CN114752688A - 鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法、探针和试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鉴定和筛选人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法、相关检测剂组合和试剂盒以及相关应用。本发明以单细胞分辨率对人类胚胎BM有核细胞(BMNC)进行了全面筛查，使用两种互补策略(STRT和10X基因组学)进行scRNA‑seq分析，鉴定出LIFR+PDGFRB+是MSC的特异性标志物。本发明还发现LIFR+PDGFRB+CD45‑CD31‑CD235a‑MSC可以在体内有效地重建造血微环境。本发明还鉴定了表达TM4SF1+CD44+CD73+CD45‑CD31‑CD235a‑的单能骨祖细胞亚群，其具有成骨潜力。因此，本发明鉴定了两种类型的人类胚胎骨髓MSC，本发明将加深对人类胚胎骨髓来源的MSC的认识以及进一步促进对MSC临床应用的理解。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，并具体涉及一种在单细胞分辨率上通过单细胞转录组学和功能分析从分子和功能上鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法。
背景技术
长期以来，骨髓(bone marrow，BM)来源的间充质干细胞(mesenchymal stromal/stem cell，MSC)一直被描述为可以自我更新并产生基质、骨、软骨和脂肪的细胞类群1-5。然而，过去对MSC的认识主要集中于体外研究，其在体内的真实身份至今尚未完全明确。使用基因编辑小鼠的几项研究表明，小鼠BM中的LepR+、Nestin+和Grem1+基质细胞，除了具有MSC活性外，还是造血干细胞HSC微环境的重要组分，具有支持HSC的功能6-8。尽管在过去几十年中通过转基因小鼠已经扩展了我们对MSC的认识，但由于材料限制，目前对人类BM中不同MSC亚群的了解仍然有限9。
最近，Huelsken的研究小组发现，小鼠BM原代MSC移植后可在体内重建骨髓基质功能，而这些细胞在体外培养2周后再进行移植，则不再具备重建骨髓基质的功能10。另有研究表明，体外培养会显著减少MSC在骨髓和脾脏的归巢11。据报道，CD146可标记人骨髓MSC，然而，当把CD146+细胞在体外进行培养时，CD146表达水平则会发生显著变化13，14。此外，原代MSC在体外扩增后，细胞的DNA甲基化也会发生显著差异15。所有这些研究都清楚地表明，MSC的体外特征并不能真实地反映其体内功能。然而，目前对人类骨髓MSC的了解主要是通过体外培养系统来实现的。因此，鉴定人类骨髓MSC体内真实身份的策略将对以MSC为基础的临床转化应用提供很大的帮助。
单细胞RNA测序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq)技术的最新突破使得研究人员能够以单细胞分辨率研究新鲜分离的原代细胞，并研究人类MSC在体内的真实身份16。另一方面，基于每个细胞的转录组，研究人员可以更好地了解不同MSC类群的复杂性和异质性17。
发明内容
在本研究中，本发明人以单细胞分辨率对人类胚胎BM有核细胞(BMNC)进行了全面筛查(图1a)。本发明人对来源于46个发育周为6周到24周的人类胚胎的原代BMNC，使用两种互补策略(STRT和10X基因组学)进行scRNA-seq分析，以平衡数据准确性。基于系统的生物信息学分析和实验验证，本发明人鉴定了两种类型的人类胚胎骨髓来源的MSC。本发明将加深对人类胚胎骨髓来源的MSC的认识以及进一步促进对MSC临床应用的理解。
本发明提供了基于单细胞转录组学分析的人类胚胎BM有核细胞的表达情况。出乎意料的是，没有检测到目前用于分离MSC的常见细胞表面标志物，如CD146、CD271和PDGFRa，但本发明鉴定出LIFR+PDGFRB+是MSC的特异性标志物。体内移植证明LIFR+PDGFRB+CD45-CD31-CD235a-MSC可以在体内有效地重建造血微环境(hematopoietic microenvironment，HME)。本发明还鉴定了表达TM4SF1+CD44+CD73+CD45-CD31-CD235a-的单能骨祖细胞亚群，其具有成骨潜能，但不能重建HME。在人类胚胎骨髓的不同发育阶段，MSC表达一系列不同的转录因子，提示MSC的干性特征在发育过程中可能会发生改变。此外，与新鲜分离的原代MSC相比，培养后的MSC的表型特征发生了显著变化。本发明提供了单细胞分辨率下人类胚胎骨髓MSC的异质性、发育、体内微环境以及培养前后的总体情况。
因此，在一个方面，本发明涉及鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中LIFR和PDGFRB基因表达阳性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
在一个实施方案中，本发明涉及鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中LIFR和PDGFRB基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
在另一个实施方案中，本发明涉及鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
在又一个实施方案中，本发明涉及鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
在另一方面，本发明涉及筛选细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，将LIFR和PDGFRB基因表达阳性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
