CN104388543A

CN104388543A - 长链非编码rna loc401317的原位杂交探针、试剂及其应用

Info

Publication number: CN104388543A
Application number: CN201410584311.7A
Authority: CN
Inventors: 李桂源; 曾朝阳; 熊炜; 龚朝建; 李小玲; 张文玲; 李夏雨; 曾勇; 周鸣; 马健; 彭淑平; 向波
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2014-10-27
Filing date: 2014-10-27
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-10-27
Also published as: CN104388543B

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用。该长链非编码RNA LOC401317可以用于制备鼻咽癌患者的预后制剂，特别是制备出原位杂交检测法预测鼻咽癌患者预后的试剂盒。通过研究证实LOC401317在鼻咽癌组织中表达下调，低表达LOC401317的鼻咽癌患者比高表达LOC401317的鼻咽癌患者预后差，因此，将LOC401317的表达用于鼻咽癌患者的预后预测，可以为鼻咽癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用方法。

背景技术

鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，其中抑癌基因的失活与癌基因的激活发挥了关键的作用。

TP53基因(编码p53蛋白)自1979年被克隆以来，一直是肿瘤分子生物学研究领域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的证据表明，TP53基因通过调控一系列信号转导通路广泛参与了多种恶性肿瘤的发生发展。在细胞受到各种致癌因素的刺激时，p53蛋白激活并通过转录调控下游关键靶基因的表达，阻滞细胞周期、诱导细胞分化、启动细胞衰老及凋亡、参与DNA损伤修复维持基因组的稳定、调节能量代谢和抑制肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤的发生发展。已有的研究发现，TP53基因是包括鼻咽癌在内的多种恶性肿瘤中最常见的突变基因之一，33％～76％的患者存在TP53基因异常。因此，恢复鼻咽癌中TP53基因功能或逆转其下游信号通路，对鼻咽癌的治疗具有重要的意义。

长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200nt、缺少特异完整的开放阅读框、无或很少有蛋白编码功能的RNAs分子。最近的研究表明，lncRNAs通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，它们参与了生物体生长、发育、衰老及死亡等重要生命活动的调控。越来越多的研究表明lncRNAs的异常表达或功能缺失与肿瘤的发生发展密切相关。一些lncRNAs分子在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要的意义，且可以作为肿瘤预后判断新的分子标记。目前，已经克隆的人类lncRNAs基因已超过4万多个，但绝大部分lncRNA的功能未知。

为了寻找鼻咽癌中TP53基因调控的下游lncRNAs及其在鼻咽癌中的应用价值，我们在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因，收集不同时间点的细胞用新一代lncRNAs芯片检测了已知 lncRNA的表达水平。芯片检测的结果显示，lncRNA LOC401317的表达差异最显著，其表达明显上调，提示LOC401317可能具有抑瘤基因的作用。

我们构建了表达LOC401317的真核表达载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和裸鼠移殖瘤体内模型中均证实lncRNA LOC401317可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的生长，因此LOC401317是一个新的抑瘤性lncRNA。将LOC401317真核表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒，可保护LOC401317载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。

进一步地，我们检测了LOC401317在临床离体肿瘤样本中的表达水平，并分析了LOC401317表达水平与临床病例资料的相关性。我们从鼻咽癌及相对应的正常对照组织中抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了LOC401317的表达情况，结果显示LOC401317在鼻咽癌组织中表达下调。我们随后又利用原位杂交的方法，进一步在存档石蜡样本验证了LOC401317在鼻咽癌中表达显著下调，因此针对LOC401317的检测制剂可用于鼻咽癌的辅助诊断，结合临床回访资料进行生存曲线分析发现LOC401317表达低的患者其生存时间短于该lncRNA表达高的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判断。

发明内容

本发明的目的是提供长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用方法，利用长链非编码RNA LOC401317序列可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的制剂。

lncRNAsLOC401317的应用方法，用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA LOC401317的序列见SEQ NO:1。

所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。

所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针，序列如下：

LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’

LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’。

所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。

试剂盒中含有上述用于原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针：

LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’

LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’；

阳性对照探针(检测看家基因GAPDH)：

GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'

GAPDH探针2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。

试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、DAB染色试剂；

其它常规生物化学试剂，包括20x柠檬酸钠缓冲溶液(saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent)，TNB缓冲液(即：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.5％阻断试剂)，TNT缓冲液(即：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.05％Tween 20)。

我们通过原位杂交在鼻咽癌和正常鼻咽上皮存档石蜡组织标本中发现LOC401317在鼻咽癌中表达显著下调，且LOC401317的表达与预后密切相关，LOC401317表达低的患者更快地死亡，提示LOC401317可作为鼻咽癌预后预测的分子标志。本发明为鼻咽癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1为TP53基因可诱导lncRNA LOC401317表达情况；

A：在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体0、12、24和48小时后用实时荧光定量PCR检测TP53基因的表达，TP53基因mRNA表达水平显著上调；

B：在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体0、12、24和48小时后用Western Blotting方法检测TP53基因的表达，TP53基因蛋白表达水平显著上调；

C：在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体0、12、24和48小时后用荧光素酶报告基因活性方法检测TP53基因表达的p53蛋白作为核转录因子的转录活性，p53转录活性显著上调；

D：在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体12、24和48小时后利用lncRNA芯片检测细胞内lncRNA表达水平的变化，本图显示了细胞中转染TP53基因后表达上调最显著的30个基因；

E：实时荧光定量PCR技术验证lncRNA芯片的结果，转染TP53基因后细胞中lncRNA LOC401317的表达显著上调；

图2为在鼻咽癌细胞中导入lncRNA LOC401317抑制鼻咽癌细胞的生长情况；

A：生长曲线实验表明在鼻咽癌细胞中转染LOC401317表达载体后细胞生长速度减慢；

B：流式细胞分析仪检测转染LOC401317表达载体后，鼻咽癌细胞周期阻滞于G0/G1期；

C：流式细胞分析仪检测转染LOC401317表达载体后，凋亡的鼻咽癌细胞明显增多；

图3为动物实验证实lncRNA LOC401317抑制鼻咽癌细胞的生长和增殖情况；

A：在鼻咽癌细胞中转染LOC401317表达载体后，注射到裸鼠腋窝皮下，每周测量移殖瘤大小，LOC401317可显著抑制鼻咽癌细胞的增殖；

B：35天后处死裸鼠，大体观察表明重表达LOC401317组移殖瘤最小；

C：处死裸鼠后取出移殖瘤比较和测量移殖瘤大小，重表达LOC401317组移殖瘤最小；

图4为利用实时荧光定量PCR的方法检测鼻咽癌离体样本中LOC401317的表达情况；LOC401317在鼻咽癌(T)中的表达比正常对照(N)样本中显著下调；

图5为原位杂交检测LOC401317在鼻咽癌及正常鼻咽粘膜中的表达情况；左图为鼻咽癌组织，右图为正常鼻咽粘膜组织(放大倍数：200×)，LOC401317在鼻咽癌中表达水平较低；

图6为鼻咽癌中LOC401317的表达与患者的预后相关分析；LOC401317表达低或者不表达的患者更快的死亡。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1，在鼻咽癌细胞中导入TP53基因，lncRNA LOC401317表达显著上调

1.材料与方法：

1.1 试剂及试剂盒

琼脂糖(agrose)等常用生化试剂、胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，利用 Mini Kit(Qiagen)抽提试剂盒抽提高质量的RNA，SuperScript^TM III(Invitrogen)试剂盒将RNA逆转录成cDNA。荧光素酶报告基因检测试剂盒Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司。本发明所用的鼻咽癌细胞HNE2为中南大学肿瘤研究所保存。细胞培养所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。lncRNA芯片为安捷伦公司产品，该芯片规格为4*180K，其中lncRNAs探针46506条。

TP53真核表达质粒购自美国Clontech公司，用于检测p53蛋白转录活性的pp53-TA-luc荧光素酶报告质粒购自碧云天公司。

实时荧光定量检测引物序列有：

TP53基因上游引物：5’-CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3’

