CN108486159B - 一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种敲除GRIN2D基因的CRISPR‑Cas9系统及其应用，CRISPR‑Cas9系统包括Cas9和特异性靶向GRIN2D基因的gRNA。本发明还公开了其在制备治疗癌症药物中的应用及GRIN2D基因在制备用于胃癌及其他肿瘤精准医疗的诊断试剂盒和药物中的应用；通过胃癌临床样本组织芯片，经免疫组化证实，GRIN2D在胃癌中表达增高，且与预后相关；本发明CRISPR‑Cas9系统可高效敲除在胃癌中高度表达的GRIN2D基因，抑制胃癌细胞的增殖与侵袭迁移，该系统操作简单，敲除效率高。有望在过表达GRIN2D的胃癌及其他肿瘤的诊疗中得到应用。本发明系统适用于GRIN2D异常表达的多种肿瘤。

Description

一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
技术领域
本发明涉及癌症精准医疗药物技术领域，具体涉及一种敲除GRIN2D基因(来源于NCBI GENE数据库，ID:2906)和GRIN2D基因作为胃癌及其他肿瘤诊疗靶点的用途。
背景技术
根据2012年GLOBOCAN的统计资料，在全球范围内，胃癌每年新发病例约95.2万例，每年因胃癌死亡人数约72.3万人。胃癌的全球发病率居恶性肿瘤第5位。约70％的患者在发展中国家，1/2的患者集中在东亚地区，韩国是全球胃癌发病率最高的国家，其次是蒙古、日本和中国；我国胃癌发病率居恶性肿瘤的第3位，死亡率居第3位，每年新发胃癌病例约40万例，每年因胃癌死亡人数约32万人。近期，胃癌分子生物学方面的进展(如新一代测序手段的成熟)为我们打开了胃癌精准医疗的大门，胃癌的治疗已经向规范化和个体化迈进。现已研发的一些针对不同靶点的药物在应用中显示了较好的疗效趋势，如中国HER2阳性晚期胃癌患者接受规范化的抗HER2靶向治疗联合化疗方案，能够降低28％的死亡风险，显著延长总生存期。探寻新的生物分子标志物来预测胃癌的进展，指导精准治疗，以改善患者生活质量，延长患者生命，具有重要的实际临床意义。
GRIN2D基因位于19q13.33，编码N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartatereceptor，NMDAR)的一个亚基NMDAR2D。NMDA受体是一种配体门控离子通道，既受突触电压的调控也受神经递质如谷氨酸，甘氨酸和镁离子等调控，通道激活后钠离子为主，钙离子和钾离子等也可透过。NMDA受体是谷氨酸受体家族中的重要亚型，在哺乳动物中枢神经系统，特别是在发育中的间脑中广泛分布，与长时程增强的诱导和维持有关，在学习记忆过程中有重要作用。有研究者在发育正常的小鼠出生前和出生后选择性地敲除GRIN2D，发现小鼠的运动行为和焦虑测试并未显示出异常，小鼠依然存在正常的交配行为。但是由于NMDA受体功能的缺失，小鼠在强迫游泳和光/暗箱应力试验中表现出了情绪的异常。由于GRIN2D能改变谷氨酸盐的传递过程、大脑生理和认知，因此早期很多研究者将研究关注点放在GRIN2D与中枢系统的关系上，对于GRIN2D与肿瘤的关系鲜有报道。近来有学者证实GRIN2D在肠癌血管中过表达，并且阳性表达者预后较阴性表达者好，体内外试验显示GRIN2D在肠癌的血管生成、癌细胞侵袭转移中可能起到重要作用。此外，有报道称GRIN2D可能导致绝经前妇女乳腺微环境出现差异，从而影响乳腺癌细胞的生物学行为。John B等人通过二代测序发现GRIN2D作为一种新的甲基化相关基因在胰腺癌中发挥了重要作用。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是在细菌中发现的适应性免疫反应系统(Adaptive immune system)，能有效抵抗噬菌体(Bacteriophage)等对细菌造成的损伤。在这套系统的基础上，科学家发展出一种新的基因组编辑技术—CRISPR/Cas技术。现在所广泛使用的CRISPR/cas9系统是由II型CRISPR改造而来，并应用到分子生物学的相关研究中，成为一种可用于基因组编辑的分子生物学利器。CRISPR基因组编辑系统通过sgRNA上携带的靶点序列识别特定DNA序列，这种方式决定了CRISPR系统具有很强的特异性，由于其没有物种的限制，已经成功在小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、水稻(Oryza sativa)等多种动物和植物中实现了基因的精确编辑。CRISPR-Cas9具有突变率高，操作简单，成本低的特点。基于CRISPR-Cas9的基因工程操作，可实现对疾病关键基因的定向修饰，以实现减缓或治愈疾病的目的。
