CN104878011B - 长链非编码rna afap1-as1在制备乳腺癌实时荧光定量辅助诊断制剂上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA AFAP1‑AS1在制备乳腺癌实时荧光定量辅助诊断制剂上的应用。通过研究证实AFAP1‑AS1在乳腺癌组织中表达上调，高表达AFAP1‑AS1的乳腺癌患者比低表达AFAP1‑AS1的乳腺癌患者预后差，因此，将AFAP1‑AS1的表达用于乳腺癌患者的辅助诊断和预后预测，可以为乳腺癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

长链非编码RNA AFAP1-AS1在制备乳腺癌实时荧光定量辅助 诊断制剂上的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA AFAP1-AS1的引物、检测试剂及其应用。

背景技术

人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(The Encyclopedia of DNAElements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中lncRNA序列的比例也相应地增大，提示lncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着lncRNA不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现lncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。

LncRNA可作为功能蛋白质的信号(signal)、诱导(guide)、诱饵(decoy)或支架(scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的是，lncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一起。因此，深入研究lncRNA的功能，揭示由lncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。

乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤的第一位，自20世纪70年代末开始其发病率一直呈上升趋势，美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌，而我国乳腺癌发病率近年来也一直持续增长，已成为当前社会的重大公共卫生问题，乳腺癌容易发生转移，晚期患者预后较差。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在乳腺癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们利用lncRNA芯片，构建了乳腺癌活检组织及正常对照样品中lncRNA的表达谱，从中筛选了一些在乳腺癌中差异表达的lncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实lncRNA AFAP1-AS1(NCBI accessionnumber:NR_026892)在乳腺癌中表达显著上调，且AFAP1-AS1的表达水平与乳腺癌的淋巴结转移及临床分期密切相关，针对该lncRNA的检测制剂也可以用于乳腺癌的辅助诊断。随后，我们进一步增加样本，在77例有临床随访资料的乳腺癌石蜡存档标本中，通过原位杂交(insitu hybridization)的方法检测了AFAP1-AS1的表达水平，发现AFAP1-AS1表达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该lncRNA表达低的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于乳腺癌的预后判断。

发明内容

本发明的目的是提供长链非编码RNA AFAP1-AS1的引物、检测试剂及其应用，利用AFAP1-AS1序列得到的引物可以制备用于乳腺癌辅助诊断或者预后预测的制剂。长链非编码RNA AFAP1-AS1的应用方法，用于制备乳腺癌辅助诊断或者疗效预测的实时荧光定量检测试剂，该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO:1所示。

所述的实时荧光定量检测试剂中包含：

用于实时荧光定量检测AFAP1-AS1表达的引物序列：

正向引物：5’-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3’，

反向引物：5’-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3’。

所述的实时荧光定量检测制剂为试剂盒。

试剂盒中含有：

用于实时荧光定量检测AFAP1-AS1表达的引物序列：

正向引物：5’-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3’，

反向引物：5’-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3’。

内参基因GAPDH特异性PCR引物：

正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

试剂盒中还含有：

(1)从乳腺癌组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；

(2)以总RNA为模板将LncRNA AFAP1-AS1逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；

(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括实时荧光定量SYBR染料、无酶水。

我们从乳腺癌和正常乳腺组织样本中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量法检测了AFAP1-AS1的表达，结果显示AFAP1-AS1在乳腺癌组织中表达上调。提示AFAP1-AS1可作为乳腺癌预后预测的分子标志。本发明为乳腺癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR技术验证lncRNA AFAP1-AS1在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达情况，AFAP1-AS1在乳腺癌(T)中的表达比正常乳腺组织(N)中显著提高；

图2为原位杂交检测AFAP1-AS1在乳腺癌中的表达情况；

在79.22％的乳腺癌(77例乳腺癌组织中的61例)中检测到有AFAP1-AS1的高表达(左)，其余的16例乳腺癌组织中AFAP1-AS1的表达较低(右)；

图3为乳腺癌中AFAP1-AS1的表达与乳腺癌患者预后的关系，

乳腺癌中AFAP1-AS1的高表达与乳腺癌患者的不良预后相关，即AFAP1-AS1高表达的患者总的生存时间(Over-all survival，左)和无复发生存时间(Relapse-freesruvival，右)要明显低于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1，实时荧光定量PCR法检测证实AFAP1-AS1在乳腺癌中表达上调

1.材料与方法：

收集17例正常乳腺组织和104例乳腺癌组织，抽提总RNA，2μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。AFAP-AS1引物为5’-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3’，SEQ NO:8和5’-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3’，SEQ NO:9。

用于对照的GAPDH引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，SEQ NO:10和5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，SEQ NO:11，

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

AFAP1-AS1在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在乳腺癌组织中高表达P＝0.006(图1)

实施例2，原位杂交检测发现AFAP1-AS1在乳腺癌中的表达与患者预后相关

1.材料方法

1.1设计并合成杂交探针

为了采用原位杂交方法检测AFAP1-AS1的表达情况，我们设计了针对原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各3条。

用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针：

AFAP1-AS1探针1：5’-ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3’，SEQ NO:2，

AFAP1-AS1探针2：5’-TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3’，SEQ NO:3，

