白质在12％SDS-PAGE上分离，电转膜至PVDF膜上。在含有5％BSA的TBST缓冲液(含有0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水)中在室温下封闭1小时，与一抗抗DDX56(1：1000，sc-393078，Santa Cruz，CA，USA)，抗β-肌动蛋白(1:5000，ab6276，Abcam)含有5％BSA的TBST缓冲液在4℃过夜，然后用TBST洗涤三遍，并在室温下与TBST缓冲液中的山羊抗小鼠HRP缀合的二抗(Santa Cruz)一起温育2小时。TBST缓冲液中洗涤三次后使用ECL Prime Western Blot试剂盒(GE Healthcare)和ImageQuant LAS4000(Fujifilm)观察免疫反应条带。

实施例1、使用基于iTRAQ的2D LC-MS/MS鉴定与SCC早期复发相关的差异表达蛋白

为了鉴定与SCC患者预后相关的蛋白质，本发明人比较了手术后早期复发(ER，10个月内)与晚期复发的患者(LR，>30个月)的原发性SCC肿瘤组织的蛋白质的差异表达。20个配对(根据患者相似的临床病理特征，包括性别，吸烟史，年龄和TNM状态)的SCC肿瘤样本进行iTRAQ标记定量蛋白质组学分析。本发明人共鉴定到4194种蛋白质(FDR<0.01，由至少1个独特肽鉴定)，其中，在至少6个样品组中鉴定到的蛋白质2743种，用于后续差异表达的统计分析。10对匹配的ER与LR SCC患者中的蛋白质表达比例的分布见图7。136个蛋白质(72个上调和64个下调的蛋白质)在ER与LR中表现出显著的差异表达(至少在4个配对样本中表达水平差异>1.5倍，p值<0.05，采用单样本Wilcoxon检验，定量蛋白质组学分析实验方案如图1所示。

实施例2、生物信息学分析和差异表达蛋白质的综合文献调查

为了研究鉴定到的差异表达蛋白质的生物学功能，本发明人进行了蛋白质网络分析和基因本体(GO)分析。使用IPA软件进行136个显著改变的蛋白质的网络分析。如图2(A-B)，IPA分析确定的前2名疾病和功能网络是“细胞运动，炎症反应，毛发和皮肤发育与功能”(评分＝43)和“癌症，血液病，细胞发育”(得分＝26)。结果表明，ER与LR患者的蛋白质显著改变与细胞运动和癌症网络密切相关。对上调蛋白和下调蛋白进行GO分析，分别使用DAVIDBioinformatics资源6.7。GO中确定的前五大GO条款如图3所示。GO分析显示，ER患者的下调蛋白主要与免疫反应有关，而上调蛋白主要参与RNA加工。

这些结果提示，上调的蛋白质在SCC的早期复发中起作用，也暗示了RNA加工与癌症复发之间的联系。

为了更好地了解与SCC早期复发相关的蛋白的生物学背景，本发明人基于文献和公共数据库检索，分析了前10种上调蛋白质，大多数蛋白质已经被报道与不同的癌症或癌症的预后有关，4种蛋白质已被归类为人类蛋白质图谱中的癌症相关或疾病相关基因。有趣的是，其中DDX56(IPI00302281)已被证明发挥核糖体生物发生的作用，并被用于传染性西尼罗河病毒颗粒的组装，然而还没有研究表明DDX56在癌症中的作用。

表3、肿瘤组织中DDX56蛋白的相关信息

实施例3、DDX56的表达与肺癌患者生存期的相关性

为了进一步评估DDX56与前10种ER组中上调的蛋白质和癌症患者的总生存率之间的相关性，本发明人使用了两种在线生存分析软件：SurvExpress和KMplot。

SurvExpress生存分析基于一个已发表达130个SCC患者microarray数据集，本发明人对DDX56单独分析同样显示，DDX56的高基因表达水平与SCC患者预后不良显著相关(风险比＝1.74，logrank P值＝0.0261；图4，A)。

接下来，本发明人使用了KMplot在各种癌症类型中对DDX56与癌症预后的相关性做进一步的调查。KMplot的背景数据库包括了2,437个肺腺癌患者，平均随访为69，40，49和33个月。结果表明，DDX56的高基因表达水平与和肺腺癌(风险比＝3.05，logrank P值＝2.4e-13；图4，B)患者较短的总生存期(OS)显著相关。

