CN112322734A

CN112322734A - 一种与肺癌相关的诊断标志物及其应用

Info

Publication number: CN112322734A
Application number: CN202011258451.7A
Authority: CN
Inventors: 陈辰; 黄兴; 于韶荣; 陆建伟; 戴立玲
Original assignee: Jiangsu Cancer Hospital
Current assignee: Jiangsu Cancer Hospital
Priority date: 2020-11-11
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-11-11
Also published as: CN112322734B

Abstract

本发明公开了一种与肺癌相关的诊断标志物及其应用。所述的诊断标志物为编码IL1F5蛋白的以及编码该蛋白的mRNA。本发明通过临床肺腺癌临床样本进行PCR检测和组织芯片免疫组化证实，IL1F5在肺腺癌中表达增高，经生存分析提示IL1F5表达较高的患者预后较差；通过体外细胞实验研究siRNA下调IL1F5基因表达对肺腺癌细胞增殖侵袭等生物学行为的影响，发现特异性的siRNA序列可以有效抑制人肺腺癌细胞株H1299中IL1F5蛋白的表达，且在与CD8⁺T细胞共培养情况下，IL1F5表达降低的H1299细胞的增殖、侵袭能力降低(单独培养肿瘤细胞无差异)。

Description

一种与肺癌相关的诊断标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与肺癌相关的诊断标志物及其应用。

背景技术

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，近年来我国肺癌发病病理类型悄然发生改变，肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)发病率已上升至肺癌发病总数的70％，超过肺腺鳞癌占据主导地位。随着手术、化疗、放疗水平的进步，近年来肺腺癌患者的生存率有了较大的提高。但由于肺腺癌多为周围型，早期常无明显的临床症状，往往在明确诊断时为时已晚，错过了最佳手术时期。并且，传统的放化疗敏感性有限，并且治疗过程中，因为基因突变产生化疗耐药及放疗抵抗的患者不在少数。

通过不断地探索，包括肺腺癌在内的实体肿瘤因为其复杂性，被越来越多的科学家们认为是一种“器官”。其中不仅含恶性肿瘤细胞，还包括成纤维细胞、血管、淋巴管内皮细胞等，更有浸润的免疫系统细胞及它们产生的各种细胞因子。它们相互作用，共同构成了肿瘤微环境。其中，在肿瘤发生及恶性进展过程中，肿瘤浸润的免疫细胞用处不容小觑，炎性微环境中的细胞因子在免疫逃逸的过程中也发挥着重要的调控作用，与肿瘤的发生、发展、转移以及血管形成均密切相关。

在肿瘤进展过程中，识别免疫反应的特定缺陷或功能异常，使肿瘤免疫微环境达到免疫正常化(Immune normalization)，对于继续改善肺腺癌患者的预后至关重要。针对逆转肿瘤的免疫逃逸，PD-1、PD-L1、CTLA-4等免疫检查点抑制剂表现卓越，但这些靶点还远远不够彻底逆转肿瘤免疫微环境的免疫抑制状态，相关药物单独用于晚期肺腺癌患者，有效率仅为20％。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是一种与肺癌相关的诊断标志物及其应用、试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种与肺癌相关的诊断标志物，所述诊断标志物为IL1F5蛋白或编码该蛋白的mRNA。

优选的，所述IL1F5蛋白序列为SEQID NO.1，所述编码该蛋白的mRNA对应的cDNA序列为SEQID NO.2。

优选的，当该诊断标志物为编码该蛋白的mRNA时，PCR上游引物选自SEQID NO.3，下游引物选自SEQID NO.4：

前述所述的诊断标志物在制备用于肺癌诊断的试剂或试剂盒中的应用。

前述所述的诊断标志物在制备用于肺癌判断预后的试剂或试剂盒中的应用。

前述所述的诊断标志物在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。

优选的，所述药物包括IL1F5(human)siRNA-112、IL1F5(human)siRNA-482或IL1F5(human)siRNA-288，所述IL1F5(human)siRNA-112序列为SEQID NO.5，所述IL1F5(human)siRNA-482序列为SEQID NO.6，所述IL1F5(human)siRNA-288序列为SEQID NO.7

其中，序列如下：

SEQID NO.1MVLSGALCFR MKDSALKVLY LHNNQLLAGG LHAGKVIKGE EISVVPNRWLDASLSPVILG VQGGSQCLSC GVGQEPTLTL EPVNIMELYL GAKESKSFTFYRRDMGL TSSFESAAYPGWF LCTVPEADQP VRLTQLPENG GWNAPITDFYFQQCD

