CN104877992A - 一种microRNA-30a-5p的检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种microRNA-30a-5p的检测试剂盒和检测方法。本发明公开了SEQ ID NO：1～3所示的引物，以及它们的用途和由它们制备的检测microRNA-30a-5p的试剂盒。本发明检测试剂盒和检测方法可以有效检测microRNA-30a-5p，特异性强、灵敏度高、稳定性好，检测快速，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌的检测技术，特别是microRNA-30a-5p的检测试剂盒和检测方法。
背景技术
肿瘤的诊断主要依靠病理学、影像学及血清学证据，而目前常用的肿瘤标志物在敏感度、特异性、费用方面存在一些不足，而近年来学者们对miRNA的深入研究为肿瘤诊断提供了新的切入点。研究发现，microRNA-30a-5p的表达水平与肿瘤相关，可用于肿瘤的诊断。
然而，目前通过PCR检测microRNA-30a-5p的表达水平的方法存在扩增效率低、出现非特异性产物几率较高等问题，大大影响结果的真实性和可靠性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的microRNA-30a-5p的检测试剂盒和检测方法。
本发明提供了SEQ ID NO：1～3所示的引物对。
本发明还提供了SEQ ID NO：1～2所示的引物在制备检测microRNA-30a-5p的试剂中的用途。
所述试剂还包括SEQ ID NO：3所示引物。
本发明还提供了一种检测microRNA-30a-5p的试剂盒，包含序列如SEQID NO：1～2所示的引物。
所述试剂盒还包括SEQ ID NO：3所示引物。
本发明还提供了一种检检测血浆中microRNA-30a-5p含量的方法，包括如下步骤：
a，提取样本RNA：提取待检样本中的RNA；
b，基因扩增：用前述的试剂盒对待检样本中的RNA进行逆转录和PCR扩增；
c，结果检测：对扩增结果进行检测。
综上，本发明检测试剂盒和检测方法可以有效检测microRNA-30a-5p，特异性强、扩增效率高、灵敏度高、稳定性好，检测快速，可用于肿瘤检查，具有良好的应用前景。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1肺癌组织2中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图2肺癌组织2中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图3正常肺组织2中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图4正常肺组织2中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图5肺癌组织3中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图6肺癌组织3中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图7正常肺组织3中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图8正常肺组织3中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图9肺癌组织4中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图10肺癌组织4中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图11正常肺组织4中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图12正常肺组织4中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图13肺癌组织5中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图14肺癌组织5中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图15正常肺组织5中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图16正常肺组织5中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图17肺癌患者血浆1中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图18肺癌患者血浆1中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图19正常人血浆1中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图20正常人血浆1中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图21肺癌患者血浆2中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图22肺癌患者血浆2中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