为了验证DDX56的蛋白质组学定量结果，本发明人对ER和匹配的LR SCC患者之间的肿瘤组织进行了Western blot分析。DDX56信号强度使用β-肌动蛋白进行归一化。结果显示，与匹配的LR患者相比，ER患者DDX56的表达水平显著升高(图5，A；P＝0.046，由配对学生t检验确定)。本发明人进一步通过Western blot分析来自队列1的患者的相邻正常组织中DDX56蛋白表达，以研究ER和匹配的LR患者之间相邻正常组织中DDX56是否存在差异表达模式。如图5的B图所示，ER和匹配的LR SCC患者之间的相邻正常组织中DDX56的蛋白表达没有显著差异。

为进一步验证DDX56蛋白表达水平与SCC患者总生存期(OS)之间的相关性，本发明人通过IHC在由56例SCC患者组成的独立患者队列中分析了SCC原发性肿瘤中的DDX56蛋白质表达(其中35例完整的随访资料可用)。根据IHC染色将患者分为低(阴性和弱染色)或高(中等和强染色)DDX56表达组(表2)。Cox回归分析显示，DDX56蛋白质表达水平与患者队列的OS显著相关(风险比＝2.03，logrank P值＝0.0338)(图6，A-B)。图6的最终结果表明低表达DDX56可以使总生存期显著增加(曲线下面积越大，生存期越长)。

为了确定DDX56的表达水平是否独立于其它预后指标，本发明人使用卡方检验验证DDX56(高DDX56或低DDX56)的IHC染色水平与其它临床病理特征(年龄，分期，肿瘤分级和淋巴结状态)的相关性。如表4所示，DDX56表达与年龄，肿瘤分期，肿瘤分级和淋巴结状态无统计学意义的相关性。有趣的是，本发明人还发现大多数T3肿瘤(直径大于5.0厘米的肿瘤)为高DDX56(85.7％)表达。

表4、肿瘤中临床病理特征与DDX56表达水平之间相关性的卡方分析

综上，本发明人使用基于iTRAQ的定量蛋白质组学研究了手术后早期复发(ER)患者和晚期复发(LR)患者的肺鳞状细胞癌肿瘤组织中的差异表达的蛋白。在ER与LR组中，前10个显著上调的蛋白质中，DDX56被鉴定为SCC的潜在新型预后标志物。并通过了另一独立的SCC患者样本组织芯片的验证。DDX56在肺腺癌中与预后的相关性也通过了在线生存分析程序进行验证，结果表明，DDX56mRNA的表达水平同时也与肺腺癌的总体生存期(OS)显著相关。DDX56作为肺癌预后标志物的研究未见相关报道。

本发明人的研究结果首次表明，DDX56可作为评估肺鳞状细胞癌和肺腺癌早期复发风险的预后指标，并表明DDX56可能在肺癌进展中发挥作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院;复旦大学附属肿瘤医院