SEQID NO.2

ATGGTCCTGAGTGGGGCGCTGTGCTTCCGAATGAAGGACTCGGCATTGAAGGTGCTTTATCTGCATAATAACCAGCTTCTAGCTGGAGGGCTGCATGCAGGGAAGGTCATTAAAGGTGAAGAGATCAGCGTGGTCCCCAATCGGTGGCTGGATGCCAGCCTGTCCCCCGTCATCCTGGGTGTCCAGGGTGGAAGCCAGTGCCTGTCATGTGGGGTGGGGCAGGAGCCGACTCTAACACTAGAGCCAGTGAACATCATGGAGCTCTATCTTGGTGCCAAGGAATCCAAGAGCTTCACCTTCTACCGGCGGGACATGGGGCTCACCTCCAGCTTCGAGTCGGCTGCCTACCCGGGCTGGTTCCTGTGCACGGTGCCTGAAGCCGATCAGCCTGTCAGACTCACCCAGCTTCCCGAGAATGGTGGCTGGAATGCCCCCATCACAGACTTCTACTTCCAGCAGTGTGACTAG

IL1F5(国家基因库，Entrez ID：26525)基因序列为

＞NC_00000212：113058638-113064744Homo sapiens chromosome 2，GRCh38.p13PrimaryAssembly

GGAGAGTCCCACCTCTAACATCTCCTGTAGGCCTGGCAATGGCAGGCAGGAAAGACAGAGGAAGGAAGGAGGGAGAAGGGAAGGAGTGAAGGAAGGAGTGAAAAAGGTAAGGAAGAAAGGGAATAGGGGAGGAAGGGAGGAAATGGGAAGGGAAAGAAGGAAAGGAAGGAAAGAGGGAGGGAAGAAAGGAAGGGAAAAGGGAGGGAGTGAGTGAATGAAAGATGGAAAGAAGGAAGAAAGGGAGGGAGGCAGGGAGGAAAGAAAGTCGCGCTTCCCTTGAGCTGCCATGGGCACTGACTCTTAGGGTCTGAAAGCCCCTGAGATGCAAAAGCCTAGTGCTCACAAAGAGCTGGAAAGCCTCAAGGAAGTTCTTCAATATTTCTGGAAGGAAACTGTCTCCAGAAGCTTCCCTCCCCACGACAGATAATGAGCAGCAAGTGCTTCTGGCGACTTAGGGTGATGTGAAATCACGCTGGGAATCCTGCTCCTCCTCAGGTCCTGGCAGTTTCAGGGCCCCTCCCTAGGCCTTACTTAAAAGGCTGAGGCATCCTTGGAGGAACAGGCAGACTCCACAGCTCCCGCCAGGAGAAAGGAACATTCTGAGGTATGCTCTGGGGCGCTGGTGGTACCGGAGCTCTCTCCTGACCCCAGACCCAGAATCTGCTCCGTGGAGGCTGTTCACATGCTGGGGAGCTCGGTGCAGCTGCTTGCTCCCCAGACCCCAGCCAACTCAGCCTCTCTCTCCATGATTTTCTGTTGTTTATTCCAAAATAGGGGAGTCTACACCCTGTGGAGCTCAAGATGGTCCTGAGTGGGGCGCTGTGCTTCCGGTGAGTGTATGAGGCCCTGGTTTGGTGGTGTCCTCCGGAGGAAGTGAGTTCTGGATAGACCCGTTGTCCAGCTCTGAGCAGGAGGGAGGAAGGGAGGGGCTGCCATTGCAGCTGGGAAATTGTGACCAGCACCTCACTGCTCTTAGAGTTTTCCCAGCCTTTTTCAAATAGGGGCAGGACTGGGGCAGGCCATCTCACAAGGGGTCCCTGATGCTGAGGGGGATAAGTGAACCTCCCAGTCTAGAGCTCCAGCCAAGTCTATCCAAGGTGGGAACGGGGGCCAGGATCCCTGCTCAGAGCTCCGCCATTGTCCCCCATCACAGTGAATGGATGTAAGCTCACCCACTCTGTGCCCCTGCCTCCCTGCTACTCTTTGGGGATAATAATAAAACAAAAACCATTACCATCAGTCAGTCTGTCCACCCACTGGCATGTACCAAGCCAGACACTCTGCCGTGTTCTGGGCTTTACAACAGAGGATGAGAGTGGTCCTTTCTCTCAGTCTAATAAAGCACTTCCCATGATGTGTTCTATGGGACTCGATTAGAGGAGTCCCACAGAGGCATCCAGGAGATGCTTTACACAGTGGAGCTCTCTGATCAAGTAAATGCAGGGAATTCTGCTTTCTACATCCTCTCATAAGAGAACCACAGCCCAGCTCAGCATATGAGTGACTCTGAGGTTTTCTGAAGTAAGGCAACTTGTTGAATTGTATTTAGCCATGCATCGACCCAATTTTTACACTGCATCCTTTTCCCCCATATAACTTTTGGAGAAACCCACTTTAGGATACATCTTCCACCTCATAGGATGCCAGGAAATCAACTGAGTTCAAAGATGAGAAACAACTTTGAAAAGTTAAATAAAAGAAATTTAAATTTAAAGAAACTCCTCACTTAGTAAGGAATATATGACCAAATAGAAATACATGTATCTTGAAGAATTGAAGAATCAGGCTTTAACGTGGAAGAGGCCTGGATGTTATCCAACCCATCATCTTAGTGTAGCAATGGGGAGGCTCAGGCCCAGAGTGGGCGAGAGAGTTGTCTCCTGCGACTCAGCAGCATTGGAGGCAGAGATGGGGCAAGAACCTAGGGCTCTG

