CN107779504A

CN107779504A - 结直肠癌microRNA分子标志物及其用途

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Publication number: CN107779504A
Application number: CN201610720090.0A
Authority: CN
Inventors: 贾宝庆; 刘洪�; 刘洪一; 张卫红; 李冰; 靳文静; 李鹏; 宋高尚; 郭少华; 刘欣欣
Original assignee: BEIJING QUANTOBIO BIOTECH Co Ltd
Current assignee: BEIJING QUANTOBIO BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2016-08-24
Filing date: 2016-08-24
Publication date: 2018-03-09
Anticipated expiration: 2036-08-24
Also published as: CN107779504B

Abstract

本发明提供一种结直肠癌microRNA分子标志物组合，包括一种以上选自以下的microRNA核酸分子：miR‑21‑3p、miR‑877‑5p、miR‑181d、miR‑202‑3p、miR‑19b‑3p、miR‑380‑5p、miR‑1246、miR‑627、miR‑451a、miR‑339‑5p、miR‑520e、miR‑21‑5p和miR‑532‑3p，及其在制备结直肠癌诊断试剂中的用途以及结直肠癌的诊断试剂盒。结直肠癌患者microRNA分子标志物在血浆/血清中的含量与结直肠息肉患者、健康对照血浆/血清中相比，存在显著差异。使用本发明的分子标志物指导诊断具有高灵敏性，高特异性等特点。

Description

结直肠癌microRNA分子标志物及其用途

技术领域

本发明涉及结直肠癌的诊断领域，具体来说涉及一组结直肠癌microRNA分子标志物组合，其可应用于对结直肠癌的诊断和疗效及预后评估。通过结直肠癌诊断，及时地发现并治疗结直肠癌，对于结直肠癌的病情控制和治愈是十分有帮助的。对于结直肠癌患者而言，增加诊断的准确性，可确定针对性的防治方案，并对疗效及预后进行评估，极大的提高其临床治愈率和长期存活率。可应用于肿瘤疑似病人的早期诊断，以及确诊病人的治疗以及跟踪。

背景技术

microRNA(miRNA)是近年来的研究热点，它是一种广泛存在于真核生物中的单链小分子RNA，不具编码功能，但它能够结合于基因序列的侧翼区域阻遏或抑制靶mRNA的翻译，具有高度的保守性、时序性和组织特异性，目前在肿瘤、血液病、病毒感染等多种疾病的临床诊断、治疗及预后评价等领域发挥了重要作用。

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。美国2012年统计报告显示，无论男性还是女性，结直肠癌的发病率及死亡率均位居第三位，2012年预计新发病例超过14万，预计死亡病例超过5万。在欧洲，2008年新发的结直肠癌病例超过43万是所有新发肿瘤第一位，约占13.6％；死亡病例约占所有肿瘤的12.2％，仅次于肺癌为第二位肿瘤常见死亡原因。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率目前居第4位，根据2012年北京肿瘤生物中心数据，我国结直肠癌的发病率年增长速度增至5％，每年新发病例高达40万人。

结直肠癌患者生存期的长短与临床分期密切相关，发现越早，治愈的机率就越大。如能早期治疗,5年生存率可达70-95％；中期治疗，五年存活率约为50-60％，但是晚期治疗5年生存率仅5-10％。因此早期发现和早期治疗至关重要。绝大多数癌症患者在患病早期，要么感觉不到任何症状，要么症状轻微，易被忽视；等病情进展到症状明显而不得不就医时，往往已经错过了最佳治疗时机，需采取综合治疗，治疗费用明显增加，治疗副反应增加，而且治疗效果差，5年生存率显著下降。

筛查和早期诊断是改善结直肠癌患者预后的主要方法之一。大多数结直肠癌的发生发展是一个多阶段、多步骤、多因素、多基因参与的复杂过程，是外在环境因素和机体内在的遗传因素相互作用的结果。

近年来，关于结直肠癌miRNA标志物的研究较多，但主要集中在结直肠癌组织与正常结直肠组织的miRNA差异表达，血清/血浆miRNA差异表达研究较少，在临床和研究中，需寻找可有效判断结直肠癌的microRNA标志物，特别是用于将结直肠癌与息肉等良性疾病区别开来的microRNA标志物。

