CN103074441B

CN103074441B - 长链非编码rna基因linc00312的应用方法

Info

Publication number: CN103074441B
Application number: CN201310044009.8A
Authority: CN
Inventors: 李桂源; 张文玲; 黄琛; 曾朝阳; 熊炜; 李小玲; 李夏雨; 范松青; 石磊; 谭琛; 黄东海; 赵艳华
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2013-01-24
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-01-24
Also published as: CN103074441A

Abstract

本发明提供了一个长链非编码RNA基因LINC00312的应用方法，根据该基因序列，设计并合成实时定量PCR引物和原位杂交探针，制备用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。利用该制剂，在鼻咽癌临床病例标本中检测LINC00312的表达水平，发现LINC00312在鼻咽癌中表达显著下调，但有转移的鼻咽癌样品中LINC00312的表达较高。将临床病理参数中的年龄、性别、组织学类型、临床分期、肿瘤大小及浸润范围、有无淋巴结转移及LINC00312表达情况进行多变量分析（Cox’s proportional hazards model），分析这些参数与鼻咽癌病人预后的关系，结果显示LINC00312表达能作为鼻咽癌患者独立的预后因子，在没有侵袭转移的患者中LINC00312表达高预后较好，而有侵袭转移的患者中LINC00312表达高反而预后差。

Description

长链非编码RNA基因LINC00312的应用方法

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA基因LINC00312的应用方法。

背景技术

鼻咽癌是一种上皮源性的多基因遗传性肿瘤，具有明显的种族和地域差异，临床表现复杂多变，发病机制还不十分清楚，治疗效果也不理想，五年生存率仍徘徊在50%左右。如何揭示鼻咽癌发生发展的分子机制、发现其预后的特异性分子标志物、预测鼻咽癌患者的预后，从而实现对鼻咽癌患者的预后判定，采用不同的针对性治疗方案，实现对鼻咽癌患者的个体化治疗，最终提高五年生存率、降低死亡率，是目前值得临床科研工作者们研究的重要课题。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，研究发现很多lncRNA在肿瘤的发生发展中有重要调节作用，它具有抑制肿瘤生长和促进肿瘤转移等生物学作用。lncRNA根据其基因位置可分为五种类型：正义lncRNA(sense lncRNA)、反义lncRNA(antisense lncRNA)、双向lncRNA(bidirectional lncRNA)、基因内lncRNA(intronic lncRNA)及基因间lncRNA(intergenic lncRNA)。之前一直被认为是转录“噪音”的lncRNA，因在基因调节中的重要功能，目前已成为继miRNA之后非编码RNA领域又一研究热点。近年的研究已表明，lncRNA参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。lncRNA有望成为肿瘤诊断、治疗和预后新的标志物，同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。

LINC00312是一个长的基因间非编码RNA，位于染色体3p25.3，3p25.3-26.3是一个与鼻咽癌发生密切相关的染色体等位基因共同缺失区域。我们利用显微切割技术获得纯净的鼻咽癌组织样本，抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了LINC00312在鼻咽癌组织中的表达情况，结果显示LINC00312在鼻咽癌组织中表达下调（P<0.001）。我们随后又利用鼻咽癌组织微阵列技术，通过原位杂交的方法，在大样本中验证了LINC00312在鼻咽癌中表达显著下调（P<0.001）。ROC曲线分析发现LINC00312表达能很好区分鼻咽癌患者和非癌患者，因此LINC00312的检测制剂可用于鼻咽癌的辅助诊断。且LINC00312表达与临床进展及肿瘤大小呈负相关，但与淋巴结转移呈正相关，生存曲线分析发现在无淋巴结转移的鼻咽癌患者中LINC00312阳性表达的患者其总生存率和无病生存率高于LINC00312阴性表达的患者，而在有淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达的患者其总生存率和无病生存率低于LINC00312阴性表达的患者。多因素分析则证实LINC00312是鼻咽癌预后的独立判断因素。

发明内容

本发明的目的是提供LINC00312基因的应用方法，利用该基因可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的制剂。

所述的用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂包括原位杂交检测试剂和实时定量PCR检测试剂。

根据该基因序列设计并合成用于原位杂交的寡核苷酸探针，具体序列如下：

5'-ctactataaggaaaagcactatcttctccc-3'

5'-gccttaggtcagattctactagtttaaagc-3'