有益效果

与现有的技术相比，本发明委托生物样本库制备成组织芯片，利用免疫组化技术检测肺腺癌中IL1F5的表达情况，结果提示IL1F5的表达在肺腺癌组织中明显高于癌旁正常组织，且经过统计IL1F5高表达组患者的预后较差。因此可以以IL1F5蛋白和编码其的mRNA作为肺癌的诊断标志物。

经过Westem blot、Transwell、CCK8、划痕等体外实验，利用小干扰RNA抑制IL1F5基因表达来研究对肺腺癌细胞生物学行为的影响；发现特异性的siRNA序列可以有效抑制人肺腺癌细胞株H1255中IL1F5蛋白的表达，在与CD8⁺T细胞共培养的前提下，可明显降低肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力，而单独培养肿瘤细胞则无明显差异，说明IL1F5可通过诱导肿瘤的免疫逃逸；

因此IL1F5可以作为肺腺癌细胞免疫治疗的一个靶点，在制备肺腺癌诊断试剂盒和治疗肺腺癌的药物中将具有广泛的应用。

附图说明

图1 IHC检测IL1F5在肺腺癌及癌旁组织中的表达图

图2 IL1F5表达情况、肺腺癌分期与肺腺癌患者预后的关系

图3A肺腺癌细胞株H3255、H1299及A549，正常人肺上皮细胞HBE为对照，qRT-PCR和Western-blot分别检测IL1F5的mRNA和蛋白表达水平图；

图3B选取肺腺癌细胞株H1299进行siRNA干扰，测定转染效率；

图4两种状态(单独培养H3255细胞、H3255细胞和CD8+TIL共培养)下，CCK8检测肿瘤细胞增殖；

图5划痕实验验证两种培养状态下肿瘤细胞迁移能力；

图6 Transwell实验检测两种培养状态下肿瘤细胞的侵袭能力。

图7免疫正常的C57BL/6小鼠(图7A)NOD/SCID免疫缺陷小鼠(图7B)中，干扰IL1F5表达对肿瘤生长情况的影响

具体实施方式

通过下列实施例可以进一步说明本发明，实施例是为了说明而非限制本发明的。本领域的任何普通技术人员都能够理解这些实施例不以任何方式限制本发明，可以对其做适当的修改和数据变换而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。

以下实施例中使用的主要试剂为：二步法免疫组化检测试剂盒：基因科技上海有限公司；兔抗人、鼠IL1F5多克隆抗体(免疫组化试验用，Novus公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(免疫组化试验用，北京中杉金桥公司)；抗体稀释液(北京中山生物技术有限公司)；0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)(北京中山生物技术有限公司)；DAB：Dako公司；二甲苯、中性树胶等由病理科提供。DAB工作液：试剂C∶试剂B＝1∶50；人肺腺癌细胞株A549、H3255(购自南京科佰生物科技有限公司)；1640培养基、胎牛血清：美国gibco公司；BCA蛋白测定试剂盒：Biosharp；PVDP膜(Westernblot试验用)：Bio-Rad公司；兔兔抗人、鼠IL1F5多克隆抗体(免疫组化试验用，Novus公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔/鼠IgG(Westemblot试验用)：abcam公司；ECL发光试剂盒(苏州新赛美公司)；LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)。PMI-1640完全培养液：分别加入RPMI-1640与胎牛血清混匀，使其终浓度分别为90％，10％，1×，4℃保存。细胞冻存液：将RPMI-1640完全培养液、胎牛血清和DMSO按5∶4∶1比例配制，4℃保存。1×PBS1L：取Na₂HP0₄·，12H₂O3.23g、Na₂H₂PO₄·，2H₂O 0.45g、Nacl 8g混合溶解，定容至1L。1×TBST1L：取Tris2.42g、NaCl8.0g、Tween-200.5mL，混合溶解，定容至1L，常温保存。1×转膜Buffer1L：甘氨酸14.4g、Tris3.03g，加适量双蒸水搅拌溶解，再加200mL无水甲醇，定容至1L，混合均匀(用时配制)。封闭液100mL：取脱脂奶粉5g，加入100mL1×TBST，混合溶解即可(需用时配制)。

以下实施例中使用的主要仪器如下：组织芯片制作仪：美国Beecher Instruments公司；自动免疫组化染色仪(2D)：美国LABVISION公司。倒置相差显微镜：日本Olympus公司；凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司；多功能酶标仪：美国Thermo公司；BD Accuri^TM C6流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司。

实施例1

219例肺腺癌组织切片标本、相应32例癌旁组织疾病切片标本，所有切片组织均取自南京医科大学附属肿瘤医院病理科2007-2017年间住院手术治疗患者。所有的病例均是由两名病理学专家进行病理组织学确定，患者术前没有接受过免疫治疗、化疗或放疗，临床病例资料详细完整。

