CN104878009A - 基于长链非编码rna afap1-as1的干扰制剂及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰制剂及其应用方法，具体是该长链非编码RNA基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法及其制备的干扰制剂；根据该基因序列，设计并合成了用于RNA干扰封闭该长链非编码RNA表达的短发夹结构RNA真核表达载体，并将该载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球，利用该载体成功地在肺癌细胞系中抑制了AFAP1-AS1的表达，并抑制了肺癌细胞的侵袭与转移。本发明的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒，可保护AFAP1-AS1干扰载体免受核酸酶降解，延长作用时间，有更高的转染效率，有利于进一步的开发和应用。

Description

基于长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰制剂及其应用方法

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰载体、抑瘤试剂及其应用。

背景技术

人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(The Encyclopedia of DNA Elements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中lncRNA序列的比例也相应地增大，提示lncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着lncRNA不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现lncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。

LncRNA可作为功能蛋白质的信号(signal)、诱导(guide)、诱饵(decoy)或支架(scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的是，lncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一起。因此，深入研究lncRNA的功能，揭示由lncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。

肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤，近50年来全球肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，在女性中则占第二位。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在肺癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们利用lncRNA芯片，构建了肺癌活检组织及正常对照样品中lncRNA的表达谱，从中筛选了一些在肺癌中差异表达的lncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实lncRNA AFAP1-AS1(NCBI accession number:NR_026892)在肺癌中表达显著上调，针对该lncRNA的检测制剂可以用于肺癌的辅助诊断。 随后，我们进一步增加样本，在226例有临床随访资料的肺癌石蜡存档标本中，通过原位杂交(in situ hybridization)的方法检测了AFAP1-AS1的表达水平，发现AFAP1-AS1表达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该lncRNA表达低的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于肺癌的预后判断。

我们通过设计并合成靶向AFAP1-AS1的短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNAs)序列，构建了靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体，转染到肺癌细胞株中，在体外培养细胞模型中证实了靶向干扰AFAP1-AS1的表达可明显抑制肺癌细胞的侵袭与转移能力。将AFAP1-AS1的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护AFAP1-AS1的RNA干扰载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。

发明内容

本发明的目的是提供长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰载体、抑瘤试剂及其应用。本发明所述的用于在肿瘤细胞中抑制AFAP1-AS1表达的制剂由靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体与多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒两个部分组成。利用AFAP1-AS1序列得到的干扰载体可以抑制AFAP1-AS1的表达，并可制备抑制肺癌细胞侵袭转移的制剂。

长链非编码RNA AFAP1-AS1的应用方法，用于制备抑制肺癌细胞侵袭转移的制剂，该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO:1所示。

上述应用中所述的制剂是针对该长链非编码RNA基因设计的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体。还可以将所述的表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球。

所述的制备用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体所需的3条干扰靶点序列如下：

shRNA-1：GCAATTCACTGAGTGGTTACG

shRNA-2：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT

shRNA-3：GCAAGACATCCGATGGTATAC。

针对3条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的DNA双链；具体序列如下：

shRNA-1：

shRNA-2：

shRNA-3：

所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体的制备方法具体如下：

1)shRNA的设计

首先根据长链非编码RNA基因AFAP1-AS1，寻找shRNA靶点，3条靶点序列如下：

shRNA-1：GCAATTCACTGAGTGGTTACG

shRNA-2：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT

shRNA-3：GCAAGACATCCGATGGTATAC

以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下：

Scramble：GACACGCGACTTGTACCAC

2)针对这3条靶点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下：

shRNA-1：

shRNA-2：

shRNA-3：

Scramble

3)shRNA载体构建

化学合成上述3个shRNA和对照的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取10μl混合；然后将oligo混合物在PCR仪中95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段；

用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3.1kb的载体片段，将退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质的量的比例混合，用T4连接酶，16℃连接过夜；转化E.coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用ClaⅠ和EcoRⅠ酶切构建好的pSUPER质粒，2％的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了目的片段的阳性克隆，将得到的包含AFAP1-AS1干扰序列的pcSUPER质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

