CN114875143A

CN114875143A - 环状RNA circBRD7在制备鼻咽癌诊断和/或治疗制剂中的应用

Info

Publication number: CN114875143A
Application number: CN202210298863.6A
Authority: CN
Inventors: 周鸣; 魏建霞; 李梦娜; 陈峙朋; 薛长宁; 段玉梅; 郑乐媚; 李桂源; 熊炜; 曾朝阳; 李小玲
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2042-03-25
Also published as: CN114875143B

Abstract

本发明公开了环状RNA circBRD7在制备鼻咽癌诊断和/或治疗制剂中的应用。该环状RNA circBRD7可以用于制备鼻咽癌患者的诊断和治疗制剂，特别是制备出原位杂交检测法用于诊断鼻咽癌患者的试剂盒。通过研究证实circBRD7在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞系中表达下调，与鼻咽癌患者的临床进展负相关。此外，circBRD7在鼻咽癌中发挥抑瘤基因功能，外源过表达circBRD7能够弥补鼻咽癌细胞及组织中circBRD7的不足，从而达到逆转鼻咽癌恶性表型的目的。因此，基于circBRD7的表达检测和外源过表达可用于鼻咽癌患者的早期分子诊断、进展评估和临床靶向治疗，具有重要的临床价值和推广应用前景。

Description

环状RNA circBRD7在制备鼻咽癌诊断和/或治疗制剂中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种环状RNA circBRD7的原位杂交探针、表达载体以及circBRD7用于鼻咽癌诊断和治疗的制剂。

背景技术

鼻咽癌是一种起源于鼻咽部上皮细胞的恶性头颈部肿瘤，有明显的区域聚集性，恶性程度高，具有强大的侵袭转移能力。虽然近年来临床和实验肿瘤学在鼻咽癌诊断方面有了很大的发展，但鼻咽癌患者的预后并没有明显的提高，局部复发和远处转移仍是鼻咽癌晚期患者生存率低的主要原因。早期鼻咽癌患者对放化疗非常敏感，有非常好的临床疗效；但由于鼻咽癌患者的发病位置隐蔽、早期症状不典型，许多鼻咽癌患者初诊就是晚期，错过了最佳的临床治疗阶段，因而很容易发生放化疗抵抗和远处转移。因此，鼻咽癌的早期诊断和个体化治疗在鼻咽癌的临床诊断和治疗中非常关键，但目前临床上尚无鼻咽癌早期诊断和进展评价的筛选标志物，确切需要研发和建立一种用于鼻咽癌早期诊断和进展评价的诊断方法。

Circular RNAs(circRNAs)是一类具有调节能力的新型的非编码RNA，既缺少5’帽子也没有3’poly(A)尾，是前体mRNA通过外显子、内含子反向剪接或由外显子内含子二者共同融合到共价闭合环中产生的，这个过程不同于线性RNA的生成。CircRNA最早在1976年于RNA病毒中首次发现，随后Hsu MT等人使用电子显微镜技术在猴的肾细胞质中发现了circRNA的存在。随着高通量测序和生物信息学的发展，近年来已经发现了数千个环状RNA，其中许多环状RNA以组织特异性和疾病特异性的方式表达。相较于传统的线性RNA，环状RNA具有稳定性、保守性和功能多样性等生物学特征，能在离体的组织和细胞中相对稳定地保持其来源组织的表达特征，且操作相对简单。因此，筛选和验证更多的新型circRNA作为肿瘤诊断和治疗的生物标志物及其应用，并能尽早在专利领域得到有效的保护，能显著提升我国在该技术领域的国际竞争力。

本发明中我们证实了circ_0039345是由BRD7基因的6-8号外显子反向剪切而成，全长420bp，证实了circ_0039345真实存在于鼻咽癌细胞中，因此将其命名为circBRD7。此外，我们设计并合成了用于扩增circBRD7全长的引物，构建了circBRD7的过表达载体，成功表达出完整的环状RNA circBRD7，弥补了鼻咽癌细胞和组织中circBRD7的不足；并发现circBRD7的表达与鼻咽癌的发生发展密切相关，作为抑瘤基因参与了鼻咽癌的发生发展，因此circBRD7有可能成为鼻咽癌的诊断和治疗的重要分子靶点。

发明内容

本发明证实了circBRD7是由BRD7基因的6-8号外显子反向剪切而成，全长420bp，在鼻咽癌组织中及鼻咽癌细胞系中表达下调，与鼻咽癌患者的临床进展负相关，可用于鼻咽癌患者的辅助诊断和治疗。

本发明的首要目的是提供检测环状RNA circBRD7的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断制剂中的应用，该环状RNA circBRD7的序列见SEQ NO:1。

所述的鼻咽癌辅助诊断的制剂包括原位杂交检测试剂。

所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测circBRD7表达的寡核苷酸探针，优选序列如下：

circBRD7探针:

5’-TAGTTTGAAGTTATCCTGACTGTTCACAAG-3’，序列见SEQ NO:2。

所述的原位杂交检测试剂为原位杂交检测试剂盒。

所述的原位杂交检测试剂盒包括：

用于原位杂交检测circBRD7表达的寡核苷酸探针：

优选：circBRD7探针:

5’-TAGTTTGAAGTTATCCTGACTGTTCACAAG-3’

用于检测内参基因GAPDH的阳性对照探针,优选以下任一条：

探针序列1：5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'，序列见SEQ NO:3，

探针序列2：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，序列见SEQ NO:4。

除了寡核苷酸探针之外，

试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit2^nd Generation，Roche公司)；抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂(Anti-Digoxigenin-POD，Fab fragments，Roche公司)以及DAB染色试剂(ORIGENE)。

原位杂交所需其它常规试剂：乙二胺四乙酸(EDTA，pH＝8.0)；4M氯化锂(LiCl)溶液；胃蛋白酶；3％柠檬酸(pH＝2.0)；0.1M甘氨酸；1到5％热失活胎牛血清或羊正常血清；预杂交液[主要成分：20×柠檬酸钠缓冲溶液(Saline Sodium Citrate,SSC)、硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)、去离子甲酰胺(Deionized Formamide)、多聚腺苷酸(polyadenylicacid，Poly A)、多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)、变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)、酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)、二硫苏糖醇(DTT)、50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)、磷酸缓冲液(PBSbuffer)]；TNB缓冲液(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5，0.5％Blocking Reagent)；TNTBuffer(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5，0.05％Tween 20)；1％阻断试剂(Blockingreagent，Roche公司)。