<120> 用于肺癌诊断或预后的标志物及诊断试剂

<130> 173461

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2499

<212> DNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 1

taccacaaat ttactggctt aaaacgacgc aagtctgtag gtcagaagtc tgacacgggt 60

cttaactggt gacccgagtc agatttggga cacaaagaac agaaaccaag ctgtgcaggt 120

ttctgacagg cagtccggtt agggagccct acagcaaccc gccggtcctc tctctcaggc 180

agttgctgcc atggctcatt attccaaccg gttctcctca gcccagtcta tctcagtggc 240

tccattcata gggtgatgtg cccggcggga cactaaccct aaccaagcag agagacggtc 300

atgcccgtca cgacctcggc cctcgccccg gccgaggctt ctcctgcagg tcgcgagaat 360

caggtgcgtc agcggcgtcc gggaacgccg gaagagccag tggagcggct ctgtagtcca 420

aagtaccccg tcgaccccag cacggccgct ccaccgcctc ctactagacc cagtcctagg 480

gactgcgcag tcgcagagct ccgtccgagt accggaagcc taggccgcca gcacttccgg 540

gaagtgactt cgtctccgaa gccgattggt tgttgctttg ctcccgctcg cgtcggtggc 600

gtttttcctg cagcgcgtgc gtgctgcgct actgagcagc gccatggagg actctgaagc 660

actgggcttc gaacacatgg gcctcgatcc ccggctcctt caggctgtca ccgatctggg 720

ctggtcgcga cctacgctga tccaggagaa ggccatccca ctggccctag aagggaagga 780

cctcctggct cgggcccgca cgggctccgg gaagacggcc gcttatgcta ttccgatgct 840

gcagctgttg ctccatagga aggcgacagg tccggtggta gaacaggcag tgagaggcct 900

tgttcttgtt cctaccaagg agctggcacg gcaagcacag tccatgattc agcagctggc 960

tacctactgt gctcgggatg tccgagtggc caatgtctca gctgctgaag actcagtctc 1020

tcagagagct gtgctgatgg agaagccaga tgtggtagta gggaccccat ctcgcatatt 1080

aagccacttg cagcaagaca gcctgaaact tcgtgactcc ctggagcttt tggtggtgga 1140

cgaagctgac cttctttttt cctttggctt tgaagaagag ctcaagagtc tcctctgtca 1200

cttgccccgg atttaccagg cttttctcat gtcagctact tttaacgagg acgtacaagc 1260

actcaaggag ctgatattac ataacccggt tacccttaag ttacaggagt cccagctgcc 1320

tgggccagac cagttacagc agtttcaggt ggtctgtgag actgaggaag acaaattcct 1380

cctgctgtat gccctgctca agctgtcatt gattcggggc aagtctctgc tctttgtcaa 1440

cactctagaa cggagttacc ggctacgcct gttcttggaa cagttcagca tccccacctg 1500

tgtgctcaat ggagagcttc cactgcgctc caggtgccac atcatctcac agttcaacca 1560

aggcttctac gactgtgtca tagcaactga tgctgaagtc ctgggggccc cagtcaaggg 1620

caagcgtcgg ggccgagggc ccaaagggga caaggcctct gatccggaag caggtgtggc 1680

ccggggcata gacttccacc atgtgtctgc tgtgctcaac tttgatcttc ccccaacccc 1740

tgaggcctac atccatcgag ctggcaggac agcacgcgct aacaacccag gcatagtctt 1800

aacctttgtg cttcccacgg agcagttcca cttaggcaag attgaggagc ttctcagtgg 1860

agagaacagg ggccccattc tgctccccta ccagttccgg atggaggaga tcgagggctt 1920

ccgctatcgc tgcagggatg ccatgcgctc agtgactaag caggccattc gggaggcaag 1980

attgaaggag atcaaggaag agcttctgca ttctgagaag cttaagacat actttgaaga 2040

caaccctagg gacctccagc tgctgcggca tgacctacct ttgcaccccg cagtggtgaa 2100

gccccacctg ggccatgttc ctgactacct ggttcctcct gctctccgtg gcctggtgcg 2160

ccctcacaag aagcggaaga agctgtcttc ctcttgtagg aaggccaaga gagcaaagtc 2220

ccagaaccca ctgcgcagct tcaagcacaa aggaaagaaa ttcagaccca cagccaagcc 2280

ctcctgaggt tgttgggcct ctctggagct gagcacattg tggagcacag gcttacaccc 2340

ttcgtggaca ggcgaggctc tggtgcttac tgcacagcct gaacagacag ttctggggcc 2400

ggcagtgctg ggccctttag ctccttggca cttccaagct ggcatcttgc cccttgacaa 2460

cagaataaaa attttagctg ccccaaaaaa aaaaaaaaa 2499

<210> 2

<211> 547

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 2

Met Glu Asp Ser Glu Ala Leu Gly Phe Glu His Met Gly Leu Asp Pro

1 5 10 15

Arg Leu Leu Gln Ala Val Thr Asp Leu Gly Trp Ser Arg Pro Thr Leu

20 25 30

Ile Gln Glu Lys Ala Ile Pro Leu Ala Leu Glu Gly Lys Asp Leu Leu

35 40 45

Ala Arg Ala Arg Thr Gly Ser Gly Lys Thr Ala Ala Tyr Ala Ile Pro

50 55 60

Met Leu Gln Leu Leu Leu His Arg Lys Ala Thr Gly Pro Val Val Glu

65 70 75 80

Gln Ala Val Arg Gly Leu Val Leu Val Pro Thr Lys Glu Leu Ala Arg

85 90 95

Gln Ala Gln Ser Met Ile Gln Gln Leu Ala Thr Tyr Cys Ala Arg Asp

100 105 110

Val Arg Val Ala Asn Val Ser Ala Ala Glu Asp Ser Val Ser Gln Arg

115 120 125

Ala Val Leu Met Glu Lys Pro Asp Val Val Val Gly Thr Pro Ser Arg

130 135 140

Ile Leu Ser His Leu Gln Gln Asp Ser Leu Lys Leu Arg Asp Ser Leu

145 150 155 160

Glu Leu Leu Val Val Asp Glu Ala Asp Leu Leu Phe Ser Phe Gly Phe

165 170 175

Glu Glu Glu Leu Lys Ser Leu Leu Cys His Leu Pro Arg Ile Tyr Gln

180 185 190

Ala Phe Leu Met Ser Ala Thr Phe Asn Glu Asp Val Gln Ala Leu Lys

195 200 205

Glu Leu Ile Leu His Asn Pro Val Thr Leu Lys Leu Gln Glu Ser Gln

210 215 220

Leu Pro Gly Pro Asp Gln Leu Gln Gln Phe Gln Val Val Cys Glu Thr

225 230 235 240

Glu Glu Asp Lys Phe Leu Leu Leu Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ser Leu