TP53基因下游引物：5’-CTCCGTCATGTGCTGTGACT-3’

内参看家基因GAPDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

内参看家基因GAPDH下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’

LOC401317上游引物：5’-CTTTCTTGCTGGCATCGTTACC-3’

LOC401317下游引物：5’-CTTGCCCCTCTAAGAACTTCGT-3’

Western blotting检测p53蛋白及内参基因GAPDH表达的抗体购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养与转染

将生长状态良好的鼻咽癌细胞HNE2按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始TP53真核表达载体的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入3μl的lipofectamine 2000于100μl无血清培养基中混匀静置5min；将TP53表达载体加入100μl无血清培养基中；然后与上述包含lipofectamine的100μl无血清培养基温和混匀，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成复合体；用D-Hank's液洗涤细胞3次；将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养12、24和48小时。

1.3 实时荧光定量法检测TP53基因和LOC401317的表达

鼻咽癌细胞HNE2转染TP53真核表达载体后于0、12、24和48小时收集细胞，抽提细胞中的总RNA，2μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。

1.4 Western blotting检测p53蛋白的表达

鼻咽癌细胞HNE2转染TP53真核表达载体后于0、12、24和48小时收集细胞，抽提细胞中的总蛋白，常规Western blotting方法检测p53蛋白的表达，GAPDH作为内参基因。

1.5 荧光素酶报告基因检测p53的转录活性

鼻咽癌细胞HNE2转染TP53真核表达载体，同时转染pp53-TA-luc荧光素酶报告质粒，于0、12、24和48小时收集细胞，根据Promega公司荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测p53转录因子活性。

1.6 lncRNA芯片检测转染TP53基因后鼻咽癌细胞中lncRNA表达变化

按安捷伦公司产品说明，抽提细胞总RNA、纯化，随机引物合成cDNA，并在cDNA上标记荧光Cy3，与lncRNA芯片杂交，芯片杂交后经洗涤后在安捷伦专用芯片扫描仪上扫描，获得芯片上每个探针点的荧光强度，专用软件分析转换成对应的lncRNA表达水平。比较鼻咽癌细胞HNE2转染TP53真核表达载体后0、12、24和48小时细胞内lncRNA的表达水平，获得差异表达基因图谱。

2.结果

2.1 TP53真核表达质粒转染鼻咽癌细胞HNE2后的表达效果：

将TP53真核表达载体转染HNE2细胞后，12、24和48小时均可检测到TP53mRNA(图1A)和p53蛋白(图1B)的表达显著升高，且表达出的p53蛋白具有较强的转录因子活性(图1C)。

2.2 转染TP53真核表达载体后鼻咽癌细胞中部分lncRNA的表达水平显著改变：

利用lncRNA芯片，我们检测了转染TP53表达载体0、12、24和48小时后鼻咽癌细胞HNE2中lncRNA的表达状态，部分lncRNA表达水平发生了显著的变化(图1D列举了表达上调最显著的30个lncRNA)。随后，我们对转染TP53载体后HNE2细胞中LOC401317的表达水平用实时荧光定量法进行验证，证实LOC401317的表达确实显著上调(图1E)，表明TP53在HNE2细胞中调控了LOC401317的表达，鉴于TP53基因是最重要的抑瘤基因之一，提示LOC401317可能也具有抑瘤基因功能。

实施例2，lncRNA LOC401317抑制鼻咽癌细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡

1.材料与方法

1.1 试剂及试剂盒

限制性内切酶Nhe I和EcoR I及T4DNA连接酶等购自TakaRa公司；TRIZOL^TM Reagent(Invitrogen)；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒(OMEGA)；逆转录试剂盒(Promega)；蛋白酶K、DNase I、RNAsin、RNase A(GBICOL公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma)；抗生素G418(Ameresc)。

1.2pcDNA3.1–LOC401317真核表达载体的构建

我们选择pcDNA3.1空白载体(来源于Invitrogen公司)构建LOC401317的过表达载体。我们选择Nhe I和EcoR I酶切位点用于酶切pcDNA3.1载体并将LOC401317序列插入该位点。