5'-agactggttgtctgccccatagtagttgtc-3'。

根据该基因序列设计并合成出用于实时定量PCR的检测引物，具体序列如下：

用于实时定量PCR检测的上、下游引物分别为5’-AAGCGAACCAAGCCAATA-3’和5’-CAAATCCCTGAAACTCTG-3’。

申请人利用显微切割技术获得纯净的鼻咽癌或正常鼻咽上皮组织样本，抽提RNA后逆转录，荧光实时定量PCR检测了LINC00312表达，结果显示LINC00312在鼻咽癌组织中表达下调（P<0.001）。并通过原位杂交也发现LINC00312在鼻咽癌中表达显著下调，与临床进展及肿瘤大小呈负相关，与淋巴结转移呈正相关，LINC00312表达能很好区分鼻咽癌患者和非癌患者，有明显的统计学差异。另外，LINC00312的表达与预后密切相关，多因素分析发现LINC00312可作为预测鼻咽癌预后的独立预后因素。提示LINC00312可作为鼻咽癌预后预测的分子标志。本发明为鼻咽癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1为正常鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织显微切割图片；

a正常鼻咽上皮组织；b正常鼻咽上皮组织显微切割后；c鼻咽癌组织；d鼻咽癌组织显微切割后；

图2为LINC00312在经显微切割后的40例正常鼻咽上皮组织和100例鼻咽癌组织中实时定量PCR结果；

图3为两个各含448个不同组织点的鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列；

图4为组织微阵列各组织点对应标本的临床资料数据库；

图5为原位杂交检测LINC00312在鼻咽癌（a）及非癌鼻咽上皮组织中的表达（b）；

图6为ROC分析结果；显示LINC00312的表达可用于区分鼻咽癌和正常鼻咽上皮，从而可以用于鼻咽癌的辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性

图7根据有无转移及LINC00312表达水平将鼻咽癌患者分组，不同分组病人的预后曲线。A无淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达（+）的患者其无病生存率高于LINC00312阴性表达（-）的患者；B无淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达（+）的患者其总生存率高于LINC00312阴性表达（-）的患者；C有淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达（+）的患者其无病生存率低于LINC00312阴性表达（-）的患者；D有淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达（+）的患者其总生存率低于LINC00312阴性表达（-）的患者。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

一、荧光实时定量PCR

1.材料与方法：

40例正常鼻咽上皮组织和100例鼻咽癌组织经Leica ASLMD(Leica MicrosystemsLtd.;Wetzlar,Germany)显微切割纯化后（图1），抽提总RNA，2μg RNA经逆转录成cDNA后，进行荧光实时定量PCR。GAPDH引物为5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′（见序列表第9条序列）和5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′（见序列表第10条序列），LINC00312引物为5’-AAGCGAACCAAGCCAATA-3’（见序列表第7条序列）和5’-CAAATCCCTGAAACTCTG-3’。（见序列表第8条序列）

荧光实时定量PCR反应体系

荧光实时定量PCR反应步骤

1 94℃ 5min

2 95℃ 10sec

3 58℃ 30sec

4 72℃ 20sec

5 Plate read

6 82℃ 30sec

7 Plate read

8 Go to step 2 for more 39 times

9 Perform melting curve from55.0℃ to 95.0℃,read every0.2℃,hold for 1 sec

反应结束后确认荧光实时定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值（threshold cycle values）、内参基因（GAPDH）标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

与正常鼻咽上皮相比，LINC00312基因在鼻咽癌组织表达下调，P<0.001（图2）

二、原位杂交

1.材料方法

1)寡核苷酸探针的设计

打开网址NCBI核酸数据库，输入目的基因名称LINC00312，查找基因序列，利用DNAClub软件将各基因cDNA序列转换为其互补序列。利用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi/)的探针设计功能，以每一个基因的互补序列为模板，在其阅读框架内设计寡核苷酸探针，探针参数设定基本一致，GC含量为40-60%，Tm为65-70℃。根椐基因序列长度，以200或300个碱基的间隔，在同一条件下设计5-6条30个碱基长度的寡核苷酸探针。使用BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)对所设计探针进行精确匹配，筛选出杂交参数最佳特异性的3条寡核苷酸探针。

2)用于组织微阵列原位杂交的寡核苷酸探针

LINC00312及用作对照的看家基因GAPDH对应的寡核苷酸探针长度为30个碱基，寡核苷酸探针5’端为磷酸基团，3’端为羟基，探针序列均为这些基因cDNA的互补序列。基因寡核苷酸探针的详细序列，GC含量，Tm值见表1。寡核苷酸探针采用化学合成方法合成。

表1用于原位杂交的基因的寡核苷酸探针序列

3)寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂

Dig Oligonucleitide Tailing Kit(2^nd Generation)试剂盒(Roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fab fragments，Roche公司)。增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSA^TM Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)。DAB染色试剂盒(北京中山公司)。20×SSC，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon spermDNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，DTT，50×Denhardts’s solution，PBSbuffer，胃蛋白酶K，BSA(牛血清清蛋白)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5%Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05%Tween20)醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent，Roche公司)。

