CN104140967B

CN104140967B - 与结直肠癌肝转移相关的长链非编码rna clmat1及其应用

Info

Publication number: CN104140967B
Application number: CN201410261644.6A
Authority: CN
Inventors: 许剑民; 叶乐驰; 韦烨; 任黎; 钟芸诗; 朱德祥; 常文举; 林奇
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2034-06-13
Also published as: CN104140967A

Abstract

本发明提供了与结直肠癌肝转移相关的长链非编码RNA CLMAT1及其应用。所述的长链非编码RNA CLMAT1，位于第14号染色体chr14：101379770‑101381326，hg19，基因序列长度为1557bp。相比正常肠组织，肠癌中CLMAT1高表达与结直肠癌肝转移成正相关，且患者预后不良，也间接提示患者发生肝转移的可能性较高。

Description

与结直肠癌肝转移相关的长链非编码RNA CLMAT1及其应用

技术领域

用来诊断结直肠癌肝转移的发生，可评估结直肠癌患者的预后，并从长链非编码RNA的角度揭示结直肠癌发生肝转移的潜在机制。

背景技术

我国结直肠癌发病率逐年上升，尤其在北京、上海等城市，已居消化道肿瘤的第1位。肝脏是结直肠癌血行转移最主要的靶器官，也是影响结直肠癌预后的主要因素。15％～25％的结直肠癌病人在确诊时即合并肝转移，而另有15％～25％的病人在结直肠癌原发灶根治术后发生肝转移。结直肠癌肝转移(colorectal livermetastasis，CLM)也是结直肠癌患者最主要的死亡原因，肝转移灶未经治疗的病人其中位生存期仅6.9个月，无法切除病人的5年存活率接近0％。目前认为根治性手术切除是CLM患者获得治愈的有效手段，但临床实际中，绝大多数(80％～90％)的患者肝转移灶因未能早期发现而失去根治性手术切除的机会。因此，早期预测发现肝转移，并给予积极的综合治疗，可提高结直肠癌患者的生存时间和生存质量。

在目前工作中，我们仍局限于通过血清学检测(如CEA、CA199等)或影像学检查(如B超、CT和MRI)去发现CLM，前者敏感性和特异性不高，而后者只能检测出直径1cm以上病灶，无法做到早期发现和预测。课题组前期曾对收治在本单位的1613例CLM病人进行回顾性临床病理分析，发现部分结直肠癌患者即使原发灶无淋巴结转移，甚至肿瘤仅仅侵犯黏膜下层或肌层却也发生肝转移。可见从微观角度去深入了解CLM发生机制并获得其早期诊断标志物是十分必要的，这需要从基因组或转录组学等方面针对CLM开展基础研究。

人类基因组测序完成后的分析结果表明，人类基因组中能编码蛋白的DNA只占整个基因组的3～5％，众多DNA仅仅转录成RNA，而不编码蛋白质，都属于非编码RNA，它们的数量远远大于编码蛋白质的mRNA。近年来，分子生物学技术的不断更新日益彰显出非编码RNA并不是所谓的“转录噪音”，它们在基因转录后调控、剪切和修饰具有十分重要的功能，与疾病各方面有密切的关系。目前针对非编码RNA的研究已成为分子生物学最热门的前沿研究领域之一，并取得了一定成果，但大部分研究都集中在小RNA(如miRNA)，而忽视了另外一类数量更多(被转录最多)且序列比较长的非编码RNA，即长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)。

LncRNA作为一类转录本长度在200nt～100kb之间的RNA，其本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上调控基因的表达水平。相对于蛋白编码序列以及小分子RNA，lncRNA的研究虽还仅仅处于起步阶段，但其已展现出繁多的分子生物学功能，如调节转录模式，调控蛋白活性，改变RNA的剪切模式等等。2011年《Nature》《Cell》等杂志均多篇幅报道了lncRNA研究的必要性及重要意义，癌症遗传学家Pandolfi在针对转录调控网络机制所提出的竞争性内源RNA假说中，也认为lncRNA是揭开RNA“语言”秘密的关键一员。可见，lncRNA为人们提供了一个从未涉足的调控领域，也预示其在不同的组织细胞中可能有不同的表达谱，并且这种表达谱差异可能与许多生物学过程有密切联系。