上述多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒是运用OP-10、环己烷、氨水的微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修饰，制备得到。

制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒的具体过程：

1)将OP-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得粒径范围10-50nm的硅纳米颗粒；其中H₂O与OP-10及H₂O与正硅酸异酯的摩尔比为2～10、氨水浓度为1.6～28％、正硅酸异酯在环己烷中的摩尔浓度为0.1～3mol/L；

2)将硅纳米颗粒按0.1～10mg/ml重悬于0.6M NaCO₃溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1～10mg/ml重悬于pH 7.4的PBS中，超声分散，加多聚赖氨酸，终浓度为4～15nmol/mL，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀按0.1～10mg/ml重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。

将多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10～50ug长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰载体，混合，室温静置使其结合，就得到了抑制鼻咽癌细胞侵袭转移的制剂。

本发明构建了抑制AFAP1-AS1表达的RNA干扰载体，转染到肺癌细胞株中，在体外培养细胞模型中证实抑制AFAP1-AS1的表达可明显抑制肺癌细胞的侵袭转移能力。将AFAP1-AS1干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护AFAP1-AS1干扰载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR技术验证lncRNA AFAP1-AS1在肺癌和癌旁肺组织中的表达情况，AFAP1-AS1在肺癌(T)中的表达比癌旁肺组织(N)中显著提高；

图2为原位杂交检测AFAP1-AS1在肺癌中的表达情况；

在85％的肺癌(226例肺癌组织中的192例)中检测到有AFAP1-AS1的高表达(左)，其余的34例肺癌组织中AFAP1-AS1的表达较低(右)；

图3为肺癌中AFAP1-AS1的表达与肺癌患者预后的关系，

肺癌中AFAP1-AS1的高表达与肺癌患者的不良预后相关，即AFAP1-AS1高表达的患者总的生存时间(Over-all survival，左)和无复发生存时间(Relapse-free sruvival，右)要明显低于AFAP1-AS1低表达的患者；

图4为在肺癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体，可显著抑制AFAP1-AS1在肺癌细胞中的表达，

在肺癌细胞系A549中导入靶向AFAP1-AS1的干扰载体(sh-1，sh-2，sh-3)后，实时荧光定量PCR方法检测了肺癌细胞中AFAP1-AS1的表达情况，AFAP1-AS1的表达受到明显的抑制。阴性对照(NC)为scramble干扰载体，Mock为未经任何处理的肺癌细胞；

图5为在肺癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞侵袭能力降低，

细胞穿膜(transwell)实验证实，在肺癌细胞系A549中转入靶向AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的肺癌细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力降低；

图6为在肺癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞迁移能力降低，

细胞划痕实验证实，在肺癌细胞系A549中转入靶向AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，肺癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移速度明显减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1，实时荧光定量PCR法检测证实AFAP1-AS1在肺癌中表达上调

1.材料与方法： 

收集25对肺癌及癌旁正常对照组织，抽提总RNA，2μg RNA经逆转录成cDNA后，进 行实时荧光定量PCR。AFAP-AS1引物为5’-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3’，SEQ NO:8和5’-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3’，SEQ NO:9。

用于对照的GAPDH引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，SEQ NO:10和5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，SEQ NO:11，

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

AFAP1-AS1在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在肺癌组织中高表达P<0.001(图1)

实施例2，原位杂交检测发现AFAP1-AS1在肺癌中的表达与患者预后相关

1.材料方法

1.1设计并合成杂交探针

为了采用原位杂交方法检测AFAP1-AS1的表达情况，我们设计了针对原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各3条。

用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针：

AFAP1-AS1探针1：5’-ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3’，SEQ NO:2，

AFAP1-AS1探针2：5’-TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3’，SEQ NO:3，

AFAP1-AS1探针3：5’-TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3’，SEQ NO:4。

阳性对照探针(检测看家基因GAPDH)：

GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，SEQ NO:5，

GAPDH探针2：5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3”，SEQ NO:6，

GAPDH探针3：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'，SEQ NO:7。

采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。

1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂

地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2^nd Generation，Roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fab fragments，Roche公司)，增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSA^TM Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)，DAB染色试剂盒(北京中山公司)，20x柠檬酸钠缓冲溶液(saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5％Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)，醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent，Roche公司)。