所有组织标本均常规10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，蜡块经筛选无明显缺陷，委托病理科制作成厚度为4mm厚的组织芯片，置于冰箱4℃冷藏室储存备用。

1.1组织芯片的制作：

(1)根据HE染色切片的镜检结果，在蜡块上有代表性的癌巢区域作标记。(2)1∶1混合石蜡与蜂蜡，制作空白受体蜡块。在蜡块上设计10×7孔，共350点组织阵列，然后用组织芯片仪制成TMA空白蜡块。(3)将供体蜡块在标记的点上选取最有代表性的癌巢区域，取直径2mm的组织块，每例各取1个芯。(4)将取好的组织芯转移到受体蜡块的孔中，并取相应癌旁组织做对照。(5)组织阵列块在55℃的恒温烤箱中加热融合10分钟，在快融化之前放至室温冷却，使受体蜡块与供体组织融为一体。(6)将组织芯片置于4℃条件下冷冻4小时左右，随后用全自动组织切片机对组织阵列块进行修正，速度为20mm/转，等修到所有组织芯完全曝露。(7)用切片机对组织阵列块进行切片，将连续切片分别漂在凉水中，使其自然展开，再将切片转移至45℃温水中展片2分钟左右，待展开后将其贴在经过防脱片处理的载玻片上晾干。(8)将切片置于60℃的环境下烤片3分钟，58℃继续烤片16h。(9)将做好的组织芯片保存于切片盒，置于冰箱4℃冷藏室备用。

1.2免疫组化染色(EnVision两步法)

(1)脱蜡水化：组织芯片先放在60℃的恒温箱中，烘烤约6-8小时，便于二甲苯脱蜡。将已干燥的组织芯片浸于二甲苯中30分钟2次。取出后进行梯度酒精脱水，100％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，80％乙醇5分钟，70％乙醇5分钟，ddH₂O水冲洗组织芯片。(2)抗原修复：将组织芯片置于耐高温切片架上，置于pH为6.0的柠檬酸盐缓冲液，99℃高温修复30分钟，自然冷却至室温后用PBS冲洗3次，每次5分钟，最后用免疫组化笔画出组织范围。(3)滴加30％H₂O₂避光孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，再将芯片置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，总共3次，然后取出甩干。(4)滴加10％封闭液，置于室温下20分钟后PBS冲洗。(5)用一抗稀释液稀释兔抗人IL1F5多克隆抗体(稀释比例为1∶50)，后滴200μl加于组织芯片上，在4℃条件下过夜。(6)第二天，取出组织芯片，复温30分钟，后置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，之后取出甩干。(7)在组织芯片上滴加200μl的二抗增强剂，于室温孵育30分钟，将组织芯片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，取出甩干。(8)滴加200μl二抗，与室温下放置30分钟，将组织芯片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，取出甩干。(9)滴加准备好的显色剂DAB工作液，光镜下控制显色程度，显色完全后，立即用蒸馏水冲洗，终止显色。(10)衬染：于肺腺癌组织切片上滴加适量的苏木素复染10-20s，后在自来水中缓缓冲洗，然后再放于盐酸-乙醇分色液中约2-3s，最后用流水缓慢冲洗5分钟。(11)脱水：准备不同浓度梯度的乙醇溶液(70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇)，按顺序依次浸泡3min×1次、3min×1次、5min×1次、5min×1次，后稍微吹干切片上的乙醇，再浸于二甲苯溶液中8min×2次。(12)封片：在肺腺癌组织切片中央处滴一滴中性树脂，盖上盖玻片并轻轻按压，此过程不要产生气泡，置于通风橱中风干。

结果判断：免疫组化结果判断采用双盲法，由两位经验丰富的病理科医师对组织芯片上的染色结果独立评价。根据染色阳性的肿瘤细胞数目所占百分比计为0～100％，染色强度按肿瘤细胞着色的深浅计分：无着色为0分，黄色计1分，浅棕色计2分，棕褐色计3分。IL1F5的最终染色得分为染色强度与阳性细胞染色面积的乘积。IL1F5表达分数的分界点由X-tile软件得出。评分如下：0～139为低表达或无表达，140～300为高表达。

所有数据均用统计软件SPSSV.20.0和STATAV.9.0处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，IL1F5表达与肺腺癌患者的预后关系分析用Kaplan-Meier生存分析，所有检验结果P＜0.05为差异有统计学意义。

我们对219例肺腺癌组织切片标本行免疫组化染色，IL1F5蛋白阳性主表达于肺腺癌组织的间质和细胞质中，呈棕黄色，而癌旁组织低表达或无表达，见免疫组化照片(图1中同一患者的连续切片用IL1F5进行染色：在肺腺癌组织SampleA/B/C中IL1F5的表达呈阳性；正常组织Sample D中IL1F5为阴性表达)。且发现IL1F5表达升高程度与TNM分期密切相关(表1)，免疫组化染色结果显示TNM分期为0-I期的胃癌组织IL1F5蛋白表达阳性率为39.33％(35/89)，II期阳性率56.94％(41/72)，III期-IV期阳性率60.00％(33/55)，差异显著，有统计学意义(P＝0.022)。单因素分析、多因素分析和Kaplan-Meier生存曲线(图2)均显示高表达IL1F5的肺腺癌患者预后较差，总体生存率(OS)显著差于低表达的患者(表2、图2)*P＜0.05。

表1 IL1F5/IL36γ在肺腺癌组织中的表达与临床病理分期的关系

*P＜0.05.