本发明的第二个目的是提供circBRD7过表达试剂在制备鼻咽癌治疗制剂中的应用，为鼻咽癌患者的治疗提供一种新型且高效的治疗产品。

所述的鼻咽癌治疗制剂包括circBRD7的过表达载体。

所述的鼻咽癌治疗制剂包括用于扩增circBRD7全长序列的引物，序列如下：

上游：5’-CCCATCGATgataacttcaaactaatgtg-3’，序列见SEQ NO:5，下划线部分为ClaI识别位点；

下游：5’-TTTCCGCGGctgactgttcacaagccg-3’，序列见SEQ NO:6，下划线部分为SacII识别位点。

所述的鼻咽癌治疗制剂除了扩增circBRD7全长的引物之外，还含有：

转染circBRD7过表达载体所需的试剂Lipofectamine^TM 3000；环状RNA空载pcDNA3.1(+)circRNA Mini plasmid；Quickcut限制性内切酶ClaI和SacII以及T4DNA连接酶(Promega公司)。

构建circBRD7表达载体所需其它常规试剂：TksGflex^TMDNA Polymerase(TAKARA)；2×Gflex PCR Buffer(Mg²⁺,dNTP plus)(TAKARA)；无酶水；10×Quickcut Buffer；10×T4DNA Ligase buffer；50×TAE；琼脂糖粉；GoldView核酸染料；DNA ladder 2000；DH5α感受态细菌；LB液体培养基；胰蛋白胨；酵母提取物；天根无内毒素质粒小提中量试剂盒以及Opti-MEM(Invitrogen)。

本发明通过原位杂交在鼻咽癌患者和正常鼻咽上皮临床组织标本中发现circBRD7在鼻咽癌中表达显著下调，显著低于正常鼻咽上皮组织中的表达，与鼻咽癌患者的临床进展呈负相关。为了进一步探究circBRD7在鼻咽癌发生发展中所发挥的功能，我们通过circBase网站检索circBRD7(hsa_circ_0039345)的全长序列，并设计合成了扩增其全长的引物，PCR扩增测序鉴定正确后，将其连接到环状RNA空载pcDNA3.1(+)circRNA Miniplasmid上，利用Lipofectamine^TM 3000试剂将circBRD7的过表达载体转染到5-8F和CNE2细胞中。结果发现，circBRD7过表达载体具有良好的成环效果，表达出完整的环状RNA。在确保circBRD7成功过表达后，体外和体内实验均证实了circBRD7能够抑制鼻咽癌细胞增殖和体内肿瘤的生长，表明构建circBRD7过表达载体能够弥补鼻咽癌细胞和组织中circBRD7的不足，可以用于制备鼻咽癌治疗的制剂。因此，本发明为鼻咽癌患者的辅助诊断和治疗提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1为circBRD7真实存在于鼻咽癌中及其在鼻咽癌细胞中的表达情况；

A：琼脂糖凝胶电泳鉴定BRD7来源的circRNAs剪接位点的存在。M:marker(DL2000)；从1到5，依次为circ_0039343(184bp),circ_0039344(110bp),circ_0039345(200bp)，circ_19158(208bp),circ_0105514(168bp)；

B：Sanger测序证实了circBRD7是由BRD7mRNA的6-8外显子反向剪接成环的，全长420bp；

C：在鼻咽癌细胞系和正常鼻咽上皮中检测circBRD7的表达；

D：RNA荧光原位杂交技术检测circBRD7在鼻咽癌细胞5-8F和CNE2中的定位(细胞核用DAPI染色)，Scale bar,20μm；

E：核质分离实验检测鼻咽癌细胞中circBRD7的表达；

F：放线菌素D处理鼻咽癌细胞5-8F和CNE2 0h、8h、16h、24h后，qRT-PCR检测circBRD7以及BRD7的稳定性。数据以均值±标准误的方式呈现，并且进行了三次独立实验。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；ns,没有统计学差异。

图2为原位杂交检测circBRD7在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；

上图(放大倍数：200×)，下图(放大倍数：400×)，circBRD7在鼻咽癌中表达水平较低，且与临床进展负相关。

图3为过表达载体图谱；

图4为体外过表达circBRD7抑制鼻咽癌细胞生长的功能检测；

A：qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系5-8F和CNE2中circBRD7的过表达效果和成环效率；

B：CCK8法检测过表达circBRD7对5-8F和CNE2细胞增殖能力的影响；

C：克隆形成实验表明，过表达circBRD7抑制了5-8F和CNE2细胞的克隆形成能力；

D：流式细胞术检测circBRD7过表达后，鼻咽癌细胞周期阻滞于G0/G1期；

E：流式细胞术检测circBRD7过表达后，凋亡的鼻咽癌细胞明显增多；

F：Western Blot分析circBRD7过表达的鼻咽癌细胞中CDK4、p21、Cleaved-PARP的表达。数据以均值±标准误的方式呈现，并且进行了三次独立实验。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；ns,没有统计学差异。

图5为体内实验证实circBRD7抑制鼻咽癌生长的表型检测

A：将鼻咽癌细胞5-8F/ctrl、5-8F/circBRD7注射到裸鼠右前肢腋下偏上的皮下位置，每隔3天测量移植瘤大小，circBRD7可显著抑制鼻咽癌细胞的增殖；

B：30天后处死裸鼠，大体观察发现过表达circBRD7可显著抑制移植瘤生长；

C：处死裸鼠后取出对照组和过表达circBRD7组移植瘤比较，过表达circBRD7组移植瘤最小；

D：称量对照组和过表达circBRD7组移植瘤，发现过表达circBRD7组移植瘤体重较轻。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步阐述本发明，而非限制本发明。

本发明所用的正常鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织标本均来自中南大学湘雅二医院的患者。搜集了所有病人的相关临床资料，所有实验用组织样本采集均获得中南大学伦理委员会授权和病人同意。

本发明所用5-8F/CNE2两株鼻咽癌细胞系均为中南大学肿瘤研究所分子遗传实验室所保存。细胞培养条件为：含10％胎牛血清(FBS)和1％双抗(青霉素、链霉素)的DMEM液体培养基，37℃、5％CO₂浓度的恒温培养箱内贴壁生长。