在一个实施方案中，本发明涉及筛选细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中将LIFR和PDGFRB基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
在另一个实施方案中，本发明涉及筛选细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，将TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
在又一个实施方案中，本发明涉及筛选细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中将TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
在又一方面，本发明涉及LIFR和PDGFRB作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及LIFR、PDGFRB、CD45、CD31和CD235a作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及TM4SF1、NT5E、CD44、CD45、CD31和CD235a作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
在又一个实施方案中，本发明涉及TM4SF1、CD44和CD73作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及TM4SF1、CD44、CD73、CD45、CD31和CD235a作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
在另一方面，本发明涉及检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中LIFR和PDGFRB基因的表达。
在一个实施方案中，本发明涉及检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中LIFR、PDGFRB、CD45、CD31和CD235a基因的表达。
在另一个实施方案中，本发明涉及检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中TM4SF1、CD44和CD73基因的表达。
在又一个实施方案中，本发明涉及检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中TM4SF1、CD44、CD73、CD45、CD31和CD235a基因的表达。
在又一方面，本发明涉及通过本发明的筛选/分选细胞的方法所获得的间充质干细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的间充质干细胞。
在又一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含本发明的间充质干细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的间充质干细胞。
在又一个实施方案中，本发明涉及本发明的间充质干细胞在制备药物中的用途。
在另一方面，本发明涉及本发明的间充质干细胞用于形成骨组织的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的间充质干细胞用于形成骨组织并重建造血微环境的用途。
本发明从分子和功能层面上在人类胚胎骨髓来源的有核细胞中鉴定出了真正的MSC，同时探索了这群MSC的发育过程。本发明的发现拓展了对MSC的认识，为后续对MSC的研究提供了重要的参考，并有希望加速MSC在临床上的应用，从而造福人类。
附图简要说明
图1显示的是人类胚胎BM基质细胞的表达谱(landscape)(通过10X基因组学scRNA-seq技术对这些细胞进行测序)。图1a为本发明的研究示意图。图1b是UMAP图，其显示的是来源于人类胚胎骨髓的所有FACS分选的CD235a-CD45-CD43-有核细胞的聚类(左)和样品周数大小信息(右)。图1c显示的是图1b中鉴定的每个主要细胞簇代表性标记基因的表达模式。从蓝色到红色的颜色键分别表示从低到高的表达水平。点的大小表示表达某种基因的细胞百分比。图1d显示的是用Monocle 3算法推断的间充质细胞发育轨迹。图1e显示的是来自不同胚胎发育阶段的股骨切片的H&E染色图。
图2显示的是人类胚胎BM中MSC的异质性。图2a显示的是裸鼠移植示意图。图2b是点图(左)和UMAP图(右)，其显示了TM4SF1、CD44和NT5E基因的组合在软骨细胞中的特异性表达。从蓝色到红色的颜色键分别表示从低到高的表达水平。点的大小表示表达某种基因的细胞百分比。图2c显示来源于原代TM4SF1+CD44+CD73+/CD45-CD31-CD235a-单细胞的单克隆移植8周，在体内后形成大量新骨。图2d是UMAP图，其显示了图1b中确定的MPC的聚类结果(左)和发育轨迹(右)。图2e是点图，其显示了图2d中确定的每个群中代表性标记基因的表达水平。图2f是热图，其显示了C01.MSC和C02.CXCL12差异表达的转录因子和表面标志物。从紫色到黄色的颜色键分别表示低到高的表达水平。图2g是小提琴图，其显示了C01.MSC和C02.CXCL12的潜在表面标志物的表达水平。图2h是UMAP图，其显示了LIFR和PDGFRB基因组合在C01.MSC和C02.CXCL12中的特异性表达。图2i显示在源自原代LIFR+PDGFRB+/CD45-CD31-CD235a-单细胞的单克隆移植3周后，出现造血间质(hem)，并在8周成熟。移植3周后形成大量新骨。β-TCP：羟基磷灰石载体。
