CN111133099A - 神经纤毛蛋白-1（nrp1）作为细胞表面标志物用于分离人心脏心室祖细胞的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了NRP1作为细胞表面标志物用于分离人心肌原性心室祖细胞(HVP)，特别是优先分化为心脏心室肌细胞的祖细胞。还提供了通过单细胞测序鉴定的其他HVP细胞表面标志物。本发明提供了分离NRP1+心室祖细胞及其大规模扩增和繁殖的体外方法。还提供了分离的NRP1+心室祖细胞的大量克隆群。还提供了体内使用NRP1+心室祖细胞进行心脏修复或改善心脏功能的方法。还提供了使用NRP1+心室祖细胞进行测试化合物的心脏毒性筛选的方法。

Description

神经纤毛蛋白-1(NRP1)作为细胞表面标志物用于分离人心脏 心室祖细胞的用途

相关申请

本申请要求于2017年8月23日提交的美国临时申请No.62/549,345的优先权日的权益。该临时申请的内容通过引用整体并入本文。

背景技术

主要由心肌梗死引起的心力衰竭是全世界成人和儿童的主要死亡原因，并且在世界范围内呈指数增长(Bui,A.L.et al.(2011)Nat.Rev.Cardiol.8:30-41)。该疾病主要由心肌损伤期间发生的心室肌丧失驱动(Lin,Z.and Pu,W.T.(2014)Sci.Transl.Med.6:239rv1)，并由于可以忽略的成年人心脏增加再生反应的能力而加剧(Bergmann,O.et al.(2009)Science 324:98-102；Senyo,S.E.et al.(2013)Nature 493:433-436)。尽管心脏移植可以治愈疾病，但人类心脏器官供体的供应量明显有限，导致对可再生来源的纯净、成熟且功能性的人心室肌组织的临床需求普遍未得到满足(Segers,V.F.M.and Lee,R.J.(2008)Nature 451:937-942；

D.et al.(2014)Development 141:4418-4431)。

人类万能干细胞(hPSC)提供了产生大量功能性心肌细胞的潜力，用于受损或患病心脏中的功能的潜在临床恢复。已经提出将干细胞移植到心脏中以改善心脏功能和/或富集并再生受损的心肌(参见例如美国专利公开20040180043)。还提出了组合疗法，其中将成体干细胞与用生长因子蛋白的疗法联合给药(参见例如美国专利公开20050214260)。

尽管将细胞移植到心脏为改善心脏功能和再生心脏组织提供了一种有前途的方法，但是移植什么类型的细胞的问题却一直是许多研究的主题。研究用于再生心脏组织的细胞类型包括骨髓细胞(参见例如Orlic,D.et al.(2001)Nature 410:701-705；Stamm,C.et al.(2003)Lancet 361:45-46；Perin,E.C.et al.(2003)Circulation 107:2294-2302)、成体干细胞(参见例如Jackson,K.A.et al.(2001)J.Clin.Invest.107:1395-1402)、骨髓来源的间充质干细胞(参见例如Barbash,I.M.et al.(2003)Circulation 108:863；Pettinger,M.F.and Martin,B.J.(2003)Circ.Res.95:9-20)、骨髓基质细胞(Bittira,B.et al.(2003)Eur.J.Cardiothorac.Surg.24:393-398)、间充质干细胞和胎儿心肌细胞的组合(参见例如Min,J.Y.et al.(2002)Ann.Thorac.Surg.74:1568-1575)以及骨髓来源的单核细胞与骨髓来源的间充质干细胞的组合(参见例如美国专利公开20080038229)。还提出了在体外对成年哺乳动物心肌细胞进行去分化以产生用于移植的心脏干细胞(参见例如美国专利公开20100093089)。

细胞移植以改善心脏功能并再生心脏组织的方法的重大进步是鉴定和分离了一系列能产生心肌细胞、心脏平滑肌和心脏内皮细胞的多能心脏祖细胞(Cai,C.L.et al.(2003)Dev.Cell.5:877-889；Moretti,A.et al.(2006)Cell 127:1151-1165；Bu,L.et al.(2009)Nature 460:113-117；美国专利公开20060246446)。这些心脏祖细胞的特征在于LIM同源域转录因子Islet 1(Isl1)的表达，并因此被称为Isl1+心脏祖细胞。(出处同前)。相反，Isl1在分化的心脏细胞中不表达。已经描述了在分化中比Isl1晚出现的Isl1+心脏祖细胞的其他标志物，且包括Nkx2.5和flk1(参见例如美国专利公开20100166714)。

已证明Isl1+心脏祖细胞的更新和分化受Wnt/β-catenin信号传导途径调控(参见例如Qyang,Y.et al.(2007)Cell Stem Cell.1:165-179；Kwon,C.et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:10894-10899)。这导致了诱导万能干细胞进入Isl1+谱系并通过调节Wnt信号传导扩增Isl1+群体的方法的开发(参见例如Lian,X.et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:E1848-57；Lian,X.et al.(2013)Nat.Protoc.8:162-175；美国专利公开20110033430；美国专利公开20130189785)。

尽管人类万能干细胞具有广阔的前景，但从多种心脏细胞的简单分化转移为在体内形成更大规模的纯3D心室肌组织的能力一直是一项重大挑战，其最终需要血管化、细胞外基质的组装和排列、以及成熟。为此，多种心脏细胞群(心房、心室、起搏器)已与人工和脱细胞基质结合(Masumoto,H.et al.(2014)Sci.Rep.4:5716；Ott,H.C.et al.(2008)Nat.Med.14:213-221；Schaaf,S.et al.(2011)PLoS One 6:e26397)，血管细胞和导管(Tulloch,N.L.et al.(2011)Circ.Res.109:47-59)和microRNA混合物(Gama-Garvalho,M.et al.(2014)Cells 3:996-1026)已被研究，但目标仍然遥不可及。

虽然将Isl1鉴定为心脏祖细胞的标志物是一项重大进展，但由于Isl1是细胞内蛋白，因此其不是用于分离大量活细胞的合适标志物。而是仍然需要细胞表面标志物。此外，Isl1作为标志物鉴定可分化为心脏谱系内的多种细胞类型的群体，并因此仍需要鉴定偏向于心脏谱系内特定细胞类型的心脏祖细胞特别是分化为心室细胞的祖细胞的标志物。因此，在本领域中仍然强烈需要心脏祖细胞的其他标志物，特别是心脏祖细胞的细胞表面标志物，该心脏祖细胞主要产生心肌细胞并且将允许快速分离和大规模扩增心肌原性(cardiomyogenic)祖细胞。此外，在本领域中仍然非常需要用于分离心脏心室祖细胞的方法和组合物，该心脏心室祖细胞在体内分化为心室肌细胞，从而允许在体内移植心室祖细胞或心室肌细胞以增强心脏功能。

发明内容

本发明描述了神经纤毛蛋白-1(NRP1)作为细胞表面标志物用于分离人心脏心室祖细胞的用途。此外，如表1、5和10所示，提供了适用于分离人心脏心室祖细胞的其他细胞表面标志物。这些人心脏祖细胞偏向于心室谱系，使得它们在体外和体内均主要分化为心室肌细胞。即，可以在体外条件下培养这些心脏祖细胞，使得它们偏向于心室谱系，并因此是人心室祖细胞(HVP)。而且，当被引入受试者的心脏的心室区域时，这些祖细胞几乎完全分化为根据其心室程序起作用的心室肌细胞。特别地，本文提供的人心室祖细胞利用细胞自主途径，通过该细胞自主途径这些细胞可以在正常鼠肾脏或心脏表面上在体内构建纯的3-D血管化功能性且成熟的心室细胞壁，从而允许体内器官对器官的组织工程。

