CN108660214B

CN108660214B - 检测circ_CLASP2的试剂在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用及试剂盒

Info

Publication number: CN108660214B
Application number: CN201810525208.3A
Authority: CN
Inventors: 谭怡忻; 龚朝建; 郭灿; 张姗姗; 熊芳; 刘凌云; 莫勇真; 王裕民; 陶文静; 熊炜; 曾朝阳; 李小玲; 李桂源
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2038-05-28
Also published as: CN108660214A

Abstract

本发明公开了一种检测circ_CLASP2的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断制剂中的应用及试剂盒。收集多例鼻咽癌组织和正常鼻咽上皮组织，利用qRT‑PCR技术检测了circ_CLASP2的表达情况。结果显示，在鼻咽癌组中circ_CLASP2表达水平大约是正常炎性鼻咽上皮的3倍，两组数据的差异具有统计学意义(P＝0.0386)。因此，提示circ_CLASP2可以作为鼻咽癌辅助诊断分子标记，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

检测circ_CLASP2的试剂在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用及试剂盒

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种检测环状RNA circ_CLASP2的试剂在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和相应的试剂盒。

背景技术

目前环状RNA(Circular RNA)是个研究热点，circRNA主要来源于蛋白质编码基因的外显子区，也可以由内含子区、UTR区、基因间区、非编码RNA位点及已知转录物的反义位点形成。CircRNA是由前体RNA(precursor RNA,pre-RNA)反向拼接而形成的一类不具有5‘末端帽子和3’末端poly(A)尾巴并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。

CircRNA形成过程可以分为两大类，即外显子环化(exon circularization)和内含子环化(intron circularization)两大机制。Jeck等提出外显子来源的circRNA(exoniccircRNA,ecircRNA)可以分为套索驱动环化(lariat-driven circularization)和内含子配对驱动环化(intron-pairing-driven circularization)两种形成方式，套索驱动环化是外显子3’端作为剪接供体(splice donor)攻击5’端剪接受体(splice receptor),Alu区共价结合而形成套索结构，套索结构进行内部拼接后切除内含子形成circRNA；内含子配对驱动环化是两个内含子碱基互补配对形成环状结构后，剪除内含子形成circRNA。其实内含子本身也可以环化，可以形成内含子来源circRNA(circular intronic RNA,ciRNA)。CircRNA是由前体mRNA反向拼接而形成的一类不具有5‘末端帽子和3’末端poly(A)尾巴并以共价键形式形成的封闭环形结构的非编码RNA分子。有着高度的稳定性、保守性、特异性，并且含量高的特点。

CircRNA最早在1976年于RNA病毒中首次发现，随后Hsu MT等人使用电子显微镜技术在猴的肾细胞质中发现了circRNA的存在。在1996年，circRNA在人类细胞中被发现，随着RNA-seq新一代测序技术的发展，近年来越来越多的circRNA被发现，目前为止已知的circRNA数目已经达到三万多个。CircRNA也不再被认为是错误的RNA转录本，而是作为非编码RNA研究中的耀眼之星冉冉升起。筛选和验证更多的新型circRNA作为肿瘤诊断和预后的生物标志物及其应用，并能尽早在专利领域得到好的保护，能显著提升我国在该技术领域的国际竞争力。

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)属于头颈部肿瘤，起源于鼻咽部上皮组织。一般在鼻咽部的后外侧隐窝(罗森缪勒窝，Fossa of Rosenmüller)处发病，此处的鼻咽癌细胞易侵袭邻近的组织和器官。由于鼻咽癌的发生发展是由积累的家族遗传和体细胞遗传突变及表观遗传学突变导致的多阶段复杂基因调控过程，涉及到原癌基因和抑癌基因的激活和沉默、及非编码RNA参与的表观遗传学调控等等。所以鼻咽癌发生发展的具体分子机制尚不明确，而且由于肿瘤异质性和个体差异性，传统的放疗联合化疗的疗效不显著。因此通过circRNA探究其与鼻咽癌发生发展机制，进一步为鼻咽癌的诊断，以及控制鼻咽癌增殖、侵袭和转移将是研究的热点。

我们在鼻咽癌细胞5-8F细胞的RNA-seq中检测到长度449bp的circ_CLASP2,其是CLASP2基因2、3、4、5、6号外显子五个外显子反向拼接形成的环状RNA。通过试验发现该环状RNA与鼻咽癌的发生发展存在关联，有可能作为鼻咽癌诊断标记物，以及治疗的靶点。

