CN109762786A - 人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法，该方法先获得角膜缘小片；用胶原酶A消化，然后用胰蛋白酶溶液进行消化，然后再接种于包被有Matrigel基质胶的六孔板上，获得原代的LNC；将原代的LNC置于改良的MESCM胚胎干细胞培养液连续培养传代扩增；采用Matrigel包被塑料培养板表面，MESCM无血清培养基扩增即得到人角膜缘微环境细胞。鉴定方法包含细胞形态学检测、细胞表面标志物检测、细胞多向诱导分化潜能检测和体外支持角膜缘干细胞活性检测共4种方法。本发明分离培养的人LNC细胞，具有明确的形态、抗原、功能特征，可以用于实验研究或者临床移植材料。

Description

人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养、鉴定、移植应用领域，具体涉及一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法。

背景技术

干细胞(stem cell)是指能够不断的通过自我更新维持干细胞特性，并能通过定向分化产生正常的功能细胞的一类细胞。1968年Friedenstein描述了一群非吞噬，非造血的成纤维细胞样的细胞，并在随后的研究中发现这群细胞可以在体外形成克隆，并分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和纤维组织，称作成纤维细胞克隆形成单元(Colony formingunit-Fibroblast，CFU-F)。1991年caplan首次提出间充质干细胞(MSC)的概念¹。2006年提出了定义MSC的最少标准：

1.可以在塑料上生长；

2.高表达特定的标志物CD105，CD73和CD90,并低表达CD45,CD34,CD14/CD11b,CD79a/CD19和HLA-DR；

3.具有自我更新，多向分化潜能及克隆形成能力，可以分化成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞，肌肉细胞以及非中胚层细胞如神经细胞和肝细胞²。MSC来源于胚胎发育早期中胚层，几乎存在于全身结缔组织^3,4。

MSC最早从骨髓造血微环境分离而来，即骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMMSC)，也可从其他组织器官例如脂肪组织、胎盘、脐带血，羊水，羊膜和多种胚胎组织，包括胚胎的血、肝、骨髓、脾、肺¹等体外分离获得。MSC因其可塑性、低免疫原性、抗炎以及抑制损伤后自身免疫反应¹的功能等被广泛的用于细胞治疗和组织工程，包括造血干细胞移植后免疫重建、移植物抗宿主病(acute and chronicgraft versus host disease，GvHD)、儿童成骨不全(children with OsteogenesisImperfecta，O.I.)、代谢紊乱(metabolic disorders)以及骨与软骨变性(bone andcartilage in degenerative disorders)的组织工程再生^5,6。

BMMSC是造血干细胞的微环境细胞，能够促进和维持造血系统的发生以及造血干细胞的生长和分化，当移植造血干细胞同时移植BMMSC，可以提高造血干细胞移植中20％的成功率⁵。而同样在角膜微环境中，存在着一种类似MSC形态和功能的间充质干细胞⁷，即角膜缘微环境细胞(limbal niche cells，LNC)。

角膜缘微环境细胞(limbal niche cell,LNC)是从角膜缘干细胞(limbal stemcell,LSC)微环境中分离培养出的一群具有血管内皮祖细胞和间质干细胞(MesenchymalStem Cell,MSC)先祖细胞功能的原始细胞，能够在体外3D培养条件下支持角膜上皮细胞先祖细胞(limbal epithelial progenitor cells，LEPC)，表现为LEPC表达P63α增加而CK12降低，因此被命名为角膜缘微环境细胞^7-10。

目前，没有分离培养角膜缘微环境细胞的方法。

参考文献

1.Strioga,M.,Viswanathan,S.,Darinskas,A.,Slaby,O.&Michalek,J.Same ornot the same？Comparison of adipose tissue-derived versus bone marrow-derivedmesenchymal stem and stromal cells.Stem cells and development 21,2724-2752,doi:10.1089/scd.2011.0722(2012)；

2.Dominici,M.et al.Minimal criteria for defining multipotentmesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapyposition statement.Cytotherapy 8,315-317,doi:10.1080/14653240600855905(2006)；

3.da Silva Meirelles,L.,Chagastelles,P.C.&Nardi,N.B.Mesenchymal stemcells reside in virtually all post-natal organs and tissues.Journal of cellscience 119,2204-2213,doi:10.1242/jcs.02932(2006).