发明内容

本发明的一个方面提供了一种结直肠癌microRNA分子标志物组合，其包括一种以上选自以下的microRNA核酸分子：miR-21-3p、miR-877-5p、miR-181d、miR-202-3p、miR-19b-3p、miR-380-5p、miR-1246、miR-627、miR-451a、miR-339-5p、miR-520e、miR-21-5p和miR-532-3p。

优选地，所述的一种以上为1-13种、更优选2-8种。

本发明提供了一组新的与结直肠癌相关的microRNA作为结直肠癌的分子标志物，由一组microRNA组成，其序列分别选自如下所示的一种以上。

microRNA名称	microRNA序列
		miR-21-3p	caacaccagucgaugggcugu(SEQ ID NO.:1)
miR-877-5p	guagaggagauggcgcaggg(SEQ ID NO.:2)
		miR-181d	aacauucauuguugucggugggu(SEQ ID NO.:3)
miR-202-3p	agagguauagggcaugggaa(SEQ ID NO.:4)
		miR-19b-3p	ugugcaaauccaugcaaaacuga(SEQ ID NO.:5)
miR-380-5p	ugguugaccauagaacaugcgc(SEQ ID NO.:6)
		miR-1246	aauggauuuuuggagcagg(SEQ ID NO.:7)
miR-627	gugagucucuaagaaaagagga(SEQ ID NO.:8)
		miR-451a	aaaccguuaccauuacugaguu(SEQ ID NO.:9)
miR-339-5p	ucccuguccuccaggagcucacg(SEQ ID NO.:10)
		miR-520e	aaagugcuuccuuuuugaggg(SEQ ID NO.:11)
miR-21-5p	uagcuuaucagacugauguuga(SEQ ID NO.:12)
		miR-532-3p	ccucccacacccaaggcuugca(SEQ ID NO.:13)

在一个优选的实施方案中，所述的至少一种microRNA在至少一种靶血浆/血清中与在至少一种对照血浆/血清中差异表达。

优选地，所述的靶血浆/血清来自结直肠癌患者，所述的对照血浆/血清来自结直肠息肉患者和健康对照。

在更加优选的实施方案中，所述的至少一种microRNA在至少一种靶血浆/血清中的表达与至少一种对照血浆/血清中的表达相比被上调，和/或其中的microRNA在至少一种靶血浆/血清中的表达与至少一种对照血浆/血清中的表达相比被下调。

发明人发现，结直肠癌中microRNA分子标志物在结直肠癌患者血浆/血清中的含量相比结直肠息肉患者和健康对照，存在显著差异，可有效区分结直肠癌和结直肠癌息肉，由此可见，结直肠癌microRNA分子标志物表达水平与结直肠息肉的病程发展密切相关。

在上述发现的基础上，本发明提供了结直肠癌microRNA分子标志物组合在制备结直肠癌的诊断试剂中的用途。

因此，本发明的第二方面提供了一种结直肠癌microRNA分子标志物组合在制备结直肠癌诊断试剂中的用途。优选地，所述的诊断将结直肠癌与结直肠息肉区分开来。

具体地，所述诊断试剂通过检测被试者血浆/血清中结直肠癌microRNA分子标志物的含量，并与结直肠息肉患者和健康对照平均水平相比较来诊断结直肠癌，其中，结直肠癌microRNA分子标志物在结直肠癌患者血浆/血清中的含量相比结直肠息肉患者和健康对照，存在显著差异，优选地，这种差异可以是后者比前者差异性升高，也可以是差异性降低。在一个特定的实施方案中，使用定量PCR的方法来检测被试者血浆/血清中结直肠癌microRNA分子标志物含量。

本发明的第三方面提供了一种诊断试剂盒，其包括所述结直肠癌microRNA分子标志物组合的特异性正向引物。

优选地，所述的特异性正向引物包括一种以上选自以下序列的引物：miR-21-3p、miR-877-5p、miR-181d、miR-202-3p、miR-19b-3p、miR-380-5p、miR-1246、miR-627、miR-451a、miR-339-5p、miR-520e、miR-21-5p和miR-532-3p。