发明内容

本发明从RNA-seq数据中筛选出高表达的circRNA，并在鼻咽癌中验证它们的表达情况，寻找到新兴的circRNA能够作为诊断鼻咽癌的分子标志物。

由于CLASP2基因的全长7145bp，有40个外显子，存在非常复杂的可变剪接；但是本发明从5-8F细胞的RNA-seq中只发现了大小为449bp的circ_CLASP2，包含CLASP2的2到6号外显子并在其他鼻咽癌细胞株和鼻咽癌活检组织中进行了验证。并发现了它与鼻咽癌之间存在的关系。

因此，本发明的第一个目的是提供一种检测环状RNAcirc_CLASP2的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断制剂中的应用，所述的环状RNAcirc_CLASP2的序列如SEQ No.1所示。为鼻咽癌辅助诊断提供了一种新的准确可靠的检测途径。

由于本发明用于验证circ_CLASP2的表达情况所收集的样本数充足，具有统计学意义，而且样本来源合理，筛选标准严格，试验过程严谨，结果真实可靠。通过在鼻咽癌细胞系中circ_CLASP2过表达效果以及沉默circ_CLASP2表达的效果检测，进一步证实本发明实验的可靠性和准确性。

进一步的，所述的检测circ_CLASP2的试剂包括RT-PCR试剂或者原位杂交检测试剂。

进一步的，所述的检测circ_CLASP2的试剂为检测鼻咽组织中circ_CLASP2含量的试剂。

进一步的，所述的检测circ_CLASP2的试剂为RT-PCR试剂。

由于环状RNA结构的特殊性，为了确保引物的特异性和qPCR的精确性，申请人严格遵循环状RNA引物设计原则，设计出能准确扩增用于实时荧光定量检测环状RNA circ_CLASP2表达的引物：

上游引物：5’-ACAGTCAGGTGAGAGATGCT-3’

下游引物：5’-TGGCATCTCCCATTCTGTCT-3’。

但本发明所述的能扩增环状RNA circ_CLASP2的引物不限于上述提供的引物。

进一步的，我们优选加入了β-actin作为参照，来减少实验过程中存在的系统误差，同时也为研究提供更加可靠的实验数据。

进一步的，所述的RT-PCR试剂包括：

β-actin作为内参的引物：

上游引物：5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’，

下游引物：5’-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3’。

但本发明的内参引物不仅仅限于上述提供的内参β-actin引物。

本发明的第二个目的是提供一种鼻咽癌诊断试剂盒，该试剂盒含有能扩增circ_CLASP2的引物。为鼻咽癌辅助诊断提供了一种新的准确可靠的检测产品。

能扩增circ_CLASP2的引物：

上游引物：5’-ACAGTCAGGTGAGAGATGCT-3’

下游引物：5’-TGGCATCTCCCATTCTGTCT-3’。

试剂盒还含有β-actin作为内参的引物：

上游引物：5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’

下游引物：5’-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3’。

试剂盒还含有组织总RNA提取试剂、RNA逆转录PCR反应试剂和实时荧光定量检测所需的试剂。

本发明从鼻咽癌中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量法检测了circ_CLASP2的表达，结果显示circ_CLASP2在鼻咽癌组织中表达上调。首次发现环状RNA分子circ_CLASP2，其与鼻咽癌存在正向相关关系，从而提示circ_CLASP2可作为鼻咽癌辅助诊断的分子标志。本发明为鼻咽癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1为qRT-RCR检测鼻咽癌组织和非肿瘤鼻炎上皮组织(正常对照)中circ_CLASP2的表达水平；

circ_CLASP2的表达水平分析以β-actin作为参照将非肿瘤鼻咽上皮组织标准化为1，N为非肿瘤鼻咽上皮组织，样本数为12；T为鼻咽癌组织，样本数为22，n为样本数量，均采用t检验，P<0.05具有统计学意义。

图2为qRT-RCR检测鼻咽癌细胞株和正常鼻咽上皮细胞株中circ_CLASP2的表达水平；

q-PCR结果显示circ_CLASP2在正常鼻咽上皮细胞NP69，以及鼻咽癌细胞CNE2、HK1、HNE2、HNE1中的表达，circ_CLASP2表达水平分析以β-actin作为参照将永生化的正常炎性鼻咽上皮细胞NP69标准化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图3为circ_CLASP2过表达载体图谱。