构建pcDNA3.1–LOC401317真核载体步骤如下：

1)以转染TP53质粒的HNE2细胞cDNA为模板，利用TaKaRa LA 酶进行PCR扩增全长LOC401317序列。LOC401317全长序列扩增引物如下：

上游引物：5’-atcgggggtgtgtgtttgcct-3’

下游引物：5’-tgacgtaatggacctgtatcc-3’

在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶Nhe I和EcoR I识别位点及保护碱基后，引物序列如下：

上游：5’-AGGAGCTAGCatcgggggtgtgtgtttgcc-3’(下划线部分为Nhe I识别位点)

下游：5’-ATGCGAATTCtgacgtaatggacctgtatcc-3’(下划线部分为EcoR I识别位点)

2)PCR扩增，LOC401317全长序列，PCR反应条件如下：

PCR反应步骤

3)将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳，再次胶回收。

4)pcDNA3.1质粒经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳胶回收目的片段。

5)以T4DNA连接酶连接4)和5)步胶回收产物，即可得到可用于真核表达lncRNA LOC401317的载体质粒。

6)将第5)步得到的包含LOC401317全长序列的pcDNA3.1真核表达质粒转化感受态细菌JM109，以扩增质粒。

1.3 制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒

多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用OP-10/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒(silica nanoparticle,SiNP)的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和通过离子静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒；所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得到：

1)将OP-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯(TEOS)，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得硅纳米颗粒(SiNP)。其中H₂O与OP-10及H₂O与TEOS的摩尔比为2～10、氨水浓度为1.6～28％、TEOS在环己烷中的摩尔浓度为0.1～3mol/L。

2)将SiNP按0.1～10mg/ml重悬于0.6M NaCO₃溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1～10mg/ml重悬于PBS(pH 7.4)中，超声分散，加多聚赖氨酸(终浓度为4～15nmol/mL)，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。多聚赖氨酸的终浓度为4～15nmol/mL。

3)将改性硅纳米颗粒超声分散，按质量比5～30:1与上述LOC401317表达载体混合，室温静置使其结合。

1.4 细胞培养与转染

将生长状态良好的鼻咽癌细胞HNE2按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始LOC401317真核表达载体的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入100μl制备好的携带LOC401317真核表达质粒的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒悬液，与100μl无血清培养基温和混匀；用D-Hank's液洗涤细胞3次；将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过夜。用携带pcDNA3.1空载体的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒作为实验对照。

1.5 MTT细胞增殖实验

1)消化上一步得到的细胞，用细胞计数仪对细胞进行计数，将转染LOC401317和pcDNA3.1空载体的细胞接种于96孔板中，每孔接种1000个细胞，每种细胞接种5孔，结果取其均值。

2)37℃，5％CO2培养箱培养6小时，待细胞贴壁后，每孔加MTT液(5mg/ml)20μl。继续孵育4小时，终止培养，弃去培养液。每孔再加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物溶解。

3)选择490nm波长，同时设定调零孔，在酶联免疫检测仪上，测定各孔吸光度值并记录结果。

4)每隔24小时重复步骤同上，共检测6天。以吸光度值为纵坐标，间隔时间为横坐标绘制MTT曲线。

5)实验重复三次。以各时间点为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.6流式细胞仪分析细胞周期

1)培养细胞达到85％融合时用胰酶消化细胞，1200rpm/min离心5min，收集细胞沉淀。

2)1xPBS重悬细胞，1200rpm/min，离心5min，收集细胞。重复此步骤2次。

3)1xPBS重悬细胞，加入预冷的70％乙醇固定细胞过夜。

4)1000rcf/min，离心5min，收集细胞沉淀。

5)PH7.4PBS洗涤细胞1次，离心后加入PBS重悬细胞，并调整细胞浓度至Ix 10⁶/ml。

6)加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI,1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。