图3显示的是早期人类胚胎BM基质细胞。图3a是UMAP图，其显示了从早期人类胚胎BM中随机挑选的所有新鲜细胞的三个主要组(左)及其发育阶段(右)。图3b是UMAP图，其显示了间充质细胞中CTHRC1的特异性表达。图3c是UMAP图，其显示了早期有7群间充质细胞。图3d是点图，其显示了在图3c中确定的每个群中代表性标记基因的表达水平。从浅蓝色到深蓝色的颜色键分别表示低到高的表达水平。点的大小表示表达某种基因的细胞百分比。图3e是小提琴图，其显示了C01.Mes和C03.OCP的标记转录因子的表达水平。图3f显示的是在图2d中确定的晚期MSC的发育。热图显示了每个发育阶段的MSC的DEG。从紫色到黄色的颜色键分别表示低到高的表达水平。图3g显示的是MSC发育过程中选择的表达模式。括号中是基因数。图3h显示的是根据MSC发育过程中每个表达模式的基因进行的基因功能分类。
图4显示的是人类胚胎BM间充质细胞的CFU-F活性。图4a显示的是来自人类胚胎CD45-CD31-CD235a-细胞的CFU-F。图4b是人类胚胎BM CD45-CD31-CD235a-细胞的CFU-F测定的研究概况。图4c是小提琴图，其显示的是来源于CD45-CD31-CD235a-单细胞的所有单克隆中代表性表面标记基因的表达水平。图4d是热图，其显示的是TM4SF1+CD44+NT5E+(TCN)克隆与LIFR+PDGFRb+(LP)克隆之间的DEG。从紫色到黄色的颜色键分别表示从低到高的表达水平。图4e是TCN和LP克隆在来源于CD45-CD31-CD235a-单细胞的所有26个克隆中的特征评分。
图5显示的是原代和培养的BM间充质细胞之间的比较。图5a是PCA图，其显示的是原代和培养的BM间充质细胞之间的关系。图5b显示的是原代和培养的BM间充质细胞的发育拟时间分析。图5c显示的是将细胞沿着发育拟时间分成28个区间(bin)。每个区间包括50个细胞，热图显示了每个区间的DEG。将所有的区间根据其表达模式分成4个主要亚群。右侧列出了根据每个亚群中所有DEG进行的基因功能分类。括号中的数字表示–log10(P值)。图5d显示的是DEG(左)和GO(右)的基因功能分类信息，其显示的是新鲜分离的LP细胞和LP克隆表现出高度的异质性。图5e显示的是DEG(左)和GO(右)的基因功能分类信息，其显示的是新鲜分离的TCN细胞和TCN克隆表现出极高的异质性。
图6显示的是MSC和体内微环境之间的细胞间通讯。图6a显示的是C01.MSC与造血细胞之间的细胞相互作用。图6b显示的是C02.CXCL12与造血细胞之间的相互作用。图6c显示的是MSC和造血细胞之间独特的配体-受体对。不同的红色配体-受体对表示C01.MSC和C02.CXCL12之间的差异。图6d显示的是C01.MSC与间充质细胞之间的细胞相互作用。图6e显示的是C02.CXCL12与间充质细胞之间的细胞相互作用。
图7显示的是人类胚胎BMNC的表达谱(通过10X基因组学scRNA-seq技术对细胞进行测序)。图7a是UMAP图，其显示的是未经FACS分选的人类胚胎BMNC的聚类(左)和样品周数大小(右)。图7b是点图，其显示的是图7a中确定的每个主要群中代表性标记基因的表达模式。从蓝色到红色的颜色键分别表示从低到高的表达水平。点的大小表示表达某种基因的细胞百分比。图7c是流式细胞术分析图，其显示的是使用20周大的胚胎为例的CD45-CD31-CD235a-骨髓有核细胞。图7d是热图，其显示的是图1b中确定的群的DEG。从紫色到黄色的颜色键分别表示从低到高的表达水平。图7e显示的是基于图7d中确定的群的DEG的GO基因功能分类信息。图7f显示的是来自不同胚胎发育阶段的股骨切片的油红O染色图。
图8显示的是FACS分选的人类胚胎BM来源的干细胞。图8a显示的是TM4SF1+CD44+CD73+/CD45-CD43-CD235a-BMNC的流式细胞术分析图。图8b显示的是在TM4SF1+CD44+CD73+/CD45-CD43-CD235a-BMNC中的软骨细胞代表性标记基因表达水平的条形图。图8c显示的是LIFR+PDGFRB+/CD45-CD43-CD235a-BMNC的流式细胞术分析图。图8d是小提琴图，其显示的是在LIFR+PDGFRB+/CD45-CD43-CD235a-BMNC中MSC代表性标记基因表达水平。
图9显示的是早期人类胚胎BMNC的表达谱。图9a是UMAP图，其显示的是通过STRTscRNA-seq技术分析人类胚胎BM中造血细胞的标记基因。图9b是UMAP图，其显示的是人类胚胎BM中造血细胞群(左)。图9b的右边显示的是每个群的代表性标记基因。图9c是小提琴图，其显示的是10X数据集的间充质细胞的代表性标记转录因子的表达水平。图9d显示的是MSC发育过程的表达模式。括号中是基因数。图9e是小提琴图，其显示的是选定表达模式的代表性标记基因的表达水平。
图10显示的是TCN克隆与LP克隆之间的比较。图10a是PCA分析图，其展示了TCN克隆和LP克隆之间明显差异。图10b是使用TCN克隆和LP克隆的DEG进行KEGG的基因分类。
图11显示的是在发育拟时间图中映射的培养的间充质细胞的时间信息(上图和中图)以及在发育拟时间图中映射的拆分区间信息(下图)。
图12显示的是MSC和造血细胞之间的细胞相互作用。
图13显示的是骨髓MSC与人类胚胎骨骼干细胞(SSC)之间的比较。图13a显示的是在本发明的研究中鉴定的骨髓MSC与Longaker组鉴定的SSC有很大不同。图13b显示的是UMAP图上映射的代表性标记基因的表达水平。圈出并显示了与标记基因相关的细胞类型。
具体实施方式
本发明可通过以下实施方案进行实施，但本发明并不限于此。
应当理解的是，本发明不涉及对人类胚胎的具体操作，本发明仅使用来源于人类胚胎骨髓的细胞进行研究、鉴定与分析。
实施例
方法
伦理学声明
本研究得到北京大学第三医院生殖研究伦理委员会的批准(2012SZ-013和2017SZ-043)。每位捐赠者均签署知情同意书，并且研究是按照ISSCR指南进行的。
单细胞RNA-seq文库构建