图4为qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系中circ_CLASP2过表达效果和成环效率；

a和c.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系CNE2、HNE2中circ_CLASP2过表达效果和成环效率；b和d.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系CNE2、HNE2中过表达circ_CLASP2对CLASP2mRNA水平的影响；以β-actin作为参照将pcDNA3.1(+)组标准化为1，ns代表没有意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图5为qRT-PCR技术检测鼻咽癌细胞系中circ_CLASP2siRNA的沉默效率；

a和c.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系CNE2、HNE2中circ_CLASP2siRNA的沉默效率；b和d.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系CNE2、HNE2中沉默circ_CLASP2对CLASP2mRNA水平的影响；circ_CLASP2表达水平分析以β-actin作为参照，将NCsiRNA组标准化为1，ns代表没有意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图6为体外过表达Circ_CLASP2对鼻咽癌细胞增殖的影响；

a-b.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系CNE2、HNE2中circ_CLASP2过表达效率；c-d.对上述细胞进行MTT实验检测细胞增殖能力，circ_CLASP2表达水平分析以β-actin作为参照，将pcDNA3.1(+)组标准化为1，ns代表没有意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图7为体外沉默Circ_CLASP2对鼻咽癌细胞增殖的影响；

a-b.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系CNE2、HNE2中circ_CLASP2敲低效率；c-d.对上述细胞进行MTT实验检测细胞增殖能力，circ_CLASP2表达水平分析以β-actin作为参照，将NCsiRNA组标准化为1，ns代表没有意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图8为qRT-PCR检测划痕实验细胞中circ_CLASP2过表达效率；

a-b.划痕实验所用鼻咽癌细胞株CNE2、HNE2转染效率用qRT-PCR实验检测，circ_CLASP2表达水平分析以β-actin作为参照，将pcDNA3.1(+)组标准化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图9为过表达circ_CLASP2对鼻咽癌细胞CNE2、HNE2划痕愈合实验的影响；

a-b.鼻咽癌CNE2和HNE2细胞转染pcDNA3.1(+)空载体和过表达

circ_CLASP2载体(circ_CLASP2)，待细胞密度达到100％后划痕，于第0,12,24小时观察拍照。

图10为过表达circ_CLASP2的鼻咽癌CNE2、HNE2细胞划痕实验统计图；

a-b.每组随机选取4个视野测量划痕宽度,将0小时的划痕宽度标准化为1，作统计图；每个实验重复三次,采用Student's t-test方法统计。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图11为qRT-PCR检测划痕实验细胞中circ_CLASP2干扰效率；

a-b.划痕实验所用鼻咽癌细胞株CNE2、HNE2转染效率用qRT-PCR实验检测，circ_CLASP2表达水平分析以β-actin作为参照，将NC siRNA组标准化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图12为干扰circ_CLASP2对鼻咽癌细胞CNE2、HNE2划痕愈合实验的影响；

a-b.鼻咽癌CNE2和HNE2细胞转染阴性对照siRNA序列(NC)和靶向干扰circ_CLASP2的siRNA序列(siRNA序列1和siRNA序列2的混合物，即siRNA1+2)，待细胞密度达到100％后划痕，于第0,12,24小时观察拍照。

图13为干扰circ_CLASP2的鼻咽癌CNE2、HNE2细胞划痕实验统计图；

图14为qRT-PCR检测Transwell小室基质胶侵袭实验中circ_CLASP2的过表达效率；

a-b.Transwell小室基质胶侵袭实验所用鼻咽癌细胞株CNE2、HNE2转染效率用qRT-PCR实验检测，circ_CLASP2表达水平分析以β-actin作为参照，将pcDNA3.1(+)组标准化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图15为过表达circ_CLASP2对鼻咽癌细胞系CNE2、HNE2侵袭能力的影响；

分别过表达circ_CLASP2的CNE2、HNE2以及各自的对照组细胞进行Transwell小室基质胶侵袭实验。

图16为过表达circ_CLASP2的Transwell小室基质胶侵袭实验统计图；

每组随机选取4个细胞视野进行细胞计数，作统计图；每个实验重复三次，采用Student's t-test方法统计；以β-actin作为参照，将pcDNA3.1(+)组标准化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图17为qRT-PCR检测Transwell小室基质胶侵袭实验中circ_CLASP2的干扰效率；

a-b.Transwell小室基质胶侵袭实验所用鼻咽癌细胞株CNE2、HNE2转染效率用qRT-PCR实验检测，circ_CLASP2表达水平分析以β-actin作为参照，将NC组标准化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图18为干扰circ_CLASP2对鼻咽癌细胞系CNE2、HNE2侵袭能力的影响；

分别干扰circ_CLASP2的CNE2、HNE2以及各自的对照组细胞进行Transwell小室基质胶侵袭实验。

图19为干扰circ_CLASP2的Transwell小室基质胶侵袭实验统计图；

每组随机选取4个细胞视野进行细胞计数，作统计图；每个实验重复三次，采用Student's t-test方法统计；以β-actin作为参照，将NC组标准化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