7)流式细胞仪FACStar(美国BD公司)检测。接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。

1.7流式细胞仪分析细胞调亡率

1)培养细胞达到85％融合时，用胰酶消化各组细胞并收集于离心管内，同时收集各组上清悬浮细胞。注意轻轻吹打细胞，避免胰酶过度消化。

2)分别合并各组细胞并转移至离心管内，1000rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，细胞计数。

3)取5～10万重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入195ul Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

4)加入5ul Annexin V，轻轻混匀。避光室温孵育10min。

5)1000rpm离心5min，弃上清，加入190ul Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

6)加入10ul PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光。

7)随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

2.结果

2.1LOC401317抑制鼻咽癌细胞的生长

转染LOC401317真核表达载体后，与转染空载体的细胞相比，鼻咽癌细胞HNE2的生长速度显著减慢(图2A)。

2.2 LOC401317通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡抑制鼻咽癌细胞的生长

流式细胞仪分析表明，在鼻咽癌细胞HNE2中转染LOC401317后，G0/G1期细胞比例显著增加，而S期及G2/M期细胞比例减少，表明LOC401317可将HNE2细胞阻滞于G0/G1期，使其细胞分裂减慢速度(图2B)。同时，在鼻咽癌细胞HNE2中转染LOC401317后凋亡细胞比例明显增加(图2C)，这也是LOC401317抑制鼻咽癌细胞生长的原因之一。

实施例3，裸鼠移殖瘤模型中LOC401317抑制鼻咽癌细胞生长

1.材料与方法

30只雄性BALB/C裸鼠，4周龄，重量为19±2g，购买于上海斯莱克实验动物有限公司。所有裸鼠均质检合格，在中南大学实验动物部，于无特定病原体(SPF)条件下饲养。

LOC401317真核表达载体构建及多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒的制备、细胞培养与转染等同实施例2。

转染LOC401317或pcDNA3.1空白载体的HNE2细胞，以及未作任何处理的HNE2细胞(Mock)各取2×10⁶分别注入裸鼠腋下的皮下，观察比较肿瘤的生长情况，第10天起，用游标卡尺隔着皮肤测量移殖瘤大小，第35天时处死裸鼠，取出移殖瘤测量，比较各组移殖瘤的大小。

2.结果

裸鼠移殖瘤模型进一步证实，lncRNA LOC401317可抑制鼻咽癌细胞的生长(图3)

实施例4，实时荧光定量法检测证实LOC401317在鼻咽癌中表达下调

1.材料与方法：

18例正常鼻咽粘膜上皮和22例鼻咽癌组织抽提总RNA，2μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。LOC401317上游引物为5'-CTTTCTTGCTGGCATCGTTACC-3'和下游引物5'-CTTGCCCCTCTAAGAACTTCGT-3'。

用于对照的内参看家基因GAPDH上游引物为5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'和下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

2.结果

LncRNA LOC401317在正常对照组织中表达较低，而在鼻咽癌组织中低表达或者不表达P<0.05(图4)

实施例5，原位杂交检测发现LOC401317在鼻咽癌中的表达与患者预后相关

1.材料与方法：

1.1 设计并合成杂交探针

为了采用原位杂交方法检测LOC401317的表达情况，我们设计了针对原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各2条。

用于原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针：

LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’

LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’；

阳性对照探针(检测看家基因GAPDH)：

GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'

GAPDH探针2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。

寡核苷酸探针序列的合成采用化学合成方法合成上述设计各基因特异性的寡核苷酸探针序列。

1.2 寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂

地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2^nd Generation，Roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fab fragments，Roche公司)，增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSA^TM Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)，DAB染色试剂盒(北京中山公司)，20x柠檬酸钠缓冲溶液(saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5％Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)，醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent，Roche公司)。

1.3 其他主要试剂和材料

无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液(pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L)；3％甲醇-双氧水溶液(80％甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值)；0.1％胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精(1ml浓盐酸+99ml 70％酒精配置)；封片胶(PTS Cure MountⅡ)；专用盖玻片(480×240mm²)定制于郑州玻璃仪器厂。Leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/L,pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制)，苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。1.4标记探针

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH₂O＝9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ddH₂O 4μl)

混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2μl EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。

1.5 寡核苷酸探针标记后纯化

为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

1)探针反应混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCL+75μl 100％冷乙醇(-20℃).