本发明人制备了2.5μl的单细胞裂解缓冲液，其中含有0.8U/μl重组RNA酶抑制剂(Takara,Cat.2313B)、0.38％Triton-X 100(Sigma,Cat.T8787)、2mM dNTP混合物(Takara,Cat.4019)和300nM RT引物。96种类型的编码序列(6-bp编码)用作每个细胞的RT引物并且对应于一个编码。通过口吸管将单细胞转移到0.2ml PCR管中的裂解缓冲液中。将所选细胞存储于零下80摄氏度下或者直接进行反转录和扩增。根据STRT-seq34，35并对RT引物进行少许修改来进行单细胞转录组学扩增步骤。经过18个循环扩增后，将不同编码的cDNA汇集在一起，并使用DNA Clean and Concentration Kit(ZYMO,Cat.D5044)进行纯化，以去除引物二聚体和游离引物。然后使用含有Illumina read2引物序列和索引的生物素引物进行第二轮扩增。经过4个PCR循环之后，使用Covaris S220将cDNA进一步片段化，并且使用C1链霉抗生物素蛋白珠(Invitrogen,Cat.65002)富集第一链cDNA的5’部分。使用KAPA Hyper PrepKits for Illumina(Cat.KK8505)按照手册进行进一步的文库构建。将每个单细胞设计用于Illumina HiSeq 4000平台上的0.5G数据，使用150-bp双末端读数。
10X基因组学
将细胞在4摄氏度下500g离心5分钟。然后，除去上清并用0.04％BSA/PBS将细胞沉淀洗涤一次。在显微镜下计算浓度，然后将其加载到10X基因组学Chromium芯片上。使用10X基因组学Single Cell v2试剂盒按照手册进行反转录、cDNA扩增和文库构建。在Illuminahiseq4000上对每个文库进行测序，以获得超过90％的测序饱和度。
单细胞RNA-seq数据的处理
对于10X数据集，本发明人使用带有默认映射参数的Cell Ranger 2.2.0来处理原始数据。将读数与人类GRCh38基因组进行比对。
对于STRT数据集，本发明人使用UMI-tools36来提取来自R2读数的编码和唯一分子标识符(unique molecular identifier，UMI)。从获得的读数中删除了模板开关寡核苷酸和多聚腺苷尾序列。随后，使用STAR将干净的读数与人类GRCh38基因组进行比对37。使用Feature Counts38来计算唯一映射的读取并使用UMI-tools定量UMI。
获得UMI表达表之后，对于STRT数据集，本发明人删除了检测到的基因少于1000个和检测到的转录本少于10000个的细胞；对于10X数据集，本发明人删除了检测到的基因少于200个的细胞。还删除了线粒体基因高表达的细胞。使用Seurat package(version 2.2)39(详细细节可参见http://satijalab.org/seurat/)进行聚类分析，选择高度可变的基因来进行降维。本发明人使用Harmony来减少由胚胎差异引起的批次效应(https://github.com/immunogenomics/harmony)19。Seurat中基于图的聚类方法用于确定最终聚类。
差异表达基因(differentially expressed gene，DEG)分析和基因本体(geneontology，GO)基因功能分类分析
采用Seurat进行DEG分析。使用FindAllMarkers来确定每个群的DEG，使用Seurat中的FindMarkers函数来确定两个给定群的DEG。在Seurat中绘制热图或者使用heatmap软件包绘制热图；使用Seurat软件包生成小提琴图；并且在R中生成条形图。在clusterProfiler40和Metascape41(http://metascape.org)中进行基因本体基因功能分类分析。
发育拟时间分析
使用Monocle中的UMI计数推断MSC的发育拟时间42，43。对于图3a中所示的新鲜分离的MSC，由于本发明人已经获得这两个MSC群的标记基因，本发明人利用这些基因来推断发育拟时间。对于所有MSC，结合新鲜和培养的MSC，本发明人按照vignette中的“无监督排序(unsupervised ordering)”以默认参数构建单细胞轨迹。
细胞分选
将新鲜收获的BMNC重悬于冰冷的HBSS+(补充有2％FBS、10mM HEPES和1％青霉素/链霉素的汉克斯平衡盐溶液)中，接着在冰上用荧光染料偶联或同种型对照抗体染色30分钟。本发明中使用的抗体如下：抗CD45-APC(BioLegend,clone 2D1,1:200)、抗CD45-FITC(BioLegend,clone 2D1,1:200)、抗CD45-Pacific Blue(BioLegend,clone 2D1,1:200)、抗CD31-APC(BioLegend,clone WM59,1:200)、抗CD31-Pacific Blue(BioLegend,cloneWM59,1:200)、抗CD235a-FITC(Biolegend,clone HI264,1:200)、抗CD235a-Pacific Blue(Biolegend,clone HI264,1:200)、抗CD43-PEcy7(Biolegend,clone CD43-10G7)、抗CD44-PE(Biolegend,clone BJ18,1:200)、抗CD73-APCcy7(BioLegend,clone AD2,1:200)、抗TM4SF1-FITC(Miltenyi Biotec,clone REA851,1:200)、抗CD118-PE(BD,clone,1:200)、抗CD140b(PDGFRβ)-APC(BioLegend,clone 18A2,1:200)和抗TM4SF1-Alexa Fluor 405(RandD,FAB8164V,1:100)。在三激光MoFlo(Dako)或FACSCalibur(BD)流式细胞仪上进行流式细胞术分析和分选，使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。
移植
将来自单克隆的约103-104个细胞与β-TCP载体(Bicon,Boston,MA,USA)混合，然后植入到裸鼠背侧皮下。移植4周后和移植8周后分别采集标本，通过二氧化碳窒息法处死动物。将骨构建体在4％多聚甲醛中固定，然后在10％EDTA(pH 7.4)中脱钙10天。脱钙后，将标本脱水并随后包埋到石蜡中。本发明中进行的所有动物实验均经北京大学生物医学伦理委员会实验动物伦理委员会批准。
