CN114214285A - lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途 - Google Patents

lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114214285A
CN114214285A CN202111167709.7A CN202111167709A CN114214285A CN 114214285 A CN114214285 A CN 114214285A CN 202111167709 A CN202111167709 A CN 202111167709A CN 114214285 A CN114214285 A CN 114214285A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lncrna
mscs
mesenchymal stem
stem cells
umbilical cord
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202111167709.7A
Other languages
English (en)
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huaian Taikairui Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Huaian Taikairui Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huaian Taikairui Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Huaian Taikairui Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority to CN202111167709.7A priority Critical patent/CN114214285A/zh
Publication of CN114214285A publication Critical patent/CN114214285A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid

Abstract

本发明公开了lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途。体外培养的包括UC‑MSCs在内的MSCs易衰老特性制约着其临床发展与应用。D‑半乳糖诱导是构建体外衰老细胞模型的经典方法。本发明研究结果发现，lncRNA‑1708高表达的UC‑MSCs具有相对较强的抗衰老活性，同时还具有较强的体外增殖活性。因此，可以通过提高lncRNA‑1708表达水平的方法体外培养人脐带间充质干细胞抑制其衰老。

Description

lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途
技术领域
本发明属于干细胞领域，具体涉及lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有高度自我更新、多向分化及独特免疫调节能力特性的细胞，其可以通过与先天免疫和适应性免疫系统的细胞相互作用以及分泌细胞调节性因子发挥免疫调节作用。间充质干细胞外泌体(exosomesfrommesenchymal stem cells，MSCs-Exo)就是MSCs发挥功能的一种分泌物质。研究表明，MSCs-Exo具有多种活性，比如组织修复、免疫调节和疾病治疗，越来越被重视。
脐带间充质干细胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells，UC-MSCs)具有来源充足、取材方便、培养简单等特点，也不存在伦理学问题，因而得到广泛研究。
然而，体外培养的包括UC-MSCs在内的MSCs易衰老特性制约着其临床发展与应用。如何延缓UC-MSCs的衰老成为国内外学者研究的热点。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术不足，提供lncRNA高表达抑制UC-MSCs衰老的用途。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种通过提高lncRNA表达水平的方法用于体外培养人脐带间充质干细胞抑制其衰老的用途；其中，所述lncRNA为lncRNA-1708。
一种体外培养人脐带间充质干细胞抑制其衰老的方法，在培养过程中添加提高lncRNA-1708表达水平的物质。
进一步的，所述物质包括小分子化合物、核酸分子以及包含所述核酸分子的表达载体。
技术效果：
D-半乳糖诱导是构建体外衰老细胞模型的经典方法。本发明研究结果发现，lncRNA-1708高表达的UC-MSCs具有相对较强的抗衰老活性，同时还具有较强的体外增殖活性。因此，可以通过提高lncRNA-1708表达水平的方法体外培养人脐带间充质干细胞抑制其衰老。
附图说明
图1中A为UC-MSCs的倒置显微镜观察图，B为UC-MSCs的流式细胞仪检测图；
图2中A为各组UC-MSCs中lncRNA-1708的含量比较，B为各组衰老细胞比例，C为各组细胞增殖活性。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
一、实验材料
胎牛血清、DMEM/F12培养基购自Gibco公司，双抗、PBS和胰蛋白酶购自碧云天生物。lncRNA-1708 mimic、lncRNA-1708 NC mimic由上海吉玛生物技术有限公司合成提供。FITC或PE标记的小鼠抗人CD90、CD105、CD73、CD14、CD34和CD45抗体及各相关同型对照购自美国eBioscince公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen。TRIzol试剂盒购自赛默飞世尔。Western Blot相关试剂材料购自碧云天生物等。
二、实验方法
1、UC-MSCs分离培养