使用在分化的不同阶段的心脏祖细胞的单细胞测序，鉴定了一组在HVP中差异表达的基因，如实施例14中所述，并在表10中示出。在该组中，显示第5天的祖细胞同时表达Islet 1(Isl1)和NRP1。心脏心室祖细胞的关键细胞表面标志物的这种鉴定允许容易且快速地分离细胞。此外，确定用于细胞扩增和心室谱系偏向的培养条件允许制备心脏心室祖细胞的克隆群的大量培养物(十亿或更多细胞)。这些细胞可以例如用于改善受试者的受损心脏中的功能，尤其是改善心室区域中的损伤。可以将祖细胞体内移植以原位分化为心室细胞，替代地，可以从祖细胞体外制备包含心室肌细胞的心肌补片(patch)，用于随后的体内移植。该细胞还可以用于例如体外毒性筛选测定，以评估测试化合物的心脏毒性，以及用于生化研究，以鉴定用于心脏成熟和分化的相关途径。

因此，本发明提供了纯化形式的人心脏心室祖细胞。该人心脏心室祖细胞能够在体外和体内分化为心室肌细胞。这些祖细胞可以在体外扩增为大量细胞，并且当在体内移植到心脏的心室区域中时，它们基本上全部分化为心室肌细胞。更进一步，这些细胞具有在体内迁移到不同部位的能力，并且当在体内移植时，这些细胞会按照其作为心室细胞所设定的方式进行运作(与仅收缩的心肌细胞不同)。因此，心室祖细胞可以被移植到天然组织中以增强心室功能，并具有将脉管系统并入新的心室组织中的能力。

因此，在一方面，本发明涉及用于分离人心脏心室祖细胞的方法，该方法包括：

使含有人心脏祖细胞的细胞培养物与一种或多种同NRP1反应的试剂接触；和

将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出人心脏心室祖细胞。

在一种实施方式中，使人心脏祖细胞与同NRP1反应的试剂并与同HVP标志物(一种或多种)结合的至少一种第二试剂(如本文所述)接触，从而将NRP1/第二试剂反应性阳性细胞与非反应性细胞分开。

优选地，人心脏祖细胞是Islet 1+人心脏祖细胞。优选地，人心脏祖细胞是JAG1+、FZD4+、LIFR+、FGFR3+和/或TNFSF9+。在另一种实施方式中，细胞培养物也与至少一种第二试剂接触；并且，将NRP1反应性/第二试剂反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出心脏心室祖细胞。在一种实施方式中，至少一种第二试剂结合选自JAG1+、FZD4+、LIFR+、FGFR3+和/或TNFSF9+的标志物。细胞培养物可同时与同NRP1反应的试剂和至少一种第二试剂接触。替代地，细胞培养物可以在与同NRP1反应的试剂接触之前与至少一种第二试剂接触。替代地，细胞培养物可以在与至少一种第二试剂接触之前与同NRP1反应的试剂接触。在另一种实施方式中，还针对缺乏万能干细胞的至少一种标志物(例如TRA-1-60)的表达而阴性选择细胞培养物。在另一种实施方式中，进一步培养和分化人心脏心室祖细胞，使得它们表达心室标志物MLC2v。在某些实施方式中，包含人心脏祖细胞的起始细胞培养物来源于人胚胎干细胞或人诱导性万能细胞。

在另一方面，本发明涉及用于分离人心脏心室祖细胞的方法，该方法包括：

在产生心脏祖细胞的条件下培养人万能干细胞以获得培养的细胞群；

使培养的细胞群与一种或多种同NRP1反应的试剂接触；和

将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出人心脏心室祖细胞。

在另一种实施方式中，细胞培养物也与至少一种第二试剂接触；并且将NRP1反应性/第二试剂反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出心脏心室祖细胞。在一种实施方式中，至少一种第二试剂结合选自JAG1+、FZD4+、LIFR+、FGFR3+和/或TNFSF9+的标志物。细胞培养物可同时与同NRP1反应的试剂和至少一种第二试剂接触。替代地，细胞培养物可以在与同NRP1反应的试剂接触之前与至少一种第二试剂接触。替代地，细胞培养物可以在与至少一种第二试剂接触之前与同NRP1反应的试剂接触。在另一种实施方式中，还针对缺乏万能干细胞的至少一种标志物(例如TRA-1-60)的表达而阴性选择细胞培养物。在另一种实施方式中，进一步培养和分化人心脏心室祖细胞，使得它们表达心室标志物MLC2v。在某些实施方式中，包含人心脏祖细胞的起始细胞培养物来源于人胚胎干细胞或人诱导性万能细胞。

在分离人心脏心室祖细胞的方法中，可以将同NRP1结合的各种类型的试剂用作同NRP1反应的试剂(一种或多种)。例如，在一种实施方式中，同NRP1反应的试剂是抗NRP1抗体，例如单克隆抗体。在另一种实施方式中，同NRP1反应的试剂是可溶性NRP1配体，例如NRP1配体融合蛋白。例如，同NRP1反应的试剂可以包含NRP1配体VEGF-A或Sema3A，例如可溶性融合蛋白(例如，Ig融合蛋白)。

在用于分离人心脏心室祖细胞的方法中，可以使用各种类型的分开方法来将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开。例如，在一种实施方式中，通过荧光激活细胞分选(FACS)将反应性阳性细胞与非反应性细胞分开。在另一种实施方式中，通过磁性激活细胞分选(MACS)将反应性阳性细胞与非反应性细胞分开。

在另一方面，本发明涉及获得人心脏心室祖细胞的克隆群的方法，该方法包括：

分离单个NRP1+人心脏心室祖细胞；和

在一定条件下培养单个NRP1+人心脏心室祖细胞，使得该细胞扩增到至少1×10⁹个细胞，从而获得人心脏心室祖细胞的克隆群。

在一种实施方式中，单个NRP1+人心脏心室祖细胞在初始培养时为Islet 1阳性、Nkx2.5阴性和flk1阴性。单个NRP1+人心脏心室祖细胞可通过诸如上述的方法(例如FACS或MACS)分离。可以使用诸如上述的同NRP1反应的一种或多种试剂(例如，抗NRP1抗体、可溶性NRP1配体，诸如配体融合蛋白)分离单个NRP1+人心脏心室祖细胞。经过进一步培养和分化后，人心脏心室祖细胞的克隆群可以表达心室标志物MLCV2。

在优选的实施方式中，在使得细胞偏向心室分化的条件下体外培养单个NRP1+人心脏心室祖细胞。例如，可以在心脏祖细胞培养(CPC)培养基(80％的高级DMEM/F12，补充有20％的KnockOut血清替代物、2.5mM的GlutaMax和100μg/ml的维生素C)中培养单个NRP1+人心脏心室祖细胞，该培养基允许细胞分化为表达MLC2v心室标志物的心室细胞。在各种实施方式中，单个NRP1+人心脏心室祖细胞被扩增为例如至少1×10⁹个细胞、至少2×10⁹个细胞、至少5×10⁹个细胞或至少10×10⁹个细胞的克隆群。