所述的诊断试剂盒还进一步包括：

(1)血浆/血清总RNA提取试剂，

(2)RNA加polyA试剂，

(3)RT-PCR试剂，

(4)定量PCR试剂，

其中，定量PCR试剂中包括所述结直肠癌microRNA分子标志物组合的特异性正向引物。

优选地，所述血浆总RNA提取试剂中包括序列为EC-1的外部控制序列-1(ExternalControl-1)，所述RNA加polyA试剂中包括序列为EC2的外部控制序列-2(ExternalControl-2)，所述RT-PCR试剂中包括序列为RT-Primer的反转录引物(RT-Primer)。

优选地，所述定量PCR试剂中包括序列分别为UPM-short和UPM-long的通用反向引物UPM-short和UPM-long。

本发明的第四个方面提供了所述的诊断试剂盒用于结直肠癌的诊断的用途，优选地，所述的用途用以区别结直肠癌和结直肠息肉、健康对照的诊断。

本发明定量PCR试剂中包括结直肠癌microRNA分子标志物的特异性正向引物，优选地，其序列如下所示。

microRNA名称	引物序列
		miR-21-3p	GCAACACCAGTCGATGGG(SEQ ID NO.:19)
miR-877-5p	GTAGAGGAGATGGCGCAG(SEQ ID NO.:20)
		miR-181d	GGGGAACATTCATTGT(SEQ ID NO.:21)
miR-202-3p	GAGAGGTATAGGGCATGG(SEQ ID NO.:22)
		miR-19b-3p	GGGGTGTGCAAATCCAT(SEQ ID NO.:23)
miR-380-5p	GGTTGACCATAGAACATGC(SEQ ID NO.:24)
		miR-1246	GGAATGGATTTTTGGAGCA(SEQ ID NO.:25)
miR-627	GGTGAGTCTCTAAGAAAAG(SEQ ID NO.:26)
		miR-451a	ACCGTTACCATTACTGAG(SEQ ID NO.:27)
miR-339-5p	TCCCTGTCCTCCAGGAGC(SEQ ID NO.:28)
		miR-520e	GAAAGTGCTTCTCTTTTGA(SEQ ID NO.:29)
miR-21-5p	GCTTATCAGACTGATGTTG(SEQ ID NO.:30)
		miR-532-3p	CTCCCACACCCAAGGCT(SEQ ID NO.:31)

在一个特定的实施方案中，所述血浆/血清总RNA提取试剂中包括序列为5’-CAACCTCCTAGAAAGAGTA-3’(SEQ ID NO.:14)(EC1)的External Control-1；所述RNA加polyA试剂中包括序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-2’(SEQ ID NO.:15)(EC2)的External Control-2；所述RT-PCR试剂中包括序列为

5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(SEQ IDNO.:16)(RT-Primer)的RT-Primer(其中，V为A或C或G，N为A或T或C或G)；所述定量PCR试剂中包括序列分别为

5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’(SEQ ID NO.:17)(UPM-short)和

5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’(SEQ ID NO.:18)(UPM-long)的通用反向引物UPM-short和UPM-long。

使用本发明的结直肠癌microRNA分子标志物诊断结直肠癌具有操作简单，安全无创伤，高灵敏性，高特异性以及易于大量筛查的特点。

附图说明

图1为在结直肠癌和结直肠息肉患者中，利用Spss作图软件，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标、假阳性率(1-特异性)为横坐标，绘制ROC(receiver operatingcharacteristic)曲线，13条相关的miRNA及miRNA组合的结果，miRNA组合AUC(曲线下面积)达到0.990，说明本发明的结直肠癌microRNA分子标志物可有效区分结直肠癌患者和结直肠息肉患者。

图2为在结直肠癌和健康对照中，利用Spss作图软件，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标、假阳性率(1-特异性)为横坐标，绘制ROC(receiver operating characteristic)曲线，13条相关的miRNA及miRNA组合的结果，miRNA组合AUC(曲线下面积)达到0.985，说明本发明的结直肠癌microRNA分子标志物可有效区分结直肠癌患者和健康对照。

具体实施方式

如本发明所述，microRNA或者miRNA具有其在本领域中的普通含义(例如见CN102943108A)。也就是说，microRNA表示来自遗传基因位点的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体microRNA结构的转录物加工而来。成熟microRNA通常长度为20、21、22、23、24、或25个核苷酸，尽管其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26、27或28个核苷酸。