本发明环状RNA的引物与线性RNA引物的设计不同，是根据拼接位点两侧设计，在Primer3.0网站上在线设计，最终的引物合成工作，通过发送电子邮件订货，委托生工生物公司合成。

实施例1，证实circBRD7在鼻咽癌细胞中真实存在

1.材料与方法：

1.1试剂及试剂盒

琼脂糖(agrose)、核酸染料以及DL2000 Marker等琼脂糖凝胶电泳常用生化试剂购自US EVERBRIGHT公司；Actinomycin D(Dactinomycin)购自Selleck公司；胞浆胞核RNA分离试剂盒(PARIS^TM Kit Protein and RNA Isolation System)购自invitrogen公司。利用AG RNAex Pro Reagent(艾科瑞公司)抽提高质量的RNA，

ⅡQ RT SuperMix forqPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒(Vazyme)将RNA逆转录成cDNA，ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix qPCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测。本发明所用的鼻咽癌细胞系(NP69、CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、HONE1、5-8F、HK1、6-10B、C666-1)为中南大学肿瘤研究所保存。细胞培养所用DMEM培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为BiologicalIndustries公司产品。

1.2 qPCR引物序列

(1)GAPDH

上游引物：5’-CAACGGATTTGGTCGTATTGG-3’，序列见SEQ NO:7，

下游引物：5’-TGACGGTGCCATGGAATTT-3’，序列见SEQ NO:8，

(2)U6

上游引物：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，序列见SEQ NO:9，

下游引物：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，序列见SEQ NO:10，

(3)BRD7

上游引物：5’-ATGAGACCACCAGATTGC-3’，序列见SEQ NO:11，

下游引物：5’-TCCATACGTGCTTACGAT-3’，序列见SEQ NO:12，

(4)circBRD7(hsa_circ_0039345)

上游引物：5’-CGTGAAGGAATCTGGAGGAA-3’，序列见SEQ NO:13，

下游引物：5’-TCATTCCTGAGTGCAACAGC-3’，序列见SEQ NO:14，

(5)hsa_circ_0039343

上游引物：5’-GGGCCCTACAGTTCTTATGC-3’，序列见SEQ NO:15，

下游引物：5’-GGAGAGTTCGGTGACTTCGT-3’，序列见SEQ NO:16，

(6)hsa_circ_0039344

上游引物：5’-CTGTGAGACTGGGAATGACAAC-3’，序列见SEQ NO:17，

下游引物：5’-TCTTCTTTCAAATTCGCACTGG-3’，序列见SEQ NO:18，

(7)hsa_circ_19158

上游引物：5’-CGTGCCAAGATTATCCGTATGT-3’，序列见SEQ NO:19，

下游引物：5’-CCAGTTGTCATTCCCAGTCTCA-3’，序列见SEQ NO:20，

(8)hsa_circ_0105514

上游引物：5’-GTGCAGAAGAGCCACAATGA-3’，序列见SEQ NO:21，

下游引物：5’-TTCTTATCCATGGGTTCCACA-3’，序列见SEQ NO:22.

1.3细胞培养

将-80℃冻存的生长状态良好的鼻咽癌细胞系复苏于培养皿中，将培养皿置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至90％密度即可传代培养用于后续实验。

1.4基因circRNA逆转录PCR反应(依据Vazyme公司

II Q RT SuperMixfor qPCR(+gDNA wiper)(R223-01)的实验说明手册操作)，

(1)gDNA去除

在无酶的EP管中配置如下混合液：

用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。

(2)配制逆转录反应体系

在步骤(1)的反应管中直接加入5×HisScriptⅡqRTSuperMixⅡ

(3)进行逆转录反应

注：如果模板具有复杂二级结构域或高GC区域，可以将第一步反应温度提高至55℃，有助于提高产量。

(4)产物可以立即用于qPCR反应，或者在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-80℃，cDNA应避免反复冻融。

1.5 PCR扩增BRD7可能产生的circRNAs的拼接位点

(1)待鼻咽癌细胞5-8F生长至90％的密度时，收集细胞，抽提细胞中的总RNA，1μgRNA经逆转录成cDNA后，进行PCR反应。

(2)PCR反应体系(20μl)

(3)PCR反应步骤

1.6琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段

首先配制琼脂糖凝胶(凝胶浓度根据片段大小调整，此处应用2％浓度的胶)

(1)用天平称量2g琼脂糖粉末倒入200ml锥形瓶内，加入100ml 1×TAE溶液，摇匀后置于微波炉内加热，高火加热3min至沸腾，取出摇匀后，再次加热至沸腾，直到溶液均质透明，至溶液中看不到琼脂糖粉末，室温冷却至65℃左右。

(2)加入10μlSuper GelRed^TM核酸染料，摇匀。

(3)将琼脂糖溶液缓缓倒入配胶槽中，避免产生气泡，若产生气泡，应及时使用10μl枪头赶走气泡，插上梳子，避光放置约30min左右至其凝固。

(4)根据所需孔数切好琼脂糖凝胶，置于电泳槽内，倒入适量1×TAE溶液，使胶能够没入1×TAE溶液中。

(5)上样：在最左侧孔中加入5μl DNA Marker；加PCR产物时，若PCR Mix中不含有loading，应先将PCR产物与10×loading混匀，再按上样顺序加至孔中。注意加样过程要缓慢，以免产物在孔内溢出。

(6)电泳：110V，30min。

(7)通过Gel Doc XR System图像分析系统观察电泳条带位置是否正确及条带特异性。

1.7实时荧光定量法检测鼻咽癌细胞系及正常鼻咽上皮细胞中circBRD7的表达

(1)待鼻咽癌细胞系及正常鼻咽上皮细胞(NP69、CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、5-8F、HK1、C666-1、6-10B)生长至90％的密度，收集细胞，抽提细胞中的总RNA，1μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。

(2)实时荧光定量PCR反应体系(10μl)

(3)实时荧光定量PCR反应步骤

(4)反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度。根据扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数(CT值)、内参基因标化后，分析统计数据。