表2 IL1F5在肺腺癌组织中的表达和患者预后的关系

＊P＜0.05

可见，IL1F5蛋白的表达与肺腺癌TNM分期正相关。IL1F5高表达患者较低表达患者预后差。

实施例2

2.1 siRNA设计

选用人IL1F5的四段不同的siRNA序列及阴性对照siRNA(negative control，NC)，由bioinshine公司设计并完成，序列如下：

2.2细胞复苏：

(1)从-80℃冰箱中取出H3255细胞的冻存管，放到37℃水浴箱中快速摇动，使细胞在1min内完全解冻。取出冻存管酒精消毒后放入超净台。(2)吸取细胞悬液至15mL的离心管中，添加10mLRPMI-1640于AGS，SNU719，MKN1，H3255，MKN27细胞中，混合均匀，1200rpm离心3min。(3)倒去上清，取2mL含10％胎牛血清的培养液重悬细胞，转移到细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，次日更换一次培养液，继续培养。

2.3细胞传代培养：

(1)紫外灯消毒超净台30分钟，将所需液体提前从冰箱中拿出复温待温，打开酒精灯。(2)将培养瓶中旧培养液弃去，PBS冲洗一遍，加入1mL含0.02％EDTA+0.25％胰酶消化液，消化3～5分钟，显微镜下观察细胞状态，当细胞变圆，间隙变大时，加入5mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化，用吸管反复吹打瓶底。(3)细胞悬液离心，1200rpm，3分钟后弃去上清液，加入含10％胎牛血清的RPMI-164培养基重悬细胞，分装至新的培养瓶，再加入适量培养液，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

2.4细胞计数法：

(1)细胞消化制备成细胞悬液，用酒精棉球将盖玻片擦干净，放到细胞计数板上。(2)吹打细胞悬液使其混匀，取10μl轻轻注入盖玻片和计数板的交界处。(3)在显微镜下读取计数板四角大方格的细胞数，细胞压到线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方。(4)计算：细胞密度(个/mL)＝(4大格细胞数之和/4)×10⁴。

2.5细胞冻存：

(1)选择对数生长期的细胞，消化细胞，制备成细胞悬液，离心1200r/min，3min。(2)弃去上清，加入冻存液重悬细胞，按每管1mL分装到无菌的冻存管中。(3)将冻存管封好，标明细胞名称、冻存时间等信息。(4)梯度冻存：4℃放置30min，-20℃放置30min，置于-80℃冰箱中，如需长期保存则放入液氮罐。

2.6细胞培养：

(1)复苏的细胞移入25cm²培养瓶中，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。

(2)次日更换细胞培养液，继续培养待细胞生长达90％融合后，细胞传代培养。

(3)经过几次传代后部分细胞可冻存，部分细胞继续培养，准备试验用。

2.7 Westernblot分别筛选IL1F5高、低表达细胞系

2.7.1蛋白质提取：

(1)各种肺腺癌细胞均培养于37℃培养箱，CO₂饱和湿度保持在5％，用RPMI1640完全培养基培养，1-2天换液，根据相应的密度传代。(2)按实验的需求将siRNA转染至相应的肺腺癌细胞中，收集正常或转染后的肺腺癌细胞，弃培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2次，弃PBS，用移液器将残留的PBS溶液吸取干净，以免稀释细胞蛋白。(3)根据细胞培养瓶的大小和细胞的生长密度，加入不同的1×SDS细胞裂解液，后用细胞刮子刮净细胞，转移至干净的EP管中。(4)将刮下的细胞蛋白在沸水中煮沸10-15min，结束后取出立刻放于冰上冷却。(5)4℃离心(12000r×10min)。(6)留上清，用紫外分光亮度仪测细胞蛋白的浓度，后保存在-80℃冰箱以备用。

2.7.2 SDS-PAGE电泳：

配胶：(1)将两片干净的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，准备灌胶。(2)先将12％的分离胶用1mL枪沿两玻璃间隙灌胶，先快后慢，避免产生气泡，注胶至距上缘约1.5cm处，在胶上缓慢加一层异丙醇。放置30分钟左右至水和胶之间可见明显折线，用ddH₂O冲洗掉上层异丙醇，用5％浓缩胶灌满剩余间隙，并插上梳子。约半小时后拔掉梳子，准备上样。(3)每孔上样约为15～20μl，其中一孔加入预染蛋白质Marker。

