CN103160580B

CN103160580B - 一个长链非编码rna基因的应用方法

Info

Publication number: CN103160580B
Application number: CN201310059864.6A
Authority: CN
Inventors: 熊炜; 李桂源; 曾朝阳; 李小玲; 张文玲; 范松青; 石磊; 李夏雨; 向波; 肖凯; 向娟娟; 彭淑平; 周艳宏; 肖岚; 李征; 曹利
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2013-02-26
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-02-26
Also published as: CN103160580A

Abstract

本发明涉及一个新克隆的长链非编码RNA基因的应用方法，根据该基因序列，设计并合成实时定量PCR引物和原位杂交探针，制备用于肝癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。利用该制剂，在肝癌临床病例标本中检测该长链非编码RNA的表达水平，发现该长链非编码RNA在肝癌中表达显著上调，且该长链非编码RNA表达高的肝癌患者预后较差。

Description

一个长链非编码RNA基因的应用方法

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一个新克隆的长链非编码RNA基因序列的应用方法。

背景技术

原发性肝癌是亚洲与部分非洲地区的高发肿瘤，其病死率居我国恶性肿瘤的第二位，五年生存率只有5%左右，肝癌的防治及其发病机制研究一直是我国医学科学研究中的重要课题。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌的一种主要类型，尽管目前在肝细胞癌的诊断和治疗方面有了新的进展，但是对于其发生发展及转移的确切机制仍然存在大量未知的问题。

长链非编码RNA（longnon-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，研究发现很多lncRNA在肿瘤的发生发展中有重要调节作用，它具有抑制肿瘤生长和促进肿瘤转移等生物学作用。lncRNA根据其基因位置可分为五种类型：正义lncRNA(sense lncRNA)、反义lncRNA(antisense lncRNA)、双向lncRNA(bidirectional lncRNA)、基因内lncRNA(intronic lncRNA)及基因间lncRNA(intergenic lncRNA)。之前一直被认为是转录“噪音”的lncRNA，因在基因调节中的重要功能，目前已成为继miRNA之后非编码RNA领域又一研究热点。近年的研究已表明，lncRNA参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。lncRNA有望成为肿瘤诊断、治疗和预后新的标志物，同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。

新一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术的迅猛发展将基因组水平的研究带入了一个新的阶段，许多基于全基因组的研究成为可能，RNA测序(RNA-Sequencing，RNA-Seq)就是利用新一代测序技术对生物样品转录的全部RNA进行高通量测序，以获得被测样品转录组(transcriptome)数据的一种重要新技术。

最近我们利用新一代测序技术对肝细胞癌患者活检标本及正常对照肝组织样品进行RNA-Seq，在肝癌样品中检测到染色体11q13.1区域存在相邻的几个明显RNA-Seq信号峰，而在正常对照组织中却没有，且该染色体区域目前尚无已知基因登录，提示可能存在一个或多个未知的新基因。我们以此为线索，证实这几个RNA-Seq峰来自同一个新基因，并克隆了该基因全长序列。该基因全长序列为3526bp，可转录成多个转录本，将该基因全长的序列输入ORF finder软件进行开放阅读框预测，未发现明显的开放阅读框，说明该基因编码一个长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。

我们从肝癌及正常对照组织中抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了该lncRNA的表达情况，结果显示该lncRNA在肝癌组织中表达上调（P<0.001）。我们随后又利用原位杂交的方法，进一步在大样本中验证了该lncRNA在肝癌中表达显著上调（P<0.001）。因此针对该lncRNA的检测制剂可用于肝癌的辅助诊断。生存曲线分析发现该lncRNA表达高的患者其生存时间短于该lncRNA表达低的患者（P=0.024）。因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于肝癌的预后判断。

我们还针对该lncRNA基因的序列设计了用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体，利用该载体在肝癌细胞系中抑制了该lncRNA的表达，且发现抑制该lncRNA表达可抑制肝癌细胞系的生长。因此针对该lncRNA的抑制制剂也具有肝癌基因治疗的潜在用途。

