CN103993093B - 早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱及诊断模型 - Google Patents

早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱及诊断模型 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱，由表达上调的miR-152，miR-148b-3p，以及表达下调的miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a-3p,miR-30a-5p构成。所述早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如SEQIDNO：1～13所示。本发明还提供了一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型，利用以下公式：logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)计算，用于膀胱癌的早期诊断，经ROC曲线分析，此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学,此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和T1)。

Description

早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱及诊断模型
技术领域
本发明涉及早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱，其逆转录引物和检测引物，以及诊断模型，属于医学诊断技术领域。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在我国其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤的首位，且近年有逐渐上升的趋势。20％-30％的膀胱癌病人初诊时已发生肌层浸润，而在最初诊断为非侵袭性膀胱癌的病人中，约15％的膀胱癌病人五年内发展为侵袭性膀胱癌。因此，早期诊断和早期治疗是改善膀胱癌预后、降低死亡率的关键。目前，用于膀胱癌的诊断方法主要包括膀胱镜、尿脱落细胞学及影像学检查等。膀胱镜检查虽然具有较高的诊断效能，但该检查方法的有创性限制了其在膀胱癌筛查中的广泛应用；尿液脱落细胞学检查虽特异性较高，但敏感性较低，尤其对低分级肿瘤的敏感性仅为20％～40％，且易受监测这主观因素的影响；CT和超声检查不易发现膀胱内较小的病变，对膀胱癌分期预测具有一定的有限性。寻找临敏感性高和特异性高的早期肿瘤标志物，建立一种安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是临床亟待解决的难题。
MicroRNA(miRNAs)是一类广泛分布于真核生物的高度保守的、非蛋白编码的单链小分子RNAs，通过对靶mRNA降解或翻译抑制，在转录后水平调节靶基因的表达，进而调控细胞分化、生长、代谢和凋亡等功能。以往研究证实，miRNAs在肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展、转移和预后存在密切的联系。近年来研究发现，血清中存在丰富且稳定的miRNAs，通过对比分析肿瘤患者和对照组血清中miRNAs表达谱，发现不同肿瘤具有其特定的miRNAs表达谱，为肿瘤的无创性早期诊断提供了新的依据。因此，确定膀胱癌miRNAs特异表达谱，筛选差异表达的miRNAs，建立膀胱癌血清miRNAs诊断模型，有助于实现对膀胱癌的早期诊断。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了膀胱癌患者血清miRNA特异表达谱，及其逆转录引物和检测引物、检测试剂盒，以及诊断模型，为临床上膀胱癌的早期发现和早期治疗提供支持。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种早期膀胱癌miRNAs特异表达谱，由上调表达的miR-152,miR-148b-3p以及下调表达的miR-3187-3p，miR-15b-5p,miR-27a-3p，miR-30a-5p构成。
所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
所述膀胱癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如下：
((1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：1所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：2所示：
SEQIDNO：1：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3’；
SEQIDNO：2：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’；
(2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：3所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：4所示：
SEQIDNO：3：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3’；
SEQIDNO：4：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’；
(3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：5所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：6所示：
SEQIDNO：5：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’；
SEQIDNO：6：5’-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’；
(4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：7所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：8所示：
SEQIDNO：7：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’；
SEQIDNO：8：5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’；
(5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：9所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：10所示：
SEQIDNO：9：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’；
SEQIDNO：10：5’-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’；
(6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：11所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：12所示：
SEQIDNO：11：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’；
SEQIDNO：12：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’；
(7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO：13所示：
SEQIDNO：13：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，包括上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物。
一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型。具体如下：运用以下公式计算：
logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)
公式中的“(miR-152)”、“(miR-148b-3p)”、“(miR-3187-3p)”、“miR-15b-5p)”、“miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分别表示相对应的miRNAs的表达量。
一种利用上述诊断模型诊断的方法，如下：首先，利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物测定待诊断患者的血清中六种miRNAs的表达量，包括miR-152，miR-148b-3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p,miR-27a-3p和miR-30a-5p，然后，运用下述公式计算：
logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)
将六种miRNAs的表达量分别输入Matlab软件(该软件为所属领域的常规软件，为现有技术中已有的软件)，若logit(P＝BC)为1，可以判断为膀胱癌；若logit(P＝BC)为0，判断为非膀胱癌。
本发明首先基于临床常规收集的非侵袭性膀胱癌患者、侵袭性膀胱癌患者及对照者血清样本筛查差异表达miRNAs的技术路径，采用“miRNAscDNA文库+文库预扩增+Miseq深度测序”的研究策略，对三组血清标本中miRNAs表达谱进行了比对分析，共筛查出26个差异表达miRNAs，序列见表1。然后采用SYBRGreen的逆转录-实时荧光定量PCR方法，对上述26个差异表达miRNAs在膀胱癌患者及对照血清中的表达丰度进行验证，最终确定了与膀胱癌相关的6个miRNAs，包括表达上调的miR-152,miR-148b-3p以及下调表达的miR-3187-3p，miR-15b-5p,miR-27a-3p，miR-30a-5p，且自主设计了其反转录引物和前向反向检测引物，具体见表2。进而，提供了一种诊断膀胱癌的血清miRNAs表达模型：利用多元logistic回归方法提供了一种膀胱癌血清miRNAs诊断模型的计算公式：
logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)
ROC曲线分析显示，此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学，此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和T1)。
附图说明
图1：六种miRNAs在膀胱癌组和对照组中的表达，其中，A：miR-152；B：miR-148b-3p；C：miR-3187-3p；D：miR-15b-5p；E：miR-27a-3p；F：miR-30a-5p。
图2：六种miRNAs对膀胱癌的诊断ROC曲线，其中，A：miR-152；B：miR-148b-3p；C：miR-3187-3p；D：miR-15b-5p；E：miR-27a-3p；F：miR-30a-5p。
图3：建立的诊断模型(panel)及尿液脱落细胞学对膀胱癌的诊断ROC曲线。
图4：建立的诊断模型对不同分期膀胱癌的诊断ROC曲线，其中，A：Ta；B：T1；C：T2-T4。
图2、3、4中，横坐标：特异性；纵坐标：敏感性。
具体实施方式
以下结合实施例和实验对本发明作详细的说明。
实施例一
1、研究对象
血清标本共来自经受试者同意的175例膀胱癌患者(BC)和165例排除泌尿系肿瘤的对照者。所有膀胱癌患者均来自山东大学齐鲁医院(以下称本院)泌尿外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经膀胱镜检查或术后病理检查确认。对照者包括37名前列腺良性增生患者，25名尿路结石患者，19名膀胱炎患者和84名健康者。其中，获取75名膀胱癌患者、16名前列腺良性增生患者、13名尿路结石患者、8名膀胱炎患者和38名健康者的尿液标本。所有血清和尿液标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。
2、标本采集
采集血清3ml，立即1600g离心5分钟，然后16000g离心10分钟，将分离上清液保存于-80℃待测。取3μl分离上清液与3μlRNA分离液混合，16000g离心10分钟，分离上清，将上清1:10稀释用于逆转录模板。留取中段尿15ml，立即1300g离心10min，取沉渣瑞氏染色进行尿液脱落细胞学检查。
4、文库构建和Miseq测序
取冻存样本于常温下解冻，按miRNeasyMiniKit试剂盒(Qiagen公司)操作者说明提取血清总RNA，总RNA浓缩后经T4RNA连接酶作用，分别连接3’-linker和5’-linker，然后通过RT-PCR技术扩增建库。使用KAPAqPCR试剂盒检测文库，若qPCR浓度大于1nM且无dimer污染则确定为检测合格。文库检测符合要求后，通过Miseq测序仪进行深度测序分析。比对分析测序后获得的序列和miRNA数据库(miRBase17.0)中人miRNA序列，获取三组样本已知miRNA的表达丰度。
5、RT-qPCR
使用One StepmiRNA cDNA SynthesisKit逆转录试剂盒(Takara公司)反转录上述mRNA成cDNA，再进行PCR反应，运行于ABI7500实时荧光定量PCR分析仪(ABI公司)。
PCR反应体系(25μl)：
模板DNA：2ul
SYBRPremixExTaqⅡ：12.5μl
DyeⅡ：0.5μl
上游引物(10μM)：1μl
下游引物(10μM)：1μl
无菌水：8μl
反应条件为：95℃30秒→1个循环；(95℃5秒，57℃34秒)→45个循环；添加溶解曲线。
每个标本均重复测定三次，miRNA表达量采用2-△△Ct进行分析。
6、数据处理与统计学分析
通过SPSS17.0软件对数据进行统计学分析，使用Mann-WhitneyU非参数检验比较两组样本间miRNAs的浓度差异，P<0.05被认为具有统计学差异。经多元logistic回归分析建立miRNAs诊断模型和计算公式，诊断模型的诊断效能采用ROC曲线及曲线下面积AUC分析。
7、检测结果
1)经Miseq测序分析，膀胱癌组与对照组对比共得到26个差异表达的miRNAs(入选标准：在任一组中拷贝数大于50；在膀胱癌组与对照组的表达量差异大于2倍)，其中上调的包括miR-24-3p,miR-128,miR-98,miR-148b-3p,miR-152,miR-30d-5p,miR-1294和let-7c，下调的包括miR-484,let-7b-5p,let-7a-5p,miR-30a-5p,miR-181b-5p,miR-1228-5p,miR-181a-5p,miR-27a-3p,miR-3135b,miR-3187-3p,miR-185-5p,miR-15a-5p,miR-15b-5p,miR-92b-5p,miR-342-3p,miR-148a-3p,miR-501-3p,和let-7i-5p。序列如表1所示(如SEQIDNO：14～39所示)。
表1 测序筛出的差异miRNAs序列
2)上述26个miRNAs经RT-qPCR验证，以平均Cq值小于35且检测率大于75％；在膀胱癌组和对照组表达差异具有统计学意义，即P<0.05为入选标准，共确定出6个差异表达的miRNAs，包括miR-152，miR-148b-3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p和miR-30a-5p。检测引物为自主设计，其序列及Tm值如表2所示(如SEQIDNO：1～13所示)。
表2 引物序列
3)如图1所示，miR-152和miR-148b-3p在膀胱癌组表达显著增高，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p和miR-30a-5p表达显著降低。建立上述6个miRNAs各自诊断膀胱癌的ROC曲线，如图2所示。
4)将上述6个miRNAs带入多元logistic回归分析，建立联合诊断模型。计算公式为：logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)。经ROC曲线分析，此模型对膀胱癌的诊断效能AUC为0.919，敏感性和特异性分别为94.67％和82.67％，高于传统的尿液脱落细胞学(AUC为0.653，P<0.001)，如图3所示。
5)利用该诊断模型对膀胱癌分期为Ta，T1，T2-T4的患者进行分析，其诊断Ta，T1，T2-T4患者的AUC分别为0.879，0.908和0.952，如图4所示。说明该模型能够实现对膀胱癌的早期诊断。