按照常规方法在无菌条件下取健康足月顺产新生儿脐带组织，用含1％双抗的PBS洗涤多次以去除残血，并剔除脐动静脉，留下Wharton胶样组织，将其剪碎，形成约1mm3的小块，然后用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F12培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养，每3～4d换液1次。在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。待细胞长至90％融合时，胰蛋白酶消化传代培养。取第3代UC-MSCs用于流式检测表面标志物。流式检测方法为：取第3代UC-MSCs，0.25％胰酶消化并调整细胞密度为1×106个/mL，每离心管中加入1mL细胞悬液，无菌PBS洗涤2次，1000×g离心5min，弃上清，100μLPBS重悬细胞后，向各管单细胞悬液中加入适量CD90、CD105、CD73、CD14、CD34和CD45抗体以及各同型对照，室温避光孵育30min，1000×g离心5min，PBS洗涤2次，加入500μLPBS重悬，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。
2、UC-MSCs分组、转染和检测
实验分为空白对照组(Blank)、阴性对照组(Negative Control，NC)和阳性实验组(Positive group，PG)。取生长状态良好的UC-MSCs，用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F12培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养，接种于6孔板中，并分组如下：
Blank组：未转染；
NC组：转染lncRNA-1708 NC mimic，lncRNA-1708正常表达；
PG组：转染lncRNA-1708 mimic，lncRNA-1708高表达。
24h后，按Lipofectamine 2000说明和上述分组进行细胞转染，将lncRNA-1708的模拟物(mimic)及阴性对照模拟物(NC mimic)分别转染至对应组别的UC-MSCs中，48h后洗涤收集各组细胞进行后续实验。
RT-PCR法检测转染后lncRNA-1708基因表达水平：收集转染后的细胞用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度，反转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增，以U6为内参，按照试剂盒操作方法根据公式lncRNA-1708/U6计算各组lncRNA-1708相对表达水平，并以Blank组lncRNA-1708相对表达水平计为1.00。
lncRNA-1708和U6的引物如下：
lncRNA-1708上游引物：5'-CGTCACCTCTACCTCCTTAATAC-3'；
lncRNA-1708下游引物：5'-CAGGTTTTACTGCATATGTAGATAGTG-3'；
U6上游引物：5'-CCCGGACACGTGGGCTCCC-3'；
U6下游引物：5'-CACATCCCTGGACACAGTCCTAG-3'。
3、抗衰老活性测定
首先按照“2、UC-MSCs分组、转染和检测”中方法获得未转染(Blank组)、转染但lncRNA-1708正常表达(NC组)、转染后lncRNA-1708高表达(PG组)的UC-MSCs，然后将这三种UC-MSCs接种于24孔板中，每孔0.5mL，每孔含有细胞2×105个。待细胞完全贴壁后，全部更换为含有10mg/mLD-半乳糖的完全培养基培养24h诱导UC-MSCs衰老。24h后，使用SA-β-Gal检测试剂盒检测细胞衰老，衰老细胞呈蓝色。于倒置显微镜下观察，每组随机取3个视野，计数衰老细胞比例(视野内衰老细胞占视野内总细胞的百分比)。
4、细胞增殖活性测定
首先按照“2、UC-MSCs分组、转染和检测”中方法获得未转染(Blank组)、转染但lncRNA-1708正常表达(NC组)、转染后lncRNA-1708高表达(PG组)的UC-MSCs，然后将这三种UC-MSCs接种于96孔板中，每孔100μL，每组设6个复孔。培养24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，培养4h，去上清液，加入150μL DMSO轻轻震荡，用酶标仪检测其在490nm处的吸光度(OD值)，通过OD值按照如下公式计算转染组增殖率，Blank组增殖率计为100％：转染组增殖率＝转染组OD值/Blank组OD值×100％。吸光度越高代表增殖活性越强。
5、统计学分析
采用GraphPad Prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析，P<0.05认定为差异显著。
三、实验结果
1、UC-MSCs倒置显微镜下观察结果
图1中A为UC-MSCs的倒置显微镜观察图，可见细胞呈梭形，大小较均等，呈平行或旋涡状生长，符合UC-MSCs细胞生物学特点。
图1中B为流式细胞仪检测图，CD90、CD105、CD73阳性表达，CD14、CD34和CD45阴性表达，符合UC-MSCs表面标记特点。
2、UC-MSCs转染结果
表1和图2中A为各组UC-MSCs中lncRNA-1708的含量比较，PG组lncRNA-1708含量显著高于Blank组、NC组，说明高表达lncRNA-1708的UC-MSCs造模成功。
表1各组UC-MSCs中lncRNA-1708相对表达水平
Figure BDA0003292098320000041
*代表与Blank、NC组相比差异显著。
3、抗衰老活性测定结果
表2和图2中B为各组衰老细胞比例，PG组衰老细胞比例显著低于Blank组和NC组，NC组衰老细胞比例与Blank组衰老细胞比例无显著性差异。
表2各组衰老细胞比例
Figure BDA0003292098320000042
*代表与Blank、NC组相比差异显著。
4、细胞增殖活性测定
表3和图2中C为各组细胞增殖活性，PG组细胞增殖活性显著高于Blank组和NC组，NC组细胞增殖活性与Blank组细胞增殖活性无显著性差异。
表3细胞增殖活性
Figure BDA0003292098320000043
*代表与Blank、NC组相比差异显著。
D-半乳糖诱导是构建体外衰老细胞模型的经典方法。上述结果说明，lncRNA-1708高表达的UC-MSCs具有相对较强的抗衰老活性，同时还具有较强的体外增殖活性。因此，可以通过提高lncRNA-1708表达水平的方法体外培养人脐带间充质干细胞抑制其衰老。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (3)

