CN113768860A - 一种间充质干细胞外泌体和在促进皮肤屏障修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞外泌体和在促进皮肤屏障修复中的应用。皮肤屏障功能是皮肤最重要的功能之一，在保护机体免受环境伤害、防止微生物入侵、调节体温、避免体内水分流失、维持内环境相对稳定等方面发挥重要的作用。本发明实验表明，与正常人脐带间充质干细胞分泌的外泌体相比，miR‑485‑5p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体一方面可以更有效地提高人类永生化表皮细胞HaCaT细胞的增殖活性，另一方面可以更有效地提高HaCaT细胞的迁移活性，具有开发成促进皮肤屏障修复的护肤品或药品的前景。

Description

一种间充质干细胞外泌体和在促进皮肤屏障修复中的应用
技术领域
本发明属于干细胞领域，涉及一种间充质干细胞外泌体和在促进皮肤屏障修复中的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有高度自我更新、多向分化及独特免疫调节能力特性的细胞，其可以通过与先天免疫和适应性免疫系统的细胞相互作用以及分泌细胞调节性因子发挥免疫调节作用。间充质干细胞外泌体(exosomes frommesenchymal stem cells，MSCs-Exo)就是MSCs发挥功能的一种分泌物质。研究表明，MSCs-Exo具有多种活性，比如组织修复、免疫调节和疾病治疗，越来越被重视。
脐带间充质干细胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells，UC-MSCs)具有来源充足、取材方便、培养简单等特点，也不存在伦理学问题，因而得到广泛研究。脐带间充质干细胞外泌体(UC-MSCs-Exo)也较其他干细胞外泌体更易被应用和推广。
皮肤屏障功能是皮肤最重要的功能之一，在保护机体免受环境伤害、防止微生物入侵、调节体温、避免体内水分流失、维持内环境相对稳定等方面发挥重要的作用。
已有技术表明，UC-MSCs-Exo具有促进皮肤屏障修复的活性，但是活性尚待提高，这样才能克服UC-MSCs-Exo量少的不足，实现少量高效，易于被应用和推广。
发明内容
本发明旨在克服现有技术不足，第一目的是提供一种脐带间充质干细胞外泌体，第二目的是提供该脐带间充质干细胞外泌体在促进皮肤屏障修复中的应用。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种脐带间充质干细胞外泌体，该脐带间充质干细胞外泌体为miR-485-5p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
上述脐带间充质干细胞外泌体在促进皮肤屏障修复中的应用。实验研究发现，与正常人脐带间充质干细胞分泌的外泌体相比，miR-485-5p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体一方面可以更有效地提高人类永生化表皮细胞HaCaT细胞的增殖活性，另一方面可以更有效地提高HaCaT细胞的迁移活性。
进一步的，所述应用为用于制备抗皮肤衰老的护肤品或药品。
更进一步的，所述护肤品为精华液、乳液、面膜或面霜。
技术效果：
表皮细胞层是皮肤屏障最重要的细胞层，表皮细胞的增殖活性和迁移活性直接关系到皮肤屏障受损后的修复能力。上调或下调改变部分基因表达水平是调节、改进细胞功能的重要研究方法。本发明实验表明，与正常人脐带间充质干细胞分泌的外泌体相比，miR-485-5p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体一方面可以更有效地提高人类永生化表皮细胞HaCaT细胞的增殖活性，另一方面可以更有效地提高HaCaT细胞的迁移活性，具有开发成促进皮肤屏障修复的护肤品或药品的前景。
附图说明
图1中A为UC-MSCs的倒置显微镜观察图，B为UC-MSCs的流式细胞仪检测图，C为各组UC-MSCs中miR-485-5p的含量比较，D为各组UC-MSCs-Exo的透射电镜观察图，E为各组UC-MSCs-Exo的Westernblot检测结果；
图2中A为各组HaCaT细胞的增殖活性比较，B为各组HaCaT细胞的迁移活性比较。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
实施例1：UC-MSCs-Exo的制备
一、实验材料
胎牛血清、DMEM/F12培养基购自Gibco公司，双抗、PBS和胰蛋白酶购自碧云天生物。miR-485-5p mimic、miR-485-5p NC mimic由上海吉玛生物技术有限公司合成提供。FITC或PE标记的小鼠抗人CD90、CD105、CD73、CD14、CD34和CD45抗体及各相关同型对照购自美国eBioscince公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen。TRIzol试剂盒购自赛默飞世尔。Western blot相关试剂材料购自碧云天生物等。
二、实验方法
1、UC-MSCs分离培养