目前，胃癌的有效疗法仍以外科手术的切除为主。早期胃癌根治切除后5年生存率可达90％以上，但我国目前临床就诊的胃癌患者中多数为中晚期，手术切除率仅为50％左右。总的术后5年生存率也只有20％～30％。为了提高胃癌的治疗效果，除应在早期诊断，合理地运用手术切除方法等方面进行努力外，还应结合其他疗法。针对基因的靶向抑制，目前常用的siRNA可有效地抑制基因表达，但是siRNA的使用具有药物的递送效率低，要持续给药，并不能够彻底根治，而且用药复杂，不适宜大规模推广。ZFNs和TALEN技术表达结构复杂，而CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。据现有文献，胃癌中GRIN2D表达和它与临床特征及预后之间的关系，以及GRIN2D对胃癌细胞功能的影响尚未有研究。同时，未见敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统的报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统，能高效敲除GRIN2D基因。本发明的另一目的是提供一种上述敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统的应用。本发明还有一目的是提供一种GRIN2D基因在制备用于胃癌及其他肿瘤诊疗药物和试剂盒中的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统，包括特异性靶向GRIN2D基因的gRNA，所述的特异性靶向GRIN2D基因的gRNA对应的DNA序列如下所示：
GRIN2D-gRNA1：5’-CTGACTGACGGTAGTCTGGTGGG-3’
GRIN2D-gRNA2：5’-ACGAGTGGTCACGGCTACAAAGG-3’
GRIN2D-gRNA3：5’-GACCTGAAGCTGTTGCTCGGTGG-3’
所述CRISPR-Cas9系统还包括Cas9。
所述CRISPR-Cas9系统还包括带抗性标记及荧光标记的Cas9骨架载体。
所述Cas9骨架载体为有U6启动子表达的Cas9骨架载体。
所述的敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统在制备GRIN2D基因敲除的细胞模型或动物模型中的应用。
所述的敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统在制备治疗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤为适用于GRIN2D过表达的肿瘤。
GRIN2D基因在制备用于GRIN2D过表达的肿瘤的预后判断的诊断试剂盒中的应用。
GRIN2D基因在制备用于治疗GRIN2D过表达的肿瘤的药物中的应用。GRIN2D基因。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过胃癌临床样本组织芯片，经免疫组化证实，GRIN2D在胃癌中表达增高，且与预后相关；本发明CRISPR-Cas9系统可高效敲除在胃癌中过表达的GRIN2D基因，抑制胃癌细胞的增殖与侵袭迁移，该系统操作简单，敲除效率高。有望在胃癌和其他肿瘤的诊疗中得到应用。本发明系统适用于GRIN2D过表达的多种肿瘤。
附图说明
图1是敲除载体pGK1.1载体图；
图2是菌落PCR检测电泳图；
图3是敲除载体测序结果；
图4是经CRISPR-Cas9系统敲除后GRIN2D蛋白表达量图；
图5是CRISPR-Cas9敲除GRIN2D后AGS细胞的生长曲线图；
图6是CRISPR-Cas9敲除GRIN2D后AGS细胞的侵袭迁移能力结果图；
图7是胃癌GRIN2D蛋白免疫组化图；图中：a1,b1,c1,d1为40倍，a2,b2,c2,d2为400倍，a1,2为GRIN2D蛋白在胃癌组织中，癌细胞表达为强阳性；b1,2为GRIN2D蛋白在胃癌组织中，癌细胞表达为阳性；c1,2为GRIN2D蛋白在胃组织，肠化的黏膜上皮细胞表达阳性；d1,d2为GRIN2D蛋白在正常胃组织中，黏膜上皮细胞阴性；