1.3其他主要试剂和材料

无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液(pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L)；3％甲醇-双氧水溶液(80％甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值)；0.1％胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精(1ml浓盐酸+99ml 70％酒精配置)；封片胶(PTS Cure MountⅡ)；专用盖玻片(480×240mm²)定制于郑州玻璃仪器 厂。Leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/L,pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制)，苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。1.4标记探针

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH₂O＝9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ddH₂O 4μl)

混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2μl EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。 

1.5寡核苷酸探针标记后纯化

为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

1)探针反应混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCL+75μl 100％冷乙醇(-20℃).

2)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

3)13.000×g 4℃离心15min。

4)弃上清，用50μl冰冷的70％(V/V)乙醇洗涤。

5)13.000xg 4℃，离心5min。

6)弃上清，真空4℃干燥。

7)用无菌双蒸水重溶探针。

1.6原位杂交检测存档石蜡切片中AFAP1-AS1的表达

石蜡切片杂交前处理

1)4℃保存的石蜡切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。

2)二甲苯依次脱蜡3×5min。

3)梯级酒精洗涤，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→DEPC水洗涤2×3min→DEPC-PBS洗涤2×5min。

4)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。

6)切片入0.2N HCL，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。

7)切片用4％多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。

8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25％乙酸酐BufferⅠ (0.1M三乙醇胺)，室温10min。

9)1M PBS洗涤2×5min。

预杂交和杂交 

预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为50μl，石蜡膜履盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2XSSC，10％Dextran sulphate，1X Denhardt’s solution，50mM Phosphate Buffer(PH 7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47％Deionized formamide)。

1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×SSC中5min。

2)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和100pmol 30个碱基的裸探针标记反应理论探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。

3)杂交后洗涤，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×SSC(0.5％SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5％SDS)，2×15min。

杂交后显色检测反应

1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。

2)切片转至TNT缓冲液中，3×5min。

3)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温，30min。

4)吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％Triton X-100+1％阻断剂)，室温4小时。

5)TNT Buffer(0.1M Tris-CL，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)洗涤，3x5min。

6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液)，室温10分钟。

7)TNT洗，3×5min。

8)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/TMAs，室温30min。

9)TNT洗，3×5min。

10)蒸溜水洗涤，1×1min。

11)DAB显色，显微镜下控制显色反应。

12)苏木素复染， 

13)酒精梯级脱水，切片干燥。

14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片1min。

1.7结果判断及标准

应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：(1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。(2)依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25％，记1分；c.25％＜阳性细胞数＜50％，记2分；d.阳性表达细胞数≥50％，记3分。

为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。

1.8分析和统计软件

应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ²test或Fisher exact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test；多变量分析采用Cox’s proportional hazards model；P＜0.05即差异有统计学意义。

2结果

2.1 AFAP1-AS1在肺癌中的表达情况

在85％的肺癌(226例肺癌组织中的192例)中检测到有AFAP1-AS1的高表达(图2左)，其余的34例肺癌组织中AFAP1-AS1的表达较低(图2右)。

2.2 AFAP1-AS1高表达的肺癌患者预后较差

我们对226例肺癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对肺癌组织中AFAP1-AS1的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现AFAP1-AS1高表达患者平均生存时间明显短于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者(图3)。说明AFAP1-AS1是一个 与肺癌预后相关的分子标记，该lncRNA表达高，病人预后差。