众多研究证实，lncRNA在乳腺癌、肝癌、肺癌等肿瘤组织或细胞中存在异常表达，且与患者预后相关。肿瘤中lncRNA表达水平的变化甚至能够作为肿瘤诊断的标记，如lncRNA-DD3在大约90％的前列腺癌病例中存在高表达，从而被作为特异性标记用于临床诊断；lncRNA-MALAT1与非小细胞肺癌转移密切关联也使其成为肺癌患者诊断的标志。最近新报道的lncRNA，如SChLAP1、AK050349及AFAP1-AS1分别在前列腺癌、肝癌及食道鳞癌转移中起到一定作用，进一步预示了lncRNA与肿瘤侵袭转移密切相关。就肠癌尤其CLM来说，已有零星文献证实lncRNA-H19、HULC、HOTAIR、CCAT1等与CLM存在关联，如lncRNA-HULC被发现在肠癌肝转移灶上存在高表达，且可从外周循环中测得该lncRNA的表达。然而迄今为止，lncRNA与结直肠癌转移的相关报道仍停留在单个lncRNA表达验证的水平上，尚无文献直接针对CLM相关lncRNA表达谱及其功能等系统研究进行报道。

发明内容

本发明的目的是利用高通量lncRNA芯片技术首先在不同肝转移的结直肠癌组织及正常肠组织进行lncRNA表达谱的系统筛查，接着通过逐步扩大临床样本验证，确定可能与CLM相关的目标lncRNA。在此基础上，针对目标lncRNA结合临床病理资料分析，并进行细胞体外功能实验、裸鼠模型体内实验及初步机制研究，以揭示目标lncRNA对肠癌转移的影响与潜在的调控途径。本发明可为CLM早期诊断提供新的线索，并有助于丰富CLM发生的分子机制。

为了达到上述目的，本发明提供了一种长链非编码RNA CLMAT1(lncRNA-CLMAT1)，位于第14号染色体chr14：101379770-101381326，hg19，基因序列长度为1557bp。

本发明还提供了上述的长链非编码RNA CLMAT1在制备预测结直肠癌患者预后、肝转移或淋巴结转移的试剂、试剂盒或基因芯片中的应用。

本发明还提供了一种预测结直肠癌患者预后、肝转移或淋巴结转移的定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测上述的长链非编码RNA CLMAT1的正向引物：TACACTGACCCCACAGCCTATG和反向引物：CATTTCCCAAGCAGGTTTCC。

本发明利用lncRNA芯片分别在无肝转移、异时性肝转移、同时性肝转移的肠癌组织及正常肠黏膜组织上进行筛查，发现1332个CLM差异表达lncRNA。结合生物信息学分析，从中选择40个可能与CLM相关的lncRNA，经扩大临床病例样本验证，最终确定3个在CLM中差异表达显著且目前尚未报道的目标lncRNA，并命名为lncRNA-CLMAT1～3。结合临床资料分析，其中lncRNA-CLMAT1高表达与肠癌患者发生肝转移及淋巴结转移呈显著相关(P＜0.05)；且CLMAT1低表达组患者的中位生存时间明显长于高表达组患者(33.7个月vs.30.1个月，P＝0.04)。提示lncRNA-CLMAT1可能与结直肠癌肝转移的发生有关，其高表达与预后不佳相关。

本发明的原理是：

结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，影响结直肠癌患者预后的最大问题就是肿瘤复发或转移，其中最常见的就是肝转移。传统研究结直肠癌时，往往根据TNM分期，笼统地将结直肠癌归为非转移性、局部转移及远处转移，而未将远处转移性结直肠癌细化为肝转移、腹腔转移等；即使对于CLM，也往往未能根据肝转移发生时期、肝转移有无伴随肝外转移及肝转移灶是否已获得根治性切除等情况而区别对待；而CLM不同亚类别的临床诊治及生存预后差异迥异，异时性肝转移患者生存率好于同时性肝转移。本发明充分利用课题组前期建立的CLM完备的临床资料和组织标本库，针对上述现实问题，重点关注所有转移性结直肠癌：将筛选的病例分为局部转移性结直肠癌与单纯肝转移结直肠癌，并将后者细分为同时性肝转移与异时性肝转移，从而为进一步在结直肠癌临床样本中验证目标lncRNA的可信性提供坚实基础。

近年来随着研究的不断深入，愈来愈多的新lncRNA被发现，但多存在零散报道，一直缺乏在生物信息学方面对lncRNA进行系统描述。本发明直接关注在不同肝转移情况的肠癌组织上呈现动态变化的lncRNA，并通过扩大临床样本检测进一步分析其临床意义，从而确定可能在CLM中发挥功能的lncRNA。