1.8 RNA FISH检测鼻咽癌细胞中circBRD7的表达

(1)爬片：24孔板的孔内提前放入已处理好且大小合适的盖玻片，按照30000个细胞/孔将贴壁细胞接种于24孔板中；

(2)吸弃培养基，加入500μl 37℃预热的1×PBS洗两次，每次洗5min；

(3)固定：吸弃PBS，每孔加入100μl 4％多聚甲醛，室温固定15min；

(4)吸弃4％多聚甲醛，每孔加入100μl BufferA(现配现用)，室温处理细胞15min。(Buffer A:997.5μl 1×PBS+2.5μl TritonX-100)；

(5)吸弃Buffer A，1×PBS洗两次，每次5min；

(6)预杂交：准备湿盒，杂交盒底部加20％甘油200ml以保持湿度，按每张盖玻片20μl加入预杂交液，恒温箱37℃-40℃2-4h，甩去多余预杂交液，不用冲洗；

(7)杂交：用寡核苷酸探针稀释液稀释地高辛标记的原位杂交探针，浓度一般为4μm/8μm，每张盖玻片加20μl 37℃预热的杂交液，将盖玻片倒扣杂交，恒温37℃-40℃杂交过夜(≥16h)；

(8)杂交过夜后，30-37℃左右的水温的2×SSC洗涤2次，每次5min；0.5×SSC洗涤15min；0.2×SSC洗涤2次，每次15min；

(9)封闭：滴加封闭液，37℃封闭30min，不洗涤，甩去多余封闭液。

(10)滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃孵育60min，或室温孵育2h；0.5M PBS，5min×4次。

(11)荧光二抗(鼠二抗)按照稀释比例用1×PBS稀释，每张盖玻片滴加20μl稀释的荧光二抗，37℃避光孵育1h；0.5M PBS洗3次，每次5min。

(12)将盖玻片放置在24孔板中，每孔加入200μl稀释后的DAPI工作液，避光染色3min；

(13)吸弃DAPI工作液，在24孔板中加入500μl 0.5M PBS洗3次，每次10min；无酶水洗10min×1次。注意洗涤过程中应将24孔板放置在摇床上，低速洗，避免速度过快导致细胞脱落。

(14)封片：滴加适量荧光抗淬灭剂于干净载玻片上，避免过量，会造成后续拍摄过程中片子滑动。将盖玻片倒扣在上面，封片后，使用激光共聚焦显微镜拍摄，应在一周内完成拍摄，避免荧光淬灭。

1.9胞浆胞核RNA分离实验检测鼻咽癌细胞中circBRD7的表达胞质RNA用吸附柱吸附法提取

(1)待细胞密度长到90％时，收集细胞，用4℃预冷的1×PBS洗细胞一次，离心后置细胞于冰上；

(2)加入100-500μl预冷的细胞分离缓冲液(不少于300μl，本次实验中加入400μl)，轻轻重悬，以免造成胞浆中有核RNA污染；

(3)冰上孵育10分钟，样品应该立马变澄清；

(4)4℃，500×g离心1-5min；

(5)用200μl枪头小心吸取上清部分(即胞浆部分)后置于冰上，沉淀即为胞核部分；

(6)选做：加入与步骤(2)同体积的预冷细胞分离缓冲液，轻轻吹打EP管，4℃，500×g离心1min，吸弃上清，应尽量吸干净，以免造成胞核中有胞浆RNA污染；

(7)在室温下加入与胞浆裂解液等体积(400μl)的2×裂解/结合溶液，用枪头轻轻吹打3-4次；

(8)加入与胞浆裂解液等体积的-20℃预冷的无水乙醇，用枪头轻轻吹打3-4次；

(9)用过滤柱过滤裂解液至收集管，离心半分钟或1分钟，倒掉滤液(一次最大过滤体积为700μl，每个过滤柱可过滤2ml裂解液)；

(10)加入700μl洗脱液1至过滤柱，离心15s-1min，倒弃滤液，回收滤管；

(11)加入500μl洗脱液2/3至过滤柱，离心15s-1min，倒弃滤液，回收滤管；

(12)重复步骤(11)；

(13)空离一次过滤管以去除微量残液；

(14)将Filter Cartridge放入新的收集管，加入40-60μl 95-100℃预热的洗脱液收集RNA，离心30s；

(15)再次用40-60μl预热的95-100℃的洗脱液收集RNA，离心30s；

(16)储存RNA于-80℃。

注意：步骤7-16均在室温下进行，离心条件为：10000-15000×g(通常10000-14000rpm)

胞核沉淀用Trizol提取

(1)在得到的胞核沉淀中加1ml 4℃保存的Trizol，用移液枪反复吹吸，振荡涡旋，使细胞充分裂解，将溶液转移至无酶离心管中，冰上裂解5min，使蛋白核酸复合物完全分离。

(2)在以上溶液中加入200μl-20℃预冷的氯仿(每使用1ml Trizol加入200μl氯仿)，立刻剧烈涡旋30s，冰上静置5min。

(3)将以上溶液13000rpm，4℃，离心20-30min。此时样品分为三层：红色有机相，中间层是白色膜状沉淀以及上层无色水相，RNA主要存在于水相中。将上层水相(400μl)转移至新的无酶1.5ml离心管中，注意不要吸到中间层。

(4)在得到的水相溶液中加入等体积(400μl)的-20℃保存的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置30min。

(5)13000rpm离心30min，可在管底看到白色沉淀，弃去上清。

(6)在所得沉淀中加入1ml75％乙醇(用无酶水与-20℃预冷的无水乙醇配制，现配现用)，将沉淀弹起，上下轻轻颠倒洗涤沉淀。

(7)13000rpm离心5min，小心吸弃上清，并重复上述步骤，吸净上清。

(8)打开管盖，将离心管倒扣在干净的无尘纸上，室温晾干沉淀，使乙醇挥发，RNA沉淀由白色变成透明色，根据沉淀的量加入适量的4℃预冷的无酶水，冰上放置5min，充分溶解RNA。

(9)测浓度后，将得到的胞浆和胞核RNA分别逆转录1μg成cDNA后，进行实时荧光定量PCR，分别检测胞浆以及胞核中circBRD7的表达，GAPDH作为胞浆参照基因，U6作为胞核内参基因。

(10)实验后-80℃保存，防止RNA降解。

1.10放线菌素D处理后检测鼻咽癌细胞中circBRD7的稳定性

(1)将生长状态良好的鼻咽癌细胞5-8F以及CNE2种在24孔板中，待其密度生长为80％左右时，在500μl培养基中加入1μl 1mg/ml的放线菌素D，使其终浓度为2μg/ml；