电泳：起始电压80V，约40min，待溴酚蓝进入分离胶，电压改为100V，约90min，当溴酚蓝接近分离胶底部时停止电泳。

转膜：(1)电转移垫和滤纸用转膜缓冲液浸湿，PVDF膜在甲醇中浸10s至完全极化。(2)从玻璃板上小心取下凝胶，去除所有浓缩胶，将凝胶放在转移缓冲液中浸泡。(3)组装电转移装置，由负极到正极，按电移垫、2层滤纸、凝胶、PVDF膜、2层滤纸、电转移垫顺序安装，PVDF膜接正极、凝胶接负极，注意不要起气泡，放入电转仪，加盖电极和绝缘盖板，300mA，2h。

膜的封闭、标记抗体及显影：(1)5g脱脂奶粉用TBST定容至100mL，充分混匀配成封闭液，将PVDF膜放入封闭液中，在摇床上室温孵育2h。(2)取出PVDF膜，在摇床上用TBST液洗3遍，每次10min。(3)按1∶200的比例将一抗(IL1F5抗体)和一抗稀释液混匀，将膜置入此液体中，4℃过夜。(4)取出PVDF膜，在摇床上用PBST液洗3遍，每次10min。(5)加二抗，按1∶2000的比例将二抗和PBST混匀，将膜置入此液体中，室温孵育2h。(6)取出PVDF膜，在摇床上用PBST液洗3遍，每次10min。(7)按ECL试剂盒说明书，将A、B液混合，滤纸吸干PVDF膜，将膜正面朝上滴加配好混合液，凝胶成像系统拍照、保存。

2.7.3肺腺癌细胞的筛选：

选取肺腺癌细胞株H3255、H1299及A549为研究对象，正常人肺上皮细胞HBE为对照，qRT-PCR和Western-blot分别检测IL1F5的mRNA和蛋白表达水平；结果如图3A所示，可以看出qRT-PCR和Westernblot检测结果表明IL1F5蛋白和编码其的mRNA在H1299、H3255细胞中表达较高，在HBE细胞中表达量最低。

2.8细胞转染

2.8.1转染效率的判定：

(1)转染前一天，取对数生长期的H1299细胞，按4～5×10⁴/孔的密度接种在六孔培养板上(细胞量控制在过夜能达到70％)，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。(2)以100μ1RPMI-1640稀释5μlLipofectamineTM2000，轻轻混匀。(3)以100μL RPMI-1640分别稀释0μL、1000ng、1500ng、2000ng、2500ng的siRNA，轻轻混匀。(4)室温孵育5min后，混合稀释的siRNA和稀释的LipofectamineTM2000，在室温下孵育20min，使形成siRNA-LipofectamineTM2000复合物。(5)弃去6孔板内旧培养液，用PBS清洗两遍，将复合物加入到每个包含细胞的孔中，轻轻前后十字摇动培养板，使其充分混匀，每孔加1.8mLRPMI-1640，放入培养箱。(6)6小时后换液，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。(7)24小时后每孔加0.1mLDAPI，染色2分钟，用PBS清洗三次，去除残余荧光，然后置于倒置荧光显微镜下观察、拍照，得出siRNA转染最佳效率所需要的浓度。整个过程用锡箔纸包裹，注意避光。

不同浓度的siRNA对转染率有一定影响，根据RNA干扰实验的设计原则，要求尽可能使转染率相对较高，siRNA浓度相对较低。实验结果提示，2500ngsiRNA的转染率最高，大约为80％，可以用于进行后续的实验检测。

2.8.2 siRNA-IL1F5转染H1299：

(1)转染前一天，取对数生长期的H1299细胞按4～5×10⁴/孔的密度接种在六孔培养板上(细胞量控制在过夜能达到70％)，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。(2)分别用100μLRPMI-1640稀释5μLLipofectamineTM2000和2500ng siRNA，轻轻混匀。(3)室温孵育5min后，混合稀释的siRNA和稀释的LipofectamineTM2000，轻轻混合，在室温下孵育20min，使形成siRNA-LipofectamineTM2000复合物。(4)弃去6孔板内旧培养液，用PBS清洗两遍，将复合物加入到每个包含细胞的孔中，轻轻前后十字摇动培养板，使其充分混匀，每孔加1.8mLRPMI-1640，放入培养箱。(5)6小时后换液，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃、5％CO₂培养48小时，至细胞生长到孔板面积约80～90％时提取细胞蛋白，进行下一步Westernblot检测。

2.8.3筛选转染效率最高的一组siRNA：

(1)按上述方法分别提取各组细胞的蛋白。(2)用qRT-PCR、Westernblot检测IL1F5的表达情况。(3)筛选出转染效率最高的一组siRNA序列用于后续的细胞生物学检测。(为实验标记方便，实验中将该序列标为si1，将IL1F5(human)siRNA-482标记为si2)