图23正常人血浆2中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图24正常人血浆2中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图25肺癌患者血浆3中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图26肺癌患者血浆3中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图27正常人血浆3中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图28正常人血浆3中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图29肺癌患者血浆4中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图30肺癌患者血浆4中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图31正常人血浆4中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图32正常人血浆4中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图33肺癌组织2中U6外参含量的扩增曲线
图34肺癌组织2中U6外参含量的熔解曲线
图35正常肺组织2中U6外参含量的扩增曲线
图36正常肺组织2中U6外参含量的熔解曲线
图37肺癌组织3中U6外参含量的扩增曲线
图38肺癌组织3中U6外参含量的熔解曲线
图39正常肺组织3中U6外参含量的扩增曲线
图40正常肺组织3中U6外参含量的熔解曲线
图41肺癌组织4中U6外参含量的扩增曲线
图42肺癌组织4中U6外参含量的熔解曲线
图43正常肺组织4中U6外参含量的扩增曲线
图44正常肺组织4中U6外参含量的熔解曲线
图45肺癌组织5中U6外参含量的扩增曲线
图46肺癌组织5中U6外参含量的熔解曲线
图47正常肺组织5中U6外参含量的扩增曲线
图48正常肺组织5中U6外参含量的熔解曲线
图49肺癌患者血浆1U6外参含量的扩增曲线
图50肺癌患者血浆1U6外参含量的熔解曲线
图51正常人血浆1U6外参含量的扩增曲线
图52正常人血浆1U6外参含量的熔解曲线
图53肺癌患者血浆2U6外参含量的扩增曲线
图54肺癌患者血浆2U6外参含量的熔解曲线
图55正常人血浆2U6外参含量的扩增曲线
图56正常人血浆2U6外参含量的熔解曲线
图57肺癌患者血浆3U6外参含量的扩增曲线
图58肺癌患者血浆3U6外参含量的熔解曲线
图59正常人血浆3U6外参含量的扩增曲线
图60正常人血浆3U6外参含量的熔解曲线
图61肺癌患者血浆4U6外参含量的扩增曲线
图62肺癌患者血浆4U6外参含量的熔解曲线
图63正常人血浆4U6外参含量的扩增曲线
图64正常人血浆4U6外参含量的熔解曲线
图65肺癌患者血浆1中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图66肺癌患者血浆1中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图67肺癌患者血浆2中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图68肺癌患者血浆2中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图69肺癌患者血浆3中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图70肺癌患者血浆3中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图71肺癌患者血浆4中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图72肺癌患者血浆4中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图73肺癌患者血浆5中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图74肺癌患者血浆5中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图75肺癌患者血浆6中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图76肺癌患者血浆6中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图77肺癌患者血浆7中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图78肺癌患者血浆7中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图79肺癌患者血浆8中microRNA-30a-5p含量的扩增曲线
图80肺癌患者血浆8中microRNA-30a-5p含量的熔解曲线
图81肺癌患者血浆1中U6外参含量的扩增曲线
图82肺癌患者血浆1中U6外参含量的熔解曲线
图83肺癌患者血浆2中U6外参含量的扩增曲线
图84肺癌患者血浆2中U6外参含量的熔解曲线
图85肺癌患者血浆3中U6外参含量的扩增曲线
图86肺癌患者血浆3中U6外参含量的熔解曲线