因此，在另一方面，本发明涉及分离的NRP1+人心脏心室祖细胞的克隆群。在各种实施方式中，该克隆群包含例如至少1×10⁹个细胞、至少2×10⁹个细胞、至少5×10⁹个细胞或至少10×10⁹个细胞。在优选的实施方式中，该克隆群包含至少1×10⁹个NRP1+人心脏心室祖细胞。

在另一方面，本发明涉及使用本文所述的NRP1+人心脏心室祖细胞来增强受试者的心脏功能的方法。例如，在一种实施方式中，本发明提供了增强受试者的心脏功能的方法，该方法包括给药包含NRP1+人心脏心室祖细胞的克隆群的药物组合物，诸如至少1×10⁹个细胞、至少2×10⁹个细胞、至少5×10⁹个细胞或至少10×10⁹个细胞的克隆群。在一种实施方式中，将克隆群直接给药至受试者的心脏中。例如，可以将克隆群直接给药至受试者心脏的心室区域中。在一种实施方式中，给药至受试者的药物组合物包含配制在三维基质上的克隆群，该三维基质例如是包含心室肌细胞的心肌补片。该受试者是需要增强心脏功能的人，例如患有心肌梗死的人或患有先天性心脏病的人。

在另一方面，本发明涉及用于产生人心室组织的方法，该方法包括：

将NRP1+人心脏心室祖细胞移植到非人类动物的器官中；和

使祖细胞在体内生长，从而产生人心室组织。

非人类动物可以是例如免疫缺陷小鼠。器官可以是例如肾脏(例如，将细胞移植到肾囊下)或心脏。在一种实施方式中，在当存在以下细胞标志物模式中的一种、两种、三种、四种或五种时移植细胞：(i)在心脏中胚层形成的峰值之后；(ii)在峰值Islet-1表达时；(iii)在NKX2.5表达的峰值之前；(iv)在下游基因MEF-2和TBX-1的峰值表达之前；以及(v)在分化的收缩蛋白基因表达之前。在一种实施方式中，在产生人心室祖细胞的条件下，在人万能干细胞的体外培养的第5天和第7天(含端值)之间移植细胞。在另一种实施方式中，在产生人心室祖细胞的条件下，在人万能干细胞的体外培养的第6天移植细胞。该方法可以进一步包括收获在非人类动物中产生的人心室组织。

在本发明的又一个方面，本文所述的人心脏心室祖细胞可用于筛选测定以评估测试化合物的心脏毒性。因此，本发明提供了筛选测试化合物的心脏毒性的方法，该方法包括：

提供NRP1+心脏心室祖细胞；

使细胞与测试化合物接触；和

测量测试化合物对细胞的毒性，

其中测试化合物对细胞的毒性指示了测试化合物的心脏毒性。可以例如通过评估细胞活力或细胞的其他生理参数来测量测试化合物对细胞的毒性。

还提供了用于产生人心室祖细胞的培养方法。例如，在一种实施方式中，本发明涉及产生人心室祖细胞(HVP)的方法，包括：

在包含CHIR98014的培养基中培养人万能干细胞(hPSC)，使得产生表达心脏中胚层标志物的细胞；和

在包含Wnt-C59的培养基中培养表达心脏中胚层标志物的细胞，使得产生HVP。

通过以下详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。

附图说明

图1是用于从人万能干细胞(hPSC)产生人Isl1+心肌原性祖细胞的示例性培养方案的示意图。

图2示出了在hPSC的心脏分化过程中蛋白质表达的蛋白质印迹分析结果，其示出了Isl1、Nkx2.5和cTn1的表达。GAPDH用作对照。

图3示出了心肌原性祖细胞的流式细胞术分析结果，其示出了分化第6天时Isl1在细胞上的表达。

图4示出了心肌原性祖细胞的双染色流式细胞术分析的结果，其示出了分化第6天时Isl1和Jag1在细胞上的共表达。

图5示出了在hPSC的心脏分化过程中蛋白质表达的蛋白质印迹分析结果，其示出了FZD4的表达。GAPDH用作对照。

图6示出了心肌原性祖细胞的双染色流式细胞术分析的结果，其示出了分化第5天时Isl1和FZD4在细胞上的共表达。

图7是人心室祖细胞(HVP)的产生、其最终分化成心室肌细胞、其抗体纯化以及其用于移植的示意图。

图8A和8B是将HPV移植到肾囊(图8A)或心肌内(图8B)用于器官对器官组织工程的示意图。

图9示出了人心室祖细胞(HVP)的双染色流式细胞术分析的结果，其示出了Isl1和LIFR在细胞上的共表达。

图10A和10B示出了与未分化的胚胎干细胞(ES)(图10A)相比，人心室祖细胞(图10B)上的LIFR和FGFR3的表达的流式细胞术分析的结果。

图11是来自单细胞测序第5天的细胞的tSNE图，其示出了基于差异基因表达的两个细胞簇，标记为0和1。

图12A和12B是来自单细胞测序第5天的细胞的Isl1表达(图12A)和NRP1表达(图12B)的tSNE图。深灰色表示高表达，中灰色表示低表达，以及浅灰色表示无表达。

图13是来自单细胞测序第5天的簇中Isl1和NRP1表达水平的小提琴图，其示出了NRP1+和ISL1+细胞在同一簇中，因为它们具有相似的基因表达谱。

图14A、14B和14C示出了从H9干细胞产生的HVP在第6天的NRP1(图14A)、TRA-1-60(图14B)以及NRP1和TRA-1-60两者(图14C)的表达的流式细胞术分析结果。

图15A、15B和15C示出了从H9干细胞产生的HVP在第6天的NRP1(图15A)、ISL1(图15B)以及NRP1和ISL1两者(图15C)的表达的流式细胞术分析结果。

具体实施方式

基于NRP1是心脏心室祖细胞(HVP)的细胞表面标志物的发现，本发明提供了分离人心肌原性祖细胞，特别是偏向心室谱系的细胞的方法，以及此类祖细胞的分离的克隆群。HVP的其他合适的细胞表面标志物在例如表1、5和10中示出。还提供了这些心脏心室祖细胞的体外和体内用途。

先前已证明了HVP表达细胞表面标志物，诸如JAG1、FZD4，LIFR、FGFR3和/或TNFSF9，以及细胞内标志物Islet 1(参见于2015年8月21日提交的美国序列号14/832,324和于2015年12月30日提交的美国序列号14/984,783，其每个的全部内容均明确地通过引用并入本文)。此外，已经鉴定出HVP的各种阳性和阴性植入标志物(参见于2017年2月15日提交的美国序列号15/433,713，其全部内容明确地通过引用并入本文)。

为了可以更容易地理解本发明，首先定义了某些术语。在整个具体实施方式中阐述其他定义。

如本文所用的术语“神经纤毛蛋白-1”、“NRP1”可互换使用，是指本领域已知的蛋白质，其已在例如Soker,S.et al.(1998)Cell 92:735-745和Rossignol,M.et al.(2000)Genomics 70:211-222中描述。NRP1在本领域中也称为BDCA4、VEGF165R和CD304。NRP1蛋白的非限制性实例是具有Genbank登录号NP_003864.4中列出的氨基酸序列的人蛋白。