Westernblot法检测2段不同的siRNA序列对H1299细胞IL1F5蛋白表达的干扰效率显示(图3B)：IL1F5(human)siRNA-112，也即si1在转染后48小时对H1299细胞的干扰效率最佳，以此作为后续研究的干扰序列。

2.9 CCK8法观察细胞增殖

(1)转染前一天，取对数生长期的H1299细胞，按4～5×10⁴/孔的密度接种在六孔培养板上(细胞量控制在过夜能达到70％)，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。(2)细胞铁壁后，分3组进行转染：H1299 NC、H1299IL1F5(human)siRNA-112(后续实验中，为标记方便，将其标志为si1)和H1299 IL1F5(human)siRNA-482(后续实验中，为标记方便，将其标志为si2)，使用脂质体LipofectamineTM2000介导转染(转染步骤同上)。(3)6h后将转染的细胞常规消化，重悬细胞，调整细胞浓度为3×10⁴个/mL，按100μL/孔接种于96孔板中，每块板每组细胞设3个复孔，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。(4)6h后待细胞贴壁，取转染12h为CCK8实验0h，分别检测0h、24h、48h、72h、96h四个时间段细胞增殖情况。(5)先吸尽孔内液体，每孔加入90μL含10％血清的RPMI-1640和10μL CCK8液，37℃、5％CO₂培养2小时，多功能酶标仪测定各孔A450值。(6)以3组细胞在不同检测时间点(0h、24h、48h、72h、96h)的A450值绘制细胞生长曲线。

转染48小时后，单独培养H1299细胞条件下，转染IL1F5-siRNA的细胞与转染NC组无明显差异(图4A所示)，抑制IL1F5表达不能影响H1299细胞的增殖能力；而H1299细胞和CD8+TIL共培养下，CCK8检测肿瘤细胞增殖，转染IL1F5-siRNA的细胞与转染NC组相比出现明显生长抑制(P＜0.05)，表示IL1F5影响H1299细胞的增殖能力需要通过CD8+TIL介导(图4B)。

2.10划痕实验验证IL1F5表达改变对H1299细胞迁移能力的影响

(1)两种状态(单独培养H1299细胞、H1299细胞和CD8+TIL共培养)下，划痕实验验证两种培养状态下肿瘤细胞迁移能力。(2)提前将实验要用的marker笔、直尺紫外消毒30分钟。(3)marker笔在6孔板后用直尺比着约每间隔0.5-1.0cm划一条横线，横穿过孔，每孔至少5条线。(4)取转染的细胞，常规消化，重悬细胞，以5×10⁵/孔接种于六孔板上(细胞数以过夜能长满六孔板为准)。(5)第二天用枪头比着直尺，垂直于背后横线划痕(枪头垂直)。(6)用PBS缓慢清洗细胞3次后，加入含1％血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5％CO₂，的培养箱，按0、12、24、48h拍照记录。

24h、48h后分别观察发现：仅在H1299细胞和CD8+TIL共培养条件下，IL1F5抑制的H1299细胞与NC组相比，划痕愈合较慢(图5A、5B为单独培养H1299细胞、图5C、5D为H1299细胞和CD8+TIL共培养)。以上实验结果均重复三次，结果有统计学意义。

2.11 Transwell观察细胞侵袭、迁移能力

(1)实验设置3组：H1299 NC、H1299 si1和H1299 si2，每组设3个复孔。(2)取培养至对数生长期细胞，常规消化，重悬细胞，以2.5×10⁵/孔接种于六孔板上，待细胞融合达70％～90％时使用脂质体LipofectamineTM2000介导转染(转染步骤同上)。(3)取Transwell小室，上室面覆以Matrigel胶(Matrigel胶：RPMI-1640培养基＝1∶4)50μl/孔，将小室放入24孔板，使用前37℃孵育1h。(4)转染48h后，常规消化，重悬各组细胞，以200μL/孔接种于覆盖Matrigel胶的小室内，下室为含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液600μL，37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h。(5)孵育结束后，取出小室，PBS洗两遍，用棉签轻轻拭去上室滤膜内侧面贴壁细胞，PBS洗两遍。(6)将滤膜用4％多聚甲醛固定10分钟，吸去固定液，将膜风干，每孔加入500μL考马斯亮蓝染液，室温置放30min，除去染色液，PBS洗两遍，将上室取出，自然干燥。(7)正置荧光显微镜下计数膜背面迁移的细胞数，计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野，实验重复三次，计算平均值。

转染48h后，仅在H1299细胞和CD8+TIL共培养条件下，通过计数穿过Transwell小孔细胞数目迁移、侵袭能力，转染IL1F5-siRNA组的细胞与NC组相比迁移、侵袭能力受到抑制(P＜0.05)，而单独培养H1299细胞条件下则无明显差异(图6)。以上所有数据均用统计软件SPSSV.20.0和STATAV.9.0处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