组织学染色
将骨组织固定在4％多聚甲醛中，4度条件下固定，然后在室温下在14％EDTA溶液(EDTA溶解在Milli-Q水中，用氢氧化铵将pH值调节至7.1)中脱钙5-35天(每24小时更换一次新鲜的14％EDTA溶液)。完全脱钙后，将骨在PBS中洗涤2小时，在4摄氏度下，30％蔗糖中浸泡并在持续搅拌下过夜，最后包埋在石蜡中。然后用苏木精和伊红(H&E)和油红O染色对切片(5-μm厚)进行染色。
数据可用性
本发明所产生的所有测序数据存储于Gene Expression Omnibus(登录号GSE113037)。已创建以下安全令牌以允许在记录GSE113037仍处于私有状态时对其进行查看：almnqyuqprunvcz。
实施例1-人类胚胎骨髓基质细胞表达谱
为了探索人类胚胎BM基质细胞的多样性，本发明人使用10X基因组学和scRNA-seq技术对BMNC进行了单细胞转录组分析。
由于BM充满了红细胞，本发明人用冰冷的无菌水裂解掉红细胞18。为了测试实验方案的可行性，获得了来源于两个胚胎(即：20周和21周大)的2,634个通过质量控制的单细胞。本发明所使用的来源于人类胚胎骨髓的有核细胞获取自北京大学第三医院。
结果表明，本发明人在Harmony中确定了12个具有批量效应校正的集群，在Seurat中确定了无监督集群(图7A)19，20。根据经典标记基因，这些簇被注释为：两个红细胞亚群(分别特异性表达GYPA和HBG1)；嗜碱性粒细胞(CSF2RB)；骨髓细胞(PLEK)；中性粒细胞(AZUJ)；单核细胞(CSTA)；自然杀伤细胞(SPINK2)；三个B细胞亚群(分别高表达CD79A、LTB和JCHAIN)；巨噬细胞(CSF1R)和间充质细胞(表达胶原三螺旋重复蛋白-1(CTHRC1))(图7b)。
接下来，为了捕获相对稀有的BM基质细胞，本发明人对分选的非造血CD235a-CD45-CD43-细胞进行了scRNA-seq(图7c)，并且获得来源于9个胚胎(11-22周)的8,725个分选的细胞。
如图1b所示，人类胚胎BM CD235a-CD45-CD43-细胞分成11个群。基于差异表达基因DEG和基因本体GO的基因功能分类(图1c；图7d-e)，本发明人将其注释为七个间充质细胞群、三个造血细胞群和一个内皮细胞群。分选的细胞多为非造血细胞，这表明FACS分选的准确性。在七个间充质细胞群中，本发明人鉴定出四个群表现出成骨细胞(osteoblast，OB)谱系的发育轨迹，从OB祖细胞到成熟OB(OB-P1、OB-P2、OB-P3和OB)。本发明人还检测到一个具有软骨细胞谱系的群(特异性表达ACAN)和一个循环间充质细胞的群。重要的是，本发明人发现了一群没有明显分化特征的间充质祖细胞(高表达CYP1B1)，其被命名为间充质祖细胞(MPC)(图1c)。该结果也得到由Monocle推断的发育轨迹的支持(图1d)21。此外，无论是在单细胞数据中还是股骨切片的H&E和油红O染色中均没有检测到任何脂肪细胞(图1e和图7f)，这证明了人类胚胎BM中脂肪细胞的稀少。
实施例2-人类胚胎BM中MSC的异质性
最近的一项研究阐明，围产期软骨细胞形成了大部分新的成骨细胞，并随着年龄的增长而逐渐减少22。因此，本发明人对软骨细胞群进行了实验测试，方法是将分选的单细胞分别接种于96孔板中，然后用β-TCP载体将扩增的集落移植到裸鼠背侧皮下(图2a)。
如图2b所示，软骨细胞群特异表达表面标志物CD44、NT5E、TM4SF1。随后，本发明人通过FACS分选收获CD44+CD73+TM4SF1+/CD45-CD31-CD235a-细胞(图8a)。STRT分析进一步证实了FACS的准确性(图8b)。
结果发现，由单个CD44+CD73+TM4SF1+细胞扩增的集落能够有效地形成骨组织(图2c)。因此，本发明人的研究结果与围产期软骨细胞能够产生新的成骨细胞的最新发现一致22。
本发明人还进一步使用FACS抗体ENPP1和ANKH分选OB祖细胞(OB-P1、OB-P2、OB-P3)。但是，来源于ENPP1+/ANKH+单细胞的单克隆不能形成新骨(数据未显示)。骨髓中的MSC被认为是具有三谱系分化能力的多能干细胞，即能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞7，23，24，但是，MSC在体内的确切身份尚不清楚。
随后，本发明人通过亚群和发育轨迹分析将MPC分成五个主要亚群，即MSC(C01.MSC)、CXCL12+MSC(C02.CXCL12)、软骨祖细胞(C03.Chon-P)和两个OB祖细胞亚群(C04.Ob-P1和C05.Ob-P2)(图2d-e)。具体而言，一个亚群显著表达关键的成骨细胞特异性基因ASPN和BGLAP(C04.Ob-P1)；另一个亚群高表达EPYC和HAPLN1，其被注释为软骨祖细胞(C03.Chon-P)。实际上，OB祖细胞和软骨祖细胞都可以从骨髓间充质干细胞分化而来。
为了对MSC进行实验验证，本发明人首先选择有效表面标志物。如图2f-h所示，在C01.MSC和C02.CXCL12中，LIFR和PDGFRB表现出良好的表达模式。与LIFR相比，C01.MSC中ENG的表达水平更低。
接下来，本发明人通过分选LIFR+PDGFRB+/CD45-CD31-CD235a-细胞用于裸鼠移植，验证了这两个MSC亚群(图2i；图8c)。STRT分析首先验证了FACS的准确性(图8d)。如上所述，将单个LIFR+PDGFRB+/CD45-CD31-CD235a-细胞接种于96孔板，两周后，收获单克隆集落并移植到裸鼠背侧。如图2i所示，移植4周后观察到大量新生的骨小骨。移植8周后，造血细胞明显出现，这与骨髓中发现的造血细胞相似。
实施例3-MSC发育早期和晚期的差异
为了追踪人类胚胎MSC的起源，本发明人试图捕获更早发育阶段的间充质细胞(6-9周)。但是，由于在发育早期获得的细胞数量有限，本发明人没有使用10X基因组学scRNA-seq技术，而是通过随机挑选的方法收集细胞，并使用STRT scRNA-seq技术对细胞进行了测序。本发明人从来源于6-24周龄的17个胚胎的细胞中总共得到了2,989个高质量单细胞转录组。