如本文所用的术语“干细胞”以广义使用，并且包括传统干细胞、祖细胞、前祖细胞、储备细胞等。术语“干细胞”或“祖细胞”在本文中可互换使用，且是指未分化的细胞，其能够增殖并产生更多具有生成大量母细胞能力的祖细胞，而这些母细胞又可以产生分化的或可分化的子细胞。子细胞本身可以被诱导以增殖并产生后代，后代随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时还保留了一种或多种具有亲代发育潜能的细胞。因此，术语“干细胞”是指在特定情况下具有分化成更专门化或分化的表型的能力或潜力的细胞，并且其在某些情况下仍保持增殖能力而基本上不分化。在一种实施方式中，术语祖细胞或干细胞是指广义的母细胞，其后代(子代)通常通过分化(例如，通过获得完全独立的特征)而朝着不同的方向专门化，如在胚胎细胞和组织的逐步多样化中发生的那样。细胞分化是通常通过许多细胞分裂发生的复杂过程。分化的细胞可以衍生自多能细胞，该多能细胞本身也衍生自多能细胞，等等。虽然这些多能细胞中的每一个都可以被认为是干细胞，但是每个细胞所能产生的细胞类型范围却可能相差很大。一些分化的细胞也具有产生有更大发育潜力的细胞的能力。这样的能力可以是自然的，也可以是在用各种因子处理后被人工诱导的。在许多生物学实例中，干细胞也是“多能的”，因为它们可以产生一种以上不同细胞类型的后代，但这不是“干细胞特性”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分，且在本文中使用时，它是必不可少的。理论上，自我更新可以通过两种主要机制之一发生。干细胞可能不对称分裂，一个子代保留干细胞状态，而另一个子代表现出一些独特的其他特定功能和表型。替代地，群体中的一些干细胞可以对称地分裂为两种干细胞，从而维持群体中的一些干细胞为整体，而仅群体中的其他细胞产生分化的后代。形式上，以干细胞开始的细胞可能会走向分化的表型，但然后“逆转”并重新表达干细胞表型，该术语通常被称为“去分化”。

本文使用的术语“祖细胞”是指相对于其能够通过分化产生的细胞具有更原始的细胞表型的细胞(例如，沿着发育途径或进展比完全分化的细胞处于更早的步骤)。通常，祖细胞也具有显著或非常高的增殖潜力。根据发育途径和细胞在其中发育和分化的环境，祖细胞可产生多种不同的分化细胞类型或单一的分化细胞类型。

如本文所用的术语“万能(pluripotent)”是指具有在不同条件下分化为所有三种胚细胞层(内胚层、中胚层和外胚层)特征的细胞类型的能力的细胞。万能细胞的主要特征是，使用例如裸鼠和畸胎瘤形成试验，其能够分化为所有三种胚层的能力。万能性还可以通过胚胎干(ES)细胞标志物的表达来证明，尽管万能性的优选测试方法是证明分化为三种胚层中的每个的细胞的能力。在一些实施方式中，万能细胞是未分化的细胞。

如本文所用的术语“万能性”或“万能状态”是指具有分化成所有三种胚胎胚层：内胚层(肠组织)、中胚层(包括血液、肌肉和血管)和外胚层(诸如皮肤和神经)的能力的细胞，并通常具有在体外分裂很长一段时间的潜力，例如超过一年或超过30次传代。

当涉及“多能细胞”使用时，术语“多能(multipotent)”是指能够分化成来源于所有三种胚层的一些但不是全部细胞的细胞。因此，多能细胞是部分分化的细胞。多能细胞在本领域中是众所周知的，多能细胞的实例包括成体干细胞，诸如例如造血干细胞和神经干细胞。多能意味着干细胞可以在给定的谱系中形成许多类型的细胞，但不能形成其他谱系的细胞。例如，多能血干细胞可以形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但它不能形成神经元。

术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”或“ESC”在本文中可互换使用，并且是指胚胎胚泡的内部细胞团的万能干细胞(参见美国专利No.5,843,780和6,200,806，其通过引用并入本文)。此类细胞可以类似地从源自体细胞核转移的胚泡的内部细胞团中获得(参见例如美国专利No.5,945,577、5,994,619、6,235,970，其通过引用并入本文)。胚胎干细胞的区别特征限定了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有胚胎干细胞的一种或多种独特特征，使得该细胞可以与其他细胞相区分，则该细胞具有胚胎干细胞的表型。示例性的区别性胚胎干细胞特征包括但不限于基因表达谱、增殖能力、分化能力、核型、对特定培养条件的响应性等。在一些实施方式中，可以获得ES细胞而不破坏胚胎，例如，不破坏人类胚胎。

术语“成体干细胞”或“ASC”用于指来源于非胚胎组织，包括胎儿、少年和成体组织的任何多能干细胞。已经从很多成体组织中分离出了干细胞，这些成体组织包括血液、骨髓、脑、嗅觉上皮、皮肤、胰腺、骨骼肌和心肌。这些干细胞中的每一种都可以根据基因表达、因子反应性和培养物中的形态来表征。示例性成体干细胞包括神经干细胞、神经嵴干细胞、间充质干细胞、造血干细胞和胰腺干细胞。如上所述，已经发现干细胞实际上存在于每个组织中。因此，本发明认识到可以从实际上任何动物组织中分离干细胞群。

如本文所用的术语“人万能干细胞”(缩写为hPSC)是指具有分化成如上关于干细胞和万能性所讨论的各种不同细胞类型的能力的人细胞。人万能人干细胞包括例如诱导性万能干细胞(iPSC)和人胚胎干细胞，例如ES细胞系。

如本文所用的术语“人心脏祖细胞”是指定型为心脏谱系并具有分化成所有三种心脏谱系细胞(心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞)的能力的人祖细胞。人心脏祖细胞的培养物可以通过例如在使干细胞偏向于分化成心脏谱系的条件下培养干细胞而获得。在某些实施方式中，被培养以产生人心脏祖细胞的干细胞是人胚胎干细胞或人诱导性万能细胞。在某些实施方式中，明确排除了c-kit+成体祖细胞用于产生人心脏祖细胞。

如本文所用的术语“人心肌原性祖细胞”是指定型为心脏谱系并且主要分化成心肌细胞的人祖细胞(即，源自祖细胞的超过50％的分化细胞，优选超过60％、70％、80％或90％的分化细胞是心肌细胞)。

如本文所用的术语“心脏心室祖细胞”是指定型为心脏谱系并且主要分化为心脏心室肌细胞的祖细胞(即，源自祖细胞的超过50％的分化细胞，优选超过60％、70％、80％或90％的分化细胞是心脏心室肌细胞)。这种类型的细胞在本文中也称为人心室祖细胞或HVP细胞。

术语“心肌细胞”是指心脏的肌细胞(例如，心脏肌细胞)。心肌细胞通常将在其细胞表面上和/或细胞质中表达一种或多种心脏特异性标志物。合适的心肌细胞特异性标志物包括但不限于心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白-C、原肌球蛋白、小窝蛋白-3、GATA-4、肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链-2a，肌球蛋白轻链-2v、ryanodine受体和心房利钠因子。