Claims (4)

1.一种早期膀胱癌miRNAs检测试剂盒，其特征在于：包括：上调表达的miR-152，miR-148b-3p，以及下调表达的miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p，miR-30a-5p相应逆转录引物、检测引物。
2.根据权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs检测试剂盒，其特征在于：所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
3.权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs检测试剂盒中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，其特征在于：包括以下引物：
(1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：2所示：
SEQ ID NO：1：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3’；
SEQ ID NO：2：
5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’；
(2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：3所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：4所示：
SEQ ID NO：3：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3’；
SEQ ID NO：4：
5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’；
(3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：5所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：6所示：
SEQ ID NO：5：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’；
SEQ ID NO：6：
5’-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’；
(4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：8所示：
SEQ ID NO：7：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’；
SEQ ID NO：8：
5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’；
(5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：9所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：10所示：
SEQ ID NO：9：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’；
SEQ ID NO：10：
5’-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’；
(6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：11所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：12所示：
SEQ ID NO：11：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’；
SEQ ID NO：12：
5’-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’；
(7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQ ID NO：13所示：
SEQ ID NO：13：
5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
4.一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，其特征在于：包括特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如下：
(1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：2所示：
SEQ ID NO：1：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3’；
SEQ ID NO：2：
5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’；
(2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：3所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：4所示：
SEQ ID NO：3：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3’；
SEQ ID NO：4：
5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’；
(3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：5所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：6所示：
SEQ ID NO：5：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’；
SEQ ID NO：6：
5’-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’；
(4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：8所示：
SEQ ID NO：7：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’；
SEQ ID NO：8：
5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’；
(5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：9所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：10所示：
SEQ ID NO：9：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’；
SEQ ID NO：10：
5’-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’；
(6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：11所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：12所示：
SEQ ID NO：11：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’；
SEQ ID NO：12：
5’-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’；
(7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQ ID NO：13所示：
SEQ ID NO：13：
5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
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