本发明人在STRT数据集中确定了3个主要的组，即，内皮细胞(特异性表达CDH5)、间充质细胞(高表达CTHRC1，胶原三螺旋重复蛋白-1)和造血细胞(高表达PTPRC和GYPA)(图3b，图9a-b)。值得注意的是，在发育后期阶段(9周后)的大多数测序细胞是造血细胞，这与10X数据集一致(图3a)。间充质细胞进一步分成7个亚群(图3c)。基于DEG，本发明人将其注释为间充质祖细胞(C01.Mes，高表达MMP13)；循环祖细胞(C02.Cyc，以MKI67表达为特征)；骨软骨祖细胞(C03.OCP，OGN和SFRP2上调)；软骨祖细胞(C04.Chon，高表达COL2A1)；晚熟软骨细胞(C05.ChonL，高表达EPYC)；成骨细胞(C06.Ob；骨相关基因BGLAP特异性上调)和肌细胞(C07.Myocyte，特异性表达MYOG)(图3d)。
转录因子(transcription factor，TF)在多种生物过程中发挥着重要作用。本发明人发现，在发育早期的人类胚胎骨髓间充质细胞中，EGR2、EGR3、HLX、HIVEP3和CEBPB可在C01.Mes中发挥重要作用，而EBF2、CREB5、NR4A1、MEOX2、EBF3和MKX是调节软骨细胞的特异性TF(C04.Chon)(图3e)。但是，对于后期(11周-22周)的MSC，情况则完全不同。如图9c所示，SNAI2可在MSC中发挥关键作用，而MAF、TSC22D3、HES1、KLF10、TCF7L2是调控软骨细胞的特异性TF。
在10X数据集中，本发明人获得了来源于11-22周的不同发育阶段7个人类胚胎骨髓MSC，这给研究MSC的发育提供了机会。本发明人基于它们的不同发育周数对人类胚胎骨髓MSC进行差异表达分析。
如图3f所示，不同发育周数的人类胚胎骨髓MSC表现出其独特的表达模式，表明人类胚胎骨髓MSC从11周到22周的持续发育。接下来，基于其基因表达模式，本发明人将人类胚胎骨髓MSC表达的基因分成11个组(图9d)。其中，第1组和第4组基因的表达水平显示出增加的趋势，第1组和第3组基因的表达水平表现出下降的趋势，第8组基因的表达水平是上调的且在15周达到峰值并且然后下调直至22周(图3g)。这四组基因参与了不同的生物学过程，在人类胚胎骨髓MSC的发育过程中发挥了重要作用(图3h，图9e)。
实施例4-人类胚胎BM中的CFU-F的检测
为了评估间充质细胞的CFU-F活性，本发明人将来源于一例15周胚胎的新鲜分选的单个CD31-CD45-CD235a-BMNC接种到96孔板中，并在培养2周后检测到3个扩增的集落(图4a)。为了进一步评估CFU-F比率，我们将来源于一对17周双胞胎的胚胎的1,056个新鲜分选的CD31-CD45-CD235a-BMNC以单细胞接种于11个96孔板后进行培养，培养2周后观察到26个集落(图3b)。然后，将这些集落消化并进行scRNA-seq分析。
令人惊讶的是，许多先前被证明可用于标记MSC的标志物(例如THY1、ENG、NT5E、CD44、ITGAV)在所有集落中均高表达。黑素瘤细胞粘附分子(MCAM，也称为CD146)在这些集落中的表达水平差异很大，在一些集落中高表达，而在另一些集落中几乎不表达。值得注意的是，被认为用于标记未培养的多能MSC的低亲和力神经生长因子受体(LNGFR/CD271)在所有26个集落中都不表达(数据未显示)。
为了探寻在这26个集落中有多少集落来自BM来源的干细胞，接下来，本发明人使用STRT-seq分析检查了来源于分选的单个TM4SF1+CD44+NT5E+和LIFR+PDGFRB+细胞的单克隆(图10a-b)。然后，本发明人使用LIFR+PDGFRB+和TM4SF1+CD44+NT5E+单克隆之间的DEG作为它们自己的特征基因来计算这些来源于全部BMNC的26个集落的特征得分。
本实施例结果发现，只有一小部分CFU被认为来自上述两种干细胞群(图4d-e)。实际上，BM中真正的单个干细胞能够形成克隆，但反过来，不是所有单克隆都来自于单个的干细胞。因为只有部分CFU-F在体内移植时是多能的23。
实施例5-原代MSC和培养MSC的比较
本领域先前的研究表明，在扩增过程中，MSC逐渐失去增殖能力和分泌特性26，27。接下来，本发明人对新鲜分离的BMNC和培养的BMNC进行了比较，以评估可能的变化。
由于培养的细胞来源于18和24周的胚胎，本发明人将来源于相似发育阶段(16-26周)的胚胎的新鲜BMNC和培养的细胞结合起来进行后续分析。主成分分析PCA的第一轴将新鲜细胞和培养的细胞分开，而第二轴沿着培养阶段对培养的细胞进行排序，这表明在体外培养过程中基因表达模式发生了巨大变化(图5a)。通过Monocle进行的发育拟时间分析也沿着培养阶段对新鲜细胞和培养的细胞进行分类(图5b)。本发明人沿着推断的发育拟时间将所有这些细胞分成28个区间，每个区间包括50个细胞(图5c，图11)。接下来，本发明人针对每个区间进行DEG分析，发现这些细胞可以根据它们的基因表达模式分成4个主要群(C1-C4)(图5c)。每个群中的DEG都表现出一般的增殖与分化过程。C1由新鲜间充质细胞组成，C1的DEG主要与细胞外基质、胶原生物合成和血管发育有关，提示其具有新鲜间充质细胞的特征。C2中的细胞经历了活跃的增殖期，然后在C3中分化。出乎意料的是，C4类群的细胞显示p53信号传导通路的激活，反映了培养更长时间的MSC的衰老状态。
本发明人进一步比较了新鲜分离的LIFR+PDGFRB+细胞与单个LIFR+PDGFRB+来源的单克隆，TM4SF1+CD44+NT5E+细胞与其单克隆之间的异同。在这两种细胞的培养过程中，与细胞外基质组织、细胞外结构组织和成骨有关的基因表达下调，而线粒体翻译相关基因表达则上调。此外，与原代LIFR+PDGFRB+细胞培养前后相比，新鲜TM4SF1+CD44+NT5E+细胞与其培养后的克隆表现出更强的差异。
实施例6-人类胚胎BM的细胞间通讯