图87肺癌患者血浆4中U6外参含量的扩增曲线
图88肺癌患者血浆4中U6外参含量的熔解曲线
图89肺癌患者血浆5中U6外参含量的扩增曲线
图90肺癌患者血浆5中U6外参含量的熔解曲线
图91肺癌患者血浆6中U6外参含量的扩增曲线
图92肺癌患者血浆6中U6外参含量的熔解曲线
图93肺癌患者血浆7中U6外参含量的扩增曲线
图94肺癌患者血浆7中U6外参含量的熔解曲线
图95肺癌患者血浆8中U6外参含量的扩增曲线
图96肺癌患者血浆8中U6外参含量的熔解曲线
具体实施方式
一、实验材料和仪器
提取血浆RNA的试剂：Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,US),
提取肺组织RNA的试剂：Trizol(Invitrogen)和RNeasy mini kit(QIAGEN)
逆转录试剂盒K1622RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit：MBI公司
RNASE-free H20：MBI公司
SYBR Green：Bio-Rad
qRT-PCR仪器IQ5Real-time PCR system(Bio-Rad,Hercules,CA)
引物合成锐博(Guangzhou,China)
实施例1microRNA-30a-5p表达量检测方法的建立
1、PCR引物设计与合成
microRNA-30a-5p序列(5'--3')：UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG
引物序列(5'--3')：
逆转录引物：
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGcttccagt(SEQ IDNO：1)
PCR上游引物：CCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC(SEQ ID NO：2)
通用下游引物：CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT(SEQ ID NO：3)
2、检测方法
2.1组织前处理
血浆标本：SDS预处理：将血浆和10％SDS溶液进行1：1混合，4℃条件下孵育1h，加入等体积的Trizol到样本中，在震荡器上充分混匀，冰上放置30min。
组织标本：液氮磨碎后，加入Trizol匀浆，每50-100mg组织需要1mlTRIZOL，在震荡器上充分混匀，冰上放置过夜。
2.2RNA提取
在前述处理后的血样本中，加入1/5体积氯仿，震荡器上充分混匀15s，冰上放置15-20min，在4℃条件下，12000×g离心15min，留上清。加等体积异丙醇，混匀，-20℃1h以上。12000×g4℃离心15min，弃上清。加入75％乙醇洗涤沉淀，12000×g4℃离心15min，弃上清。将沉淀晾干，加入DEPC H20，使其溶解，得到血浆RNA样品。
2.3逆转录(RT)25uL体系(以U6为外参)
采用前述逆转录引物和逆转录试剂盒K1622RevertAidFirst StrandcDNA Synthesis Kit进行逆转录：
15ul RNA+2ul反转录引物，混匀后瞬时离心。70℃放置10min，冰育2min。
加入RT buffer 5x 5ul，DNTP mix(2.5Mm)2uL，RNASEinhibitor(40U/uL)0.5uL，RT酶(200U/uL)0.5uL。42℃1h，72℃10min。
2.4qPCR 20uL反应体系
取2uL逆转录产物用于实时定量荧光PCR反应，反应体系如下：
10uL SYBR Green Mix+2uL RT产物+1uL miRNA上游引物(5uM)+1uL miRNA下游引物(5uM)+6uL RNASE-free H20。
反应条件：95℃10min，95℃10S，60℃20s，72℃10s，共40个循环。
以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：
实验例1本发明方法的验证
一、检测
用实施例1的方法检测肿瘤组织、肿瘤患者血浆以及正常组织、正常人血浆中的microRNA-30a-5p。
以市售的microRNA-30a-5p检测引物作为对照，按照实施例1的方法进行检测。
对照的引物如下：
逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTCCAGT
PCR上游引物：GGCGGCGGTGTAAACATCC 3'
PCR下游引物：CCAGAGCAGGGTCCGAGGT 3'
二、检测结果
1、用本发明引物的扩增结果
结果如图1～64以及如下表1～2所示：
表1组织中microRNA-30a-5p的检测结果
| 样本名称 | microRNA-30a-5p的Ct值 | 外参U6的Ct值 |
| 肺癌组织2 | 18.60 | 24.81 |
| 肺癌组织2 | 18.63 | 24.79 |
| 肺癌组织2 | 18.58 | 24.78 |
| 正常肺组织2 | 17.92 | 24.32 |
| 正常肺组织2 | 17.92 | 24.26 |
| 正常肺组织2 | 17.90 | 24.28 |
| 肺癌组织3 | 18.81 | 23.81 |
| 肺癌组织3 | 18.85 | 23.88 |
| 肺癌组织3 | 18.84 | 23.85 |
| 正常肺组织3 | 16.15 | 23.95 |
| 正常肺组织3 | 16.08 | 24.02 |