发明内容

本发明的目的是提供一个新克隆肝癌相关lncRNA基因的应用方法，根据该基因序列，设计并合成实时定量PCR引物和原位杂交探针，制备用于肝癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。

一个长链非编码RNA基因的应用方法，根据该基因制备用于肝癌辅助诊断或者疗效预测的制剂；该基因转录本序列为序列表中SEQ ID NO：1-12所示的核苷酸序列中的任一条；或者是与序列表中SEQ ID NO：1-12任一条所示的序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是与序列表中SEQ ID NO：1-12任一条所示的序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。

用于肝癌辅助诊断或者疗效预测的制剂包括原位杂交检测试剂和实时定量PCR检测试剂。

根据该基因设计并合成用于原位杂交的寡核苷酸探针。

用于原位杂交的寡核苷酸探针序列包括：

5'-CATTGTTTTAATGCTTCCAGATGAGTTTGTATC-3'

5'-CTTTGGAAATAGTGCAGACACAAAACTAGGG-3'

5'-GTGTGTTTTGCAGTCTCCTTGTTTGTTTCTTC-3'。

根据该基因设计并合成出用于实时定量PCR的检测引物。

用于实时定量PCR检测的上、下游引物分别为：

5'-GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3'和5'-ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3'。

本发明首次发现了一个新克隆的肝癌相关长链非编码RNA基因序列，并通过原位杂交、荧光实时定量PCR等方法证明该基因在肝癌组织中的特异性表达，为肝癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具。

附图说明

图1为肝细胞癌和正常对照样品RNA-Seq结果及其在染色体上的位置图，

表明通过RNA-seq我们发现了一个新基因；

其中A：RNA-Seq发现的信号峰位于染色体11q13.1区段；B：RNA-Seq信号峰与邻近基因的位置关系；C：肝细胞癌(HCC)和正常对照(Normal)样品中RNA-Seq结果的对比，及克隆扩增该新基因全长序列所用引物设计示意图；

图2为RT-PCR证实染色体11q13.1区段的RNA-Seq峰转录自同一个基因且剪接成多个转录本；

A：以肝癌组织cDNA为模板用引物1F和2R及1F和3R进行RT-PCR扩增，PCR产物的电泳结果；B：引物1F和2R及1F和3R扩增的PCR产物经TA-clone、测序后发现的不同转录本剪接方式；C：引物3F和4R及4F和5R进行RT-PCR扩增的结果；D：引物3F和4R及4F和5R扩增的PCR产物经TA-clone、测序发现的不同转录本剪接方式；

图3为GeneRacer克隆新基因5’和3’全长序列；

A：GeneRacer实验策略草图；B：3’GeneRacer PCR产物电泳结果；

C：5’和3’GeneRacer测序结果得到的该基因5’端和3’端不同的剪接形式；

图4为新克隆的基因及12种不同转录本，开放阅读框预测结果显示为长链非编码RNA；

A：通过测序获得的新克隆基因12种代表性转录本剪接形式；B：ORF Finder预测该新基因，未发现明显的开放阅读框，表明该基因编码长链非编码RNA；

图5为实时定量PCR检测该lncRNA在10例正常肝组织和36例肝癌组织中表达的结果；

其中：N代表正常组织，T代表肝癌组织；

图6为原位杂交检测新克隆lncRNA在正常肝组织（左）及肝癌组织中的表达（右）；

表明该lncRNA在正常肝组织中不表达，而在肝癌组织中高表达；

图7为新克隆的lncRNA生存曲线分析结果；

根据新克隆lncRNA的表达水平将51例肝癌患者分组，lncRNA高表达患者组（28例患者，细虚线）生存时间短于lncRNA低表达患者（23例患者，粗实线），表明新克隆的lncRNA可用于肝癌患者预后判断；