4.da Silva Meirelles,L.,Caplan,A.I.&Nardi,N.B.In search of the invivo identity of mesenchymal stem cells.Stem cells 26,2287-2299,doi:10.1634/stemcells.2007-1122(2008)；

5.Bernardo,M.E.,Pagliara,D.&Locatelli,F.Mesenchymal stromal celltherapy:a revolution in Regenerative Medicine？Bone marrow transplantation 47,164-171,doi:10.1038/bmt.2011.81(2012).

6.Bernardo,M.E.et al.Optimization of in vitro expansion of humanmultipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches:furtherinsights in the search for a fetal calf serum substitute.Journal of cellularphysiology 211,121-130,doi:10.1002/jcp.20911(2007)；

7.Li,G.G.,Zhu,Y.T.,Xie,H.T.,Chen,S.Y.&Tseng,S.C.Mesenchymal stemcells derived from human limbal niche cells.Investigative ophthalmology&visual science 53,5686-5697,doi:10.1167/iovs.12-10300(2012)；

8.Li,G.G.,Chen,S.Y.,Xie,H.T.,Zhu,Y.T.&Tseng,S.C.Angiogenesispotential of human limbal stromal niche cells.Investigative ophthalmology&visual science 53,3357-3367,doi:10.1167/iovs.11-9414(2012)；

9.Xie,H.T.,Chen,S.Y.,Li,G.G.&Tseng,S.C.Isolation and expansion ofhuman limbal stromal niche cells.Investigative ophthalmology&visual science53,279-286,doi:10.1167/iovs.11-8441(2012)；

10.Li G,Zhang Y,Cai S,Sun M,Wang J,Li S,Li X,Tighe S,Chen S,Xie H,ZhuY.Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for theprevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.Sci Rep.2018Apr26；8(1):6566.doi:10.1038/s41598-018-24862-6.PMID:29700361。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法以及组合鉴定方法。

为实现上述目的，本发明所设计一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：

1)选取完整保留角膜及角膜缘组织的标本，放射状切成等份的角膜缘小片；

2)上述角膜缘小片用胶原酶A消化，然后用胰蛋白酶溶液进行消化，然后再接种于包被有Matrigel基质胶的六孔板上，获得原代的LNC；

3)将原代的LNC置于改良的MESCM(modified embryonic SC medium)胚胎干细胞培养液连续培养传代扩增；当LNC的融合度到达80％时,用胰蛋白酶溶液进行消化；其中，1ml的改良的MESCM胚胎干细胞培养液中各组分含量为：

4)采用Matrigel包被塑料培养板表面，MESCM无血清培养基扩增LNC可维持12代，完成33次细胞倍增，收获1×10¹⁰细胞，即得到人角膜缘微环境细胞。

进一步地，所述步骤2)中，胶原酶A消化条件为：温度为35～37℃，CO₂体积分数为5％，消化时间为8～10h。

再进一步地，所述步骤2)中，胰蛋白酶溶液为含有胰蛋白酶Trysin和EDTA的PBS溶液，消化时间为10～20min；其中，胰蛋白酶Trysin的质量分数为5％；EDTA的质量分数为：2～5％。

再进一步地，所述步骤2)中，Matrigel基质胶的体积分数为5％。

再进一步地，所述步骤3)中，改良的MESCM胚胎干细胞培养液中各组分含量如下表，以1ml计：

本发明还提供了一种上述制备的人角膜缘微环境细胞的组合鉴定方法，所述组合鉴定方法包含细胞形态学检测、细胞表面标志物检测、细胞多向诱导分化潜能检测和体外支持角膜缘干细胞活性检测共4种方法。