针对lncRNA-CLMAT1序列，本发明的发明人查阅UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/)hg19数据库与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，均发现在其上游6.4kb存存lncRNA-MEG8。而Ensemble(http://www.ensembl.org/index.html)GRCh37数据库显示CLMAT1与MEG8基因的剪切异构体(ENST00000553421，即MEG8-006)的转录本序列位置存在一致，且与MEG8的其他剪切体即MEG8-001及MEG8-005存在部分重叠。设计特异性引物作定量PCR检测，结果表明CLMAT1与MEG8-002或MEG8-005转录本在肠癌组织上表达未见相关性。考虑到lncRNA-MEG8虽是已知的lncRNA(又称Rian或Irm)，在胚胎及骨骼肌上高表达，但具体功能仍未知，在肿瘤方面迄今也未见正式报道，而lncRNA-CLMAT1在本发明中提示与CLM相关，故值得深入探索。更不能忽视的是，在lncRNA-CLMAT1上游邻近所存在的lncRNA-MEG3已被公认与结肠癌、脑膜瘤、鼻咽癌、膀胱癌等肿瘤密切相关，因此综上，在后期研究中，重点关注其在肿瘤中尤其是CLM中可能发挥的作用及潜在机制而不纠结于CLMAT1是否是MEG8的剪切异构体。

已知局部淋巴结转移与结直肠肝转移发生率密切相关，本发明发现相比淋巴结转移阴性组，lncRNA-CLMAT1高表达的病例更多地分布在淋巴结转移阳性组中，预示着CLMAT1可能在肠癌发生局部淋巴结转移中起到一定促进作用。临床上，同时性CLM患者总体预后较异时性CLMA患者差，而后者预后又较无CLM患者差，在初步临床样本验证中(每组10例)，CLMAT1表达情况在异时性与无肝转移中无显著差异，可能与异时性肝转移组病例太少有关；而同时性肝转移组中CLMAT1显著较无肝转移组肠癌组织高表达，这在连续90例结直肠癌中获得进一步证实(有肝转移组CLMAT1表达仍显著高于非肝转移组)，提示CLMAT1可能在CLM发生进展中起到促进作用。

使用时，可以使用常规定量PCR方法检测结直肠癌组织样本与配对正常肠组织的lncRNA-CLMAT1的相对表达差异。相比正常肠组织，肠癌中CLMAT1高表达与结直肠癌肝转移成正相关，且患者预后不良，也间接提示患者发生肝转移的可能性较高。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明首次在不同肝转移的结直肠癌组织中进行长链非编码RNA(lncRNA)表达谱的系统筛查、分析，获得了1332个肠癌肝转移差异表达的lncRNAs。首次发现与肠癌肝转移相关的lncRNA，即CLMAT1。本发明在一系列基因实验证实的基础上进一步应用于实际临床的中，存在一定开发价值。

附图说明

图1-1：目标lncRNA的筛选流程图。CLM为结直肠癌肝转移；NLM为无肝转移；MLM为异时性肝转移；SLM为同时性肝转移。

图1-2：同时性肝转移组肠癌原发灶与配对正常肠组织的六对组织样本RNA提取的质控结果。A为RNA的浓度、纯度表格；B，C为RNA电泳图。

图1-3：HTA芯片外观图。A为本发明所用的部分HTA芯片外观图；B为HTA芯片筛查后产生的扫描图。

图1-4：芯片筛查产生的部分聚类热图。A为同时性肝转移肠癌组与无肝转移肠癌组比较的聚类图；B为异时性肝转移肠癌组与无肝转移肠癌组比较的聚类图。

图1-5：探针号为TR140014124的lncRNA在癌与配对正常肠组织中及不同肝转移组中的表达差异。A为lncRNA在同时性肝转移组内癌与配对正常肠组织上定量PCR的表达差异箱式图，tumor代表肠癌，normal代表配对的正常肠组织。B为lncRNA在不同肝转移组间的肠癌与配对正常肠组织表达差异值的比较，SLM代表同时性肝转移，MLM代表异时性肝转移，NLM代表无肝转移组。

图1-6：lncRNA-CLMAT1在90例独立的连续结直肠癌临床样本中的表达分析。A为CLMAT1在癌与配对正常肠组织上的表达差异。B为原发灶侵犯黏膜层或肌层(T1～2)与侵犯浆膜层或穿透浆膜层(T3～4)的病例之间CLMAT1表达的差异。C为原发灶肠癌局部淋巴结有无转移之间CLMAT1表达的差异。D为CLMAT1在有肝转移组(with LM)与非肝转移组(without LM)之间的差异表达。LM表示肝转移；**表示P＜0.01；*表示P＜0.05。

图1-7：90例结直肠癌病例的生存分析结果。A为CLMAT1高表达组与低表达组的生存分析图；B为肝转移组与非肝转移组的生存分析图。HR(hazard ratios)表示危险比；95％CI表示95％可信区间；LM(liver metastasis)表示肝转移。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