4)其他主要试剂和材料

无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液（pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L）；3%甲醇-双氧水溶液(80%甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值）；0.1%胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精（1ml浓盐酸+99ml70％酒精配置）；组织微阵列专用封片胶（PTS Cure MountⅡ）；专用盖玻片（480×240mm²）定制于郑州玻璃仪器厂。Leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醛（0.01mol/L,pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制），苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。

5)寡核苷酸探针的标记

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH2O=9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ddH2O 4μl)

混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2ul EDTA(0.2M，PH8.0)中止反应。

6)寡核苷酸探针标记后纯化

为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

a)探针反应混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCL+75μl 100%冷乙醇(-20℃).

b)-70℃沉淀60min，or-20℃ 2h。

c)13.000×g4℃离心15min。

d)弃上清，用50μl冰冷的70%(V/V)乙醇洗涤。

e)13.000xg4℃，离心5min。

f)弃上清，真空4℃干燥。

g)用无菌双蒸水重溶探针。

7)组织微阵列的制作

利用自制的组织取芯针钻取合格的石蜡组织标本中标记区域的供体组织，然后用与该针配套的衬芯推出圆形供体石蜡组织，并将其移入相应受体石蜡块受体孔中。待受体蜡块全部填满组织芯后，将其置37℃30min，用载玻片轻压受体蜡块的供体组织面，使其表面平整，制作完成后置4℃保存，待切片。

制作完成两个各含448个不同组织点的鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列（图3），规格为48.0×22.0×25.0mm³，各组织芯直径为0.9mm，间距为0.6mm，位置无偏移交叉，组织芯呈圆柱形、规则完整、形态一致、排列整齐。

将两个组织微阵列蜡块各切片50张，随机选取一张切片经常规脱蜡、水化、HE染色后，显微镜下观察：切片厚度适中、细胞形态均匀一致、组织形态完整、组织结构无挤压和变形，各组织点与相应供体蜡块标记区域组织性质完全一致。

制作完成后切片再次病理诊断确定，正常和鼻咽炎性上皮141例、不典型增生鼻咽上皮98例、癌旁上皮88例、鼻咽癌（WHOI型15例、WHOII型402例、WHOIII型17例；按UICC1997临床分期标准，临床分期I期32例、II期155例、III期156例、IV期91例；有淋巴结转移283例、无淋巴结转移151例）、放疗后正常和复发的标本64例（表2），除去实验过程中缺失组织和临床资料不全的组织，最后统计的实际微阵列点的数目为825点。将组织微阵列各组织点对应标本的临床资料输入Excel表格（图4）便于统计。

表2组织微阵列点数

组织类型	点数
		正常和炎性鼻咽上皮	141
不典型增生鼻咽上皮	98
		癌旁上皮	88
鼻咽癌	434
		临床I期	32
临床II期	155
		临床III期	156
临床IV期	91
		KSCC(WHOI)	15
NKC(WHOII)	402
		UC(WHOIII)	17
无淋巴结转移	151
		有淋巴结转移	283

放疗后正常组织	28
		放疗后复发组织	36
淋巴瘤和喉癌	57

8)组织微阵列切片杂交前处理

a)4℃保存的组织微阵列切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。

b)二甲苯依次脱蜡3×5min。

c)梯级酒精洗涤，100%酒精2×2min→95%酒精1×5min→70%酒精1×5min→50%酒精1×5min→DEPC水洗涤2×3min→DEPC-PBS洗涤2×5min。

d)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

e)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。

f)切片入0.2N HCL，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。

g)切片用4%多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。

h)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25%乙酸酐BufferⅠ(0.1M三乙醇胺)，室温10min。

i)1M PBS洗涤2×5min。

9)组织微阵列预杂交和杂交

a)预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为2cmx2cm切片面积50μl，本实验组织微阵列切片组织面规格为6.5cmx2.8cm和6.2cmx2.8cm大小，每一切片预杂交液的用量均用250μl，相应大小的石蜡膜履盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2XSSC，10%Dextran sulphate，1X Denhardt’s solution，50mMPhosphate Buffer(PH7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/mlyeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47% Deionized formamide)。

b)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×SSC中5min。

c)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和100pmol 30个碱基的裸探针标记反应理论探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。

d)杂交后洗涤，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×SSC(0.5%SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5%SDS)，2×15min。

10)杂交后显色检测反应

a)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与目的RNA结合复合物；TSA放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。

b)切片转至TNT缓冲液中，3×5min。

c)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温，30min。

d)不洗，吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1%Triton X-100+1%阻断剂)，室温4小时。

e)TNT Buffer(0.1M Tris-HCl,PH7.5,0.15M NaCL,0.05%Tween20)洗3×5min。

f)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramida)贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液)，室温10分钟。

g)TNT洗，3×5min。

h)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/TMAs，室温30min。

i)TNT洗，3×5min。

j)蒸溜水洗涤，1×1min。

k)DAB显色，显微镜下控制显色反应。

l)苏木素复染，

m)酒精梯级脱水，切片干燥。

n)滴加组织微阵列切片专用封片胶，相应规格的盖玻片盖片，切片胶带转移系统配备的紫外灯下交联切片1min。

11)结果判断及标准

应用Nikon E600双目光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：（1）依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。（2）依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25%，记1分；c.25%＜阳性细胞数＜50%，记2分；d.阳性表达细胞数≥50%，记3分（由于每一组织点直径仅为0.9mm，统计阳性细胞数时于10×低倍镜下记数每个组织点的全部目标细胞）。