图8为针对该新克隆的lncRNA设计并构建shRNA表达载体，干扰肝癌细胞系HepG2中该lncRNA的表达；

表明设计的4个shRNA载体均可干扰HepG2细胞内该lncRNA的表达，四个shRNA载体混合转染细胞，效果更佳；

图9为shRNAs干扰肝癌细胞HepG2中新克隆lncRNA的表达后细胞的生长曲线，

表明干扰细胞内新克隆lncRNA的表达可以抑制HepG2细胞的生长。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

一、新的IncRNA基因克隆与分析

1.材料与方法：

1.1试剂及试剂盒

琼脂糖(agrose)等常用生化试剂、胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，1kbladder DNA分子量Marker购自Invitrogen公司；利用Mini Kit(Qiagen)抽提试剂盒抽提高质量的RNA，SuperScript^TM III(Invitrogen)试剂盒将RNA逆转录成cDNA。

1.2新一代测序技术进行RNA测序

人肝癌组织样品和正常肝组织样品提取总RNA后，过柱纯化，保留200nt以上的RNA；

然后富集mRNA，并用二价阳离子高温加热的方法将mRNA片断化；以mRNA短片段为模板；用六碱基随机引物反转录合成双链cDNA，经纯化、末端修复、加碱基A、加测序接头的步骤，经琼脂糖凝胶电泳回收片段，并进行PCR扩增完成测序文库的制备；构建好的文库经cBot扩增，用illumina solexa进行测序；

对illumina solexa进行RNA测序的结果进行分析：包括去除低质量、污染、接头的序列，将RNA测序结果与人类基因组参考序列进行比对和映射，在肝癌样品中检测到染色体11q13.1区域存在相邻的几个明显RNA-Seq信号峰，而在正常对照组织中却没有，且该染色体区域目前尚无已知基因登录，提示可能存在一个或多个未知的新基因。

1.3克隆新基因序列

为了验证在11号染色体所检测到的各个RNA-Seq峰是否来自同一个RNA序列，我们针对各个RNA-Seq峰分别设计了正向(Forward，F)引物和反向(Revise，R)引物，利用相邻峰对应引物组合进行PCR扩增.各引物所在的大致位置和方向见图1C，对应的序列如下：

1F：5’-CCCTTGTTTAGCCTCTGCTG-3’，2F：5’-CCTCTGTCACTGCCACAAAA-3’，

2R：5’-CATGTGGTGAGTGGCTGTG-3’，3F：5’-TCACTTACCCCTGCGACTCT-3’，

3R：5’-CATCACAGGGTGTGTTTTGC-3’，4F：5’-GCCCTGCTCTATCAGCAAAC-3’，

4R：5’-GCCTGCTGAGTTTGCTGATA-3’，5R：5’-CCCAAACCAAGCTGACAAAT-3’。

依次对应序列表中SEQ ID NO：13-20。

利用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)扩增未知RNA的5’端及3’端全长序列，针对本项目RNA序列用于GeneRacer反应的基因特异性引物(Gene Specific Primer，GSP)大致位置和方向见图1C，序列如下:

Racer R1：5’-GCAGAGGCTAAACAAGGGGGTCCTG-3’，序列表中SEQ ID NO：21；

Racer F5：5’-CACTGAATGCCCCACGTCAAAGAAA-3’；序列表中SEQ ID NO：22；

RT-PCR或者GeneRacer PCR的产物均用TA clone试剂盒(Invitrogen)进行连接、转化，挑选阳性克隆用Sanger法测序，以获得插入片段的序列。

1.4序列分析及生物信息学预测所用软件

新一代测序技术进行RNA-Seq发现的新基因，我们用传统的Sanger法测序进行了验证，并用Sanger法测序克隆了该基因的全长序列，Sanger法测序所获得的序列用DNAStar软件(DNASTAR Inc.)进行组装和校对；新克隆基因潜在开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)采用美国国立生物信息研究所(National Center for Biotechnology Information，NCBI)开发的在线分析软件ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorgorf.html)进行预测；潜在开放阅读框编码的多肽序列输入Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)数据库与已知蛋白结构域是否有同源性。