具体实施方式

以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明所用的正常炎性鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织标本均来自中南大学附属肿瘤医院治疗的初诊患者，未经放化疗和手术治疗。新鲜鼻咽癌组织采集好后，立即放入液氮罐中保存,随后收集所有病人的相关临床资料。所有实验用组织样本采集均获得中南大学伦理委员会授权和病人同意。

本发明所用CNE2、HNE2、HK1、HNE1等鼻咽癌细胞系及永生化的正常鼻咽上皮细胞NP69均为中南大学肿瘤研究所分子遗传实验室所保存。细胞培养条件为：含10％胎牛血清(FBS)和1％双抗(青霉素、链霉素)的RPMI1640液体培养基，37℃、95％湿度、5％CO₂浓度的恒温培养箱内贴壁生长。

本发明环状RNA的引物与线性RNA引物的设计不同，其是根据拼接位点两侧设计，在Primer3.0网站上在线设计，最终的引物合成工作，通过发送电子邮件订货，委托擎科生物公司长沙合成部合成。

(1)β-actin

上游引物：5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’

下游引物：5’-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3’

(2)环状RNA circ_CLASP2实时荧光定量PCR引物

上游引物：5’-ACAGTCAGGTGAGAGATGCT-3’

下游引物：5’-TGGCATCTCCCATTCTGTCT-3’

(3)扩增circ_CLASP2全长引物(用于构建circ_CLASP2过表达载体)

上游引物：5’-CCATCGATGG GTATCATTAATGGGA-3’

下游引物：5’-TTCCCGCGGGGACTAGCAGGGGGAATT-3’

上述引物扩增CLASP2基因2-6号外显子，酶切后插入用同样限制性内切酶切开的环状RNA过表达空载体中。

本发明为了特定的敲低环状RNA而不影响它的线性基因表达，根据拼接位点设计siRNA，靶向沉默circ_CLASP2。

circ_CLASP2siRNA序列1：

正义链(5'-3')CUGCUAGGUAUCAUUAAUGUU

反义链(5'-3')CAUUAAUGAUACCUAGCAGUU。

circ_CLASP2siRNA序列2：

正义链(5'-3')CCCCUGCUAGGUAUCAUUAUU

反义链(5'-3')UAAUGAUACCUAGCAGGGGUU。

阴性对照：

正义链(5'-3')UUCUCCGAACGUGUCACGUUU

反义链(5'-3')ACGUGACACGUUCGGAGAAUU。

本发明试验结果均采用统计学分析：t检验用来评价两组之间的差异。卡方检验用来评估基因表达或不表达在性别、年龄、肿瘤阶段、临床分期和转移情况等临床参数方面的差异。生存分析采用Kaplan–Meier方面检验。p<0.05用于表示统计学显著性，所有p值均使用双侧检验。统计分析采用SPSS 13.0和Graphpad 5.0软件进行。

实施例1：circ_CLASP2在鼻咽癌组织和细胞中的表达

1、按照标准样本采集方案，我们从湖南省肿瘤医院收集疑似鼻咽癌患者组织样本34例。所有病例均为湖南省肿瘤医院头颈外科的初诊患者(时间区间：2016年1月至2016年11月)。经病理科确诊鼻咽癌24例，鼻咽炎症患者12例(已排除肿瘤性疾病、无活动性传染病、严重免疫性疾病和其他重大疾病)。

采集的过程中记录完整的个人信息和临床资料，包括姓名、性别、年龄、门诊编号、住院编号、病理类型、病例分期、以及EBV感染情况等，详见Excel电子表格截图。所有样本的采集都征得病人允许，并与病人签署书面协议，建立资料较完整的标本库。

2、鼻咽癌或正常炎性鼻咽组织RNA提取

(1)准备工作：研钵用洗涤剂清洗后浸泡于3％的双氧水(H₂O₂)中4小时以上，冲刷数次，用蒸馏水洗一次，用锡箔纸覆盖研钵(有助于受热均匀，取出时防止污染)，置于180℃干燥箱中干烤8小时以上。达到干烤时间后，关闭干燥箱，待干燥箱温度降至室温时取出研钵，存放于洁净区。

(2)液氮研磨：在研钵中加入液氮预冷，然后夹取冻存管中保存的鼻咽部组织，快速研磨，一边研磨，一边继续加入少量液氮，再研磨，直到将鼻咽组织磨成粉末状。依据最佳比例，即每50-100mg正常或NPC样本加1ml Trizol。我们实验过程中，一个鼻咽癌组织样本约200mg左右，因此需要2ml Trizol。然后进一步研磨混匀，置于冰箱4℃大约5-10min，让组织完全裂解。待裂解产物融化成粉红色液体时转移至2ml Tube。每个样品可以分离至2个Tube，保存至-80℃。