图8是454例GRIN2D高、低表达组胃癌患者的生存曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
以下实施例中使用的主要试剂为：二步法免疫组化检测试剂盒：基因科技上海有限公司；兔抗人GRIN2D多克隆抗体(免疫组化试验用)：novus公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(免疫组化试验用)：美国Dako公司；抗体稀释液：北京中山生物技术有限公司；0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)：北京中山生物技术有限公司；DAB：美国Sigma公司；二甲苯、中性树胶等由病理科提供。DAB工作液：DAB粉剂20mg溶解于50mL0.01mol/LPBS中，再用定性滤纸过滤，保存在棕色瓶中(使用前配制)；根据需要加入由0.01mol/LPBS液配制的3％H2O2数滴帮助显色。胃癌细胞株购AGS购自南京科佰生物科技有限公司；1640培养基、胎牛血清：美国gibco公司；BCA蛋白测定试剂盒：Biosharp；PVDF膜、兔抗人GRIN2D单克隆抗体(Westernblot试验用)：默克密理博公司；IgG兔二抗及鼠二抗(Westernblot试验用)：美国abcam公司；ECL显影液(苏州新赛美公司)；鼠抗人GAPDH抗体(美国proteintech公司)；RPMI-1640完全培养液：分别加入RPMI-1640与胎牛血清混匀，使其终浓度分别为90％，10％，1×，4℃保存。细胞冻存液：将RPMI-1640完全培养液、胎牛血清和DMSO按5∶4∶1比例配制，4℃保存。1×TBST1L：取Tris2.42g、NaCl8.0g、Tween-200.5mL，混合溶解，定容至1L，常温保存。1×转膜Buffer1L：甘氨酸14.4g、Tris3.03g，加适量双蒸水搅拌溶解，再加200mL无水甲醇，定容至1L，混合均匀(用时配制)。封闭液100mL：取脱脂奶粉5g，加入100mL1×TBST，混合溶解即可(需用时配制)。
以下实施例中使用的主要仪器如下：组织芯片制作仪：美国Beecher Instruments公司；自动免疫组化染色仪(2D)：美国LABVISION公司。倒置相差显微镜：日本Olympus公司；凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司；多功能酶标仪：美国Thermo公司；BD AccuriTM C6流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司。
实施例1
1.1靶位点设计及合成
(1)设计Crispr/cas9敲除靶位点
首先，需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，通过在线工具设计：麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/。
选取GRIN2D基因所有转录本的CDS区，找出公共CDS区所处外显子进行靶位点设计，其中第一个外显子GC含量太高，在第二个外显子上设计靶位点信息：
GRIN2D-gRNA1：5’-CTGACTGACGGTAGTCTGGTGGG-3’
GRIN2D-gRNA2：5’-ACGAGTGGTCACGGCTACAAAGG-3’
GRIN2D-gRNA3：5’-GACCTGAAGCTGTTGCTCGGTGG-3’
(2)引物添加接头
引物合成需在靶序列头部添加额外的碱基，正向引物添加CACC，反向引物添加AAAC，需要特别注意的是靶序列的第一个碱基必须是G，如果选取的靶序列第一个碱基不是G，可自行在靶序列前加一个G，靶序列引物设计如下：
221174-GRIN2D-1F：5’-accGCTGACTGACGGTAGTCTGGT-3’，
221174-GRIN2D-1R：5’-aacACCAGACTACCGTCAGTCAGc-3’，
221174-GRIN2D-2F：5’-accGACGAGTGGTCACGGCTACAA-3’，
221174-GRIN2D-2R：5’-aacTTGTAGCCGTGACCACTCGTC-3’，
221174-GRIN2D-3F：5’-accGACCTGAAGCTGTTGCTCGG-3’，