2结果

2.1RNA-Seq在染色体11q13.1区域发现多个相邻的RNA信号峰

通过新一代测序技术对肝细胞癌活检组织及正常对照样品中的RNA进行高通量测序(RNA-Seq)，并以人类基因组参考序列(Build37.3，Hg19)为模版对RNA-Seq序列进行组装，我们发现肝癌组织中在染色体11q13.1区域(图1A)距11号染色体短臂末端物理距离65.6Mb附近(图1B)存在6个相邻的较明显的RNA信号峰(图1C)，除第5个峰只有50个左右测序读长(reads)支持外，其余每个峰都有超过100个reads支持，最高达到近400个reads支持(图1C下半部分)，而同一染色体区域正常对照样品中则没有或仅有痕量的reads(图1C上半部分)，表明在所检测的肝癌组织中这一染色体区段转录出了一条或多条RNA序列，且转录水平较高；这些RNA信号峰所在的染色体部位没有已知基因登录(图1B)。

为了验证这几个RNA-Seq峰到底是来自几个独立的RNA序列还是来自同一条RNA序列，我们针对各个RNA-Seq峰分别设计了正向和反向引物(图1C)，然后以肝癌组织cDNA为模板，用相邻峰对应的引物配对进行PCR扩增。

2.2RT-PCR证实11q13.1区域多个RNA-Seq峰转录自同一个基因

以肝癌组织cDNA为模版，用引物1F和2R进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳发现扩增出多条目的带，引物1F和3R也同样得到了多条带(图2A).将目的条带分别割胶纯化、TA克隆，挑选阳性克隆进行测序，发现引物1F和2R获得的PCR产物覆盖了第1、2和3个RNA-Seq峰，且存在至少2种转录后剪接形式，同样的，引物1F和3R扩增的PCR产物覆盖了第1~4个RNA-Seq峰，存在至少3种转录后剪接形式(图2B).

用引物3F和4R、4F和5R等组合PCR扩增也得到了类似的结果(图2C和图2D)，证实染色体11q13.1区段测得的这几个相邻的RNA-Seq峰实际上转录自同一个基因，它们对应的DNA片段为同一个基因的不同外显子，且由PCR和测序结果可知该基因转录的RNA存在多种剪接方式.利用引物1F和5R我们扩增了该基因更多种类型的转录本。

由于PCR扩增得到的是DNA双链，仅从测序结果我们还无法判断该RNA的实际方向，也还没得到该RNA5’和3’端全长序列，因此我们进一步利用GeneRacer试剂盒扩增该RNA的5’和3’端全长。

2.3GeneRacer克隆RNA全长序列

GeneRacer所用引物【GeneRacer试剂盒(Invitrogen)提供】见图3A，首先用烟草酸性焦磷酸酶(Tobacco Acid Pyrophosphatase，TAP)去除RNA5’端帽子(cap)结构，然后在去除帽子结构的RNA5’端用RNA连接酶(RNA ligase)连接一段特异性RNA接头序列(该接头序列【由GeneRacer试剂盒(Invitrogen)提供】图3A中左端黑色粗线条部分)，接下来用5’端增加了另一段特异性接头的oligo-dT为引物【该接头序列由GeneRacer试剂盒(Invitrogen)提供】，对RNA进行逆转录，获得cDNA的第一条链，此时cDNA就在两头都分别加上了两段特异性的接头序列。针对这两端的接头序列，GeneRacer试剂盒(Invitrogen)分别提供了5’和3’端的GeneRacer公共引物，再在我们感兴趣的目的基因序列中设计基因特异性引物(gene specificprimer，GSP，即前述的Racer R1和Racer F5)与公共的5’或3’GeneRacer引物组合进行PCR扩增就可以得到我们感兴趣的基因5’和3’端全长序列。