其中，a.细胞形态学检测主要为检测人角膜缘微环境细胞LNC直径，其步骤为：细胞的细胞悬液滴于载玻片上，于倒置显微镜下观察，分别于100X、400X放大倍数下拍照，ImageJ软件手动测量1000个以上细胞的细胞直径，并取平均值，计算其分布特征和。

b.细胞表面标志物检测：利用免疫荧光染色、流式细胞仪、RT-qPCR和激光共焦显微镜；检测的细胞标志物包括Oct4、Sox2、Nanog、Rex1、Nestin、N-cadherin、SSEA4、CD34、CD73、CD90、CD105和SCF。

c.细胞多向诱导分化潜能检测：采用相应的细胞诱导分化培养环境，检测扩增的LNC诱导分化为脂肪、成骨及软骨细胞的效率。

d.体外支持角膜缘干细胞活性鉴定：人角膜缘微环境细胞LNC与角膜缘干细胞LSC共同接种在3DMatrigel立体共培养体系中，观察球形生长现象，第10天获取细胞，采用免疫荧光染色、RT-qPCR及WB检测LSC表达p63α及CK12水平变化。

本发明的有益效果：

1)本发明分离培养的人LNC细胞，具有明确的形态、抗原、功能特征，可以用于实验研究或者临床移植材料。

2)本发明涉及的LNC分离培养方法具有很好的可重复性和一致性。

3)本发明的LNC细胞来源于中国人捐献供体，具有独特性。

4)本发明涉及操作符合伦理学及赫尔辛基宣言要求。

5)本发明LNC可以作为临床治疗眼科疾病的移植供体，发挥种子银行作用。

6)本发明LNC特征描述可以作为SFDA设立检验标准的参考依据。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：

1)选取完整保留角膜及角膜缘组织的标本，放射状切成等份的角膜缘小片；

2)上述角膜缘小片用胶原酶A在温度为37℃，体积分数为5％CO₂条件下8～10h消化，然后用胰蛋白酶溶液进行消化10min，然后再接种于包被有体积分数为5％的Matrigel基质胶的六孔板上，获得原代的LNC；其中，胰蛋白酶溶液为含有胰蛋白酶Trysin和EDTA的PBS溶液，消化时间为10～20min；胰蛋白酶Trysin的质量分数为5％；EDTA的质量分数为：2～5％；

3)将原代的LNC置于改良的MESCM(modified embryonic SC medium)胚胎干细胞培养液连续培养传代扩增；当LNC的融合度到达80％时，用胰蛋白酶溶液进行消化；其中，1ml的改良的MESCM胚胎干细胞培养液中各组分含量为：

4)采用Matrigel包被塑料培养板表面，MESCM无血清培养基扩增LNC可维持12代，完成33次细胞倍增，收获1×10¹⁰细胞，即得到人角膜缘微环境细胞。

上述制备的人角膜缘微环境细胞的组合鉴定方法，所述组合鉴定方法包含细胞形态学检测、细胞表面标志物检测、细胞多向诱导分化潜能检测和体外支持角膜缘干细胞活性检测共4种方法：

1)LNC特征描述与鉴定方法

(1)细胞直径的测定

将200微升的总数约1.25x10⁵个细胞的细胞悬液滴于载玻片上，于倒置显微镜下观察，分别于100X、400X放大倍数下拍照，ImageJ软件手动测量1000个以上细胞的细胞直径，并取平均值，计算其分布特征。

(2)抗原表达特征

免疫荧光染色、流式细胞仪及RT-qPCR显示体外培养的LNC胚胎干细胞及MSC标志抗原(RT-qPCR，激光共焦显微镜)。

(3)多向诱导分化潜能

采用相应的细胞诱导分化培养环境，检测扩增的LNC诱导分化为脂肪、成骨及软骨细胞的效率。

2)体外支持角膜缘干细胞活性鉴定

LNC与LSC细胞共同接种在3DMatrigel立体共培养体系中，观察球形生长现象，第10天获取细胞，采用免疫荧光染色、RT-qPCR及WB检测LSC表达p63α及CK12水平变化。

3)LNC特征描述与鉴定方法

(1)细胞直径的测定

将200微升的总数约1.25x10⁵个细胞的细胞悬液滴于载玻片上，于倒置显微镜下观察，分别于100X、400X放大倍数下拍照，ImageJ软件手动测量1000个以上细胞的细胞直径，并取平均值，计算其分布特征。第4代LNC细胞最小直径为4.30μm，最大直径为20.5μm，95％的细胞直径在5.58～14.9μm，平均直径为10.2±2.36μm。