221174-GRIN2D-3R：5’-aacCCGAGCAACAGCTTCAGGTC-3’，
(3)敲除载体构建
①Oligo杂交，敲除载体连接反应
将合成后的2条单链oligo DNA稀释成10μM，退火形成dsDNA，再与线性化后的pGK1.1 linear vector(cat.no.GP0134)载体连接(见图1)，可直接用T4 DNA Ligase连接，退火反应体系：10μL正链oligo(10μM)，10μL负链oligo(10μM)，16μL ddH2O，4μL AnnealingBuffer(10×)。
将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1μL的杂交后的dsDNA进行T4DNA Ligase连接反应，反应体系：1μL pGK1.1linear vector，1μLHybridized dsDNA，6.5μL ddH2O，0.5μL T4 DNALigase，1μL 10×T4 DNALigase Buffer。
将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中16℃孵育30min。
②转化Top 10感受态
从-80℃冰箱中取1管Top 10感受态，置冰上融解。融解后加入10μl连接产物，轻弹混匀，冰上孵育30min。42℃水浴热击60sec，迅速拿出置冰上冷却2～3min。向管中加入800μL无抗SOC液体培养基，至摇床(37℃/160rpm)恢复培养培养45min。4500rpm离心5min，弃去800μL上清，将沉淀悬在剩余的100μL上清中，均匀涂布于含Kan抗性的的筛选平板上，倒置培养过夜。
③筛选阳性重组子
第二天使用上游引物VSP primer与下游负链Oligo引物进行菌落PCR筛选，阳性克隆PCR正确大小应为100bp，见图2，均能扩增出100bp大小的片段，说明所检测单克隆全为阳性，送1-2个阳性克隆抽提后的质粒测序，见图3，从3个位置的比对结果来看，3个敲除载体构建成功。测序正确的质粒浓缩到1μg/μl浓度以上。
1.2电转染靶细胞及单克隆的制备和生长
(1)电转染靶细胞(cat.no.GP7901)
取状态良好的对数生长期靶细胞(AGS GFP细胞)悬液台盼蓝计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95％)。取5×106个细胞于15mL离心管中，离心弃上清(1000rpm/4min)。将细胞沉淀悬浮于210μL PBS中，转移至1.5mL EP管中，加入所需量构建好的敲除质粒5～8μg(质粒浓度要求1μg/μL以上)，轻轻混匀。将上述细胞质粒混合液用专用电转枪头转移至电击杯中，确定电击杯中溶液无气泡，且液面凸起后，盖上电击杯盖并至于电转仪，设定好电转条件后进行电转。待显示峰图正常后取出细胞液转移至六孔板培养基中(培养基需事先37℃预热且无抗生素)。
(2)pool细胞测序检测敲除效率
电转72hr后，pool细胞台盼蓝计数。在筛选阳性克隆之前，需对pool细胞(混合克隆)的敲除效率进行体内验证，但其结果只能作为参考。一般靶位点附近的序列测序中，阳性样品应在靶点位置及之后的序列中出现套峰，如敲除效率较低时，信号强度往往较低，影响判断。
(3)单克隆的制备和生长
有限稀释法稀释细胞至10块96孔板中，37℃，CO2培养箱中静置培养；一周后观察单克隆生长情况，约两周后将长起来的单克隆转移至48孔中扩大培养；当细胞长满48孔1/2时，即可取出一部分(102～104)，使用Genloci TNA抽提试剂盒(cat.no.GP0155,GP0156)提取细胞基因组。
1.3筛选基因敲除阳性克隆
(1)单克隆基因组DNA的提取
取102～104个细胞于1.5mL EP管中，室温1500rpm离心5min，小心吸掉培养液。加入150μL PBS重悬细胞，室温1500rpm离心5min，小心弃去上清，重复一次。向离心管中加入适量体积(推荐体积为50～200μL)预先配制的溶液A与溶液B的混合液，枪头吹打5次，冰上放置10min，使细胞充分裂解。加入两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃条件下沉淀20min以上。4℃，12000rpm，离心20min，弃上清。加入400～500μL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm，离心10min，小心弃去上清，自然晾干(不超过5min为宜)。加入适量体积(推荐体积为10-30μL)灭菌的双蒸水溶解沉淀，溶液可直接用于PCR反应，或于-20℃保存。