(2)以DMSO为阴性对照，使用放线菌素D处理细胞0，8，16，24h，收集细胞，抽提细胞中的总RNA，1μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。

(3)反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度。根据扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数(CT值)、内参基因标化后，采用组间t检验计算P值。

2.结果

前期通过生物信息学分析预测的5个BRD7可能产生的circRNAs(circ_0039343，circ_0039344，circ_0039345，circ_19158，circ_0105514)中，通过设计剪接位点的发散引物，采用qRT-PCR方法验证环状形式，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测到了circ_0039345的剪接位点序列(图1A)。此外，Sanger测序进一步证实circ_0039345由BRD7基因的6-8号外显子反向剪切而成，全长420bp(图1B)。证实了circ_0039345在鼻咽癌细胞中是真实存在的，我们将其命名为circBRD7。我们对正常鼻咽上皮细胞NP69、9个鼻咽癌细胞系(CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、HONE1、5-8F、HK1、6-10B和C666-1)进行了qRT-PCR，结果表明，circBRD7在鼻咽癌细胞系中的表达水平低于正常鼻咽上皮细胞系NP69(图1C)，并且两组数据的差异具有统计学意义，所以circRNAcircBRD7在鼻咽癌的发生发展中可能具有重要的生物学功能。RNA荧光原位杂交实验和核质分离实验表明，circBRD7在细胞核和细胞质中均有分布(图1D，E)。我们用放线菌素D处理5-8F和CNE2细胞0、8、16、24h，抑制细胞内RNA转录，然后提取总RNA进行qRT-PCR检测，发现circBRD7比BRD7基因的线性mRNA更稳定(图1F)。这些结果表明circBRD7是一种在鼻咽癌细胞中表达下调的真实环状RNA。

实施例2，原位杂交检测circBRD7在鼻咽癌中的表达

1.材料与方法：

1.1设计并合成杂交探针

为了采用原位杂交方法检测circBRD7在鼻咽癌患者组织中的表达情况，我们设计了针对环状RNA拼接位点检测circBRD7表达的寡核苷酸探针及检测GAPDH的阳性对照原位杂交寡核苷酸探针。

用于原位杂交检测circBRD7表达的寡核苷酸探针：

优选：circBRD7探针：

5’-TAGTTTGAAGTTATCCTGACTGTTCACAAG-3’

检测内参基因GAPDH的阳性对照探针(优选以下任一条)：

探针序列1：5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'

探针序列2：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'

采用化学合成方法合成上述检测各基因特异性表达的寡核苷酸探针序列。

1.2寡核苷酸探针标记及检测试剂盒和原位杂交检测试剂

地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2^nd Generation，Roche公司)；抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fabfragments，Roche公司)；增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSA^TM BiotinSystem，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)；乙二胺四乙酸(EDTA，pH＝8.0)；4M氯化锂(LiCl)溶液；胃蛋白酶；3％柠檬酸(pH＝2.0)；0.1M甘氨酸；预杂交液[主要成分：20×柠檬酸钠缓冲溶液(Saline Sodium Citrate,SSC)、硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)、去离子甲酰胺(Deionized Formamide)、多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)、多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)、变性剪切的蛙精DNA(denatured and shearedsalmon sperm DNA，ssDNA)、酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)、二硫苏糖醇(DTT)、50×邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)、磷酸缓冲液(PBS buffer)]；1到5％热失活胎牛血清或羊正常血清；TNB Buffer(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5，0.5％BlockingReagent)；TNT Buffer(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5，0.05％Tween 20)；1％阻断试剂(Blocking reagent，Roche公司)以及DAB染色试剂盒(ORIGENE)。

1.3其他主要试剂和材料

二甲苯；无水乙醇；90％酒精；85％酒精；75％酒精；50％酒精；30％H₂O₂；甘油；封口膜；无酶水；苏木素；中性树胶；盖玻片；载玻片；PBS缓冲液(pH7.2～7.4，137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/L Na₂HPO₄，1.4mmol/LKH₂PO₄)；3％甲醇-双氧水溶液(80％甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值)以及1％盐酸酒精(1ml浓盐酸+99ml 70％酒精配置)。

1.4地高辛寡核苷酸加尾试剂标记探针

(1)利用地高辛寡核苷酸加尾试剂(DIG OlignucleutideTailing Kit)进行寡核苷酸探针标记，反应体系(20μl)如下：

v:根据所需寡核苷酸的量来计算体积

(2)用移液枪轻轻吹打混匀，离心。37℃水浴反应30min，之后加入2μlEDTA(0.2M，PH 8.0)或65℃加热10min中止反应。

1.5寡核苷酸探针标记后纯化

某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

(1)探针反应混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCl+75μl无水乙醇(-20℃)，DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，反复的乙醇沉淀能将二者分开。

(2)-70℃沉淀60min或-20℃沉淀2h。

(3)13000×g，4℃离心15min。

(4)弃上清，用50μl冰冷的70％乙醇(无水乙醇配制)洗涤。

(5)13000×g，4℃，离心5min。

(6)弃上清，真空4℃干燥。

(7)用无菌双蒸水重溶探针。

1.6原位杂交检测鼻咽癌患者组织及正常鼻咽上皮组织石蜡切片中circBRD7的表达

(1)-20℃保存的石蜡切片置于65℃烤片过夜，熔化表面石蜡。

(2)脱蜡：二甲苯Ⅰ脱蜡10min，二甲苯Ⅱ脱蜡10min

(3)梯度酒精洗涤：100％酒精，5min→100％酒精，5min→90％酒精，5min→85％酒精，5min→85％酒精，5min→85％酒精，5min→75％酒精，5min→50％酒精，5min→无酶水，5min

(4)封闭内源性过氧化物酶：3％过氧化氢(30％过氧化氢+无酶水稀释)，30min；无酶水，5min

(5)消化：4℃保存的3％柠檬酸稀释胃蛋白酶，每1ml 3％柠檬酸滴加两滴胃蛋白酶，涡旋混匀，37℃预热，消化12min，不能消化过度。

(6)终止消化：0.1M甘氨酸，5min；无酶水，5min

(7)预杂交：甩去片子上的多余水分，根据组织大小来滴加预杂交液，用大小合适的封口膜盖住，防止预杂交液蒸发，放入37℃培养箱中，预杂交2-4h。预杂交过程中，将片子放置在杂交盒中，杂交盒底部应加入20％甘油保湿，以免切片干掉。