如本发明所述，“一种以上”表示1-13种之间，优选2-8种。

如本发明所述，结直肠癌诊断依据《结直肠癌诊疗规范(2015版)》，结合临床表现、实验室检查、影象学检查和病理学检查诊断，并进行TNM分期，需与肠炎、息肉等鉴别。

如本发明所述，结直肠息肉诊断依据《结直肠癌诊疗规范(2015版)》，主要症状可以是便血，有些患者还可有脓血样便，与结肠癌相似，钡剂灌肠检查可表现为充盈缺损，行结肠镜检查并取活组织送病理检查是有效的鉴别方法。

本发明通过具体实施例和附图进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。

实施例1：血清样本采集和制备

在2013年1月-2016年1月期间，100个满足以上结直肠癌定义的患者的血清样本和100个满足以上结直肠息肉定义的血清样本，及100例健康对照的血清样本，被预先从301医院采集。

采集外周静脉血6ml，非抗凝，血清收集流程如下：将全血样本置于室温静置2h，使其充分凝结；置于离心机内4℃，3,500rpm离心7min。用200μL移液枪将上层血浆小心地转移到1.5mL无RNA酶的无菌离心管中。对每个样本做好标记。务必在12小时内将血清样本放到超低温(-80℃)冰箱中进行保存。

实施例2.血清中总RNA的提取

使用RNA提取试剂盒(北京旷博生物技术股份有限公司)自血清中提取总RNA，每250μl血清中加入1μl(20nM)序列为5’-CAACCTCCTAGAAAGAGTA-3’(EC1)的ExternalControl-1(上海生工生物工程技术有限公司合成)来监控血清中RNA的提取质量。提取的总RNA使用Thermo NanoDrop 2000c测定浓度。

实施例3.三步法定量检测血清中的microRNA

(1)加polyA尾：

i.在无RNA酶的PCR管(Axygen公司，200μl)中配制加polyA尾的反应液，体系为20μl。每20μl体系中加入1μl(20nM)序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’(EC2)的ExternalControl-2(上海生工生物工程技术有限公司合成)来监控microRNA的加尾及反转录质量。

(注：本实验所使用的酶均为北京旷博生物技术股份有限公司的产品。)

ii.将装有配置好反应液的PCR管放入PCR仪(Thermo)中37℃孵育1小时。(2)RT-PCR得到cDNA单链：

i.向(1)得到的反应液中加入0.5μl(0.5ng/μl)序列为5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(RT-Primer)的RT-Primer(上海生工生物工程技术有限公司合成)，70℃孵育5min，立即放到冰上冰浴至少2min。

ii.配制反转录反应液：

(注：所用产品均为北京旷博生物技术股份有限公司的产品。)

iii.将i与ii得到的溶液混合，50℃孵育50min后70℃保温15min，置冰上冷却，得到cDNA。

iv.将iii得到的产物分装后-20℃保存。

(3)qPCR定量检测：

i.在2ml EP管(Axygen公司)中配制反应液：

(注：UPM-long、UPM-short均在Invitrogen公司合成，其余试剂均来自北京旷博生物技术股份有限公司的Green PCR Master Mix。)

其中，通用反向引物UPM-short和UPM-long的序列分别为5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’(UPM-short)和5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’(UPM-long)。

ii.配置好的反应液充分颠倒混匀后，分装入96孔尖底PCR板中(Axygen公司)，每孔18μl。

iii.使用排枪(Eppendoff公司，1-10μl)分别加入序列为SEQ ID NO：8至14的肝硬化microRNA分子标志物特异性正向引物(Invitrogen公司合成)，每孔2μl(10μM)。

iv.加入10μl石蜡油液封后用专用贴膜(ABI公司)密封。

v.放入ABI 7900PCR定量检测仪中，程序设定为：

vi.绘制熔解曲线，检查引物的特异性，程序设定为：95℃15s,60℃15s,95℃15s。

实施例4：结果分析：

采用STATMINER进行数据分析。

关于RT-PCR方法以及2^-ΔΔCT方法见Kenneth J Livak等(Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCTmethod.Methods 25,402-408(2001)，此处全文引入以供参考。