对细胞间通讯的研究极大地增加了对干细胞-体内微环境细胞相互作用的理解。为了全面了解人类胚胎骨髓中MSC的微环境，本发明人首先阐明了MSC和造血细胞(HC)之间的相互作用。当以MSC为配体时，本发明人发现造血细胞中的大多数细胞，包括嗜碱性粒细胞、骨髓细胞、中性粒细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、B细胞和巨噬细胞与MSC关系密切(图6a)。事实上，MSC高度富含维持HSC的关键因子，如细胞因子趋化因子配体12(CXCL12)和干细胞因子(SCF)，并且CXCR4被所有类型的HC细胞用作受体(图12)28-31。相反，当以MSC为靶点时，本发明人观察到并不是所有的造血细胞都与MSC有密切的相互作用(图6a)。当以MSC为配体时，在细胞间通讯中可见活跃的配体-受体对。与MSC一样，CAR细胞以相同的方式与造血细胞相互作用(图6b)。
本发明人还确定了每种HC细胞类型与MSC的独特相互作用(图6c)。例如，只有表达ITGA2B和ITGB3的骨髓细胞，作为MSC发送的配体TNC的受体；而MSC发送的ANGPTL1和ANGPTL4，只能被表达SDC3、CDH5、(ITGA5和ITGB1)和TEK的巨噬细胞作为受体来接收。此外，MSC和CAR细胞也与HC有独特的相互作用，例如MSC的SEMA5A-PLXNA1、ITGA4-(ITGB1+VCAM1)和HLA-DRB1-CD4，以及CAR细胞的NAMPT-(ITGA5+ITGB1)、JAG1-NOTCH4、GAS6-AXL。接下来，本发明人探讨了MSC和间充质细胞之间的细胞相互作用。如图6d-e所示，无论MSC用作配体还是靶点，它们与其他基质细胞的相互作用都非常强。CAR细胞和间充质细胞之间也存在同样的情况。
讨论
单细胞RNA测序(scRNAseq)技术已经帮助人们对小鼠骨髓中的异质群体有了全面的认识16，17，但是，由于材料上的限制，我们对人类胚胎骨髓的细胞群的相关了解仍然十分有限。在最近的一项研究中，Chan等人在人类胚胎中发现了一群骨骼干细胞(skeletalstem cell，SSC)，它们可以分化为软骨和骨/基质32。本发明人下载了他们的scRNA-seq数据集并将其与本发明人的数据集进行整合。但是，与本发明人目前在人类胚胎BM中观察到的MSC相比，在他们的数据集中没有发现我们所鉴定的MSC细胞群(图13)。这表明本研究中鉴定的MSC与他们发现的SSC是不同的谱系。
Chiara等人在scRNA-seq实验中研究了分离方法对细胞群的影响16。他们分别分析了通过冲洗未消化的髓腔和通过酶消化粉碎的整块骨头的细胞，证明只有在高强度物理处理或酶消化后才能检测到某些细胞群。此外，Ninib等人还证明了小鼠骨骼和骨髓之间不同的细胞组成17。在小鼠BM中的这些观察结果可能解释了通过酶消化的骨骼中释放出来的人类胚胎SSC33，与本发明人发现的从未消化的直接冲洗的骨髓中释放出来的人类胚胎MSC之间的差异。
尽管MSC治疗在临床前和临床试验中都有良好的效果，但越来越多的研究已经发现其疗效存在好坏参半的结果。基于MSC的细胞疗法面临的一个关键问题是在使用前须大量扩增细胞。在本发明中，基因表达谱表明，新鲜MSC和培养的MSC之间存在明显的差距。与新鲜分离的细胞相比，体外扩增培养后的细胞发生明显改变，此外，对MSC在体内微环境的展示，将是指导本发明人继续寻找维持体内MSC原始特性的最佳培养条件的重要线索。探索可保留MSC原有特征和祖细胞功能的体外培养方法，对MSC细胞治疗将会有很大帮助。
以上所述仅为本发明的具体实施方案，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。
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本发明包括以下实施方案：
1.鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中LIFR和PDGFRB基因表达阳性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
2.根据实施方案1所述的鉴定方法，其中LIFR和PDGFRB基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
3.鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
4.根据实施方案3所述的鉴定方法，其中TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
5.筛选细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，将LIFR和PDGFRB基因表达阳性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
6.根据实施方案5所述的筛选方法，其中将LIFR和PDGFRB基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
7.筛选细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，将TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
8.根据实施方案7所述的筛选方法，其中将TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
9.LIFR和PDGFRB作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
10.LIFR、PDGFRB、CD45、CD31和CD235a作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
11.TM4SF1、CD44和CD73作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
12.TM4SF1、CD44、CD73、CD45、CD31和CD235a作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