将肝癌组织RNA用GeneRacer试剂盒逆转录的cDNA(两头已加接头)为模板，利用图1C中设计的2条基因特异性GeneRacer引物Racer R1和Racer F5与试剂盒中的GeneRacer3’公共引物进行PCR扩增(图3B)，结果Racer R1与GeneRacer3’公共引物未能扩出目的条带，而Racer F5与GeneRacer3’引物则扩出了非常清楚的目的条带，表明Racer F5靠近目的基因的3’末端，其对应的图1C中第6个RNA-Seq峰就是该新基因的第6号外显子.利用GeneRacer试剂盒中提供的Hela细胞cDNA为模板，Racer F5与GeneRacer3’引物也未扩出特异性条带，表明该基因在Hela细胞中不表达或者表达很弱。图3B中Racer F5与GeneRacer3’公共引物扩增产物电泳结果除了有一条很强的目的条带外，在该条带上方还有两条较弱的条带(图中箭头所示)，表明该基因3’末端可能同样存在可变剪接。将PCR产物TA clone，Sanger法测序，我们获得了该新基因3’端三种不同转录本的序列(图3C右边部分).我们接下来用Racer R1与GeneRacer5’公共引物进行扩增，获得了该新基因5’端6种不同转录本的序列(图3C左边部分).

2.4新克隆的基因有多个转录本且没有明显的开放阅读框

我们在其他肝癌组织样本中进一步大量PCR，TA克隆和测序分析，得到了该基因更多的转录本序列，图4A是在肝癌组织中表达频率比较高的12种转录本剪接模式。将该基因不同的转录本序列输入NCBI的ORF finder软件进行开放阅读框预测，发现该基因没有明显的开放阅读框（所有潜在的开放阅读框均小于500bp）。将所有潜在ORF编码翻译为多肽序列与Pfam数据库中已知的蛋白或者结构域进行比对，也未发现有同源性，表明该基因可能编码一个长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。

二、荧光实时定量PCR

1.材料与方法：

10例正常肝脏组织和36例肝癌组织抽提总RNA，2μg RNA经逆转录成cDNA后，进行荧光实时定量PCR。新克隆lncRNA引物为5'-GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3'（序列表中SEQID NO：23）和5'-ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3'（序列表中SEQ ID NO：24）。

用于对照的18S引物为5'-TCTTAGCTGAGTGTCCCGCG-3'（序列表中SEQ ID NO：25）和5'-ATCATGGCCTCAGTTCCGAA-3'（序列表中SEQ ID NO：26），

荧光实时定量PCR反应体系

荧光实时定量PCR反应步骤

1 94℃ 5min

2 95℃ 10sec

3 58℃ 30sec

4 72℃ 20sec

5 Plate read

6 82℃ 30sec

7 Plate read

8 Go to step2for more39times

9 Perform melting curve from55.0℃to95.0℃,read every0.2℃,hold for1sec

反应结束后确认荧光实时定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值（threshold cycle values）、内参基因（18S）标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

新克隆的lncRNA在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在肝癌组织中高表达P<0.001（图5）

三、原位杂交

1.材料方法

1)寡核苷酸探针的设计

利用DNA Club软件将新克隆的lncRNA序列转换为其互补序列。利用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi/)的探针设计功能，以每一个基因的互补序列为模板，在其阅读框架内设计寡核苷酸探针，探针参数设定基本一致，GC含量为40-60%，Tm为65-70℃。根椐基因序列长度，以200或300个碱基的间隔，在同一条件下设计5-6条30个碱基长度的寡核苷酸探针。使用美国国立生物信息学研究中心（NCBI）的在线BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)对所设计探针进行精确匹配，筛选出杂交参数最佳特异性的3条寡核苷酸探针。

2)用于肝癌和对照正常组织原位杂交的寡核苷酸探针

新克隆的lncRNA及用作对照的看家基因GAPDH对应的寡核苷酸探针长度为30个碱基，寡核苷酸探针5’端为磷酸基团，3’端为羟基，探针序列均为这些基因cDNA的互补序列。基因寡核苷酸探针的详细序列如下。寡核苷酸探针采用化学合成方法合成。