按照实施方式，进行了100例结直肠癌患者、100例结直肠息肉患者和100例健康对照的microRNA分子标志物表达水平检测，发现在结直肠癌和结直肠息肉患者/健康对照间差异显著的miRNA有13条(其中结直肠癌和健康对照间差异显著的miRNA有13条，结直肠癌和结直肠息肉患者间差异显著的miRNA有8条)，结果见表1。

表1

利用Spss作图软件，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标、假阳性率(1-特异性)为横坐标，13条相关的miRNA及miRNA组合在结直肠癌和健康对照间及结直肠癌和结直肠息肉患者间绘制ROC(receiver operating characteristic)曲线，结果见图1和2，其中miRNA组合AUC(曲线下面积)分别达到0.990和0.985，这表明本发明的结直肠癌microRNA分子标志物可有效区分结直肠癌患者和结直肠息肉患者/健康对照。

Claims

1.一种结直肠癌microRNA分子标志物组合，其包括一种以上选自以下的microRNA核酸分子：序列为SEQ ID NO.:1的miR-21-3p、序列为SEQ ID NO.:2的miR-877-5p、序列为SEQID NO.:3的miR-181d、序列为SEQ ID NO.:4的miR-202-3p、序列为SEQ ID NO.:5的miR-19b-3p、序列为SEQ ID NO.:6的miR-380-5p、序列为SEQ ID NO.:7的miR-1246、序列为SEQID NO.:8的miR-627、序列为SEQ ID NO.:9的miR-451a、序列为SEQ ID NO.:10的miR-339-5p、序列为SEQ ID NO.:11的miR-520e、序列为SEQ ID NO.:12的miR-21-5p和序列为SEQ IDNO.:13的miR-532-3p，优选地，所述的一种以上为1-13种、更优选2-8种。

2.权利要求1所述的结直肠癌microRNA分子标志物组合在制备结直肠癌诊断试剂中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中，所述诊断试剂通过检测被试者血浆/血清中所述的结直肠癌microRNA分子标志物的含量，并与结直肠息肉患者、健康对照平均水平相比较来判断是否发生结直肠癌。

4.权利要求2或3所述的用途，其中，使用定量PCR的方法或者其他方法来检测被试者血浆/血清中所述的结直肠癌microRNA分子标志物含量。

5.一种结直肠癌诊断和疗效及预后评估试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的结直肠癌microRNA分子标志物组合的特异性正向引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性正向引物包括一种以上选自以下序列的引物：序列为SEQ ID NO.:19的miR-21-3p的引物、序列为SEQ ID NO.:20的miR-877-5p的引物、序列为SEQ ID NO.:21的miR-181d的引物、序列为SEQ ID NO.:22的miR-202-3p的引物、序列为SEQ ID NO.:23的miR-19b-3p的引物、序列为SEQ ID NO.:24的miR-380-5p的引物、序列为SEQ ID NO.:25的miR-1246的引物、序列为SEQ ID NO.:26的miR-627的引物、序列为SEQ ID NO.:27的miR-451a的引物、序列为SEQ ID NO.:28的miR-339-5p的引物、序列为SEQ ID NO.:29的miR-520e的引物、序列为SEQ ID NO.:30的miR-21-5p的引物和序列为SEQ ID NO.:31的miR-532-3p的引物，优选地，所述的一种以上为1-13种、更优选2-8种。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其还进一步包括：

(1)血浆/血清总RNA提取试剂，

(2)RNA加polyA试剂，

(3)RT-PCR试剂，

(4)定量PCR试剂，

其中，定量PCR试剂中包括权利要求6所述的结直肠癌microRNA分子标志物组合的特异性正向引物。

8.权利要求7所述的试剂盒，其中，所述血浆/血清总RNA提取试剂中包括序列为SEQ IDNO.:14的外部控制序列-1(External Control-1)，其中，所述RNA加polyA试剂中包括序列为SEQ ID NO.:15的外部控制序列-2(External Control-2)，其中，所述RT-PCR试剂中包括序列为SEQ ID NO.:16的反转录引物(RT-Primer)。

9.权利要求7所述的试剂盒，其中，所述定量PCR试剂中包括序列分别为SEQ ID NO.:17和SEQ ID NO.:18的通用反向引物UPM-short和UPM-long。