本发明中采用的临床标本满足以下条件：

本发明所用结直肠癌组织标本均来自复旦大学附属中山医院肠癌课题组在前期建立的结直肠癌及CLM组织标本库。所有人结直肠癌组织标本的取材与研究均获得院医学伦理委员会的批准，且患者均已签署知情同意书。取材每例结直肠癌组织标本的癌组织和癌远端正常黏膜(距结直肠癌病灶≥10cm)。取材的新鲜标本经生理盐水冲洗3次，并尽量剔除坏死组织、结缔组织及脂肪组织。

纳入本研究的标准：

年龄18-75岁之间

所有患者术前均未经化疗、靶向治疗及放疗处理；

术后病理证实为结直肠腺癌；且配对的正常肠组织经病理证实无癌残留；

病例有完整的随访复查资料；

患者术后均接受放化疗等正规治疗；

标本RNA质控合格；

排除标准：

家族性腺瘤性息肉及其他结肠疾病，例如溃荡性结肠炎、结肠结核、克隆病等病例

患有身体其他部位恶性肿瘤的病例(结直肠癌转移除外)；

有身体免疫缺陷疾病；

术后3个月内因局部肿瘤残留(术后3个月内的复发视为残留)或并发症死亡者；

本发明中采用的芯片情况：

Glue Grant Human Transcriptome Array是Affymetrix公司的芯片产品，简称GGHTA芯片。GGHTA芯片探针总数达6892960个，平均每个外显子由10个探针覆盖，平均每个基因大约有119个探针覆盖，故芯片数据相对更可靠。其中非编码RNA：563097个探针，覆盖50783个RNA，包括约4408个lncRNA。lncRNA数据库来源广泛，包括SILVA rRNA数据库；genomic tRNA数据库；snoRNA base；Signal Recognition Particle Database；Noncoding regulatory RNA数据库；RNAdb；NONCODE；fRNAdb；H-Invitational数据库；NATsDB等。

本发明的筛选流程见图1-1，首先选择不同肝转移情况的肠癌组织及正常肠组织(Cohort 1)进行lncRNA芯片筛查，获得CLM差异性lncRNA表达谱。经过生物信息学分析并结合临床，从中筛选差异显著的lncRNA在另外独立的不同肝转移肠癌组织及配对正常肠组织中(Cohort 2)做定量PCR验证，以获得CLM相关lncRNA。再从中选择1～2个与芯片结果符合且差异最显著的lncRNA，在另一组独立的连续90例结直肠癌患者组织中(Cohort 3)进一步定量PCR检测，在明确目标lncRNA的同时，分析其临床意义。

附：不同肝转移情况的肠癌分组：

●结直肠癌无肝转移组(NLM)：原发结直肠癌患者；术前影像学检查(B超、腹部CT等)和术中探查无肝转移；结直肠癌根治术后随访至少3年，影像学检查无复发转移。

●结直肠癌同时性肝转移组(SLM)：原发结直肠癌患者；术前影像学检查或术中探查发现肝脏转移，或结直肠癌根治术后6个月内影像学检查发现肝转移。

●结直肠癌异时性肝转移组(MLM)：原发结直肠癌患者；术前影像学检查和术中探查无肝转移；结直肠癌根治术后6个月后影像学检查发现肝转移。

本发明的具体步骤如下：

第一步、目标lncRNA的发现(Discovery phase)

1、病例选择

用于芯片筛查的4组病例样本分别为无肝转移组的肠癌组织、异时性肝转移组的肠癌组织、同时性肝转移组的肠癌组织及配对的正常肠组织(考虑另外2组病例在获取肠癌组织时均未伴肝转移)，每组样本均为6例，严格按照病例入选及排除标准。

局部转移的肠癌易出现肝转移，且淋巴结有无转移决定了患者术后是否需要进一步辅助化疗等。为了避免因原发灶分期不同或术后治疗方案存在差异而导致患者生存分析存在偏差，上述病例的肠癌原发灶均经过病理分析证实存在局部淋巴结转移，以最终保证肠癌原发灶样本基础病理特征一致。

用于芯片筛选的3组病例基本情况(表1-2)

表1-2：用于lncRNA芯片筛查的3组病例基本情况

2、组织RNA抽提、纯化、质控：

2.1、组织样品处理

组织样品从-80℃冰箱或液氮里取出后，将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1mL TRIzol，用电动研磨棒进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10％。

2.2、RNA抽提步骤

①加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置2min。

②4℃离心，12000g×15min，取上清。

③加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

④4℃离心，12000g×10min，弃上清。

⑤加入1mL 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。

⑥晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解(65℃促溶10～15min)。

2.3 RNA电泳质检及纯度浓度检测

抽提所得total RNA经Agilent Bioanalyzer 2100电泳质检合格后使用RNeasymicro kit和RNase-Free DNase Set，纯化total RNA(具体方法参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册)。

