CN112175910A - 一种脐带间充质干细胞外泌体及其美白用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞外泌体及其美白用途，该外泌体为miR‑877‑5p高表达人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。本发明研究证明，miR‑877‑5p高表达人脐带间充质干细胞分泌的外泌体具有抑制黑色素合成的活性，具有美白活性，该外泌体可以用于制备美白药物，或者用于制备美白化妆品。

Description

一种脐带间充质干细胞外泌体及其美白用途
技术领域
本发明属于干细胞领域，涉及干细胞的应用，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体及其美白用途。
背景技术
近几年，随着经济与技术不断进步，消费者对功能性化妆品的需求也日渐旺盛，尤其是美白类化妆品市场增长迅速。根据欧睿信息咨询公司(Euromonitor)数据显示，2019年中国美容与个人护理品零售额高达4500亿人民币，护肤品的市场占有率高达50％。同时据英敏特(Mintel)数据显示：2015～2019年亚太区新品中宣称含美白提亮类化妆品的占比--中国新品数量排名第一位(占比29％)，其次为日本和韩国。
皮肤黑暗取决于皮肤中的黑色素细胞。黑色素细胞是位于表皮的基底层，是皮肤里面一种非常特殊的细胞，它约占基底层细胞10％的总含量。由于外界不同外源和内源的因素，会促使黑色素细胞产生黑色素，从而传递给周围的角质形成细胞，一个黑色素细胞周围通常会分布着30～40多个角质形成细胞，而黑色素细胞与周围角质形成细胞最终构成了一个黑色素形成单元。通常皮肤中的黑素细胞会以酪氨酸酶为自有底物，在多种酶的氧化作用下生成黑色素；也就是非常熟悉的转化流程：酪氨酸--多巴--多巴醌--多巴色素--二羟基吲哚——酮式吲哚--黑色素，最终所形成的黑素颗粒再由黑色素细胞树突转运至皮肤表皮层的基底层细胞，进一步随着细胞新陈代谢而被带到角质层，最终伴随着角质层的周期脱落而排出。
目前，美白的主要手段就是借助各种方法降低黑色素细胞中的黑色素含量。
发明内容
本发明是为了提供一种脐带间充质干细胞外泌体及其美白用途。
技术方案：
一种脐带间充质干细胞外泌体，为miR-877-5p高表达人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。具体实施例的实验结果表明，miR-877-5p高表达人脐带间充质干细胞分泌的外泌体具有抑制黑色素的活性，这种活性与其可以抑制黑色素细胞中酪氨酸酶的表达有关。
上述脐带间充质干细胞外泌体的美白用途。
上述脐带间充质干细胞外泌体在制备美白皮肤的化妆品中的应用。
上述脐带间充质干细胞外泌体在制备美白皮肤的药物中的应用。
技术效果：
本发明发现，miR-877-5p高表达人脐带间充质干细胞分泌的外泌体具有抑制黑色素合成的活性，具有美白活性，该外泌体可以用于制备美白药物，或者用于制备美白化妆品。
附图说明
图1为人脐带间充质干细胞倒置显微镜观察结果；可见细胞呈梭形，呈漩涡状生长，符合人脐带间充质干细胞的生长特点。
图2为人脐带间充质干细胞免疫表型的流式测定结果；CD34、CD45、HLA-DR表达水平很低，CD73、CD90、CD105表达水平很高，符合人脐带间充质干细胞的免疫表型特点。
图3为各组人脐带间充质干细胞中miR-877-5p相对表达水平；与空白对照组相比，过表达组人脐带间充质干细胞中miR-877-5p表达水平显著升高(P＜0.05)，说明miR-877-5p过表达慢病毒已经成功将miR-877-5p转染进入人脐带间充质干细胞中。与空白对照组相比，阴性对照组miR-877-5p表达水平无显著差异(P＞0.05)。
图4为Western blot检测结果；过表达Exo、阴性对照Exo和空白对照Exo均强表达外泌体标志物蛋白CD63和CD81，符合外泌体的表型特点。
图5为各组B16细胞相对增殖活性；各组细胞的增殖活性无显著差异，说明测试浓度下的三种外泌体均对B16细胞的增殖无明显影响(P＞0.05)。