为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家在不知道各个组织点性质的情况下，分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达；④6分和9分者最终计为3分，认为强阳性表达。对于有组织点重复的标本，统一按照其第一个未脱落组织点的结果进行计分；全部组织点脱落的标本不计分和统计。

12)分析和统计软件

应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ² test或Fisher exact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test；多变量分析采用Cox’s proportional hazards model；P＜0.05即差异有统计学意义。

2结果

1)LINC00312在鼻咽癌及非癌鼻咽上皮组织中的表达

LINC00312在鼻咽炎性上皮的表达主要位于细胞浆（图5a），在鼻咽癌中大部分呈阴性表达（图5b），LINC00312在鼻咽癌中的阳性表达率为51.4%（169/329），在非癌鼻咽上皮中的阳性表达率为78.4%（182/232）。说明LINC00312在鼻咽癌中表达是显著下调的，两者之间具有明显的统计学差异(P<0.001)。

2)LINC00312与鼻咽癌临床病理特征的关系

LINC00312与临床进展和肿瘤大小呈负相关(P＝1.7×10^-5，2×10^-7)，与淋巴结转移呈正相关(P＝0.002)，与年龄、性别、组织学类型没有明显的差异（表3）。

表3 LINC00312与鼻咽癌临床病理特征的关系

			LINC00312
							Cases	-	+	(%)	P
Clinical stages
						StagesI+II+III	259	110	149	57.5	1.7×10^-5
Stages IV	70	50	20	28.6
						Tumor size
T1+T2+T3	268	112	156	58.2	2×10^-7
						T4	61	48	13	21.3
N stages
						No	113	63	50	44.2	0.002
N1	124	65	59	51.8
						N2	63	30	33	52.4
N3	29	5	24	82.8

3)LINC00312能区分鼻咽癌患者和非鼻咽癌患者

利用ROC曲线分析所有的鼻咽癌患者和非鼻咽癌患者，发现LINC00312能区分鼻咽癌患者和非鼻咽癌患者，曲线下面积为0.816（图6），(95%confidence interval=0.777-0.855,P=0.000,SE=0.020)，敏感性和特异性为72.1%和87.7%。

4)Kaplan-Meier生存分析

我们对所有的鼻咽癌患者进行了电话随访，最后能联系上的鼻咽癌患者有115人，我们详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了无病生存时间及状态以及总生存时间和状态，全部115例病人中最长的生存时间将近7年，无病生存率为57.4%（66/115），总生存率为66.1%（76/115）。

我们将LINC00312进行了生存曲线分析，将鼻咽癌患者分成无淋巴结转移和有淋巴结转移两组后，发现在无淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达患者总生存率及无病生存率都要高于阴性表达的患者（图7A,B）；在有淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达患者总的生存率及无病生存率都要低于阴性表达的患者（图7C,D）。

5)多变量分析（Cox’s proportional hazards model）影响预后的参数

我们将临床病理参数中的性别、临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤大小及浸润范围、组织学类型及LINC00312表达进行多变量分析（Cox’s proportional hazards model），分析这些参数与预后的关系。结果显示LINC00312表达能作为鼻咽癌患者预后的独立预后因子（表4）。

表4多变量分析（Cox’s proportional hazards model）影响无病生存和总生存时间的参数

Claims

1.长链非编码RNA基因LINC00312的应用方法，其特征在于，根据该基因序列制备用于鼻咽癌患者的淋巴结转移的诊断或者疗效预测的制剂，所述的制剂中的长链非编码RNA基因LINC00312的表达与鼻咽癌患者的淋巴结转移呈正相关。

2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的制剂包括原位杂交检测试剂和实时定量PCR检测试剂。

3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，根据该基因序列设计并合成用于原位杂交的寡核苷酸探针。

4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，用于原位杂交的寡核苷酸探针序列包括：

5'-ctactataaggaaaagcactatcttctccc-3'

5'-gccttaggtcagattctactagtttaaagc-3'

5'-agactggttgtctgccccatagtagttgtc-3'。

5.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，根据该基因序列设计并合成出用于实时定量PCR的检测引物。

6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，用于实时定量PCR检测的上、下游引物分别为5’-AAGCGAACCAAGCCAATA-3’和5’-CAAATCCCTGAAACTCTG-3’。