在细胞源自另一细胞的背景下使用的术语“源自”是指该细胞起源于(例如，改变自或产生自)不同细胞类型的细胞。术语“源自”还指已经从祖细胞分化的细胞。

如本文所用的术语“Isl1+心脏祖细胞”是指定型为心脏谱系并表达Islet1的人祖细胞。

如本文所用的术语“Isl1+NRP1+心脏祖细胞”是指定型为心脏谱系并表达Islet 1和NRP1两者的人祖细胞。

对于细胞培养物中或细胞群中的细胞，术语“基本上不含”是指细胞培养物或细胞群不含的特定细胞类型的存在量小于细胞培养物或细胞群中存在的细胞总数的约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。

在细胞个体发育的背景下，形容词“分化的”或“分化的”是相对的术语。“分化的细胞”是比所比较的细胞在发育途径上进一步向下发展的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制性前体细胞(例如中胚层干细胞)，其继而又可以分化为沿途径进一步向下的其他类型的前体细胞(例如心肌细胞前体)，并然后分化为末期分化细胞，其在某些组织类型中起重要作用，并可能保留也可能不保留进一步增殖的能力。

在本文背景下，术语“分化”是指表达标志物的细胞的形成，该标志物已知与更专门化并且更接近于成为不能进一步分化的终末分化细胞的细胞相关。细胞从较少定型的细胞发展到对特定细胞类型越来越定型的细胞，并最终发展到终末分化细胞的途径，称为渐进分化或渐进定型。更专门化的(例如已经开始沿着渐进分化的路径发展)但尚未最终分化的细胞被称为部分分化。分化是一种发育过程，由此细胞呈现出专门化的表型，例如，获得一种或多种不同于其他细胞类型的特征或功能。在一些情况下，分化的表型是指在一些发育途径中处于成熟终点的细胞表型(所谓的终末分化细胞)。在许多但不是全部组织中，分化过程与从细胞周期的退出结合。在这些情况下，终末分化的细胞丧失或大大限制了它们的增殖能力。然而，我们注意到，在本说明书的背景下，术语“分化”或“分化的”是指在其命运或功能上比在其发育的先前点处更专门化的细胞，并且同时包括终末分化的细胞和尽管没有最终分化但比在其发育的先前点处更专门化的细胞。从未定型细胞(例如干细胞)到对特定分化的细胞类型有越来越高的定型程度的细胞，并最后到终末分化的细胞的细胞发育，被称为渐进分化或渐进定型。相对于祖细胞“分化”的细胞相对于该祖细胞具有一个或多个表型差异。表型差异包括但不限于形态差异以及基因表达和生物活性的差异，不仅包括是否存在表达的标志物，还包括标志物数量的差异和一组标志物的共表达模式的差异。

如本文所用的术语“分化”是指细胞从原始阶段向更成熟(即较不原始)的细胞的细胞发育。

如本文所用，“增殖的”和“增殖”是指通过细胞分裂在群体(生长)中的细胞数目增加。通常认为细胞增殖是由响应于环境(包括生长因子和其他有丝分裂原)的多种信号转导途径的协同激活引起的。通过从细胞内或细胞外信号的作用释放和阻断或负面影响细胞增殖的机制也可能促进细胞增殖。

术语“更新”或“自我更新”或“增殖”在本文中可互换使用，并且是指细胞制造细胞自身的更多拷贝(例如复制品)的过程。在一些实施方式中，细胞能够通过长期和/或数月至数年分裂成相同的未分化细胞(例如祖细胞类型)而自我更新。在一些情况下，增殖是指通过将单个细胞重复分裂为两个相同的子细胞而使细胞扩增。

如本文所用的术语“谱系”是指描述具有共同祖先的细胞或具有共同发育命运的细胞(例如具有发育成心室心肌细胞的发育命运的细胞)的术语。

如本文所用的术语“克隆群”是指源自单个细胞的生长的细胞群。也就是说，克隆群中的细胞都是用于接种克隆群的单个细胞的后代。

术语“培养基(media)”在本文中是指用于维持组织或细胞群或培养细胞群的含有维持细胞活力并支持增殖的营养物的培养基(medium)(例如“培养基(culture media)”)。细胞培养基可以以适当的组合包含以下任何一种：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代物以及其他成分，诸如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。

术语“表型”是指在特定的一组环境条件和因素下限定细胞或生物体的一个或多个总生物学特征，其与实际基因型无关。

本文所用的“标志物”描述了细胞的特征和/或表型。标志物可用于选择包含感兴趣特征的细胞。标志物将随特定细胞而变化。标志物是特征性的，无论是针对细胞类型或由该细胞类型表达的分子而特定的形态、功能还是生化(酶)特征。优选地，这样的标志物是蛋白质，并且更优选地，这样的标志物具有针对本领域可用的抗体或其他结合分子的表位。然而，标志物可以由细胞中存在的任何分子组成，包括但不限于蛋白质(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇。形态特征或性状的实例包括但不限于形状、大小和核浆比。功能特征或性状的实例包括但不限于粘附于特定底物的能力、掺入或排除特定染料的能力、在特定条件下迁移的能力以及沿特定谱系分化的能力。可以通过本领域技术人员可用的任何方法来检测标志物。

如本文所用的术语“分离的细胞”是指已经从最初发现该细胞的生物体中取出的细胞或该细胞的后代。任选地，已经在例如其他细胞存在下体外培养该细胞。任选地，随后将该细胞引入第二生物体或重新引入分离出它(或其所来源的细胞)的生物体。

关于分离的细胞群，如本文所用的术语“分离的群”是指已经从混合的或异质的细胞群中去除并分开的细胞群。在一些实施方式中，与从中分离或富集细胞的异质群相比，分离的群是基本上纯的细胞群。

关于特定的细胞群，术语“基本上纯的”是指相对于构成总细胞群的细胞，至少约75％，优选至少约85％，更优选至少约90％，且最优选至少约95％纯的细胞群。

术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指可以使用本文所述的方法和组合物将本文所公开的心脏心室祖细胞植入到其中以例如进行治疗(其在一些实施方式中包括预防性治疗)或用于疾病模型的动物，例如人类。为了治疗对特定动物例如人类受试者具有特异性的疾病状态，术语“受试者”是指该特定动物。术语“非人类动物”和“非人类哺乳动物”在本文可互换使用，并且包括哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人类灵长类。术语“受试者”还包括任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受试者是哺乳动物，例如人，或其他哺乳动物，例如驯养的哺乳动物，例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物，例如牛、羊、猪等，也包括在术语受试者中。

如本文所用的术语“接受者”是指将接受移植的器官、组织或细胞的受试者。

如本文所用的术语“三维基质”或“支架”或“基质”在广义上是指包含生物相容性基质、支架等的组合物。三维基质可以在25℃下为液体、凝胶、半固体或固体。三维基质可以是可生物降解的或不可生物降解的。在一些实施方式中，三维基质是生物相容的，或生物可吸收的或生物可替代的。示例性的三维基质包括聚合物和水凝胶，其包括胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖、MATRIGEL^TM、聚乙二醇、右旋糖酐(包括化学可交联或可光交联的右旋糖酐)、经加工的组织基质(例如粘膜下组织)等。在某些实施方式中，三维基质包括同种异体成分、自体成分或同种异体成分和自体成分两者。在某些实施方式中，三维基质包括合成或半合成材料。在某些实施方式中，三维基质包括框架或支持物，例如纤维蛋白衍生的支架。