按照常规方法在无菌条件下取健康足月顺产新生儿脐带组织，用含1％双抗的PBS洗涤多次以去除残血，并剔除脐动静脉，留下Wharton胶样组织，将其剪碎，形成约1mm3的小块，然后用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F12培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养，每3～4d换液1次。在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。待细胞长至90％融合时，胰蛋白酶消化传代培养。取第3代UC-MSCs用于流式检测表面标志物。流式检测方法为：取第3代UC-MSCs，0.25％胰酶消化并调整细胞密度为1×106个/mL，每离心管中加入1mL细胞悬液，无菌PBS洗涤2次，1000×g离心5min，弃上清，100μL PBS重悬细胞后，向各管单细胞悬液中加入适量CD90、CD105、CD73、CD14、CD34和CD45抗体以及各同型对照，室温避光孵育30min，1000×g离心5min，PBS洗涤2次，加入500μL PBS重悬，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。
2、UC-MSCs分组、转染和检测
实验分为空白对照组(Blank)、阴性对照组(Negative Control，NC)和阳性实验组(Positive group，PG)。取生长状态良好的UC-MSCs，用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F12培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养，接种于6孔板中，并分组如下：
Blank组：未转染；
NC组：转染miR-485-5p NC mimic，miR-485-5p正常表达；
PG组：转染miR-485-5p mimic，miR-485-5p高表达。
24h后，按Lipofectamine 2000说明和上述分组进行细胞转染，将miR-485-5p的模拟物(mimic)及阴性对照模拟物(NC mimic)分别转染至对应组别的UC-MSCs中，48h后洗涤收集各组细胞进行后续实验。
RT-PCR法检测转染后miR-485-5p基因表达水平：收集转染后的细胞用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度，反转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增，以U6为内参，按照试剂盒操作方法根据公式miR-485-5p/U6计算各组miR-485-5p相对表达水平，并以Blank组miR-485-5p相对表达水平计为1.00。
miR-485-5p和U6的引物如下：
miR-485-5p上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGAGAGGCTGGCCGTGATGAATTC-3'；
miR-485-5p下游引物：5'-CTCGATTCGTCACTCACA-3'；
U6上游引物：5'-CCCGGACACGTGGGCTCCC-3'；
U6下游引物：5'-CACATCCCTGGACACAGTCCTAG-3'。
3、UC-MSCs-Exo收集和检测
按照常规离心法收集外泌体。具体方法为：取转染后的UC-MSCs用DMEM/F12培养基制成细胞悬液并接种于培养皿中，72h后收集上清并转移至离心管中，4℃条件下300×g离心10min去除残余细胞，上清于4℃条件下2000×g离心10min去除死细胞，上清于4℃条件下10000×g离心30min去除细胞碎片，上清于4℃条件下100000×g离心70min收集沉淀即得外泌体。用无菌PBS将沉淀重悬，再次于4℃条件下100000×g离心70min收集沉淀即得经过洗涤的外泌体。最后用无菌PBS将经过洗涤的外泌体重悬，取少量用于BCA法测定外泌体浓度、透射电镜观察以及Western Blot检测外泌体标志性蛋白，其余-80℃冻存备用。
Western blot检测方法为：各组外泌体取适量并调整蛋白浓度一致后，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸10min，10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入CD9、CD63、CD81一抗，4℃孵育过夜。TBST反复洗膜后，HRP标记二抗孵育1h，洗膜后化学发光试剂显色，用凝胶成像系统拍照，Image J软件分析灰度值。
4、统计学分析
采用GraphPad Prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析，P<0.05认定为差异显著。
三、实验结果
1、UC-MSCs倒置显微镜下观察结果
图1中A为UC-MSCs的倒置显微镜观察图，可见细胞呈梭形，大小较均等，呈平行或旋涡状生长，符合UC-MSCs细胞生物学特点。
图1中B为流式细胞仪检测图，CD90、CD105、CD73阳性表达，CD14、CD34和CD45阴性表达，符合UC-MSCs表面标记特点。
2、UC-MSCs转染结果
表1和图1中C为各组UC-MSCs中miR-485-5p的含量比较，PG组miR-485-5p含量显著高于Blank组、NC组，说明高表达miR-485-5p的UC-MSCs造模成功。
表1各组UC-MSCs中miR-485-5p相对表达水平
Figure BDA0003277755870000041
*代表与Blank、NC组相比差异显著。
3、UC-MSCs-Exo检测结果