SEQID NO.2：

SEQID NO.3ACTCGGCATTGAAGGTGCTTT

SEQID NO.4GGGACCACGCTGATCTCTT

SEQID NO.5CGG CAU UGA AGG UGC UUU ATT UAA AGC ACC UUC AAU GCC GTT

SEQID NO.6CGA GAA UGG UGG CUG GAA UTT AUU CCA GCC ACC AUU CUC GTT

3.动物实验验证

选取Lewis鼠肺腺癌细胞系(规避人肺腺癌细胞系在C57BL/6小鼠中各组均无法成瘤的风险)，进行体外培养和扩增。分别过表达/沉默IL1F5，包装慢病毒感染Lewis细胞株，并获取动物实验所需要的鼠源性稳转肺腺癌细胞系；为了验证IL1F5的促癌作用是通过抑制免疫应答引起，选用两组不同的小鼠模型：免疫正常的C57BL/6小鼠和NOD/SCID免疫缺陷小鼠。将空载对照组、过表达IL1F5组、sh-NC组、sh-IL1F5组四组细胞系注入小鼠皮下进行成瘤实验。检测小鼠体重，记录皮下瘤体积/大小/重量等指标；分别观察在免疫正常的C57BL/6小鼠NOD/SCID免疫缺陷小鼠中，干扰IL1F5表达对肿瘤生长是否存在差异。结果表明：C57BL/6小鼠组，抑制IL1F5表达肿瘤生长速度减慢(图7A)；NOD/SCID免疫缺陷小鼠组，抑制IL1F5表达对肿瘤生长情况的影响不明显(图7B)。阐明IL1F5在小鼠肺腺癌进展中通过免疫系统起作用，其肺腺癌细胞可通过产生的IL1F5诱发自身免疫逃逸。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省肿瘤医院

<120> 一种与肺癌相关的诊断标志物及其应用

<130> 202011

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 155

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Val Leu Ser Gly Ala Leu Cys Phe Arg Met Lys Asp Ser Ala Leu

1 5 10 15

Lys Val Leu Tyr Leu His Asn Asn Gln Leu Leu Ala Gly Gly Leu His

20 25 30

Ala Gly Lys Val Ile Lys Gly Glu Glu Ile Ser Val Val Pro Asn Arg

35 40 45

Trp Leu Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Ile Leu Gly Val Gln Gly Gly

50 55 60

Ser Gln Cys Leu Ser Cys Gly Val Gly Gln Glu Pro Thr Leu Thr Leu

65 70 75 80

Glu Pro Val Asn Ile Met Glu Leu Tyr Leu Gly Ala Lys Glu Ser Lys

85 90 95

Ser Phe Thr Phe Tyr Arg Arg Asp Met Gly Leu Thr Ser Ser Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Ala Tyr Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Val Pro Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Arg Leu Thr Gln Leu Pro Glu Asn Gly Gly Trp Asn Ala

130 135 140

Pro Ile Thr Asp Phe Tyr Phe Gln Gln Cys Asp

145 150 155

<210> 2

<211> 468

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggtcctga gtggggcgct gtgcttccga atgaaggact cggcattgaa ggtgctttat 60

ctgcataata accagcttct agctggaggg ctgcatgcag ggaaggtcat taaaggtgaa 120

gagatcagcg tggtccccaa tcggtggctg gatgccagcc tgtcccccgt catcctgggt 180

gtccagggtg gaagccagtg cctgtcatgt ggggtggggc aggagccgac tctaacacta 240

gagccagtga acatcatgga gctctatctt ggtgccaagg aatccaagag cttcaccttc 300

taccggcggg acatggggct cacctccagc ttcgagtcgg ctgcctaccc gggctggttc 360

ctgtgcacgg tgcctgaagc cgatcagcct gtcagactca cccagcttcc cgagaatggt 420

ggctggaatg cccccatcac agacttctac ttccagcagt gtgactag 468

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

actcggcatt gaaggtgctt t 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gggaccacgc tgatctctt 19

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cggcauugaa ggugcuuuat tuaaagcacc uucaaugccg tt 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cgagaauggu ggcuggaaut tauuccagcc accauucucg tt 42

Claims

1.一种与肺癌相关的诊断标志物，其特征在于，所述诊断标志物为IL1F5蛋白或编码该蛋白的mRNA。

2.根据权利要求1所述的诊断标志物，其特征在于，所述IL1F5蛋白序列为SEQ IDNO.1，所述编码该蛋白的mRNA对应的cDNA序列为SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的诊断标志物，其特征在于，当该诊断标志物为编码该蛋白的mRNA时，PCR上游引物选自SEQ ID NO.3，下游引物选自SEQ ID NO.4。

4.权利要求1-3任一项所述的诊断标志物在制备用于肺癌诊断的试剂或试剂盒中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的诊断标志物在制备用于肺癌判断预后的试剂或试剂盒中的应用。

6.权利要求1-3任一项所述的诊断标志物在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包括IL1F5(human)siRNA-112或IL1F5(human)siRNA-482，所述IL1F5(human)siRNA-112序列为SEQ ID NO.5，所述IL1F5(human)siRNA-482序列为SEQ ID NO.6。