实施例3，构建shRNA载体干扰AFAP1-AS1的表达

1.材料方法

1.1试剂及试剂盒 

限制性内切酶Hind III、Bgl II、EcoR I及Cla I，T4DNA连接酶等购自TakaRa公司；

TRIZOL^TM Reagent(Invitrogen)；

质粒抽提试剂盒(#D6943-01，OMEGA)；

胶回收试剂盒(#M5212，OMEGA)；

逆转录试剂盒(#A3500，Promega)；

抗生素G418(Ameresc)。

1.2 shRNA的设计

首先将AFAP1-AS1序列输入Invitrogen公司的Block-It RNAi designer软件，寻找该lncRNA的shRNA最佳靶点，挑选最佳的3条相应的靶点序列如下：

shRNA-1：GCAATTCACTGAGTGGTTACG，SEQ NO:12

shRNA-2：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT，SEQ NO:13

shRNA-3：GCAAGACATCCGATGGTATAC，SEQ NO:14

以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下：

Scramble：5’-GACACGCGACTTGTACCAC-3’，SEQ NO:15

针对这3条lncRNA靶点序列，及Scramble序列，根据OligoEngine公司pSUPER载体说明书，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链。具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下：

shRNA-1：

5’-GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGAATTGC TTTTTA-3’，SEQ NO:16

3’-GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAAAATTCGA-5’，SEQ NO:17

shRNA-2：

5’-GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA-3’，SEQ NO:18

3’-GGG CGAATGAGAGAACCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAAAATTCGA-5’，SEQ NO:19

shRNA-3：

5’-GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA-3’，SEQ NO:20

3’-GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5’，SEQ NO:21

Scramble

5’-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3’，SEQ NO:22

3’-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5’，SEQ NO:23

两条互补配对的DNA退火后，左边是限制性内切酶Bgl II的粘性末端，右边是Hind III的粘性末端。 

1.3 shRNA载体构建

化学合成上述4个shRNA对应的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取10μl混合。然后将oligo混合物在PCR仪中95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段。

用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3.1kb的载体片段，将退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质量的比例混合，用T4连接酶，16℃连接过夜。转化E.coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用ClaⅠ和EcoRⅠ酶切构建好的pSUPER质粒，2％的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了目的片段的阳性克隆，阳性克隆测序验证后用于干扰细胞内AFAP1-AS1的表达。

1.4 细胞培养与转染

肺癌细胞系A549购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。

将生长状态良好的肺癌细胞系A549按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始shRNA表达载体的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入3μl的lipofectamine 2000于100μl无血清培养基中混匀静置5min；

将构建的shRNA表达载体加入100μl无血清培养基中；然后与上述包含lipofectamine的 100μl无血清培养基温和混匀，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成复合体；

用D-Hank's液洗涤细胞3次；

将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；

将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养48小时。

1.5实时定量PCR检测shRNA干扰lncRNA表达的效果： 

将各种shRNA载体转染后的肺癌细胞抽提总RNA，2μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。AFAP1-AS1引物为5’-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3’，和5’-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3’。

用于对照的GAPDH引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’,

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。 2.结果

这三个shRNA载体转染肺癌细胞A549后，均可显著下调肺癌细胞中AFAP1-AS1的表达水平(图4)。

实施例4，制备荷载shRNA干扰载体的纳米颗粒抑制肺癌细胞中AFAP1-AS1的表达

1.材料方法

1.1制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒

多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用OP10/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒(silica nanoparticle,SiNP)的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和通过离子静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒；所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得到：

1)将OP-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯(TEOS)，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得硅纳米颗粒(SiNP)。其中H₂O与OP-10及H₂O与TEOS的摩尔比为2～10、氨水浓度为1.6～28％、TEOS在环己烷中的摩尔浓度为0.1～3mol/L。

2)将SiNP按0.1～10mg/ml重悬于0.6M NaCO₃溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1～10mg/ml重悬于PBS(pH 7.4)中，超声分散，加多聚赖氨酸(终浓度为4～15nmol/mL)，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。多聚赖氨酸的终浓度为4～15nmol/mL。

3)将改性硅纳米颗粒超声分散，按质量比5～30:1与实施例3中所述的靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体混合，室温静置使其结合。

1.2细胞培养与转染

将生长状态良好的肺癌细胞A549按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始AFAP1-AS1真核表达载体的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入100μl制备好的携带AFAP1-AS1真核表达质粒的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒悬液，与100μl无血清培养基温和混匀；用D-Hank's液洗涤细胞3次；将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过夜。用携带Scramble序列的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒作为实验对照。