| 正常肺组织3 | 16.15 | 24.01 |
| 肺癌组织4 | 18.88 | 23.29 |
| 肺癌组织4 | 18.95 | 23.44 |
| 肺癌组织4 | 18.98 | 23.42 |
| 正常肺组织4 | 16.34 | 25.26 |
| 正常肺组织4 | 16.29 | 25.25 |
| 正常肺组织4 | 16.26 | 25.21 |
| 肺癌组织5 | 17.90 | 25.13 |
| 肺癌组织5 | 17.95 | 25.10 |
| 肺癌组织5 | 17.92 | 25.07 |
| 正常肺组织5 | 16.97 | 24.98 |
| 正常肺组织5 | 16.90 | 24.98 |
| 正常肺组织5 | 16.90 | 25.09 |
表2血液中microRNA-30a-5p的检测结果
| 样本名称 | microRNA-30a-5p的Ct值 | U6外参的Ct值 |
| 肺癌患者血浆1 | 27.22 | 23.13 |
| 肺癌患者血浆1 | 27.43 | 23.17 |
| 肺癌患者血浆1 | 27.43 | 23.12 |
| 正常人血浆1 | 29.00 | 23.10 |
| 正常人血浆1 | 29.04 | 23.09 |
| 正常人血浆1 | 28.93 | 23.09 |
| 肺癌患者血浆2 | 26.70 | 21.99 |
| 肺癌患者血浆2 | 26.81 | 21.99 |
| 肺癌患者血浆2 | 26.72 | 21.97 |
| 正常人血浆2 | 28.73 | 23.99 |
| 正常人血浆2 | 28.61 | 24.06 |
| 正常人血浆2 | 28.69 | 24.01 |
| 肺癌患者血浆3 | 27.60 | 22.53 |
| 肺癌患者血浆3 | 27.76 | 22.58 |
| 肺癌患者血浆3 | 27.63 | 22.56 |
| 正常人血浆3 | 26.74 | 21.52 |
| 正常人血浆3 | 26.72 | 21.55 |
| 正常人血浆3 | 26.71 | 21.56 |
| 肺癌患者血浆4 | 26.25 | 23.16 |
| 肺癌患者血浆4 | 26.49 | 23.15 |
| 肺癌患者血浆4 | 26.46 | 23.17 |
| 正常人血浆4 | 27.42 | 20.86 |
| 正常人血浆4 | 27.42 | 20.94 |
| 正常人血浆4 | 27.30 | 20.91 |
可以看出，用本发明引物检测组织和血液中的microRNA-30a-5p时：
(1)熔融曲线上，都只有1个峰，说明本发明引物的特异性好，无非特异性扩增；
(2)扩增的Ct值均小于30，说明扩增是有效的，而且Ct较小，说明扩增效率高，灵敏度高；
(3)同一样本重复检测时，Ct值变化非常小，说明稳定性好。
实验结果说明，采用本发明引物检测样本中的microRNA-30a-5p时，特异性好，扩增效率高，灵敏度高，稳定性好，可以准确检测待检测本中的microRNA-30a-5p。
2、对照引物的扩增结果
结果如图65～96以及如下表3所示：
表3血液中microRNA-30a-5p的检测结果
| 样本名称 | microRNA-30a-5p的Ct值 | 外参U6的Ct值 |
| 肺癌患者血浆1 | 35.28 | 28.62 |
| 肺癌患者血浆2 | 34.58 | 29.98 |
| 肺癌患者血浆3 | 35.98 | 28.56 |
| 肺癌患者血浆4 | 35.23 | 31.58 |
| 肺癌患者血浆5 | 34.82 | 28.74 |
| 肺癌患者血浆6 | 35.99 | 30.35 |
| 肺癌患者血浆7 | 33.27 | 27.13 |
| 肺癌患者血浆8 | 34.54 | 28.79 |
可以看出，用对照1的引物检测血液中的microRNA-30a-5p时：
(1)检测microRNA-30a-5p时，熔融曲线(melting peaks)上均有多个峰，说明其出现了非特异性扩增，特异性差；
(2)扩增microRNA-30a-5p的Ct值均大于30，说明microRNA-30a-5p扩增效率非常低，难以有效检测。
实验结果说明，采用对照的引物检测样本中的microRNA-30a-5p时，特异性差，扩增效率非常低，难以有效检测。
综上，本发明检测试剂盒和检测方法可以有效检测microRNA-30a-5p，特异性强、扩增效率高、灵敏度高、稳定性好，检测快速，可用于肿瘤检查，具有良好的应用前景。
Claims (6)
1.SEQ ID NO：1～3所示的引物。
2.SEQ ID NO：1～2所示的引物在制备检测microRNA-30a-5p的试剂中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述试剂还包括SEQID NO：3所示引物。
4.一种检测microRNA-30a-5p的试剂盒，其特征在于：它包含SEQ IDNO：1～2所示的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：它还包括SEQ ID NO：3所示引物。
6.一种检测血浆中microRNA-30a-5p含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a，提取样本RNA：提取待检样本中的RNA；
b，基因扩增：用权利要求4或5所述的试剂盒对待检样本中的RNA进行逆转录和PCR扩增；
c，结果检测：对扩增结果进行检测。
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