(3)水相分离：每1000μl含trizol的组织裂解液添加200μl 4℃预冷的氯仿，震荡约30s进行混匀。低温环境放置5分钟后，进行25分钟离心操作(12,000rpm，4℃)。离心完毕，可观察到管内液体分为3层，上层透明层中存在RNA，中层是膜状的白色沉淀，下层粉红色。因此，进一步吸取含有RNA的上层水相至1.5ml Tube中，用100μl枪轻柔吸取，尽量避免吸到中层和下层物质，造成RNA污染。

(4)RNA沉淀：在上清中加入1:1等体积的异丙醇约500μl，动作轻柔地上下颠倒混匀数次，置于冰箱-20℃放30分钟后，离心30分钟(4℃,12,000rpm)，可见管底有RNA沉淀，用100μl移液枪吸弃去上清，尽量保留RNA沉淀。

(5)RNA洗涤：每管RNA沉淀样品加入1ml用无酶水制备的75％乙醇，温和上下倒置离心管，以洗涤RNA沉淀。然后离心5分钟(4℃,7,600rpm)，用100μl的移液枪尽量弃去上清，室温晾干10～15分钟。

(6)重新溶解RNA并保存：每管样品加入15-30μl DECP水，保存于-80℃。

3、细胞总RNA提取

准备工作：灭菌后的无RNase水、75％乙醇(无RNase配制)、氯仿、异丙醇、1×PBS、无酶tip头和EP管，高速低温离心机预冷至4℃，实验开始前先将实验台面及移液枪用75％酒精擦拭。

(1)待提取RNA的细胞(NP69，以及CNE2、HK1、HNE2、HNE1)，用1×PBS或D-hanks清洗两次；

(2)12孔板中每孔加500μl Trizol裂解液，室温裂解1-2分钟，用移液枪轻轻吹下细胞，上下轻柔颠倒10次，室温静置5分钟；

(3)加入100μl的氯仿(按1mlTrizol:0.2ml氯仿:0.5ml异丙醇)，用力震荡15-30s，冰上放置5分钟；

(4)4℃，12000rpm/20min；

(5)取上层水相于预冷的Tube管中，加入250μl异丙醇，用漩涡混合器或移液枪混匀(-20℃>1h)；

(6)4℃，12000rpm/30min，弃上清；

(7)加入75％乙醇(预冷)1ml，混匀；

(8)4℃，7600rpm/5min；弃上清，重复步骤8,9；

(9)闪离10s，尽量吸尽上清，倒置干燥10分钟；

(10)加入20-30μl DEPC，测RNA浓度和OD值。

4、基因circRNA逆转录PCR反应

(依据abm公司5×All-In-OneRTMasterMix(withAccuRTGenomicDNARemovalKit)(#G492)的实验说明手册操作，)

配置如下反应体系：

逆转录PCR上机反应程序如下：

25℃ 10min，

42℃ 15min，

85℃ 5min。

待反应结束后，-20℃保存产物备用。

5、实时荧光定量PCR

先将逆转录反应产物稀释5倍，然后依据abm公司EvaGreen qPCR MasterMix(MasterMix-R)的实验说明手册操作，配置如下反应体系：

实时荧光定量PCR机上反应程序如下：(Cycle×39)

Bio-RadIQ5实时荧光定量PCR仪进行上述反应完成后，与内参基因β-actin标化,以2-^△△CT值显示目标基因的相对表达量，判定基因的表达差异。采用unpaired t-test检验计算P值。

结果：与12例鼻咽炎症上皮组织(用做正常对照)相比，circ_CLASP2在22例鼻咽癌组织中明显高表达，在鼻咽癌组中circ_CLASP2表达水平大约是正常炎性鼻咽上皮的3倍，两组数据的差异具有统计学意义(P＝0.0386)，结果见图1。因此，circRNA circ_CLASP2在鼻咽癌组织中高表达，circ_CLASP2对鼻咽癌的发生发展可能具有重要的生物学功能。

为了进一步验证circ_CLASP2在鼻咽癌中的生物学功能，我们在永生化的正常鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞CNE2、HNE2、HK1、HNE1中进行qRT-PCR实验验证circ_CLASP2的表达情况。结果显示，circ_CLASP2在各鼻咽癌细胞系中均高于正常鼻咽癌上皮细胞NP69约60倍，并且两组数据的差异具有统计学意义(P＝0.008、P＝0.0174、P＝0.0003、P＝0.0402)，结果见图2。所以circRNA circ_CLASP2在鼻咽癌细胞中高表达，circ_CLASP2对鼻咽癌的发生发展可能具有重要的生物学功能。