2.4结果判定

总RNA定量：RNA定量方法与DNA定量相似。可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/mL的单链RNA。如用1cm光径，用ddH₂O稀释DNA样品n倍并以ddH₂O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA(mg/mL)＝40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000。

总RNA纯度：根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。对于组织提取的RNA来说，若2100 RIN≥7.0并且28S/18S≥1.7，可视为合格的RNA。

针对所有用于芯片筛查的组织中提取的RNA进行严格的RNA质控检测，包括RNA浓度、纯度、RNA电泳图等。由图1-2可见，所用RNA质控合格。

第二步：芯片杂交、扫描、质控：

本部分实验委托上海国家生物工程公司(伯豪公司)，按照Affymetrix公司提供的GGHTA芯片的操作流程规范进行。

具体步骤：

①样品RNA的放大和标记：将实施例1获得的RNA样品按照Affymetrix公司提供的操作流程进行RNA放大和标记实验。

②芯片杂交：按照Affymetrix表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，Hybridization，Wash and Stain Kit，在滚动杂交炉，Hybridization Oven 645中45℃，16h滚动杂交，杂交完成后在洗涤工作站Fluidics Station 450按照Affymetrix提供的标准操作流程进行芯片的洗涤。

③芯片扫描：芯片结果采用Scanner 3000进行扫描，用CommandConsole Software 3.1读取原始数据，质控合格的数据采用R软件进行处理。

④芯片质控标准：qc_summery中6个参数(pm_mean_outlier、bgrd_mean_outlier、pos_vs_neg_auc_outlier、all_probeset_percent_called_outlier、PSR_coravg_outlier、TC_coravg_outlier)为“1”的个数不大于4个。

利用Affymetrix公司提供的GGHTA芯片，在上海国家生物工程公司按照操作流程规范进行芯片筛查(图1-3)，质控结果均合格。

第三步：芯片数据准确性的定量PCR验证

为了验证芯片数据的准确性，在芯片筛查所产生的数据库中随机取5个探针号，并利用先前芯片杂交筛选所用的组织cDNA进行定量PCR检测，以检测其结果是否与芯片数据一致。

具体步骤：

1、从-80℃冰箱中取出RNA，在室温下解冻，然后在0.2mL PCR管中配制反应溶液：

总RNA	1μg
		5×iScript reaction mix	4μL
iScriptase reverse transcriptase	1μL
		ddH₂O(DEPC)	XμL
Total RNA(根据样本RNA浓度调整)	XμL
		总volume	20μL

将PCR管置于25℃5min，42℃孵育30min，85℃变性5min，4℃保温，合成cDNA第一链。

SYBR green qPCR：反应体系：96孔板

将PCR管子置于PCR仪中进行反应，然后95℃，10min；接着进行40个循环：95℃，15s；60℃，30s。

2、结果说明：

每个样本均做复孔，取平均值。所获得Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，在图形上看就是Threshold线和扩增曲线交点的Y轴坐标，起始模板量越是大Ct值越是小。2^-ΔCt即为目的基因的量通过内均一化处理之后相对于内参(管家基因)的值。

由图1-4可见，在同时性肝转移组中肠癌与配对正常肠组织的比较中，定量PCR所反映的相对表达差异倍数与芯片筛查数据基本一致，因此该芯片筛查所获得的数据是可信且可靠的，可进行后期进一步的生物信息学分析及目标lncRNA的筛选。

引物由上海生工生物工程有限公司代为合成。

表1-1：目标lncRNA CLMAT1的引物

名称	Probe ID	Forward primer	Reverse primer
				CLMAT1	TR14014124	TACACTGACCCCACAGCCTATG	CATTTCCCAAGCAGGTTTCC
内参	GAPDH	TGACTTCAACAGCGACACCCA	CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA

目标lncRNA CLMAT1的探针序列

Aatggaggctccagagtgaaattaatgacactttgtcgatgaagatcttgattgtgacctctgtggaaaatgagccatgaaccaaccaataagcaggcttagtcacccttgacacagtttgcagttatccacctcctccaagttcttaatatgttagatccagataactgccttgtacagccacctccaggatactgcctccctaaaaaacagctagatacactgaccccacagcctatgtggaccacacagatatagtggcttgctctaaatgcaccagtgagaactctctgcaggaaacctgcttgggaaatgccatagcctgcaatacaggctttccccttcccgctggccctgtgaggcatgcaggatctgtaagtaataaactgcttctgttgtttcatttca