图6为各组黑色素相对含量；与对照组相比，过表达Exo组黑色素含量显著降低(P＜0.05)，阴性对照Exo、空白对照Exo组黑色素含量降低不明显(P＞0.05)。
图7为琼脂糖凝胶电泳结果；与对照组相比，过表达Exo组酪氨酸酶表达水平显著下调，且具有明显的剂量效应。
具体实施方式
一、实验材料
人脐带间充质干细胞购自上海传秋生物科技有限公司。
B16小鼠黑色素瘤细胞(简称B16细胞)购自上海吉至生化科技有限公司。
胎牛血清、DMEM/F12(1:1)培养基购自购自美国Gibco公司。
碱性成纤维生长因子(b-FGF)购自碧云天生物。
miR-877-5p过表达慢病毒及其阴性对照慢病毒、RT-PCR引物序列由吉凯基因构建。
ExoQuick-TCTM外泌体提取试剂盒购自美国System Biosciences公司。
二、实验方法
1、人脐带间充质干细胞的培养、传代、形态观察和表型检测
将冻存的人脐带间充质干细胞按常规方法复苏后，用含10％胎牛血清和10ng/mLb-FGF的DMEM/F12培养基培养于T25培养瓶中，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。2～3d换一次液，待细胞长满瓶底面积80％～90％时传代。传代比例为1:5，步骤为：将0.25％胰酶-0.53mM EDTA消化液与DPBS置于37℃预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5mLDPBS，轻晃洗涤后弃去。使用DPBS将胰酶稀释4倍，往瓶中加2mL稀释后的胰酶，置于室温孵育消化，消化好后加入2mL含血清的完全培养基或其他胰酶中和液终止消化。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液并吹打成单个细胞悬液，1200rpm离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，进行传代。
取传代3次后的人脐带间充质干细胞用于后续实验。
形态观察：在倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞的形态和生长情况，拍照。
表型检测：将人脐带间充质干细胞用0.25％胰酶消化，PBS重悬，制备1×106/mL的细胞悬液。然后取100μL细胞悬液与20μL标记一抗(CD73-PE、CD90-FITC、CD105-APC、CD34-PE、CD45-APC、HLA-DR-FITC)4℃避光孵育1h，通过流式细胞仪检测细胞的免疫荧光。
2、细胞转染、表型检测和miR-877-5p相对表达水平检测
取生长状态良好的人脐带间充质干细胞，以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞生长至70％～80％融合度时，按照病毒感染比率值(MOI)50:1分别加入miR-877-5p过表达慢病毒及其阴性对照慢病毒感染人脐带间充质干细胞，同时设置不做任何处理的人脐带间充质干细胞作为空白对照，记为过表达组、阴性对照组和空白对照组，每组2个复孔，4块6孔板平行操作。培养6h后，洗涤、收集其中2块6孔板上的各组细胞用于miR-877-5p相对表达水平检测，另外2块6孔板用PBS洗涤细胞并更换新鲜的完全培养液，继续培养24h，PBS洗涤，取适量细胞按照“1、人脐带间充质干细胞的培养、传代、形态观察和表型检测”中的表型检测方法检测免疫表型。miR-877-5p相对表达水平检测的方法为：根据试剂盒说明书用Trizol试剂提取细胞总RNA，用1μg总RNA和PrimeScriptTM RT试剂盒通过反转录反应合成cDNA，用SYBR Premix Ex Taq在RT-PCR仪上进行RT-PCR，以GAPDH为内参，通过2－ΔΔCt法分析各组人脐带间充质干细胞中miR-877-5p的相对表达水平，以空白对照组计1.00。
RT-PCR引物序列如下。
miR-877-5p正向序列：5'-GTAGAGGAGATGGCGCAGG-3'
miR-877-5p反向序列：5'-CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC-3'
GAPDH正向序列：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'