新克隆的lncRNA探针：

5'-CATTGTTTTAATGCTTCCAGATGAGTTTGTATC-3'（序列表中SEQ ID NO：27）

5'-CTTTGGAAATAGTGCAGACACAAAACTAGGG-3'（序列表中SEQ ID NO：28）

5'-GTGTGTTTTGCAGTCTCCTTGTTTGTTTCTTC-3'（序列表中SEQ ID NO：29）

看家基因GAPDH所对应的探针：

5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'（序列表中SEQ ID NO：30）

5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'（序列表中SEQ ID NO：31）

5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'（序列表中SEQ ID NO：32）

3)寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂

Dig Oligonucleitide Tailing Kit(2^nd Generation)试剂盒(Roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fab fragments，Roche公司)。增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSA^TM Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)。DAB染色试剂盒(北京中山公司)。20×SSC，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon spermDNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，DTT，50×Denhardts’s solution，PBSbuffer，胃蛋白酶K，BSA(牛血清清蛋白)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5%Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05%Tween20)醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent，Roche公司)。

4)其他主要试剂和材料

无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液（pH7.2～7.4，NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L）；3%甲醇-双氧水溶液(80%甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml0.1M柠檬酸溶液和41ml0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值）；0.1%胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精（1ml浓盐酸+99ml70％酒精配置）；组织微阵列专用封片胶（PTS Cure MountⅡ）；专用盖玻片（480×240mm²）定制于郑州玻璃仪器厂。Leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醛（0.01mol/L,pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制），苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。

5)寡核苷酸探针的标记

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH2O=9μl(control:control oligonucleutide5μl+ddH₂O4μl)

混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2ul EDTA(0.2M，pH8.0)中止反应。

6)寡核苷酸探针标记后纯化

为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

a)探针反应混合物(22μl)+2.5μl4M LiCL+75μl100%冷乙醇(-20℃).

b)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

c)13.000×g4℃离心15min。

d)弃上清，用50μl冰冷的70%(V/V)乙醇洗涤。

e)13.000xg4℃，离心5min。

f)弃上清，真空4℃干燥。

g)用无菌双蒸水重溶探针。

7)组织切片杂交前处理

a)4℃保存的组织切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。

b)二甲苯依次脱蜡3×5min。

c)梯级酒精洗涤，100%酒精2×2min→95%酒精1×5min→70%酒精1×5min→50%

酒精1×5min→DEPC水洗涤2×3min→DEPC-PBS洗涤2×5min。

d)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

e)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。

f)切片入0.2N HCL，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。

g)切片用4%多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。

h)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰化处理。切片入0.25%乙酸酐BufferⅠ(0.1M三乙醇胺)，室温10min。

i)1M PBS洗涤2×5min。

8)组织预杂交和杂交

a)预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为每平方厘米切片面积12.5μl，相应大小的石蜡膜覆盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2XSSC，10%Dextran sulphate，1X Denhardt’s solution，50mMPhosphate Buffer(PH7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47%Deionized formamide)。

b)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×SSC中5min。

c)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜覆盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和100pmol30个碱基的裸探针标记反应理论探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。

d)杂交后洗涤，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×SSC(0.5%SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5%SDS)，2×15min。

9)杂交后显色检测反应

a)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与目的RNA结合复合物；TSA放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。

b)切片转至TNT缓冲液中，3×5min。

c)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温，30min。

d)不洗，吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1%TritonX-100+1%阻断剂)，室温4小时。

e)TNT Buffer(0.1M Tris-HCl,PH7.5,0.15M NaCL,0.05%Tween20)洗3×5min。

f)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液)，室温10分钟。

g)TNT洗，3×5min。

h)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/TMAs，室温30min。

i)TNT洗，3×5min。

j)蒸溜水洗涤，1×1min。

k)DAB显色，显微镜下控制显色反应。

l)苏木素复染，

m)酒精梯级脱水，切片干燥。

n)滴加组织切片专用封片胶，相应规格的盖玻片盖片，切片胶带转移系统配备的紫外灯下交联切片1min。

10)结果判断及标准

应用Nikon E600双目光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：（1）依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。（2）依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25%，记1分；c.25%＜阳性细胞数＜50%，记2分；d.阳性表达细胞数≥50%，记3分（由于每一组织点直径仅为0.9mm，统计阳性细胞数时于10×低倍镜下记数每个组织点的全部目标细胞）。