1.3细胞穿膜实验 

细胞穿膜((transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小室(孔径 8μm)及基质胶(Matrigel)购自美国BD公司，4％多聚甲醛固定液、结晶紫染液(0.1％g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水化。

在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和1×10⁵个转染了AFAP1-AS1shRNA干扰载体或对照载体(scramble)的肺癌细胞，在Transwell小室下层加入含20％胎牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4％多聚甲醛固定液固定，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的肺癌细胞。

1.4细胞划痕实验 

细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迁移能力的实验方法。转染了AFAP1-AS1shRNA干扰载体或对照载体(scramble)的肺癌细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90％时，用200ul pipet在每个6孔板中划一条直线(划痕)，随后在0、24和48小时等各个时间点在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细胞迁移速度。

2.结果

2.1在肺癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1后，细胞侵袭能力降低

细胞穿膜(transwell)实验证实，在肺癌细胞系A549中转入靶向AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的肺癌细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力降低(图5)。

2.2在肺癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞迁移能力降低

细胞划痕实验证实，在肺癌细胞系A549中转入靶向AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，肺癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移的速度减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低(图6)。

Claims (9)

1.长链非编码RNA AFAP1-AS1基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法，其特征在于，根据该长链非编码RNA基因制备了用于干扰其表达，并抑制肺癌细胞侵袭转移的制剂；该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的制剂是针对该长链非编码RNA基因设计的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体。

3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，将所述的表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球。

4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，所述的用于制备用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体所需的3条干扰靶点序列如下：

shRNA-1：GCAATTCACTGAGTGGTTACG

shRNA-2：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT

shRNA-3：GCAAGACATCCGATGGTATAC。

5.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于，

针对3条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的DNA双链；具体序列如下：

shRNA-1：

5’-GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGAATTGC TTTTTA-3’

3’-GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAAAATTCGA-5’

shRNA-2：

5’-GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA-3’

3’-GGG CGAATGAGAGAACCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAAAATTCGA-5’

shRNA-3：

5’-GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA-3’

3’-GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5’。

6.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体的制备方法具体如下：

1)shRNA的设计

首先根据长链非编码RNA基因AFAP1-AS1，寻找shRNA靶点，3条靶点序列如下：

shRNA-1：GCAATTCACTGAGTGGTTACG

shRNA-2：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT

shRNA-3：GCAAGACATCCGATGGTATAC

以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下：

Scramble：GACACGCGACTTGTACCAC

2)针对这4条靶点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下：

shRNA-1：

5’-GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGAATTGC TTTTTA-3’

3’-GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAAAATTCGA-5’

shRNA-2：

5’-GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA-3’

3’-GGG CGAATGAGAGAACCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAAAATTCGA-5’

shRNA-3：

5’-GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA-3’

3’-GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5’

Scramble

5’-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3’

3’-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5’

3)shRNA载体构建

化学合成上述3个shRNA和对照的10条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligoannealing buffer溶解成20μM，互补单链各取10μl混合；然后将oligo混合物在PCR仪中95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段；

用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3.1kb的载体片段，将退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质的量的比例混合，用T4连接酶，16℃连接过夜；转化E.coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切构建好的pSUPER质粒，2％的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了目的片段的阳性克隆。将得到的包含AFAP1-AS1干扰序列的pcSUPER质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

7.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，

多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒是运用OP-10、环己烷、氨水的微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修饰，制备得到。

8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒：

1)将OP-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得粒径范围10-50nm的硅纳米颗粒；其中H₂O与OP-10及H₂O与正硅酸异酯的摩尔比为2～10、氨水浓度为1.6～28％、正硅酸异酯在环己烷中的摩尔浓度为0.1～3mol/L；

2)将硅纳米颗粒按0.1～10mg/ml重悬于0.6M NaCO₃溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1～10mg/ml重悬于pH 7.4的PBS中，超声分散，加多聚赖氨酸，终浓度为4～15nmol/mL，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀按0.1～10mg/ml重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。

9.根据权利要求7或8所述的应用方法，其特征在于，将多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10～50ug长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰载体，混合，室温静置使其结合。