实施例2在鼻咽癌细胞系中circ_CLASP2过表达效果检测

首先我们选择酶切位点，将circ_CLASP2全长序列(即CLASP2基因2到6号外显子共449bp序列)放入NEB cutter 2.0在线网站分析，显示ClaI和SacII酶切位点为circ_CLASP2全长序列中不存在的位点，同时在pcDNA3.1质粒载体中单一存在的DNA限制性内切酶。据此构建过表达载体；图3为过表达载体图谱。

为了检测circ_CLASP2的过表达效率，首先我们将构建的circ_CLASP2真核过表达载体在鼻咽癌细胞中进行表达。把生长状况良好的鼻咽癌细胞CNE2、HNE2种到12孔板中，待细胞融合度达到60％-80％时，用脂质体lipofectamine3000把无内毒素质粒空白载体和circ_CLASP2过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞CNE2和HNE2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circ_CLASP2的表达水平。为了鉴定转染circ_CLASP2对CLASP2的mRNA影响情况，我们利用实时荧光定量PCR技术检测同时检测CLASP2的表达水平(见图4)，qPCR结果显示，与pcDNA3.1空质粒组细胞相比，转染circ_CLASP2过表达质粒组的细胞中circ_CLASP2的表达水平显著升高，且在CNE2、HNE2细胞系中其表达倍数为60倍和20倍以上，结果具有统计学意义。但是CLASP2的mRNA表达水平没有明显的变化，即可说明转染circ_CLASP2对CLASP2的mRNA水平没有影响，后续实验结果中的功能均由circ_CLASP2发挥而非CLASP2基因。

实施例3在鼻咽癌细胞系中沉默circ_CLASP2表达的效果检测

为了确保实验的严谨性，我们根据拼接位点设计了两条circ_CLASP2的siRNA序列，siRNA即一类长度为21-25个核苷酸，能与同源RNA互补结合，特异性降解目的RNA，从而抑制其表达的双链RNA分子。目前，siRNA已发展成为基因功能研究的重要工具。为了探究circ_CLASP2在肿瘤发生发展中的作用，我们根据circ_CLASP2的拼接位点设计了两条siRNA，利用Hiperfect试剂将siRNA(分别为siRNA1、siRNA2及它们的混合物siRNA1+2)和作为实验对照的无关序列(NC)瞬时转染到CNE2和HNE2细胞系中沉默circ_CLASP2的表达。转染后继续培养48小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circ_CLASP2的表达水平以检测siRNA的转染效率，同时检测CLASP2的表达水平(见图5)。靶向circ_CLASP2的siRNA序列可以将circ_CLASP2的表达水平降低到50％以下，而CLASP2的mRNA表达水平没有受到影响，即可说明转染circ_CLASP2对CLASP2的mRNA水平没有影响，后续实验结果中的功能均由circ_CLASP2发挥而非CLASP2基因。

实施例4：体外过表达circ_CLASP2促进鼻咽癌细胞增殖

我们首先用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1/has_circ_CLASP2过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞CNE2和HNE2，继续培养48小时后，利用qRT-PCR确保circ_CLASP2在鼻咽癌细胞系中表达水平升高后，进行MTT实验，验证其对细胞增殖的影响。基于第一至第五天的检测结果，我们并发现pcDNA3.1空质粒组和circ_CLASP2过表达质粒组之间的细胞增殖存在明显差异，过表达circ_CLASP2对体外培养条件下的鼻咽癌细胞增殖有促进作用。(结果见图6)

实施例5：体外沉默circ_CLASP2抑制鼻咽癌细胞的增殖

利用Hiperfect试剂将靶向circ_CLASP2的两条siRNA混合物(siRNA 1+2)和siRNA对照(NC)瞬时转染到CNE2和HNE2细胞系中沉默circ_CLASP2的表达。转染后继续培养48小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circ_CLASP2的表达水平以检测siRNA的转染效率。结果显示，siRNA具有良好的沉默效果。在确保circ_CLASP2被干扰掉后，我们用沉默了circ_CLASP2的鼻咽癌细胞系CNE2和HNE2进行MTT实验，验证其对细胞增殖的影响。基于第一至第五天的检测结果，相对于NC组，siRNA组细胞的增殖速度明显减慢，即沉默circ_CLASP2抑制鼻咽癌细胞的增殖。通过正反两个方向的验证，我们可以说circ_CLASP2对体外培养条件下的鼻咽癌细胞增殖有促进作用。(结果见图7)

实施例6：细胞划痕愈合迁移实验：

(1)照细胞台：1000μl/10μl Tip头、高温高压灭菌的D-Hank’s，直尺、1000μl/10μl移液枪、marker笔等，用酒精消毒后再放置在超净台内紫外照射30分钟；