(8)杂交：移去封口膜，甩去片子上多余的预杂交液，不洗涤。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使原位杂交探针变性，充分溶解于杂交液中，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。根据组织大小来滴加提前预热的配置好的探针杂交液，37℃杂交过夜(14-16h)。

(9)杂交后洗涤：2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC在杂交时配制，放置37℃预热。杂交后揭去封口膜，依次于摇床上摇动洗涤，切片浸入2×SSC，5min×2次→0.5×SSC，15min×1次→0.2×SSC，15min×2次。严格按照洗涤时间来洗涤片子，洗涤时间过长，会导致杂交信号减弱；洗涤时间短，背景颜色较深，影响实验结果。

(10)切片转至TNT缓冲液中，5min×3次。

(11)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温30min。

(12)吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％TritonX-100+1％阻断剂)，室温4小时，检测地高辛探针与mRNA结合复合物。

(13)TNT Buffer(100mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.05％Tween 20)洗涤，5min×3次。

(14)切片上滴加信号放大试剂BiotinylTyamid，300μl/TMAs，(BiotinylTyramid贮存液：BiotinylTyramid溶解于0.2ml DMSO，BiotinylTyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释BiotinylTyramid贮存液)，室温10分钟，增强原位杂交反应显色反应的阳性信号。

(15)TNT洗涤，5min×3次。

(16)无酶水洗涤，1min×1次。

(17)DAB显色，显色时间视情况而定，可在显微镜下观察着色情况，显色好后置于水中终止显色。

(18)苏木素复染：甩去多余水分，滴加苏木素染细胞核，严格控制染色时间。

(19)返蓝：着色后将切片置于温水中，然后置于水龙头下，冲洗5-10min返蓝。

(20)封片：晾干切片，用中性树胶封片。

(21)拍照统计：待片子完全凝固后，显微镜下拍照，并根据阳性强弱程度进行评分。

1.7结果判断及标准

(1)应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标circRNA的阳性表达信号在细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

(2)再分别以该检测circRNA表达部位阳性信号的强度和阳性率两种标准进行综合评分，判断标准为：

①依据阳性细胞染色强度判断：细胞为蓝色，记0分；细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。

②依据阳性率计分：阳性率0％，记为0分；阳性率1％-25％，记1分；阳性率26％-50％，记为2分；阳性率51％-75％，记为3分；阳性率76％-100％，记为4分。

(3)为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别进行独立评分。总分值为阳性强度×阳性率，分值大于6定义为高表达，分值小于等于6定义为低表达。

2.结果

我们通过原位杂交技术检测了circBRD7在鼻咽癌患者活检组织及正常鼻咽上皮组织中的表达水平，结果表明：与正常上皮鼻咽组织(Normal)相比，circBRD7在鼻咽癌患者活检组织(Tumor)显著低表达，在细胞核和细胞浆中均有表达。并且发现，circBRD7在鼻咽癌患者活检组织中的表达与临床分期负相关(图2)。因此，将circBRD7的表达用于鼻咽癌患者的诊断预测，可以为鼻咽癌患者的治疗提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

实施例3，体外过表达circBRD7抑制鼻咽癌增殖、诱导细胞凋亡

1.材料与方法

1.1试剂及试剂盒

限制性内切酶ClaI和SacII购自TakaRa公司；T4 DNA连接酶(PROMEGA)；质粒抽提试剂盒(天根)；纯化试剂盒(OMEGA)；RNase A(艾科瑞公司)；CCK-8试剂盒(Biomake生物公司)；结晶紫(北京碧云天生物公司)；TksGflex^TM DNA Polymerase(Takara公司)；AnnexinV-FITC/PI Kit(四正柏生物)。利用AG RNAex Pro Reagent(艾科瑞公司)抽提高质量的RNA，

II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒(Vazyme)将RNA逆转录成cDNA，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix qPCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测。

1.2 circBRD7过表达载体的构建

(1)首先我们选择酶切位点，将circBRD7全长序列放入NEB cutter 2.0在线网站分析，显示ClaI和SacII酶切位点为circBRD7全长序列中不存在的位点，同时在环状RNA空载pcDNA3.1(+)circRNA Mini plasmid(Invitrogen)中单一存在的DNA限制性内切酶，据此构建过表达载体。

(2)以扩增circBRD7拼接位点的5-8F细胞cDNA为模板，利用TksGflex^TMDNAPolymerase进行PCR扩增全长circBRD7序列。circBRD7全长序列扩增引物如下：

上游：5’-gataacttcaaactaatgtg-3’

下游：5’-ctgactgttcacaagccg-3’

(3)在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶ClaI和SacII识别位点及保护碱基后，引物序列如下：

上游：5’-CCCATCGATgataacttcaaactaatgtg-3’，下划线部分为ClaI识别位点；

下游：5’-TTTCCGCGGctgactgttcacaagccg-3’，下划线部分为SacII识别位点。

(4)按照下列组分配制PCR反应液(20μl)

(5)PCR反应步骤及条件

(6)琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段大小及位置是否正确，确认无误后，即可进行批量PCR。将PCR产物纯化回收，经ClaI和SacII双酶切，琼脂糖凝胶电泳验证正确后，再次纯化回收目的片段。

(7)pcDNA3.1质粒经ClaI和SacII双酶切后纯化回收目的片段。

(8)用T4 DNA连接酶连接(6)和(7)步纯化回收产物，室温连接30min，4℃连接过夜，即可得到可用于真核表达circBRD7的载体质粒。

(9)将上一步得到的包含circBRD7全长序列的pcDNA3.1真核表达质粒转化感受态细菌，以扩增质粒。

(10)测序正确后，根据天根无内毒素质粒小提中量试剂盒的说明书操作，抽提质粒，用于后续实验。

1.3细胞培养与转染

(1)将生长状态良好的鼻咽癌细胞5-8F及CNE2按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，轻轻晃动6孔板，使细胞均匀铺在孔底。

(2)将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待细胞生长至60-80％密度即可开始circBRD7真核表达载体的转染。