(2)抗原表达特征

免疫荧光染色显示活体LNC表达一组干细胞标志物，包括Oct4、Sox2、Nanog、Rex1、Nestin、N-cadherin、SSEA4、CD34。

免疫荧光染色、流式细胞仪及RT-qPCR显示体外培养的LNC胚胎干细胞及MSC标志抗原(RT-qPCR，激光共焦显微镜)。流式细胞仪分析显示LNC表达MSC干细胞标志物CD73、CD90、CD105水平均高于BM-MSC(P＜0.01)。LNC P4:CD73,95.02％；CD90,96.73％；CD105,92.31％，BM-MSC P4:CD73,68.09％；CD90,96.61％；CD105,19.59％

ELISA分析提示上清液中分泌型SCF(干细胞因子)在LNC(角膜缘微环境细胞)组高于BMMSC(骨髓来源间质干细胞)组,LNC(角膜缘微环境细胞)培养上清液中SCF(干细胞因子)浓度平均为8.24±1.75ng/ml，显著高于BMMSC细胞3.57±2.13ng/ml(P＜0.01)

Western Blot提示LNC(角膜缘微环境细胞)(第四代)表达SCF(干细胞因子)高于BMMSC(骨髓来源间质干细胞)

(3)多向诱导分化潜能

扩增的LNC可以形成克隆生长，诱导分化为脂肪、成骨及软骨细胞。

4)体外支持角膜缘干细胞活性鉴定

在3D立体角膜缘干细胞共培养体系中，LNC(角膜缘微环境细胞)较BMMSC(骨髓来源间质干细胞)能更好支持LSC(角膜缘干细胞)，表现为p63α表达高而CK12低(mRNA)(P＜0.01)。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)选取完整保留角膜及角膜缘组织的标本，放射状切成等份的角膜缘小片；

2)上述角膜缘小片用胶原酶A消化，然后用胰蛋白酶溶液进行消化，然后再接种于包被有Matrigel基质胶的六孔板上，获得原代的LNC；

3)将原代的LNC置于改良的MESCM(modified embryonic SC medium)胚胎干细胞培养液连续培养传代扩增；当LNC的融合度到达80％时，用胰蛋白酶溶液进行消化；

4)采用Matrigel包被塑料培养板表面，MESCM无血清培养基扩增LNC，完成细胞倍增，收获1×10¹⁰细胞，即得到人角膜缘微环境细胞。

2.根据权利要求1所述人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，胶原酶A消化条件为：温度为35～37℃，CO₂体积分数为5％，消化时间为8～10h。

3.根据权利要求1所述人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，胰蛋白酶溶液为含有胰蛋白酶Trysin和EDTA的PBS溶液，消化时间为10～20min；其中，胰蛋白酶Trysin的质量分数为5％；EDTA的质量分数为：2～5％。

4.根据权利要求1所述人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，Matrigel基质胶的体积分数为5％。

5.根据权利要求1所述人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤3)中，改良的MESCM胚胎干细胞培养液中各组分含量如下表，以1ml计：

6.一种权利要求1所述方法制备的人角膜缘微环境细胞的组合鉴定方法，所述组合鉴定方法包含细胞形态学检测、细胞表面标志物检测、细胞多向诱导分化潜能检测和体外支持角膜缘干细胞活性检测共4种方法，其特征在于：

a.细胞形态学检测主要为检测人角膜缘微环境细胞LNC直径，其步骤为：细胞的细胞悬液滴于载玻片上，于倒置显微镜下观察，分别于100X、400X放大倍数下拍照，ImageJ软件手动测量1000个以上细胞的细胞直径，并取平均值，计算其分布特征和；

b.细胞表面标志物检测：利用免疫荧光染色、流式细胞仪、RT-qPCR和激光共焦显微镜；检测的细胞标志物包括Oct4、Sox2、Nanog、Rex1、Nestin、N-cadherin、SSEA4、CD34、CD73、CD90、CD105和SCF；

c.细胞多向诱导分化潜能检测：采用相应的细胞诱导分化培养环境，检测扩增的LNC诱导分化为脂肪、成骨及软骨细胞的效率；

d.体外支持角膜缘干细胞活性鉴定：人角膜缘微环境细胞LNC与角膜缘干细胞LSC共同接种在3DMatrigel立体共培养体系中，观察球形生长现象，第10天获取细胞，采用免疫荧光染色、RT-qPCR及WB检测LSC表达p63α及CK12水平变化。