如本文所用的术语“给药”、“引入”和“移植”可互换使用，并且是指通过导致在所需位点至少部分定位细胞的方法或途径将心肌原性祖细胞和/或如本文所述分化的心肌细胞置入受试者中。可以通过任何合适的途径给药细胞，该途径导致递送至受试者中至少一部分细胞保持活力的所需位置。在给药至受试者之后，细胞的生存期可以短至几个小时，例如二十四小时，到几天，至长达几年。

术语“统计学上显著”或“显著地”是指统计显著性，并且通常是指标志物浓度两个标准偏差(2SD)低于正常或更低。该术语是指存在差异的统计证据。它定义为当零假设实际上为真时做出拒绝零假设的决定的概率。通常使用p值进行决策。如本文所用的术语“基本上”或“主要地”是指至少约60％、或优选至少约70％或至少约80％、或至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％或更多，或70％至100％之间的任何整数的比例。

术语“疾病”或“疾患”在本文中可互换使用，且是指身体或某些器官的状态发生任何变化，中断或干扰功能的执行和/或引起诸如不适、功能障碍、痛苦的症状，或甚至使患病的人或与之接触的人死亡。疾病或疾患也可与瘟热、病态(ailing)、病痛(ailment)、失常(malady)、疾患(disorder)、病(sickness)、病(illness)、病(complaint)、不舒服(indisposition)或感染有关。

如本文所用的短语“心血管病症、疾病或疾患”旨在包括以心脏功能不全、不良或异常为特征的所有疾患，例如缺血性心脏病、高血压心脏病和肺动脉高压心脏病、瓣膜疾病、先天性心脏病以及导致受试者(特别是人类受试者)充血性心力衰竭的任何病症。心脏功能不全或异常可能是疾病、受伤和/或衰老的结果。作为背景，对心肌损伤的反应遵循明确限定的途径，其中一些细胞死亡，而另一些细胞进入冬眠状态，此时它们尚未死亡但具有功能障碍。随后是炎性细胞浸润，胶原蛋白沉积为疤痕的一部分，所有这些都与新血管的内生长和一定程度的持续细胞死亡同时发生。如本文所用的术语“局部缺血”是指由于血液流入减少引起的任何局部组织的缺血。术语“心肌缺血”是指由冠状动脉粥样硬化和/或对心肌的氧气供应不足引起的循环障碍。例如，急性心肌梗死代表对心肌组织的不可逆的缺血性损伤。这种损伤导致冠状循环中发生闭塞性(例如，血栓形成或栓塞性)事件，并产生其中心肌代谢需求超过了向心肌组织的氧气供应的环境。

如本文所用的术语“治疗”或“治疗”在本文中可互换使用，并且是指降低或减少或减轻或中止心血管病症、疾病或疾患的至少一种不良作用或症状，即特征为心脏功能不全或不良的任何疾患。心脏疾患的不良影响或症状在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于呼吸困难、胸痛、心悸、头晕、晕厥、浮肿、发绀、面色苍白、疲劳和死亡。在一些实施方式中，本文所用的术语“治疗”是指预防受试者中心血管疾病症状发展的预防性治疗或预防治疗。

如果一种或多种症状或临床标志物降低，则治疗通常是“有效的”，本文如此定义该术语。替代地，如果疾病的进展减少或中止，则治疗是“有效的”。即，“治疗”不仅包括疾病症状的改善或疾病标志物的减少，而且还包括在不进行治疗的情况下预期的症状的发展或恶化的中止或减慢。有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病范围的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意为与未接受治疗的预期生存期相比生存期延长。需要治疗的人包括已经被诊断出患有心脏病的人，以及由于遗传易感性或其他因素(诸如体重、饮食和健康)而可能发展为心脏病的人。在一些实施方式中，术语治疗还涵盖预防措施和/或预防性治疗，其包括给药本文公开的药物组合物以预防疾病或疾患的发作。

症状的治疗上显著的减少是例如与对照或未治疗的受试者相比测量参数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少在约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％或更多。所测量或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物，例如水平升高或降低的生物标志物，以及与疾病或疾患的症状或标志物的临床可接受量级有关的参数。应当理解，本文公开的组合物和制剂的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。所需的确切量将根据诸如所治疗疾病的类型的因素而变化。

关于受试者的心血管病症或疾病的治疗，术语“治疗有效量”是指安全且足以预防或延迟发展或心血管疾病或疾患的量。因此，该量因此可以治愈或缓解心血管疾病或病症，减慢心血管疾病进展的进程，减慢或抑制心血管疾病或疾患的症状，减缓或抑制心血管疾病或疾患的继发性症状的发生或抑制心血管疾病或疾患的继发症状的发展。用于治疗心血管疾病或疾患的有效量取决于要治疗的心血管疾病的类型、症状的严重程度、所治疗的受试者、受试者的年龄和一般状况、给药方式等。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定合适的“有效量”。可以由普通技术人员来判断治疗的功效，例如，可以在本文所讨论的心血管疾病或疾患的动物模型中评估功效，例如对啮齿类动物急性心肌梗死或缺血再灌注损伤的治疗，以及导致本文所公开的心血管疾病或疾患的至少一种症状减轻的组合物或制剂的任何治疗或给药，例如，心脏射血分数增加、心力衰竭率降低、梗死面积减小、相关发病率降低(肺水肿、肾衰竭、心律不齐)、运动耐量或其他生活质量指标的改善，以及死亡率降低均表明有效的治疗。在其中组合物用于治疗心血管疾病或疾患的实施方式中，可以使用心血管疾病的实验动物模型，例如缺血再灌注损伤的动物模型(Headrick J P,Am J Physiol Heart circPhysiol 285；H1797；2003)和急性心肌梗死动物模型(Yang Z,Am J Physiol HeartCirc.Physiol 282:H949:2002；Guo Y,J Mol Cell Cardiol 33；825-830,2001)来判断组合物的功效。当使用实验动物模型时，相对于未治疗的动物，在治疗的动物中心血管疾病或疾患的症状减轻，例如呼吸困难、胸痛、心悸、头晕、晕厥、浮肿、发绀、面色苍白、疲劳和高血压中的一种或多种症状的减轻发生得更早时，即证明了治疗的功效。“更早”是指例如肿瘤尺寸的减小至少提早5％发生，但优选更早，例如提早一天、提早两天、提早3天或更长时间。

如本文所用的术语“治疗”在涉及心血管疾病或疾患的治疗时用于指心血管疾病或疾患的症状和/或生化标志物的减少，例如心血管疾病的至少一种生化标志物减少至少约10％将被认为是有效的治疗。此类心血管疾病的生化标志物的实例包括例如血液中的肌酸磷酸激酶(CPK)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的减少，和/或心血管疾病的症状的减少，和/或如通过心电图(ECG或EKG)或超声心动图(心脏超声)、多普勒超声和核医学成像测量的由本领域普通技术人员确定的血流和心脏功能的改善。将心血管疾病的症状减少至少约10％也将被认为是通过本文公开的方法进行的有效的治疗。作为替代实例，减少心血管疾病的症状，例如减少以下至少一种：呼吸困难、胸痛、心悸、头晕、晕厥、浮肿、发绀等至少约10％或终止此类体系，或将此类心血管疾病的症状的大小减少至少约10％将被认为是通过本文公开的方法进行的影响性治疗。在一些实施方式中，优选但不要求治疗剂实际上消除心血管疾病或疾患，而只是将症状减轻至可控制的程度。