第四步：聚类热图分析：

利用伯豪在线分析系统(SAS系统)获得如图1-5所示的聚类热图。聚类热图是对样本和基因分别进行分级聚类之后与热图画在一起。通过热图可以观察同一个基因在不同样本中的表达情况，还可以根据基因表达情况验证样本的分组情况。

由于部分聚类图图形挤压后，纵坐标的探针号无法分辨，可将结果文件(后缀为.atr，.cdt和.gtr的三个文件)下载到计算机上，用treeview软件打开查看，图片伸展后能够看清所有的探针号，并可选取区段图像保存。Java Tree view软件是一个基于JAVA平台，用于展示和调整聚类热图的应用软件。利用该软件可以读取由伯豪在线分析系统(SAS系统)生成的聚类热图文件。

第五步：差异lncRNA的筛选：

筛选参数：倍数差异(Fold Change，FC)，就是将待比较的两个标准化以后的信号相除所得的值；显著性差异P值，即进行统计学t检验，设定P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为强显著性差异；每个探针点的Flag值/Call值，芯片中用A(Absent)，P(Present)，M(Marginal)分别来表示该探针点信号与背景信号无显著性差异、具有显著性差异及差异介于A和P之间。

筛选阈值设定：本研究每组中有6个样本，即生物学重复不少于3个，满足统计学分析要求，故现将筛选阈值根据不同组比较的具体情况定为P＜0.05且FC≥1.5，至少一组内不出现A。

在线打开上海国家生物工程公司(伯豪)SAS系统，针对2组临床样本的比较，采用DiffGene(t检验和SAM检验)方法，以计算两组样品之间每个转录本差异表达的显著性强度；

筛选用于初步扩大临床样本验证的标准是须同时满足以下所有条件：

同时性肝转移组里癌与配对正常肠组织FC≥1.5，且P值＜0.05；

同时性肝转移组与无肝转移组肠癌FC≥1.5，且P值＜0.05；

同时性肝转移组与异时性肝转移组肠癌FC≥1.5，且P值＜0.05；

异时性肝转移组与无肝转移组肠癌P值＜0.05。

在具体筛选目标lncRNA过程中，同时结合临床实际情况，即与存在同时性肝转移的肠癌相比较，无肝转移的肠癌相对代表着结直肠癌的早期，而异时性肝转移的肠癌预后特点则可能介于同时性肝转移与无肝转移两者之间。另外在筛选时，更关注那些在不同肝转移组中表达呈动态变化的目标lncRNA。

分析CLM差异性lncRNA表达谱，本发明发现：与配对的正常肠组织比较，同时性肝转移的肠癌组有270个存在统计学差异的lncRNA(180个上调，90个下调)；与无肝转移肠癌组比较，同时性肝转移肠癌组有948个显著差异的lncRNA(790个上调，158个下调)，而异时性肝转移肠癌组有321个显著差异的lncRNA(274个上调，47个下调)；与异时性肝转移肠癌组比较，同时性肝转移肠癌组有466个显著差异的lncRNA(359个上调，107个下调)。排除其中重复的，最终获取1332个有显著差异的lncRNA。

根据筛选标准(见方法部分)，并结合临床意义，尤其关注在不同肝转移组中呈现动态变化的lncRNA，最终初步筛选出40个可能有潜在研究意义的lncRNA。

第六步：目标lncRNA的验证(Trainging phase)

1、病例选择：

针对Discovery phase中筛选获得的lncRNA，从课题组临床样本库中另随机抽取独立的病例，即同时性肝转移组、异时性肝转移组及无肝转移组各10例，均包括肠癌原发灶及配对的正常肠组织，通过定量PCR验证，以确定与芯片结果一致的lncRNA。

用于验证之前筛选的40个lncRNA的临床病例主要资料(表1-3)

表1-3：用于lncRNA验证阶段的3组病例基本情况

2、验证步骤：包括组织RNA抽提、质控、定量PCR检测，其中组织RNA抽提、质控同第一步，定量PCR检测同第三步。

3、定量PCR结果：

定量PCR验证结果显示，之前筛选获得的40个lncRNA中，有21个lncRNA在各组间的表达与芯片结果不一致，且组间比较均无显著性差异。另外16个lncRNA表达变化与芯片结果一致，但均无统计学意义。其中探针号为TR140014124的lncRNA在肠癌与正常肠组织间以及不同肝转移的肠癌组织间的表达均存在不同程度的显著性差异(图1-5)。

4、目标lncRNA的选择：

分析上述定量PCR的结果，首先剔除与芯片数据完全不一致的lncRNA，再选择在癌与配对正常肠组织之间表达差异或不同肝转移组间表达差异有显著性的lncRNA，最后结合临床实际意义(lncRNA的表达变化可能根据同时性肝转移、异时性肝转移及无肝转移的预后情况呈梯度变化)，选择其中差异最显著的lncRNA作为目标lncRNA，以进一步扩大临床样本验证并结合临床意义分析来最终确定。