(2)PCR扩增目的片段
①引物设计：在敲除靶位点附近设计高特异性的Primers，GRIN2D基因扩增产物长度为约440bp。Primers引物序列如下：
221174-GRIN2D-seqF2：5’-TCTGCCATATTGGGAGCTG-3’
221174-GRIN2D-seqR2：5’-GTAGCCAGATCCAGTGAGG-3’
②PCR扩增获得杂交DNA：在灭菌PCR管中配制反应体系(实验组DNA 100ng，10×G-Tag Buffer 3μL，DMSO 1.8μL，dNTP(10mMeach)0.6μL，Primer-F 1.2μL，Primer-R 1.2μL，G-Tag DNA polymerase 0.3μL，Add ddH2O to 30μL)，使用高特异性的Primers，扩增获得实验组DNA产物。
PCR反应程序：95℃预变性1.5min；95℃变性10s，55～62℃退货10s，72℃延伸20s，35～40次循环；72℃彻底延伸5min，95℃变性3min。
自然冷却至40℃以下(野生型片段与突变型片段杂交)。
PCR结束后，取2～3μL进行电泳检测，要求目的片段明亮并且单一。
(3)CruiserTM Enzyme(cat.no.GP0104、cat.no.GP0105和cat.no.GP0107)酶切筛选阳性克隆
在灭菌PCR管中配制如下反应体系：PCR Products 2～3μL，5×CruiserTM Buffer2μL，CruiserTM Enzyme 1μL，Add ddH2O to 10μL。
45℃反应20min后立即向上述10μL反应体系内加入2μL 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测或置于-20℃保存。
(4)测序筛选阳性克隆
对Crusier酶切初步筛选出来的阳性克隆进行测序验证，进一步确认阳性克隆。
(5)TA克隆
对于阳性克隆中，两个等位基因突变情况不一样的阳性克隆，重新做TA克隆后送测序，跟野生型比对，确定每个等位基因的突变情况。
(6)免疫印迹法在蛋白水平验证敲除效率
1.4细胞总蛋白的提取
(1)将细胞瓶或六孔板中生长良好的细胞弃去上清，用胰酶消化细胞，1×PBS洗涤2次，将细胞转移至1.5mL的无酶EP管中；(2)冰上配置裂解液的混合液，配置比例为裂解液RIPA:蛋白酶抑制剂PMSF＝100:1；(3)每个EP管加入200μl裂解液混合液，涡旋震荡，直至沉淀消失，插入冰中裂解20min；(4)4℃12000r/min，离心20min；(5)小心吸取上清至新的无酶EP管中，用BCA试剂盒测定蛋白浓度；(6)加入5×loading buffer缓冲液，使蛋白体积和5×loading buffer体积之比＝4:1，吹打混匀；(7)用封口膜裹好，沸水中煮10min，结束后分装放入-80℃冰箱长期保存。
1.5蛋白免疫印迹实验(western blot)
(1)制备聚丙烯酰胺凝胶(5％浓缩胶，10％分离胶)；(2)将玻璃板清洗干净，倾斜晾干。组装玻璃板，用去离子水进行验漏，验漏结束后在组装的玻璃板中加入分离胶，大约加至距玻璃板上端2cm处，立即加异丙醇液封，放置30min，等分离胶凝固后轻轻倒掉上层异丙醇，再加入浓缩胶至玻璃板顶部，立即插入梳子，静置1h，至浓缩胶凝固；(3)将配置好的胶放入电泳槽内，用电泳缓冲液将内部加满，将Maker及提取的蛋白样品上样后，将剩余的电泳液加入，接通电源，调节电压80V，marker分开后，再将电压调至100V，结束后将胶取出，切取目的蛋白；(4)剪取一定大小的PVDF膜，先在甲醇中极化5min左右，再放入转膜液中约10min。同时取海绵及滤纸将它们放入转膜液中浸泡20min左右，安装转膜装置，排放顺序为：阴极碳板+海绵+滤纸+胶+PVDF膜+滤纸+海绵+阳极碳板；将转膜装置放入转移槽内，加入冰袋，并加入转膜液至满；接通电源，按恒流调节300mA电转1.5h，转膜需在冰盒中进行。(5)转膜结束后，将PVDF膜放入封闭液(脱脂奶粉5g溶解在100mLTBST中)，摇床上以80r/min转速室温封闭2h。(6)封闭结束后，按一抗稀释比例用封闭液配制一抗稀释液，PVDF膜上均匀滴加稀释的一抗，孵育4℃过夜。(7)第二天，TBST洗膜3次，每次15min。洗膜结束后，按二抗稀释比例用TBST配制二抗稀释液，PVDF膜上均匀滴加稀释的二抗，室温1.5h。孵育结束后，TBST洗膜3次，每次15min。(8)洗膜结束后将PVDF膜用滤纸吸干，平铺于显影仪相应位置，ECL发光液在使用前等比例混合A液和B液，并用TBST稀释，均匀滴加于PVDF膜上，凝胶成像系统拍照、保存。