(3)取2个灭菌的1.5ml离心管，其中一个离心管中(A管)加入125μl Opti-MEM，4μlP3000，2μg质粒(根据质粒浓度计算体积)，另一个离心管中(B管)加入125μl Opti-MEM，4μllip3000，涡旋混匀，瞬离，室温孵育5min后，将A管中的混合液加入到B管中，涡旋混匀，室温孵育10min。

(4)用D-Hanks溶液清洗六孔板中的细胞2-3次，每个孔中加入新的2ml培养基，将孵育好的质粒及转染试剂的混合物均匀加入到对应的孔中。将6孔板置于培养箱中，37℃培养6小时。

(5)培养6h后弃上清，更换新的培养基，继续培养，可以根据实验需求在转染的不同时间收集细胞进行后续实验。

1.4 CCK8细胞增殖实验

(1)按实验所需分组在六孔板中进行转染，转染24h后，加少量胰酶消化细胞，每孔加3-4ml培养基，将细胞转移到5ml离心管中，用血球计数板对细胞进行计数。

(2)按每孔1000个细胞/100μl培养基对细胞进行稀释(每组准备35个孔的量)，接种在96孔板中(96孔板的最外面一圈加D-Hanks溶液，以减少培基蒸发)，每组5个复孔(按6天计)，每组共接种30个孔，加样时应该边用移液枪缓慢吹打边加样，以防止细胞沉淀造成加样不均匀，放置于37℃培养箱中培养。

(3)待细胞贴壁后，避光条件下，按照CCK-8：培养基体积＝1：10的比例在每孔中加入10μl的CCK-8试剂，轻轻晃动96孔板，使溶液混合均匀，放置在培养箱中孵育2h。

(4)取出96孔板，用酶标仪测定每组5个复孔中培养基在450nm处的吸光值，记录为第0天的数据，此后，每24h测定一次，依次记录为第1天、第2天等。

(5)待所有数据测定完成后，根据第0天的数据进行标化，统计细胞增殖速度，并利用GraphPad Prism软件作图。

1.5克隆形成实验

(2)按每孔1000个细胞/2ml培养基对细胞进行稀释，每组3个复孔，均匀接种在6孔板中，置于37℃培箱中培养7-14天，培养期间要注意观察，若培养基减少则要在每孔中补加1ml培养基。

(3)待细胞增殖为50个细胞以上的克隆时，在培养箱中取出，用1×PBS浸洗细胞3次，每次5min。

(4)固定：用4％多聚甲醛对细胞进行固定，室温固定20min。

(5)染色：弃上清，每孔中加入1ml结晶紫，染色5-10min，用蒸馏水冲洗至无结晶紫残留，晾干后拍照。

(6)拍照记录后，统计各组有效的细胞克隆数，分析数据。

1.6流式细胞仪分析细胞周期

(1)按实验所需分组在六孔板中进行转染，转染24h后，将细胞传至小皿中继续培养24h且密度为80％-90％时收集细胞，低温离心机(4℃)，1000rcf离心5min，沉淀细胞。

(2)弃上清，加入4℃保存的生理盐水1ml，用剪去尖端的200μl枪头轻轻重悬细胞，低温离心机(4℃)，1000rcf离心5min，重复2-3次。

(3)最后一次离心之后留取300μl生理盐水，边涡旋边滴加700μl-20℃保存的无水乙醇，放置在-20℃冰箱固定过夜。

(4)固定过夜后，500rcf离心5min，弃上清。

(5)加入1ml 4℃保存的生理盐水，500rcf离心5min，洗涤1-2次，最后一次离心弃上清。

(6)在细胞沉淀中加入200μl生理盐水，5μl PI，10μl RNase A，用剪去尖端的200μl枪头轻轻重悬混匀，37℃水浴10-30min。

(7)流式细胞仪CYTEK^TM检测。接收的信号经modifit软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。

1.7流式细胞仪分析细胞调亡率

(1)按实验所需分组在六孔板中进行转染24h后，将培养基更换成无血清培养基，饥饿处理24h。

(2)收集细胞培养基到离心管内备用，用不含EDTA的胰酶消化细胞，加入前面收集的细胞培养液，轻轻吹下所有贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。

(3)再次收集细胞到先前的离心管内，1000rpm，离心5min。如果细胞无法完全离心，可以适当延长离心时间或稍微增大离心力。

(4)小心吸弃上清，避免吸到细胞沉淀，加入1ml 4℃预冷的1×PBS或生理盐水，重悬细胞；1000rpm，离心5min，吸弃上清。

(5)用无酶水按照1:3比例稀释缓冲液，所需要的量依据细胞量及分组来配制，现配现用。

(6)用上一步中新鲜配制的1×结合缓冲液重新重悬细胞，调节细胞浓度为1-5×10⁶/ml。

(7)取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/FITC，轻轻混匀，室温避光孵育5min。

(8)加入10μl 20μg/ml的碘化丙锭(PI)轻轻混匀。

(9)加入400μl PBS，轻轻混匀，用细胞筛过滤细胞混合液，以免细胞团堵塞流式仪。

(10)立即进行流式检测，Annexin V/FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。实验应独立重复3次。

1.8 Western Blot检测周期及凋亡相关蛋白的表达

按实验所需分组进行转染，将转染后48h的细胞从培养箱取出，抽提细胞中的总蛋白，常规Western Blot方法检测周期及凋亡相关蛋白的表达，GAPDH作为内参基因。

2.结果

为了探讨circBRD7在鼻咽癌中的作用，我们根据circBRD7的全长序列，设计并合成了扩增其全长的引物，PCR扩增后酶切纯化，并将其连接到环状RNA空载pcDNA3.1(+)circRNA Mini plasmid上(图3)，利用Lipofectamine^TM3000转染到鼻咽癌细胞中，通过qRT-PCR实验检测了circBRD7的过表达效果和成环效率。结果表明，在鼻咽癌细胞5-8F和CNE2中成功过表达了circBRD7(图4A)，CCK8和克隆形成实验表明，与转染空载体的细胞相比，过表达circBRD7后鼻咽癌细胞5-8F及CNE2的生长速度显著减慢(图4B，C)。为了明确其潜在的生物学机制，我们进一步分析了circBRD7过表达对细胞周期进程的影响，流式细胞仪分析表明，与对照细胞相比，circBRD7过表达的细胞滞留在G0/G1期，S期减少，使其细胞分裂减慢速度(图4D)。细胞凋亡检测结果显示，过表达circBRD7促进了鼻咽癌细胞的凋亡(图4E)。此外，我们在circBRD7过表达情况下，通过Western Blot实验检测周期及凋亡相关基因的表达，发现过表达circBRD7之后，P21表达水平升高，CDK4表达水平降低；Cleaved-PARP的水平升高(图4F)。综上所述，外源过表达circBRD7可抑制鼻咽癌细胞增殖，促进细胞凋亡，在鼻咽癌细胞中起到肿瘤抑制因子的作用。