245 250 255

Ile Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Val Asn Thr Leu Glu Arg Ser Tyr

260 265 270

Arg Leu Arg Leu Phe Leu Glu Gln Phe Ser Ile Pro Thr Cys Val Leu

275 280 285

Asn Gly Glu Leu Pro Leu Arg Ser Arg Cys His Ile Ile Ser Gln Phe

290 295 300

Asn Gln Gly Phe Tyr Asp Cys Val Ile Ala Thr Asp Ala Glu Val Leu

305 310 315 320

Gly Ala Pro Val Lys Gly Lys Arg Arg Gly Arg Gly Pro Lys Gly Asp

325 330 335

Lys Ala Ser Asp Pro Glu Ala Gly Val Ala Arg Gly Ile Asp Phe His

340 345 350

His Val Ser Ala Val Leu Asn Phe Asp Leu Pro Pro Thr Pro Glu Ala

355 360 365

Tyr Ile His Arg Ala Gly Arg Thr Ala Arg Ala Asn Asn Pro Gly Ile

370 375 380

Val Leu Thr Phe Val Leu Pro Thr Glu Gln Phe His Leu Gly Lys Ile

385 390 395 400

Glu Glu Leu Leu Ser Gly Glu Asn Arg Gly Pro Ile Leu Leu Pro Tyr

405 410 415

Gln Phe Arg Met Glu Glu Ile Glu Gly Phe Arg Tyr Arg Cys Arg Asp

420 425 430

Ala Met Arg Ser Val Thr Lys Gln Ala Ile Arg Glu Ala Arg Leu Lys

435 440 445

Glu Ile Lys Glu Glu Leu Leu His Ser Glu Lys Leu Lys Thr Tyr Phe

450 455 460

Glu Asp Asn Pro Arg Asp Leu Gln Leu Leu Arg His Asp Leu Pro Leu

465 470 475 480

His Pro Ala Val Val Lys Pro His Leu Gly His Val Pro Asp Tyr Leu

485 490 495

Val Pro Pro Ala Leu Arg Gly Leu Val Arg Pro His Lys Lys Arg Lys

500 505 510

Lys Leu Ser Ser Ser Cys Arg Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ser Gln Asn

515 520 525

Pro Leu Arg Ser Phe Lys His Lys Gly Lys Lys Phe Arg Pro Thr Ala

530 535 540

Lys Pro Ser

545

Claims

1.DDX56蛋白或其编码基因在制备诊断试剂中的用途，所述的诊断试剂用于对肺癌进行诊断或预后。

2.一种特异性识别DDX56蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于制备对肺癌进行诊断或预后的诊断试剂或诊断试剂盒。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的肺癌包括：非小细胞肺癌，肺鳞状细胞癌，肺腺癌。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的对肺癌进行诊断或预后是：对肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期复发进行诊断或预后。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的对肺癌进行诊断或预后是：对肺鳞状细胞癌或肺腺癌患者的总生存期进行预后。

6.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂选自：

特异性扩增DDX56蛋白的编码基因的引物；或

特异性识别DDX56蛋白的编码基因或其转录本的探针；或

特异性抗DDX56蛋白的抗体。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂是特异性抗DDX56蛋白的抗体。

8.一种用于对肺癌进行诊断或预后的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：检测DDX56蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测DDX56蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自：

特异性扩增DDX56蛋白的编码基因的引物；或

特异性识别DDX56蛋白的编码基因或其转录本的探针；或

特异性抗DDX56蛋白的抗体。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：

核酸抽提试剂；和/或

聚合酶链反应试剂；和/或

蛋白免疫印迹试剂；和/或

酶链免疫反应试剂。

11.一种对肺癌进行诊断或预后的方法，其特征在于，所述方法包括：检测待测样品中的DDX56蛋白或其编码基因的表达情况，若检测为DDX56表达量显著升高，则该待测样品的提供者为肺鳞状细胞癌或肺腺癌早期复发高风险者，或总生存期预后不理想者。