可以通过本领域普通技术人员通常已知的任何诊断心肌梗死(通常称为心脏病发作)的方法来鉴定适于通过本文所公开的方法进行治疗的受试者，这些受试者适合于使用本文所公开的方法进行治疗，且这样的诊断方法包括但不限于例如：(i)血液检查，以检测心肌梗死期间释放的肌酸磷酸激酶(CPK)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和其他酶的水平；(ii)心电图(ECG或EKG)，其是心脏活动的图形记录，可以记录在纸上或计算机监视器上。ECG对检测疾病和/或损伤可以是有益的；(iii)超声心动图(心脏超声)，用于研究先天性心脏病并评估心脏壁异常，包括心脏壁、瓣膜和血管的功能异常；(iv)多普勒超声，可用于测量流经心脏瓣膜的血流；(v)核医学成像(在本领域中也称为放射性核素扫描)，允许可视化器官的解剖结构和功能，并可用于检测冠状动脉疾病、心肌梗死、瓣膜疾病、心脏移植排斥反应，检查旁路手术的有效性，或选择患者进行血管成形术或冠状动脉搭桥术。

本文中可互换使用的术语“冠状动脉疾病”和“急性冠状动脉综合症”是指心肌梗死，是指心血管病症、疾病或疾患，包括以心脏功能不全、不良或异常为特征的所有疾患，例如缺血性心脏病、高血压心脏病和肺动脉高压心脏病、瓣膜疾病、先天性心脏病以及导致受试者特别是人类受试者充血性心力衰竭的任何病症。心脏功能不全或异常可能是疾病、损伤和/或衰老的结果。作为背景，对心肌损伤的反应遵循明确定义的途径，其中一些细胞死亡，而另一些细胞进入冬眠状态，此时它们尚未死亡但具有功能障碍。随后是炎性细胞浸润，胶原蛋白沉积为疤痕的一部分，所有这些都与新血管的内生长和一定程度的持续细胞死亡同时发生。

如本文所用的术语“局部缺血”是指由于血液流入减少引起的任何局部组织缺血。术语“心肌缺血”是指由冠状动脉粥样硬化和/或对心肌的氧气供应不足引起的循环障碍。例如，急性心肌梗死代表对心肌组织的不可逆的缺血性损伤。这种损伤导致冠状循环中发生闭塞性(例如，血栓形成或栓塞性)事件，并产生其中心肌代谢需求超过了向心肌组织的氧气供应的环境。

本文可互换使用的术语“组合物”或“药物组合物”是指通常包含赋形剂的组合物或制剂，赋形剂是诸如本领域常规的并且适合给药至哺乳动物且优选人类或人类细胞的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，可以将药物组合物特别地配制成用于直接递送至靶组织或器官，例如，通过直接注射或经由导管注射至靶组织。在其他实施方式中，可以将组合物特别地配制成用于通过多种途径中的一种或多种给药，包括但不限于口服、眼部、肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、鼻内、舌下、脊柱内、脑室内等。另外，如本领域已知的用于局部(例如口腔粘膜、呼吸道粘膜)和/或口服给药的组合物可以形成溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂、口服冲洗剂或散剂，其在本文中描述。组合物还可包括稳定剂和防腐剂。有关载体、稳定剂和佐剂的实例，参见费城科学大学(2005)雷明顿：《具有事实与比较的药学科学与实践》，第21版(University of the Sciences in Philadelphia(2005)Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons,21st Ed.)。

如本文所用的术语“给药”、“引入”和“移植”可互换使用，并且是指将如本文所述的包含心肌原性祖细胞的药物组合物或包含分化的心肌细胞(例如，心室心肌细胞)群的组合物通过导致药物组合物至少部分定位在所需部位或组织位置的方法或途径置入受试者中。在一些实施方式中，可以通过在受试者中产生有效治疗的任何适当途径来给药药物组合物，即，给药导致递送到受试者中期望的位置或组织，其中至少一部分细胞位于期望的靶组织或靶细胞位置。

本文所用的短语“肠胃外给药”和“肠胃外地给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心脏内、皮肤内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑内脊髓以及胸骨内注射和输注。本文所用的短语“全身给药”、“全身地给药”、“外周给药”和“外周地给药”是指将心血管干细胞和/或其子代和/或化合物和/或其他物质非直接地给药至心脏组织中，使得其进入动物的系统并因此进行新陈代谢，和其他类似过程，例如皮下或静脉内给药。

本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其没有过多毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。

如本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其涉及从一个器官或身体部分携带或运输对象试剂至另一个器官或身体部分。从与制剂的其他成分相容的意义上讲，每种载体必须是“可接受的”。

如本文所用的术语“药物”或“化合物”或“测试化合物”是指给药至受试者以治疗或预防或控制疾病或病症的化学实体或生物产品，或化学实体或生物产品的组合。化学实体或生物产品优选是但不一定是低分子量化合物，而还可以是较大的化合物，例如核酸低聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适配体及其变型和组合。

本文使用的术语“移植”是指将新细胞(例如重编程的细胞)、组织(例如由重编程的细胞产生的分化细胞)或器官引入宿主(即移植接受者或移植受试者)。

如本文所用的术语“与NRP1反应的试剂”是指与NRP1结合或以其他方式相互作用的试剂。优选地，该试剂“特异性”结合或以其他方式与NRP1相互作用，使得其不与其他非NRP1蛋白结合或相互作用。

如本文所用的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在优选的实施方式中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体。

如本文所用的术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性并且具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和任选的恒定区的抗体。

如本文所用的术语“人源单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性并且具有来自嫁接到人类框架和恒定区域中的非人类抗体(例如小鼠单克隆抗体)的重链和轻链CDR1、2和3的抗体。

如本文所用的术语“嵌合单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性并且具有来自一个物种的与另一物种的恒定区连接的重链和轻链可变区的抗体。

如本文所用的术语“融合蛋白”是指通常使用重组DNA技术制备的复合蛋白，其中两个不同的蛋白或其部分可操作地连接在一起。非限制性实例是Fc融合蛋白，其中非免疫球蛋白可操作地连接至免疫球蛋白Fc区。

在以下小节中将更详细地描述本发明的各个方面。

分离人心脏心室祖细胞的方法

一方面，本发明涉及分离人心脏心室祖细胞的方法。如实施例中所述，NRP1现已被鉴定为人心脏心室祖细胞的细胞表面标志物，并因此该标志物可用于促进这些祖细胞的分离。作为NRP1的替代，本文提供了用于人心脏心室祖细胞的其他标志物，包括表1、5和10中所示的标志物。如本文所述，这些表中的任何蛋白(其是细胞表面蛋白)都可以用于分离HVP。

因此，在一种实施方式中，本发明提供了用于分离人心脏心室祖细胞的方法，该方法包括：

使含有心脏祖细胞的人细胞培养物与一种或多种同NRP1反应的试剂接触；和

将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出人心脏心室祖细胞。

替代地，在接触步骤之后，该方法可以包括将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分离，从而分离出人心脏心室祖细胞。