为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家在不知道各个组织点性质的情况下，分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达；④6分和9分者最终计为3分，认为强阳性表达。

11)分析和统计软件

应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ²test或Fisher exact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test；多变量分析采用Cox’s proportional hazards model；P＜0.05即差异有统计学意义。

2结果

1)新克隆的lncRNA在肝癌及正常对照组织中的表达

新克隆的lncRNA在51例肝癌中均有表达，其表达在细胞浆和胞核均有（图6右），而在92%（50例正常组织样本中的46例）的正常肝组织中呈阴性表达，其余8%为弱表达（图6左），两者之间具有明显的统计学差异(P<0.001)。

2)Kaplan-Meier生存分析

我们对所有51例肝癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对肝癌组织中新克隆lncRNA的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现新克隆的lncRNA高表达患者平均生存时间为16.09个月，四年（48个月）内82.1%（23/28）的患者已经死亡，而新克隆lncRNA低表达的患者，平均生存时间已超过24.53个月，四年（48个月）内仅34.8%（8/23）的患者已经死亡（图7）。说明新克隆的lncRNA是一个与肝癌预后相关的分子标记，该lncRNA表达高，病人预后差。

四、构建shRNA载体干扰新克隆l ncRNA的表达

1.材料方法

1)试剂及试剂盒

限制性内切酶HindIII、BglII、EcoR I及Cla I，T4DNA连接酶等购自TakaRa公司；

TRIZOLTM Reagent（Invitrogen）；

质粒抽提试剂盒(#D6943-01，OMEGA)；

胶回收试剂盒(#M5212，OMEGA)；

逆转录试剂盒(#A3500，Promega)；

抗生素G418（Ameresc）。

2)shRNA的设计

首先将新克隆的lncRNA序列输入Invitrogen公司的Block-It RNAi designer软件，寻找该lncRNA的shRNA最佳靶点，挑选最佳的4条相应的靶点序列如下：

shRNA-1：5’-GGACAAGGTCCAAGCTCTTAC-3’（序列表中SEQ ID NO：33）

shRNA-2：5’-GCAGTGCAGCAGTATCATTGC-3’（序列表中SEQ ID NO：34）

shRNA-3：5’-GCAGCAGTATCATTGCTTAGC-3’（序列表中SEQ ID NO：35）

shRNA-4：5’-GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT-3’（序列表中SEQ ID NO：36）

以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下：

Scramble：5’-GACACGCGACTTGTACCAC-3’（序列表中SEQ ID NO：37）

针对这4条lncRNA靶点序列，及Scramble序列，根据OligoEngine公司pSUPER载体说明书，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链。具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下：

shRNA-1：

5’-GATCCCC GGACAAGGTCCAAGCTCTTACTTCAAGAGA GTAAGAGCTTGGACCTTGTCC TTTTTA-3′

3′-GGG CCTGTTCCAGGTTCGAGAATG AAGTTCTCT CATTCTCGAACCTGGAACAGG AAAAATTCGA-5’shRNA-2：

5’-GATCCCC GCAGTGCAGCAGTATCATTGC TTCAAGAGA GCAATGATACTGCTGCACTGC TTTTTA-3’

3’-GGG CGTCACGTCGTCATAGTAACG AAGTTCTCT CGTTACTATGACGACGTGACG AAAAATTCGA-5’shRNA-3：

5’-GATCCCC GCAGCAGTATCATTGCTTAGC TTCAAGAGA GCTAAGCAATGATACTGCTGC TTTTTA-3’

3’-GGG CGTCGTCATAGTAACGAATCG AAGTTCTCT CGATTCGTTACTATGACGACG AAAAATTCGA-5’shRNA-4：

5’-GATCCCC GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT TTCAAGAGA ACAAATCTCACACAGAGCTGC TTTTTA-3’

3′-GGG CGTCGAGACACACTCTAAACA AAGTTCTCT TGTTTAGAGTGTGTCTCGACG AAAAATTCGA-5’Scramble

5’-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3’