AFAP1-AS1探针3：5’-TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3’，SEQ NO:4，

阳性对照探针(检测看家基因GAPDH)：

GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，SEQ NO:5

GAPDH探针2：5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'，SEQ NO:6

GAPDH探针3：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'，SEQ NO:7。

采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。

1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂

地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2^ndGeneration，Roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fabfragments，Roche公司)，增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSA^TM BiotinSystem，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)，DAB染色试剂盒(北京中山公司)，20x柠檬酸钠缓冲溶液(saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and shearedsalmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5％BlockingReagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)，醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent，Roche公司)。

1.3其他主要试剂和材料

无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液(pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L)；3％甲醇-双氧水溶液(80％甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值)；0.1％胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精(1ml浓盐酸+99ml 70％酒精配置)；封片胶(PTS Cure MountⅡ)；专用盖玻片(480×240mm²)定制于郑州玻璃仪器厂。Leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/L,pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制)，苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。

1.4标记探针

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH₂O＝9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ddH₂O 4μl)

混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2μl EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。

1.5寡核苷酸探针标记后纯化

为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

1)探针反应混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCL+75μl 100％冷乙醇(-20℃).

2)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

3)13.000×g 4℃离心15min。

4)弃上清，用50μl冰冷的70％(V/V)乙醇洗涤。

5)13.000xg 4℃，离心5min。

6)弃上清，真空4℃干燥。

7)用无菌双蒸水重溶探针。

1.6原位杂交检测存档石蜡切片中AFAP1-AS1的表达

石蜡切片杂交前处理

1)4℃保存的石蜡切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。

2)二甲苯依次脱蜡3×5min。

3)梯级酒精洗涤，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→DEPC水洗涤2×3min→DEPC-PBS洗涤2×5min。

4)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。

6)切片入0.2N HCL，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。

7)切片用4％多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。

8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25％乙酸酐BufferⅠ(0.1M三乙醇胺)，室温10min。

9)1M PBS洗涤2×5min。

预杂交和杂交

预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为50μl，石蜡膜履盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2XSSC，10％Dextransulphate，1X Denhardt’s solution，50mM Phosphate Buffer(PH 7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47％Deionized formamide)。

1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×SSC中5min。

2)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和100pmol 30个碱基的裸探针标记反应理论探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。

3)杂交后洗涤，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×SSC(0.5％SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5％SDS)，2×15min。

杂交后显色检测反应

1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。

2)切片转至TNT缓冲液中，3×5min。

3)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温，30min。

4)吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％Triton X-100+1％阻断剂)，室温4小时。

5)TNT Buffer(0.1M Tris-CL，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)洗涤，3x5min。

6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液)，室温10分钟。

7)TNT洗，3×5min。

8)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/TMAs，室温30min。

9)TNT洗，3×5min。

10)蒸溜水洗涤，1×1min。

11)DAB显色，显微镜下控制显色反应。

12)苏木素复染，

13)酒精梯级脱水，切片干燥。

14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片1min。

1.7结果判断及标准

应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：(1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。(2)依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25％，记1分；c.25％＜阳性细胞数＜50％，记2分；d.阳性表达细胞数≥50％，记3分。

为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。

1.8分析和统计软件

应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ²test或Fisherexact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test；多变量分析采用Cox’sproportional hazards model；P＜0.05即差异有统计学意义。

2结果

2.1 AFAP1-AS1在乳腺癌中的表达情况

AFAP1-AS1在79.22％的乳腺癌组织中(61/77例)有表达(图2左)，其余的16例乳腺癌组织中AFAP1-AS1的表达较低(图2右)。

2.2 AFAP1-AS1高表达的乳腺癌患者预后较差

我们对77例乳腺癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对乳腺癌组织中AFAP1-AS1的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现AFAP1-AS1高表达患者平均生存时间明显短于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者(图3)。说明AFAP1-AS1是一个与乳腺癌预后相关的分子标记，该lncRNA表达高，病人预后差。

Claims (5)

1.长链非编码RNA AFAP1-AS1 的应用方法，其特征在于，用于制备乳腺癌辅助诊断的实时荧光定量检测试剂，该长链非编码RNA AFAP1-AS1 的序列如SEQ NO:1 所示。

2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于实时荧光定量检测AFAP1-AS1 表达的引物：

正向引物：5’-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3’，

反向引物：5’-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3’。

3.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，所述的实时荧光定量检测试剂为试剂盒。

4.根据权利要求3 所述的应用方法，其特征在于，试剂盒中含有：

用于实时荧光定量检测AFAP1-AS1 表达的引物：

正向引物：5’-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3’，

反向引物：5’-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3’；

内参基因GAPDH 特异性PCR 引物：

正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

5.根据权利要求3 所述的应用方法，其特征在于，

试剂盒中还含有：

(1) 从乳腺癌组织中抽提总RNA 所用试剂，包括RNA 稳定溶液、Trizol 试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；

(2) 以总RNA为模板将LncRNA AFAP1-AS1 逆转录为cDNA 所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA 酶抑制剂、MMLV 逆转录酶以及随机引物；

(3) 将cDNA实时定量PCR 所用试剂，包括实时荧光定量SYBR 染料、无酶水。