图4定量分析结果显示，与未处理组相比，经Crispr/cas9系统处理后GRIN2D的相对蛋白表达量为0.08162±0.05570，表示GRIN2D蛋白表达被有效地抑制了。
1.6细胞增殖实验(CCK-8实验)
(1)消化收集转染后48h的各组细胞，离心待用；(2)用1640完全培养基重悬细胞，将细胞密度调整至30000个/mL；(3)每孔加入100μL细胞悬液，每组设5个复孔，轻轻拍打96孔板，使细胞分布均匀；(4)待细胞贴壁后(约24h)，分别在24、48、72、96h加入CCK-8试剂(每孔10μL)，轻轻拍打96孔板，放入培养箱1h后取出，在酶标仪上检测450nm下的吸光度值，注意酶标仪的线性范围；(5)用Graphpad prism统计处理所测数据，绘制折线图(图5)，结果显示经Crispr/cas9系统敲除GRIN2D后AGS细胞的增殖活力下降。
1.7细胞迁移与侵袭实验(transwell小室法)
(1)消化收集转染后48h的各组细胞，离心待用；(2)用1640基培重悬细胞，调整细胞密度至5×104/mL；(3)在24孔板中加入600μl的完全培养基，放入小室，充分浸润，取100μl的细胞悬液至加入Transwell小室的上室；(4)做侵袭实验时，提前一天将50μl基质胶(50μl Matrigel基质胶混合于300μl1640基培中)沿小室侧壁加入上室，轻拍24孔板，使其均匀分布于小室底面，不能有气泡，然后放入培养箱第二天用；(5)常规培养48-72h后取出，1×PBS洗2次，4％的多聚甲醛固定20min，1×PBS洗2次；(6)在24孔板中加入500μl的结晶紫染液，放入小室，10min后取出，1×PBS洗2次，倒置小室，用棉签轻轻擦去上室内未穿过去的细胞；(7)用倒置显微镜观察结果(各取5个视野，计算平均数)，用Graphpad prism统计处理所测数据，绘制折线图(图6)，结果显示经Crispr/cas9系统敲除GRIN2D后AGS细胞的侵袭迁移能力下降。
实施例2
2.1人胃癌组织标本
454例胃癌癌组织标本取材自南通大学附属医院2002～2009年胃癌手术切除标本，均有完整的临床病理资料及随访数据资料的。手术标本使用40g/L中性甲醛固定后进行石蜡包埋，3μm厚连续切片,分别进行HE和免疫组织化学染色；所有病例术前均未进行放化疗。患者中男106例，女384例。胃癌TNM分期采用AJCC标准(2002)。组织分型采用Lauren分型，分为肠型、弥漫型、混合型。另外，在454例胃癌病例中随机抽取68例癌旁非肿瘤性胃黏膜作为对照。另选取31例慢性胃炎患者，10例肠化生患者，34例低级别上皮内瘤变患者，21例高级上皮内瘤变的患者作为对照组。
2.2组织芯片的制作
454例胃癌和68例癌旁良性胃黏膜、31例慢性胃炎、10例肠化生、34例低级别上皮内瘤变及21例高级上皮内瘤变组织均用10％甲醛固定，石蜡包埋，蜡块经过筛选无明显缺陷。委托生物样本库制作成组织芯片。主要流程如下：
(1)根据HE染色切片的镜检结果，在蜡块上有代表性的癌巢区域作标记。
(2)1:1混合石蜡与蜂蜡，制作空白受体蜡块。在蜡块上设计10×7孔，共350点组织阵列，然后用组织芯片仪制成TMA空白蜡块。(3)将供体蜡块在标记的点上选取最有代表性的癌巢区域，取直径2mm的组织块，每例各取1个芯。(4)将取好的组织芯转移到受体蜡块的孔中，并取相应癌旁组织做对照。(5)组织阵列块在55℃的恒温烤箱中加热融合10分钟，在快融化之前放至室温冷却，使受体蜡块与供体组织融为一体。(6)将组织芯片置于4℃条件下冷冻4小时左右，随后用全自动组织切片机对组织阵列块进行修正，速度为20mm/转，等修到所有组织芯完全曝露。(7)用切片机对组织阵列块进行切片，将连续切片分别漂在凉水中，使其自然展开，再将切片转移至45℃温水中展片2分钟左右，待展开后将其贴在经过防脱片处理的载玻片上晾干。(8)将切片置于60℃的环境下烤片3分钟，58℃继续烤片16h。(9)将做好的组织芯片保存于切片盒，置于冰箱4℃冷藏室备用。