GAPDH反向序列：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'
3、外泌体的收集和检测
取生长状态良好的人脐带间充质干细胞，用完全培养基制备成浓度为1×106/mL的细胞悬液，接种于T25培养瓶中，待细胞生长至70％～80％融合度时，按照病毒感染比率值(MOI)50:1分别加入miR-877-5p过表达慢病毒及其阴性对照慢病毒感染人脐带间充质干细胞，同时设置不做任何处理的人脐带间充质干细胞作为空白对照。培养6h后，PBS洗涤细胞，用DMEM/F12培养基制备成浓度为1×106/mL的细胞悬液，继续培养24h后，收集培养基，3000r/min离心30min去除细胞碎片，0.22μm微孔过滤器过滤，收集滤液，再用微孔离心过滤装置100000r/min离心2h浓缩，得到浓缩液，使用ExoQuick-TCTM外泌体提取试剂盒根据说明书方法提取浓缩液中的外泌体。用PBS将外泌体重悬后，BCA法测定其浓度，置于-80℃保存备用，分别标记为过表达Exo、阴性对照Exo和空白对照Exo。
各组取等量外泌体采用Westernblot法检测外泌体标志物蛋白CD63和CD81的表达。
4、人脐带间充质干细胞外泌体的活性测试
将冻存的B16细胞按常规方法复苏后，用含10％胎牛血清和1％双抗的RPMI 1640培养基培养于T25培养瓶中，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。每2～3天更换一次培养液。当细胞生长至汇合度为80％～90％时，消化传代。
(1)细胞增殖活性测定
取对数生长期的B16细胞，制成浓度为1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔200μL。培养24h后，外泌体组更换为含有10、20ng/mL过表达Exo、阴性对照Exo或空白对照Exo的完全培养基，对照组更换为新的完全培养基，各5个复孔，继续培养48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，孵育4h，吸弃上清液，加入150μL DMSO轻轻震荡5～10min以使结晶溶解，用酶标仪测定各孔490nm处的OD值，以对照组细胞增殖活性为100％，根据其他组OD值与对照组OD值的比值计算其相对增殖活性。
(2)黑色素含量测定
取对数生长期的B16细胞，制成浓度为5×104个/mL，接种于24孔板中，每孔1mL。培养24h后，外泌体组更换为含有10、20ng/mL过表达Exo、阴性对照Exo或空白对照Exo的完全培养基，对照组更换为新的完全培养基，各5个复孔，继续培养48h后，吸弃上清液，PBS洗涤，每孔加入200μL含10％DMSO的NaOH溶液(1mol/L)，置于100℃下保温2h，至细胞块完全溶解。用酶标仪测定各孔405nm处的OD值，以对照组黑色素含量为100％，根据其他组OD值与对照组OD值的比值计算其黑色素相对含量。
(3)酪氨酸酶表达水平测定
取对数生长期的B16细胞，制成浓度为5×104个/mL，接种于24孔板中，每孔1mL。培养24h后，外泌体组更换为含有10、20ng/mL过表达Exo的完全培养基，对照组更换为新的完全培养基，各5个复孔，继续培养48h后，吸弃上清液，收集细胞，PBS洗涤，根据试剂盒说明书用Trizol试剂提取细胞总RNA，用1μg总RNA和PrimeScriptTM RT试剂盒通过反转录反应合成cDNA，用SYBR Premix Ex Taq在RT-PCR仪上进行RT-PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物中酪氨酸酶(TYR)表达水平，内参为GAPDH。
RT-PCR引物序列如下。
TYR正向序列：5'-CGATGGAACACCTGAGGGAC-3'
TYR反向序列：5'-TTCGCAGCCATTGTGTTCAAA-3'
GAPDH正向序列：5'-CCCTTAAGAGGGATGCTGCC-3'
GAPDH反向序列：5'-ACTGTGCCGTTGAATTTGCC-3”
5、统计学处理