1.一种通过提高lncRNA表达水平的方法用于体外培养人脐带间充质干细胞抑制其衰老的用途；其中，所述lncRNA为lncRNA-1708。
2.一种体外培养人脐带间充质干细胞抑制其衰老的方法，其特征在于：在培养过程中添加提高lncRNA-1708表达水平的物质。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述物质包括小分子化合物、核酸分子以及包含所述核酸分子的表达载体。
CN202111167709.7A 2021-10-08 2021-10-08 lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途 Withdrawn CN114214285A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111167709.7A CN114214285A (zh) 2021-10-08 2021-10-08 lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111167709.7A CN114214285A (zh) 2021-10-08 2021-10-08 lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114214285A true CN114214285A (zh) 2022-03-22

Family

ID=80696053

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111167709.7A Withdrawn CN114214285A (zh) 2021-10-08 2021-10-08 lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114214285A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114807024A (zh) * 2022-05-25 2022-07-29 溯玄(上海)生物技术有限公司 lncRNA CASC2激活剂在脐带间充质干细胞成心肌分化中的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114807024A (zh) * 2022-05-25 2022-07-29 溯玄(上海)生物技术有限公司 lncRNA CASC2激活剂在脐带间充质干细胞成心肌分化中的应用
CN114807024B (zh) * 2022-05-25 2023-09-08 成都赋智健康科技有限公司 lncRNA CASC2激活剂在脐带间充质干细胞成心肌分化中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2006327073B2 (en) In vitro expansion of postpartum derived cells in roller bottles
CN107254432B (zh) 一种同时分离尿源性干细胞两种亚群的培养基、分离方法及应用
US11091739B2 (en) Reagent kit for step-by-step hUC-MSC culture and hUC-MSC acquired using said reagent kit
Liu et al. Comparison of the biological characteristics of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and skin
CN101821383A (zh) 一种用于人成体原始间充质干细胞体外规模化培养的培养基、方法及获得的原始间充质干细胞及其应用
CN110564675A (zh) 一种毛囊干细胞的分离提取方法
CN109749993B (zh) 一种脐带间充质干细胞的培养方法
CN111690686B (zh) 一种miRNA高表达在促进脐带间充质干细胞体外增殖和成骨分化方面的应用
CN114214285A (zh) lncRNA高表达抑制脐带间充质干细胞衰老的用途
CN105420187B (zh) 一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒及采用所述试剂盒获得的hUC-MSC
Liu et al. Isolating and characterizing adipose-derived stem cells
CN113789296B (zh) 高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法及应用
JP6463029B2 (ja) ヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体並びにこれを用いたヒト間葉系幹細胞の分離及び／または品質評価を行う方法
CN113768860A (zh) 一种间充质干细胞外泌体和在促进皮肤屏障修复中的应用
CN113832108A (zh) 一种脐带间充质干细胞外泌体及其抗皮肤衰老用途
CN114563330A (zh) 一种自身蛋白与间充质干细胞Th1免疫调节相关性的评估方法
CN108998441A (zh) 一种三维肿瘤球培养基添加剂、培养基以及三维肿瘤球培养方法
CN104120106B (zh) 利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法
CN105420188B (zh) 一种hUC-MSC的无血清分步培养方法及采用所述方法获得的hUC-MSC
CN112662621B (zh) 一种逆转间充质干细胞衰老的方法及应用
CN114214273A (zh) Foxq1激活剂在抑制人脐带间充质干细胞衰老中的应用
Zou et al. Isolation and osteogenic differentiation of skeletal muscle‑derived stem cells for bone tissue engineering
CN110079497A (zh) 一种脂肪干细胞的分离与培养方法
CN109837241A (zh) 脂肪干细胞的分离与培养方法
CN112481219B (zh) 一种基因高表达在人脐带间充质干细胞体外培养促进其增殖方面的用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20220322