2.3免疫组化染色(EnVision两步法)：
(1)常规脱蜡水化：脱蜡前，将组织芯片放在60℃的恒温箱中，烘烤约20分钟。将已干燥的组织芯片浸于二甲苯中10分钟2次。取出后进行梯度酒精脱水，100％乙醇10分钟，95％乙醇10分钟，80％乙醇10分钟，70％乙醇10分钟，流水冲洗组织芯片。(2)将组织芯片置于耐高温切片架上，置于PH为6.0的柠檬酸盐缓冲液，高温抗原修复5分钟，自然冷却至室温后用PBS冲洗3次，每次5分钟。(3)取出蒸馏水中的芯片，滴加30％H2O2避光孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，再将芯片置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，总共3次，然后取出甩干。(4)滴加200μl的兔抗人GRIN2D多克隆抗体工作液(稀释比例为1:50)于组织芯片上，在4℃条件下过夜。(5)第二天，取出组织芯片，复温1小时，后置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，之后取出甩干。(6)在组织芯片上滴加200μl的二抗工作液，于室温孵育30分钟，将组织芯片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，之后取出甩干。(7)滴加准备好的显色剂DAB工作液，光镜下控制显色程度，显色完全后，立即用蒸馏水冲洗，终止显色。(8)室温下用苏木素复染2分钟，用蒸馏水流水震洗后甩干。(9)芯片脱水，透明，封片。(10)光镜下观察免疫组化染色结果，细胞相应部位出现棕黄色作为阳性表现。(11)结果判断：免疫组化结果判断采用双盲法，由两位经验丰富的病理科医师对组织芯片上的染色结果进行独立评价。根据染色阳性的肿瘤细胞数目所占百分比计为0-100％，染色强度按肿瘤细胞着色的深浅计分：无着色为0分，黄色计1分，浅棕色计2分，棕褐色计3分。GRIN2D的最终染色得分为染色强度与阳性细胞染色面积的乘积。GRIN2D表达分数的分界点由X-tile软件得出。评分如下：0-100为低表达或无表达，101-300为高表达。
2.4统计学方法
所有数据均用统计软件SPSS V.22.0和STATA V.9.0处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，GRIN2D表达与胃癌患者的预后关系分析用Kaplan-Meier生存分析，所有检验结果P<0.05为差异有统计学意义。
629例胃组织切片标本行免疫组化染色，GRIN2D蛋白阳性主表达于胃癌组织的细胞膜和细胞质中，呈棕黄色，而大部分正常组织低表达或无表达，见免疫组化照片(图7)。免疫组化染色结果显示GRIN2D蛋白在454例胃癌组织表达阳性率为57.93％(263/454)，68例良性切缘组织表达阳性率23.53％(16/68)，21例高级上皮内瘤变组织表达阳性率33.33％(7/21)，34例低级上皮内瘤变组织表达阳性率35.29(12/34),10例肠化生组织表达阳性率10％(1/10),31例慢性胃炎组织表达阳性率22.58(7/31)三者比较差异显著，有统计学意义(P＝0.0148)(表1)。Kaplan-Meier生存曲线显示GRIN2D高表达组比GRIN2D低表达组总体生存率低(图8)*P<0.001。
表1胃癌组织和良性切缘组织及胃良性疾病组织中GRIN2D蛋白的表达
临床参数 例数 低表达(％) 高表达(％) Pearsonχ2 P值
慢性胃炎 31 24(77.42％) 7(22.58％)
肠化生 10 9(90.00％) 1(10.00％)
低级上皮内瘤变 34 22(64.71％) 12(35.29％)
高级上皮内瘤变 21 14(66.67％) 7(33.33％)
良性切缘 68 52(76.47) 16(23.53％)
乳腺癌 454 191(42.07％) 263(57.93％)
总数 629 54.058 <0.001*
可见，GRIN2D蛋白的表达在胃癌组织中明显升高。GRIN2D高表达患者较低表达患者预后差。
序列表
<110> 南通大学附属医院
<120> 一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
<130> 100