数据采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计处理，以x±s表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05表示具有显著性差异。
三、实验结果
1、人脐带间充质干细胞形态观察和表型检测结果
倒置显微镜观察结果如图1所示，细胞呈梭形，呈漩涡状生长，符合人脐带间充质干细胞的生长特点。表型检测结果如图2所示，CD34、CD45、HLA-DR表达水平很低，CD73、CD90、CD105表达水平很高，符合人脐带间充质干细胞的免疫表型特点。
2、转染和表型检测检测结果
转染培养6h后，过表达组、阴性对照组和空白对照组人脐带间充质干细胞中miR-877-5p相对表达水平如表1和图3所示，与空白对照组相比，过表达组人脐带间充质干细胞中miR-877-5p表达水平显著升高(P＜0.05)，说明miR-877-5p过表达慢病毒已经成功将miR-877-5p转染进入人脐带间充质干细胞中。与空白对照组相比，阴性对照组miR-877-5p表达水平无显著差异(P＞0.05)。
表1各组人脐带间充质干细胞中miR-877-5p相对表达水平
组别 miR-877-5p/GAPDH的相对表达水平
空白对照组 1.00±0.03
过表达组 3.31±0.07
阴性对照组 1.04±0.05
过表达组、阴性对照组和空白对照组人脐带间充质干细胞培养24h后，CD34、CD45、HLA-DR表达率均在4％以下，CD73、CD90、CD105表达率均在95％以上，依然维持较高的干细胞特性。
上述研究结果表明，miR-877-5p成功转入人脐带间充质干细胞中，且转染miR-877-5p后高表达miR-877-5p的人脐带间充质干细胞依然维持较高的干细胞特性。
3、Western blot法检测外泌体的标志物蛋白
Western blot结果如图4所示，过表达Exo、阴性对照Exo和空白对照Exo均强表达外泌体标志物蛋白CD63和CD81，符合外泌体的表型特点。
4、活性测试结果
(1)细胞增殖活性测定结果
MTT实验结果如表2和图5所示，各组细胞的增殖活性无显著差异，说明测试浓度下的三种外泌体均对B16细胞的增殖无明显影响(P＞0.05)。
表2各组B16细胞相对增殖活性
Figure BDA0002718934420000061
(2)黑色素含量测定结果
黑色素含量测定结果如表3和图6所示，与对照组相比，过表达Exo组黑色素含量显著降低(P＜0.05)，且具有明显的剂量效应，阴性对照Exo、空白对照Exo组黑色素含量降低不明显(P＞0.05)。该结果表明，miR-877-5p高表达人脐带间充质干细胞分泌的外泌体具有抑制黑色素的活性，常规人脐带间充质干细胞分泌的外泌体在测试浓度下未见明显的黑色素抑制活性。
表3各组黑色素相对含量
Figure BDA0002718934420000062
(3)酪氨酸酶表达水平测定
琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示，与对照组相比，过表达Exo组酪氨酸酶表达水平显著下调，且具有明显的剂量效应。
上述研究结果表明，miR-877-5p高表达人脐带间充质干细胞分泌的外泌体具有抑制黑色素的活性，这种活性与其可以抑制黑色素细胞中酪氨酸酶的表达有关。
综上可见，miR-877-5p高表达人脐带间充质干细胞分泌的外泌体具有抑制黑色素合成的活性，具有美白活性，该外泌体可以用于制备美白药物，或者用于制备美白化妆品。

Claims (4)

1.一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：该外泌体为miR-877-5p高表达人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
2.权利要求1所述脐带间充质干细胞外泌体的美白用途。
3.权利要求1所述脐带间充质干细胞外泌体在制备美白皮肤的化妆品中的应用。
4.权利要求1所述脐带间充质干细胞外泌体在制备美白皮肤的药物中的应用。
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