实施例4，体内实验证实circBRD7抑制鼻咽癌细胞的生长

1.材料与方法

10只雌性BALB/C裸鼠，4周龄，重量为19±2g，购买于北京华阜康实验动物有限公司。所有裸鼠均质检合格，在中南大学肿瘤医院实验动物中心，于无特定病原体(SPF)条件下饲养。

1.1构建裸鼠皮下移植瘤模型。

(1)按照每组裸鼠数量以及每只老鼠所需注射的细胞数目，准备circBRD7过表达，以及转染对照空载的5-8F细胞。

(2)每组共有5只裸鼠，每只裸鼠准备含有5×10⁶个细胞的悬液150μl，待裸鼠生长到5周龄左右，用胰岛素注射剂将细胞悬液接种于裸鼠右前肢腋下偏上的皮下位置。

(3)待肿瘤生长出来后，每隔3天用游标卡尺记录瘤体的长、宽计算肿瘤的生长体积。

(4)按照动物伦理要求，待细胞瘤体长到一定大小后，用异氟烷麻醉小鼠，将裸鼠进行拍照，然后处死各组的裸鼠，取出瘤体拍照并测量所有瘤体的重量。

(5)将各组的部分瘤体进行脱水固定、石蜡包埋、切片之后检测增殖和凋亡标志分子的表达，剩余瘤体液氮保存，用于RNA或蛋白抽提。

1.2分析和统计软件

本课题使用GraphPad Prism软件对实验结果进行统计学分析并绘图，所有数据均使用平均值±标准误表示，并利用t检验分析数据之间的统计学差异；P＜0.05即差异有统计学意义。

2.结果

为了探讨circBRD7过表达在体内肿瘤生长过程中的作用，我们在裸鼠中进行了异种移植瘤模型的体内实验。将500万个5-8F/ctrl、5-8F/circBRD7细胞分别皮下注射到5周龄雌性裸鼠的右前肢腋下偏上的位置，并在整个裸鼠皮下成瘤模型构建过程中，每隔3天对皮下移植瘤的体积进行观测，共测量了7个时间点，发现过表达circBRD7组的移植瘤生长缓慢，第30天的时候用异氟烷麻醉小鼠，对裸鼠进行拍照，circBRD7过表达组的肿瘤体积大小明显低于对照组(图5A，B)。之后将裸鼠处死，取出瘤体拍照并测量所有肿瘤的重量。结果表明：过表达circBRD7组的瘤体体积明显较小，瘤体重量明显低于对照组，且结果具有显著统计学差异(图5C，D)。进一步证实：在鼻咽癌生长过程中，circBRD7能够显著抑制肿瘤生长过程。

序列表

<110> 中南大学

<120> 环状RNA circBRD7在制备鼻咽癌诊断和/或治疗制剂中的应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 420

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gataacttca aactaatgtg tactaatgcc atgatttaca ataaaccaga gaccatttat 60

tataaagctg caaagaagct gttgcactca ggaatgaaaa ttcttagcca ggaaagaatt 120

cagagcctga agcagagcat agacttcatg gctgacttgc agaaaactcg aaagcagaaa 180

gatggaacag acacctcaca gagtggggag gacggaggct gctggcagag agagagagag 240

gactctggag atgccgaagc acacgccttc aagagtccca gcaaagaaaa taaaaagaaa 300

gacaaagata tgcttgaaga taagtttaaa agcaataatt tagagagaga gcaggagcag 360

cttgaccgca tcgtgaagga atctggagga aagctgacca ggcggcttgt gaacagtcag 420

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagtttgaag ttatcctgac tgttcacaag 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtagaggc agggatgatg ttctggagag 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccactttacc agagttaaaa gcagccctgg 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccatcgatg ataacttcaa actaatgtg 29

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttccgcggc tgactgttca caagccg 27

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacggattt ggtcgtattg g 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgacggtgcc atggaattt 19

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attggaacga tacagagaag att 23

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaacgcttc acgaatttg 19

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgagaccac cagattgc 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccatacgtg cttacgat 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgtgaaggaa tctggaggaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcattcctga gtgcaacagc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gggccctaca gttcttatgc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggagagttcg gtgacttcgt 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgtgagact gggaatgaca ac 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcttctttca aattcgcact gg 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgtgccaaga ttatccgtat gt 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccagttgtca ttcccagtct ca 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtgcagaaga gccacaatga 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttcttatcca tgggttccac a 21

Claims

1.检测环状RNA circBRD7的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断制剂中的应用，该环状RNAcircBRD7的序列见SEQ NO:1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的鼻咽癌辅助诊断的制剂包括原位杂交检测试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测circBRD7表达的寡核苷酸探针，优选序列如下：

circBRD7探针:

5’-TAGTTTGAAGTTATCCTGACTGTTCACAAG-3’。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测试剂为原位杂交检测试剂盒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测试剂盒包括：

用于原位杂交检测circBRD7表达的寡核苷酸探针：

优选：circBRD7探针:

5’-TAGTTTGAAGTTATCCTGACTGTTCACAAG-3’；

用于检测内参基因GAPDH的阳性对照探针，优选以下任一条：

探针序列1：5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'

探针序列2：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，除了寡核苷酸探针之外，试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、DAB染色试剂；原位杂交所需其它常规试剂。

7.circBRD7过表达试剂在制备鼻咽癌治疗制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的鼻咽癌治疗制剂包括circBRD7的过表达载体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的鼻咽癌治疗制剂包括用于扩增circBRD7全长序列的引物，序列如下：

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的鼻咽癌治疗制剂除了扩增circBRD7全长的引物之外，还含有：环状RNA空载pcDNA3.1(+)circRNA Mini plasmid、Quickcut限制性内切酶ClaI和SacII；T4 DNA连接酶；转染circBRD7过表达载体所需的试剂Lipofectamine^TM 3000以及构建circBRD7表达载体所需的其它常规试剂。