3’-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5’

依次对应序列表中SEQ ID NO：38-47。

下划线的部分为shRNA靶向的lncRNA序列。两条互补配对的DNA退火后，左边是限制性内切酶BglII的粘性末端，右边是HindIII的粘性末端。

3)shRNA载体构建

化学合成上述4个shRNA对应的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealingbuffer溶解成20μM，互补单链各取10μl混合。然后将oligo混合物在PCR仪中95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段。

用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3.1kb的载体片段，将退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质量的比例混合，用T4连接酶，16℃连接过夜。转化E.coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用ClaⅠ和EcoRⅠ酶切构建好的pSUPER质粒，2%的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了目的片段的阳性克隆，阳性克隆测序验证后用于干扰细胞内新克隆lncRNA的表达。

4）细胞培养与转染

肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海生化细胞所，细胞培养所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。

将生长状态良好的肝癌细胞HepG2按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5%CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始shRNA表达载体的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入3μl的lipofectamine2000于100μl无血清培养基中混匀静置5min；

将构建的shRNA表达载体加入100μl无血清培养基中；然后与上述包含lipofectamine的100μl无血清培养基温和混匀，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成复合体；

用D-Hank's液洗涤细胞3次；

将上述混合物中加入800μl无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板中的1个孔；

将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养48小时。

5）实时定量PCR检测shRNA干扰lncRNA表达的效果：

将各种shRNA载体转染后的HepG2细胞抽提总RNA，2μg RNA经逆转录成cDNA后，进行荧光实时定量PCR。新克隆lncRNA引物为5'-GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3'（序列表中SEQ ID NO：23）和5'-ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3'（序列表中SEQ ID NO：24）

荧光实时定量PCR反应体系

荧光实时定量PCR反应步骤

1 94℃ 5min

2 95℃ 10sec

3 58℃ 30sec

4 72℃ 20sec

5 Plate read

6 82℃ 30sec

7 Plate read

8 Go to step2for more39times

9 Perform melting curve from55.0℃to95.0℃,read every0.2℃,hold for1sec

5）细胞计数观察shRNA干扰lncRNA后对肝癌细胞生长的影响：

将4种靶向新克隆lncRNA的shRNA表达载体等量混合，转染的HepG2细胞，24小时后从6孔板中消化下来，重新以1×104/孔的密度接种于24孔板中，以转染Scramble shRNA表达载体的细胞为对照组。每组各接种24个孔。

随后每种shRNA转染后的细胞在每天同一时候各取3个孔，消化其中的HepG2细胞，在显微镜下计数。并绘制细胞生长曲线。

2.结果

1）shRNA干扰lncRNA表达的效果：

这四个shRNA载体转染HepG2细胞后，均可显著下调HepG2细胞中新克隆的lncRNA的表达水平，将四个shRNA载体混合合并转染HepG2细胞，该lncRNA表达下调更为显著（图8）。

2）shRNA干扰lncRNA后对肝癌细胞生长的影响：

由于四种shRNA载体混合，干扰新克隆的lncRNA表达效果最好，我们混合这四种shRNA表达载体转染HepG2细胞，以Scramble为对照，每天进行细胞计数，发现利用shRNA技术干扰该lncRNA的表达后，肝癌细胞生长变慢（图9）。提示抑制该新克隆lncRNA的表达在肝癌中具有明显的抑瘤作用。我们构建的这四种shRNA表达载体及其衍生试剂具有潜在的基因治疗的作用。

Claims

1.用于肝癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交的寡核苷酸探针，序列为：

5'-CATTGTTTTAATGCTTCCAGATGAGTTTGTATC-3'

或

5'-CTTTGGAAATAGTGCAGACACAAAACTAGGG-3'

或

5'-GTGTGTTTTGCAGTCTCCTTGTTTGTTTCTTC-3'。

2.用于肝癌辅助诊断或者疗效预测的实时定量PCR检测的上、下游引物，分别为：

5'-GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3'和5'-ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3'。