13.检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中LIFR和PDGFRB基因的表达。
14.检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中LIFR、PDGFRB、CD45、CD31和CD235a基因的表达。
15.检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中TM4SF1、CD44和CD73基因的表达。
16.检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中TM4SF1、CD44、CD73、CD45、CD31和CD235a基因的表达。
17.通过根据实施方案5-8中任一项所述的方法获得的间充质干细胞。
18.药物组合物，其包含根据实施方案17所述的间充质干细胞。
19.试剂盒，其包含根据实施方案17所述的间充质干细胞。
20.根据实施方案17所述的间充质干细胞在制备药物中的用途。
21.根据实施方案17所述的间充质干细胞用于形成骨组织的用途。
22.根据实施方案17所述的间充质干细胞用于形成骨组织并重建造血微环境的用途。
23.试剂盒，其包含根据实施方案13-16中任一项所述的检测剂组合。
24.根据实施方案13-16中任一项所述的检测剂组合，其为探针组合、引物组合或抗体组合。
25.根据权利要求24所述的检测剂组合，其为探针组合。
26.根据权利要求24所述的检测剂组合，其为引物组合。
27.根据权利要求24所述的检测剂组合，其为抗体组合。
28.根据权利要求1-8中任一项的鉴定或筛选方法，其中所述检测包括检测mRNA水平、蛋白水平和/或蛋白活性水平。
29.根据权利要求1-8中任一项的鉴定或筛选方法，其中所述检测包括测序技术。
30.根据权利要求1-8中任一项的鉴定或筛选方法，其中所述检测单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术。
31.根据权利要求1-8中任一项的鉴定或筛选方法，其中所述检测还包括检测转录因子的表达水平。
32.根据权利要求1-8中任一项的鉴定或筛选方法，其中所述检测还包括评估间充质干细胞的CFU-F活性。
33.根据权利要求1-8中任一项的鉴定或筛选方法，其中所述检测还包括扩增所述间充质干细胞。
Claims (10)
1.鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中LIFR和PDGFRB基因表达阳性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境；任选地，其中LIFR和PDGFRB基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
2.鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，其中TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力；任选地，其中TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
3.筛选细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，将LIFR和PDGFRB基因表达阳性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境；任选地，其中将LIFR和PDGFRB基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其能够在体内有效地形成骨组织并重建造血微环境。
4.筛选细胞的方法，其包括检测待测样品的基因表达水平，将TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力；任选地，其中将TM4SF1、CD44和CD73基因表达阳性且CD45、CD31和CD235a基因表达阴性的细胞筛选为人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞，其具有成骨潜力。
5.LIFR和PDGFRB作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途；任选地，LIFR、PDGFRB、CD45、CD31和CD235a作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
6.TM4SF1、CD44和CD73作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途；任选地，TM4SF1、CD44、CD73、CD45、CD31和CD235a作为标志物在制备用于识别人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的试剂盒中的用途。
7.检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中LIFR和PDGFRB基因的表达；任选地，所述检测剂组合用于检测样品中LIFR、PDGFRB、CD45、CD31和CD235a基因的表达。
8.检测剂组合，所述检测剂组合用于检测样品中TM4SF1、CD44和CD73基因的表达；任选地，所述检测剂组合用于检测样品中TM4SF1、CD44、CD73、CD45、CD31和CD235a基因的表达。
9.通过根据权利要求3或4所述的方法获得的间充质干细胞。
10.药物组合物，其包含根据权利要求9所述的间充质干细胞。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114752688B (zh) | 2024-02-23 |
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