第七步：目标lncRNA的确定及临床意义(Validation phases)

将TR140014124序列通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或UCSC数据库(http://www.genome.ucsc.edu/)比对分析，并查阅lncRNA相关数据库，如lncRNAdb(http://www.lncrnadb.org/)等均未发现有正式报道。考虑到该lncRNA是首次在CLM组织样本中通过筛选验证获得，参考肺腺癌转移相关转录本(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)、结肠癌相关的转录物1(Colon cancer associated transcript-1，CCAT-1)等lncRNA命名特点，暂将其命名为lncRNA-CLMAT1(Colorectal liver metastases associated transcript1)。

lncRNA-CLMAT1位于第14号染色体(chr14：101379770-101381326，hg19)，基因序列长度为1557bp，含有2个外显子，转录本序列长度为408nt)。重要的是lncRNA-CLMAT1在各组间的表达差异尤为显著：与配对正常肠组织比较，其肠癌中平均表达水平相对上调2.98倍(t＝2.67，P＝0.01)，且该lncRNA无论在同时性肝转移组与无肝转移组间(t＝3.03，P＝0.007)，还是在同时性与异时性肝转移组间(t＝2.56，P＝0.02)，其相对比均存在显著差异；即使异时性肝转移组与无肝转移组比较，其差异也接近统计学差异(t＝1.75，P＝0.10)。由此强烈提示该lncRNA可能与CLM密切相关，可作为本次课题后续研究的目标lncRNA(该lncRNA序列长度小于2kp，有利于后期实验的进行)，从临床意义分析、体外体内实验等深入探索。

病例选择(用于目标lncRNA临床意义的分析)：为了进一步明确所选择的目标lncRNA与CLM相关，并分析其临床意义(包括与病理特征相关性、是否影响生存预后等)，在课题组样本库另外选取独立的连续90例结直肠癌病例(遵从样本入选标准和排除标准的前提下，保持标本号连续，且均为肠癌组织与配对正常肠组织)，其基本病例病理特征见表1-4。其中30例在获取原发灶肠癌组织时已存在肝转移，将其归结为肝转移组，而另外60例在获取原发灶肠癌组织时并未证实存在肝转移，将其归为非肝转移组。将90例结直肠癌病例就目标lncRNA表达做定量PCR检测，PCR方法同第三步。

目标lncRNA表达与病例临床特征的关系：

癌与配对正常肠组织表达分析：根据定量PCR所获得的ΔCT值分析肠癌与配对正常肠组织表达的差异。

有无肝转移的肠癌表达差异：根据定量PCR所获得的肠癌与配对正常肠组织的相对表达值2^-ΔΔCT(作图时用log10处理)，分析获取原发灶标本时有无伴随肝转移、有无淋巴结转移、肿瘤侵犯层次等病例病理特征与目标lncRNA表达的关系。

高低表达分组分析：将总体90个病例根据目标lncRNA在肠癌与配对正常组织的相对表达值2^-ΔΔCT从低到高进行排列，取前后各45例分为低表达组与高表达组。根据上述分组情况，分析目标lncRNA高低表达与病例性别、年龄、病灶部位、肿瘤大小、分化级别、浸润深度、有无淋巴结转移、癌胚抗原等的关系。

目标lncRNA与病例病理的关系：

分析lncRNA-CLMAT1在90个独立连续病例组织中的定量PCR表达情况。由图1-7可见，CLMAT1在肠癌中的表达显著比配对正常肠组织表达高，相对平均差异倍数为2.16(t＝3.11，P＝0.002)。根据国际抗癌联盟的结直肠癌TNM分期标准，对于每个病例癌与正常肠组织的差异倍数来说，在原发灶侵犯黏膜层或肌层(T1～2)与侵犯浆膜层或穿透浆膜层(T3～4)的病例之间，CLMAT1表达无统计学差异(t＝0.60，P＝0.55)，可能与T1～2的病例数偏少有关；然而与无肝转移的病例相比较，伴有肝转移的病例其CLMAT1差异倍数显著偏高(t＝2.14，P＝0.03)；与原发灶无淋巴结转移(阴性)的病例相比较，伴有淋巴结转移(阳性)的病例其CLMAT1差异倍数也显著偏高(t＝2.13，P＝0.04)。