图1中D为各组UC-MSCs-Exo的透射电镜观察图(100×)，图1中E为各组UC-MSCs-Exo标志蛋白CD9、CD63、CD81的Western Blot检测图，各组外泌体的形态和标志物都符合UC-MSCs-Exo的特点，说明各组均制备得到了外泌体。
实施例2：促进皮肤屏障修复活性
一、实验材料
人类永生化表皮细胞(HaCaT细胞)购自ATCC。胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司，双抗、MTT和胰蛋白酶购自碧云天生物。
二、实验方法
1、HaCaT细胞的培养
将HaCaT细胞用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养，每2～3d换液1次。
2、HaCaT细胞增殖活性测定
采用常规的MTT法测定HaCaT细胞的增殖活性，分为空白对照组和外泌体A、B、C组，外泌体A、B、C组添加的外泌体分别对应为实施例1中Blank组、NC组、PG组的外泌体。
具体方法为：取生长状态良好的对数生长期HaCaT细胞，调整细胞浓度至1×105个/mL，混匀后接种于96孔板中，每孔100μL，每组设6个复孔。待细胞完全贴壁后，实验组更换为含有不同浓度外泌体(低浓度为2μg/mL、高浓度为5μg/mL)的完全培养基培养，空白对照组的培养基中不含有外泌体。继续培养24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，培养4h，去上清液，加入150μL DMSO轻轻震荡，用酶标仪检测其在490nm处的吸光度(OD值)，通过OD值按照如下公式计算实验组增殖活性，空白对照组增殖活性计为100％：实验组增殖活性＝实验组OD值/空白对照组OD值×100％。吸光度越高代表增殖活性越强。
3、HaCaT细胞迁移活性测定
采用常规的划痕法测定HaCaT细胞的迁移活性，分为空白对照组和外泌体A、B、C组，外泌体A、B、C组添加的外泌体分别对应为实施例1中Blank组、NC组、PG组的外泌体。
具体方法为：取生长状态良好的对数生长期HaCaT细胞，调整细胞浓度至4×105个/mL，接种于培养皿中。待细胞完全贴壁后，实验组更换为含有5μg/mL外泌体的完全培养基培养，空白对照组的培养基中不含有外泌体。继续培养24h后，消化细胞用PBS洗涤3次，用完全培养基调整细胞浓度至2×105个/mL，接种于12孔板中。待细胞完全贴壁后，更换为含0.5％胎牛血清的培养基饥饿处理12h，使用无菌10μL枪头在细胞层垂直划痕，用PBS冲洗2～3次去除划痕区残留细胞，加入完全培养基培养12h后于显微镜下观察拍照。
4、统计学分析
采用GraphPad Prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析，P<0.05认定为差异显著。
三、实验结果
1、HaCaT细胞增殖活性测定结果
图2中A为各组HaCaT的增殖活性比较，外泌体A、B、C组的HaCaT增殖活性均显著高于空白对照组，且外泌体C组的HaCaT增殖活性显著高于外泌体A、B组，外泌体A组与B组HaCaT增殖活性无显著性差异。
表2各组HaCaT的增殖活性
Figure BDA0003277755870000061
#代表与空白对照组相比差异显著；*代表与外泌体A、B组相比差异显著。
2、HaCaT细胞迁移活性测定结果
图2中B为各组HaCaT的迁移活性比较，外泌体A、B、C组的HaCaT迁移活性均显著高于空白对照组，且外泌体C组的HaCaT迁移活性显著高于外泌体A、B组，外泌体A组与B组HaCaT迁移活性无显著性差异。
表皮细胞层是皮肤屏障最重要的细胞层，表皮细胞的增殖活性和迁移活性直接关系到皮肤屏障受损后的修复能力。上调或下调改变部分基因表达水平是调节、改进细胞功能的重要研究方法。上述实验表明，与正常人脐带间充质干细胞分泌的外泌体相比，miR-485-5p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体一方面可以更有效地提高人类永生化表皮细胞HaCaT细胞的增殖活性，另一方面可以更有效地提高HaCaT细胞的迁移活性，具有开发成促进皮肤屏障修复的护肤品或药品的前景。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (4)

1.一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：该脐带间充质干细胞外泌体为miR-485-5p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
2.权利要求1所述脐带间充质干细胞外泌体在促进皮肤屏障修复中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，用于制备促进皮肤屏障修复的护肤品或药品。
4.根据权利要求3所述的应用，所述护肤品为精华液、乳液、面膜或面霜。
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WO2023045117A1 (zh) * 2021-09-24 2023-03-30 周桂英 脐带间充质干细胞外泌体及其应用

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WO2023045117A1 (zh) * 2021-09-24 2023-03-30 周桂英 脐带间充质干细胞外泌体及其应用

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