(2)待细胞长至50％～70％左右分别转染靶向circ_CLASP2的siRNA和对照siRNA序列(NC)，或者过表达质粒和空白质粒；

(3)待细胞长满平铺板底后第二天开始划痕：将10μl枪头比着直尺垂直于6孔板底部干脆快速进行十字或井字划痕，不要倾斜，力度大小一致，以确保划痕宽带尽可能一样；

(4)吸弃掉培养液，用D-hanks轻轻洗涤3次，尽可能洗掉由于划痕引起的碎片细胞；

(5)加入1％双抗2％胎牛血清的1640培养基；

(6)拍照记录此时的十字旁边划痕宽度，记为0h；

(7)将6孔板放回培养箱培养，间隔12小时取出，拍摄0h时所拍图片的位置，记为12h；

(8)间隔24h时再拍相同位置，直到划痕愈合，整理所有的图片，并进行统计分析。

体外过表达circ_CLASP2促进鼻咽癌细胞的迁移

在确定环状RNAcirc_CLASP2对鼻咽癌细胞的增殖能力有促进作用后，我们又在鼻咽癌细胞系中进行了划痕实验，以验证circ_CLASP2对鼻咽癌细胞系的迁移有没有影响。利用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素空白质粒pcDNA3.1和CLASP2过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞CNE2和HNE2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circ_CLASP2的表达水平及成环效率(图8)。在确定了circ_CLASP2过表达质粒的过表达良好效果后，我们在鼻咽癌细胞系CNE2和HNE2进行了细胞划痕愈合实验。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点(12h和24h)均证实：相对于空载pcDNA3.1(+)质粒组，过表达circ_CLASP2的鼻咽癌细胞的划痕预后速度更快，表明细胞迁移能力明显增强(图9)。划痕宽度差异较大，且具有统计学意义(图10)。以上结果显示，过表达鼻咽癌细胞系中circ_CLASP2的表达,能够促进鼻咽癌细胞CNE2、HNE2在体外的迁移能力。

体外沉默circ_CLASP2抑制鼻咽癌细胞的迁移

利用Hiperfect试剂将靶向circ_CLASP2的2条siRNA序列混合物(siRNA1+2)和对照无关序列(NC)瞬时转染到CNE2和HNE2细胞系中沉默circ_CLASP2的表达。转染后继续培养48小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circ_CLASP2的表达水平以检测siRNA的转染效率。结果显示，siRNA具有良好的沉默效果(图11)。在确保circ_CLASP2被干扰掉后，我们在沉默了circ_CLASP2的鼻咽癌细胞系CNE2和HNE2中进行划痕实验，验证其对细胞迁移的影响。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点(12h和24h)均证实：相对于NC组，siRNA组细胞的迁移能力明显减弱(图12)。划痕宽度差异明显，且具有统计学意义(图13)。以上结果显示，沉默鼻咽癌细胞系中circ_CLASP2的表达能够抑制鼻咽癌细胞CNE2、HNE2在体外的迁移能力。通过正反两个方向验证证明，circ_CLASP2可以促进鼻咽癌细胞的迁移。

实施例7：细胞transwell侵袭实验：

(1)基质胶准备：提前一天把冻存于-20℃的BD Matrigel胶置于4℃冰箱融化成液态；

(2)基质胶稀释：BD Matrigel胶：无血清培基＝1:8，即20μl基质胶加160μl 1640培基轻吹混匀；

(3)将稀释好的基质胶加入transwell小室100μl，再沿边吸出80μl，依次铺好放入37℃培养箱里孵育2-3小时，当看到铺胶层为白色时，表明液体Matrigel胶已呈固态；

(4)消化转染后的实验细胞，用无血清培基洗2遍，然后使用无血清的培基重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为每200μl中2,0000个细胞；

(5)向下层小室添加800μl含有20％FBS的1640培养基，放入小室时将24孔板倾斜45°角，以避免放入小室过程中在小室和液面之间产生气泡；

(6)每室加200μl统一计数好的细胞悬液到transwell上室内，将24孔板放回37℃培养箱中，根据细胞状态和细胞侵袭速度，孵育约24～48小时。

(12)取出24孔板，用PBS或者D-hanks洗两遍，4％多聚甲醛浸洗10分钟，用清水洗3遍。

(13)染色：用0.1％的结晶紫滴加到transwell小室的底部，室温安静放置5-10min，用PBS清洗2-3遍，用棉签小心擦掉小室上面的基质胶；

(14)在24孔板中加入蒸馏水800μl，transwell上室中加入蒸馏水约200μl，然后在倒置显微镜下，进行观测，不同视野拍照，用image J软件进行计数和统计学分析差异的显著性。