2)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

3)13.000×g 4℃离心15min。

4)弃上清，用50μl冰冷的70％(V/V)乙醇洗涤。

5)13.000xg 4℃，离心5min。

6)弃上清，真空4℃干燥。

7)用无菌双蒸水重溶探针。

1.6 原位杂交检测存档石蜡切片中LOC401317的表达

石蜡切片杂交前处理

1)4℃保存的石蜡切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。

2)二甲苯依次脱蜡3×5min。

3)梯级酒精洗涤，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→DEPC水洗涤2×3min→DEPC-PBS洗涤2×5min。

4)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。

6)切片入0.2N HCL，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。

7)切片用4％多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。

8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25％乙酸酐Buffer Ⅰ(0.1M三乙醇胺)，室温10min。

9)1M PBS洗涤2×5min。

预杂交和杂交

预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为50μl，石蜡膜履盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2XSSC，10％Dextran sulphate，1X Denhardt’s solution，50mM Phosphate Buffer(PH 7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47％Deionized formamide)。

1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×SSC中5min。

2)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和100pmol 30个碱基的裸探针标记反应理论探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。

3)杂交后洗涤，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×SSC(0.5％SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5％SDS)，2×15min。

杂交后显色检测反应

1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。

2)切片转至TNT缓冲液中，3×5min。

3)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温，30min。

4)吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％Triton X-100+1％阻断剂)，室温4小时。

5)TNT Buffer(0.1M Tris-CL，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)洗涤，3x5min。

6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液)，室温10分钟。

7)TNT洗，3×5min。

8)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/TMAs，室温30min。

9)TNT洗，3×5min。

10)蒸溜水洗涤，1×1min。

11)DAB显色，显微镜下控制显色反应。

12)苏木素复染，

13)酒精梯级脱水，切片干燥。

14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片1min。

1.7 结果判断及标准

应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：(1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。(2)依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25％，记1分；c.25％＜阳性细胞数＜50％，记2分；d.阳性表达细胞数≥50％，记3分。

为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。

1.8 分析和统计软件

应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ²test或Fisher exact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test；多变量分析采用Cox’s proportional hazards model；P＜0.05即差异有统计学意义。

2结果

2.1 lncRNA LOC401317鼻咽癌中的表达情况

lncRNA LOC401317在大部分鼻咽癌组织中表达低或者不表达(图,5左)，但在少部分鼻咽癌组织中有表达，其表达在细胞浆和胞核均有(图5右)。

2.2 LOC401317的表达与鼻咽癌患者预后的关系

我们对81例鼻咽癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对鼻咽癌组织中lncRNA LOC401317的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现LOC401317高表达患者平均生存时间较LOC401317表达低或者不表达的患者长(图6)。说明LOC401317是一个与鼻咽癌预后相关的分子标记，该lncRNA表达低，病人预后差。

Claims

1.长链非编码RNA LOC401317的应用方法，其特征在于，用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA LOC401317的序列见SEQ NO:1。

2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。

3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，

LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’

LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’。

4.根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于，

所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。

5.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于，

试剂盒中含有用于原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针：

LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’

LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’；

试剂盒中还含有阳性对照探针，

GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'

GAPDH探针2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。

6.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于，

其它常规生物化学试剂，包括20x SSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚脱氧腺苷酸，变性剪切的蛙精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts’s solution，PBS buffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐，

TNB缓冲液：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.5％阻断试剂；

TNT缓冲液：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.05％Tween 20。

7.用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂的寡核苷酸探针，序列如下：

LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’

LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’。

8.用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂，是包含有权利要求7所述的寡核苷酸探针的试剂盒。

9.根据权利要求8所述的原位杂交检测试剂，其特征在于，试剂盒中还含有阳性对照探针：

GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'

GAPDH探针2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。

10.根据权利要求8或9所述的原位杂交检测试剂，其特征在于，

TNB缓冲液：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.5％阻断试剂；

TNT缓冲液：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.05％Tween 20。