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> GRIN2D-gRNA1(Artificial)
<400> 1
ctgactgacg gtagtctggt ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> GRIN2D-gRNA2(Artificial)
<400> 2
acgagtggtc acggctacaa agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> GRIN2D-gRNA3(Artificial)
<400> 3
gacctgaagc tgttgctcgg tgg 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 221174-GRIN2D-1F(Artificial)
<400> 4
accgctgact gacggtagtc tggt 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 221174-GRIN2D-1R(Artificial)
<400> 5
aacaccagac taccgtcagt cagc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 221174-GRIN2D-2F(Artificial)
<400> 6
accgacgagt ggtcacggct acaa 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 221174-GRIN2D-2R(Artificial)
<400> 7
aacttgtagc cgtgaccact cgtc 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 221174-GRIN2D-3F(Artificial)
<400> 8
accgacctga agctgttgct cgg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 221174-GRIN2D-3R(Artificial)
<400> 9
aacccgagca acagcttcag gtc 23
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 221174-GRIN2D-seqF2(Artificial)
<400> 10
tctgccatat tgggagctg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 221174-GRIN2D-seqR2(Artificial)
<400> 11
gtagccagat ccagtgagg 19

Claims (5)

1.一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，包括特异性靶向GRIN2D基因的gRNA，所述的特异性靶向GRIN2D基因的gRNA对应的DNA序列如下所示：
GRIN2D-gRNA1：CTGACTGACGGTAGTCTGGTGGG，
GRIN2D-gRNA2：ACGAGTGGTCACGGCTACAAAGG，
GRIN2D-gRNA3：GACCTGAAGCTGTTGCTCGGTGG。
2.根据权利要求1所述的敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统还包括带抗性标记及荧光标记的Cas9骨架载体。
3.根据权利要求2所述的敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述Cas9骨架载体为有U6启动子表达的Cas9骨架载体。
4.权利要求1-3任一权利要求所述的敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统在制备GRIN2D基因敲除的细胞模型或动物模型中的应用。
5.权利要求1-3任一权利要求所述的敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统在制备治疗胃癌药物中的应用。
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