另外，根据lncRNA-CLMAT1在每个病例癌与配对正常肠组织中所获得的差异倍数大小，将90个数值从小到大排列，取前45个数值所对应的病例归为CLMAT1低表达组，后45个数值所对应的病例归为CLMAT1高表达组，并分析其与临床病理各种特征的相关性(表1-4)，发现性别、年龄、病灶部位、肿瘤大小、肿瘤分化级别、癌胚抗原等与CLMAT1高低表达无显著相关(P＞0.05)。肿瘤浸润深度方面，CLMAT1高低表达与T分期无显著相关(P＝0.21)，这与之前分析的不同T分期间CLMAT1具体表达无差异的结果相一致。相比原发灶淋巴结转移阴性组，lncRNA-CLMAT1高表达的病例更多地分布在淋巴结转移阳性的组中(P＜0.01)。另外，CLMAT1表达差异与有无肝转移也存在密切相关(P＝0.01)，即CLMAT1高表达的病例更多地伴有肝转移。

表1-4：lncRNA-CLMAT1高低表达与结直肠癌临床病理特征的关系

注：*为lncRNA-CLMAT1在各病例中肠癌与配对正常肠组织表达的差异值；**P值是组内卡方检验的结果，＜0.05有统计学意义。

病例随访及生存分析：

1、病例随访：采用门诊、电话及信件随访相结合的方式对本组研究对象进行随访。主要随访复查要点：

病史和体检，抽血监测癌胚抗原、CA199以及腹部超声、胸片检查均每3个月1次，共2年，然后每6个月1次，总共5年，5年后每年1次。

每年进行1次胸腹、盆腔增强CT扫描，共3～5年；疑肝转移的病人应加行MRI检查，PET-CT扫描不常规推荐。

术后1年内肠镜复查，若发现异常，需1年内再复查；否则术后第3年复查。

2、生存时间(OS)定义为从明确诊断为结直肠癌至患者死亡日期，而无论死亡原因如何。对于临床数据库中没有收集到死亡信息的患者，将以最后知晓仍然生存的最近日期为截点。

目标lncRNA对患者生存预后的影响：

本组90个结直肠癌病例的总体中位随访时间为26.3个月，总体中位生存时间(MST)为33.7个月(95％CI：29.53～37.87个月)。其中肝转移组的MST为22.1个月(95％CI：10.23～33.97个月)，非肝转移组的MST为35.2个月(因删失值比率即Censored percent达到60.0％，故无法获得95％CI值)。肝转移组与非肝转移组的2年生存率分别为49％与81％，有显著差异(P＝0.01)。

鉴于临床上肝转移灶根治性手术可显著提高CLM患者的生存时间，故进一步对肝转移组中的病例分析CLMAT1高低表达与有无肝手术的相关性。结果发现CLMAT1高表达组中只有20％的肝转移患者最终获得肝转移灶的手术切除，而CLMAT1低表达组中达到一半的肝转移患者可获得肝手术处理；可能因病例数偏少，统计结果无显著性(P＝0.115)，但其一定程度上提示CLMAT1低表达的CLM患者更有机会获得肝转移灶手术。

应用SPSS 16.0统计软件进行分析，计数资料的比较采用X²检验，计量资料的比较采用t检验。存活率采用寿命表法进行推算，用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并采用Log-Rank法进行比较，用COX逐步回归法进行多因素预后分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

分析CLMAT1高低表达对患者生存预后的影响(图1-7)：与CLMAT1低表达组相比较，CLMAT1高表达的病例人群其生存预后显著不理想(MST：33.7个月vs.30.1个月，2年生存率：81％vs.60％，P＝0.04)，提示lncRNA-CLMAT1高表达的患者其生存预后可能欠佳。进一步将患者年龄是否小于60岁、性别、癌胚抗原、肿瘤大小、分化程度、侵犯程度、有无淋巴结转移、有无肝转移、有无肝转移灶手术及CLMAT1高低表达等病例特征进行多因素分析(逐步剔除法)，结果显示有无肝转移(P＜0.01)与有无肝转移灶手术(P＝0.03)等均是结直肠癌预后显著独立因素，而CLMAT1并不是独立的结直肠癌预后影响因素。

Claims

1.一种长链非编码RNA CLMAT1，该RNA产物是由位于第14号染色体的基因转录产生而来，所述的位于第14号染色体的基因的位置：chr14:101379770- 101381326，hg19；序列长度：1557bp。

2. 检测权利要求1所述的长链非编码RNA CLMAT1的引物或探针在制备预测结直肠癌患者预后、肝转移或淋巴结转移的试剂、试剂盒或基因芯片中的应用。

3. 一种预测结直肠癌患者预后、肝转移或淋巴结转移的定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测权利要求1所述的长链非编码RNA CLMAT1的正向引物：TACACTGACCCCACAGCCTATG和反向引物：CATTTCCCAAGCAGGTTTCC。