体外过表达circ_CLASP2促进鼻咽癌细胞的侵袭

我们在鼻咽癌细胞系CNE2和HNE2进行了Transwell小室基质胶侵袭实验，以观察过表达circ_CLASP2对细胞侵袭能力的影响。我们同样利用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素空白质粒pcDNA3.1和circ_CLASP2过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞CNE2和HNE2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circ_CLASP2的表达水平及成环效率(图14)。在确定了circ_CLASP2过表达质粒的良好表达效果后，我们将细胞接种到铺基质胶的Transwell小室中，发现过表达质粒组的细胞侵袭到小室下表面的数目明显比空载组多，且两株细胞系结果的趋势一致(图15)。随机拍摄6张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义(图16)。以上结果表明，过表达鼻咽癌细胞系中circ_CLASP2的表达,能够促进鼻咽癌细胞CNE2、HNE2在体外的侵袭能力。

体外沉默circ_CLASP2的表达影响鼻咽癌的侵袭

为了探究沉默circ_CLASP2后是否能够得到与过表达circ_CLASP2相反的细胞表型改变,我们又在两株细胞系中用siRNA沉默circ_CLASP2后进行了Transwell小室基质胶侵袭实验。利用Hiperfect试剂将靶向circ_CLASP2的siRNA序列混合物(siRNA1+2)和对照无关序列(NC)瞬时转染到CNE2和HNE2细胞系中沉默circ_CLASP2的表达。转染后继续培养48小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circ_CLASP2的表达水平以检测siRNA的转染效率。结果显示，circ_CLASP2siRNA具有良好的沉默效果(图17)。在确保circ_CLASP2被干扰掉后，我们在沉默了circ_CLASP2的鼻咽癌细胞系CNE2和HNE2中进行Transwell小室基质胶侵袭实验，结果显示，siRNA组可在Transwell小室下表面观察到的肿瘤细胞数目明显少于NC组，且两株细胞系结果的趋势一致(图18)。随机拍摄6张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义(图19)。以上结果表明，沉默鼻咽癌细胞系中circ_CLASP2的表达,能够抑制鼻咽癌细胞CNE2、HNE2在体外的侵袭能力。通过正反两个方向证明，环状RNAcirc_CLASP2能够促进鼻咽癌细胞的侵袭。

序列表

<110> 中南大学

<120> 检测circ_CLASP2的试剂在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用及试剂盒

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 449

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gtatcattaa tgggattgga aattttaagt gcctttgtgg acagattatc aacacgcttt 60

aaatcctatg tagcaatggt tattgtagct ttaatagaca gaatgggaga tgccaaagac 120

aaggttcgag atgaagctca gactctgata ttgaagttaa tggatcaagt agcaccacct 180

atgtacattt gggagcagtt ggcttctggt tttaaacaca agaattttcg atctcgagaa 240

ggcgtgtgtc tgtgtcttat tgaaacctta aacatttttg gggctcagcc actagtcatc 300

agcaaattga taccacattt gtgtatcctg tttggagact ccaacagtca ggtgagagat 360

gctgcaatat tggctatagt ggagatttat agacatgtgg gagaaaaagt gaggatggat 420

ctttataaga gaggaattcc ccctgctag 449

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

acagtcaggt gagagatgct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

tggcatctcc cattctgtct 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

ccatcgatgg gtatcattaa tggga 25

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

ttcccgcggg gactagcagg gggaatt 27

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

tcaccaactg ggacgacatg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

gtcaccggag tccatcacga t 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

cugcuaggua ucauuaaugu u 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

cauuaaugau accuagcagu u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

ccccugcuag guaucauuau u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

uaaugauacc uagcaggggu u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

uucuccgaac gugucacguu u 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

acgugacacg uucggagaau u 21

Claims

1.检测circ_CLASP2的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断制剂中的应用，所述的circ_CLASP2的序列如SEQ No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测circ_CLASP2的试剂包括RT-PCR试剂或者原位杂交检测试剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的检测circ_CLASP2的试剂为检测鼻咽组织中circ_CLASP2含量的试剂。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的检测circ_CLASP2的试剂为RT-PCR试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的RT-PCR试剂包括：

上游引物：5’- ACAGTCAGGTGAGAGATGCT -3’

下游引物：5’- TGGCATCTCCCATTCTGTCT -3’。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的RT-PCR试剂包括：

β-actin作为内参的引物：

上游引物：5’- TCACCAACTGGGACGACATG-3’

下游引物：5’- GTCACCGGAGTCCATCACGAT -3’。