同样如实施例中所述，Islet1是由心脏心室祖细胞与NRP1共表达的标志物，并因此这两种标志物均可用于促进这些祖细胞的分离。因此，在上述方法的另一种实施方式中，也将人类细胞的培养物与同Islet1反应的试剂接触；并且将NRP1反应性/Islet 1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出人心脏心室祖细胞。替代地或另外，可以将同其他HVP标志物(包括但不限于JAG1、FZD4、LIFR、FGFR3和/或TNFSF9)反应的试剂与NRP1组合使用以分离HVP。因此，人类细胞的培养物可以与同NRP1反应的试剂和/或同HVP标志物反应的至少一种第二试剂同时接触，该HVP标志物包括但不限于JAG1、FZD4、LIFR、FGFR3和/或TNFSF9。在一种实施方式中，将人类细胞的培养物与同NRP1反应的试剂接触，然后与同HVP标志物(一种或多种)反应的第二试剂(一种或多种)接触。在另一种实施方式中，将人类细胞的培养物与同HVP标志物(一种或多种)反应的第二试剂(一种或多种)接触，然后与同NRP1反应的试剂接触。

在另一种实施方式中，分离HVP的方法还包括阴性选择在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物，例如TRA-1-60。使用阴性选择(除了对NRP1表达和/或其他阳性HVP标志物的表达阳性选择之外)确保了对HVP群体的严格定义，并消除了批次变化和潜在的引起畸胎瘤的细胞。因此，在一种实施方式中，选择不表达在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物(例如TRA-1-60)的心脏祖细胞(阴性选择)，从而分离出高纯度的HVP群体。可用于阴性选择的在人万能干细胞表面上表达的标志物的非限制性实例包括：TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-54、SSEA1、SSEA3、SSEA4、CD9、CD24、E-钙粘蛋白(E-Cadherin)和足萼蛋白(Podocalyxin)及其组合。

在另一种实施方式中，本发明提供了用于分离人心脏心室祖细胞的方法，该方法包括：

在产生心脏祖细胞的条件下培养人万能干细胞以获得细胞培养物；

使细胞培养物与一种或多种同NRP1反应的试剂接触；和

将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出人心脏心室祖细胞。

替代地，在培养和接触步骤之后，该方法可以包括将NRP1与非反应性细胞分离，从而分离出人心脏心室祖细胞。

替代地或另外，可以将同其他HVP标志物反应的第二试剂与NRP1组合使用以分离HVP，其他HVP标志物包括但不限于JAG1、FZD4、LIFR、FGFR3和/或TNFSF9。因此，人类细胞的培养物可以与同NRP1反应的试剂(一种或多种)和/或同HVP标志物(一种或多种)反应的至少一种第二试剂同时接触，HVP标志物包括但不限于JAG1、FZD4、LIFR、FGFR3和/或TNFSF9。在一种实施方式中，将人类细胞的培养物与同NRP1反应的试剂接触，然后与同HVP标志物(一种或多种)反应的第二试剂(一种或多种)接触。在另一种实施方式中，将人类细胞的培养物与同HVP标志物(一种或多种)反应的第二试剂(一种或多种)接触，然后与同NRP1反应的试剂接触。

在另一种实施方式中，分离HVP的方法还包括阴性选择在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物，例如TRA-1-60。使用阴性选择(除了对NRP1表达和/或其他阳性HVP标志物的表达阳性选择之外)确保了对HVP群体的严格定义，并消除了批次变化和潜在的引起畸胎瘤的细胞。因此，在一种实施方式中，选择不表达在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物(例如TRA-1-60)的心脏祖细胞(阴性选择)，从而分离出高纯度的HVP群体。可用于阴性选择的在人万能干细胞表面上表达的标志物的非限制性实例包括：TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-54、SSEA1、SSEA3、SSEA4、CD9、CD24、E-钙粘蛋白和足萼蛋白及其组合。

在优选的实施方式中，同NRP1反应的试剂是抗NRP1抗体，例如单克隆抗体。非限制性实例包括对NRP1具有结合特异性的鼠、兔、人、人源或嵌合单克隆抗体。抗NRP1单克隆抗体是本领域可商购的。此外，可以使用NRP1作为抗原，使用本领域熟知的标准技术来制备抗NRP1抗体。

在另一种实施方式中，与NRP1反应的试剂是NRP1配体，例如可溶性NRP1配体或可溶性NRP1配体融合蛋白。NRP1配体的非限制性实例包括VEGF-A和Sema3A。可溶性NRP1配体可以使用标准重组DNA技术制备，例如通过缺失跨膜和胞质结构域。也可以使用标准重组DNA技术将可溶性配体转化为可溶性配体融合蛋白。可以制备融合蛋白，其中融合伴侣可以包含促进融合蛋白分离的结合部分。

为了将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，可以使用本领域已知的多种不同细胞分开技术中的一种。优选地，通过荧光激活细胞分选(FACS)将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开。FACS技术以及用于实施该技术以将细胞分开的设备是本领域熟知的。当将FACS用于细胞分开时，优选地，所使用的同NRP1反应的试剂(一种或多种)是荧光标记的抗NRP1单克隆抗体。替代地，细胞分开可以通过例如磁性激活细胞分选(MACS)来实现。当MACS用于细胞分开时，优选地，所使用的同NRP1反应的试剂是涂覆有抗NRP1单克隆抗体的磁性纳米颗粒。替代地，本领域已知的其他单个细胞分选方法可以应用于分离本发明的心脏心室祖细胞的方法，包括但不限于IsoRaft array和DEPArray技术。

在与同NRP1反应的试剂(一种或多种)接触并将NRP1反应性细胞分开之前，可以在导致心脏祖细胞产生的条件下培养人万能干细胞。在本领域中已经描述了用于产生心脏祖细胞的培养条件(参见例如Lian,X.et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:E1848-1857；美国专利公开No.20130189785)，并且在实施例1和图1以及实施例10中也有详细描述。通常，首先在hPSC中激活Wnt/β-连环蛋白信号转导，随后是温育期，然后抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导。通过与Gsk3抑制剂，优选CHIR98014(CAS 556813-39-9)一起温育来实现Wnt/α-连环蛋白信号传导的激活。通过与Porcn抑制剂，优选Wnt-C59(CAS 1243243-89-1)一起温育来实现Wnt/α-连环蛋白信号传导的抑制。用于本发明方法的合适的hPSC包括诱导性万能干细胞(iPSC)，诸如19-11-1、19-9-7或6-9-9细胞(Yu,J.et al.(2009)Science324:797-801)和人类胚胎干细胞系，诸如ES03细胞(WiCell Research Institute)或H9细胞(Thomson,J.A.et al.(1998)Science 282:1145-1147)。用于产生心肌原性祖细胞的合适培养基包括E8培养基、mTeSR1培养基和RPMI/B27不含胰岛素，每种均在实施例1和/或实施例10中进一步描述。

优选地，人心肌原性祖细胞是心室祖细胞。现在已经确定了将心肌原性祖细胞偏向心室谱系的培养条件。这些心室心肌原性祖细胞可以在RPMI/B27培养基中培养，并且它们可以进一步分化为心室肌细胞。用于体外培养心脏心室祖细胞以使其体外分化为心室细胞(例如，表达下文描述的MLC2v标志物)的优选培养基是心脏祖细胞培养(CPC)培养基(高级DMEM/F12，补充有20％KnockOut血清替代物、2.5mM GlutaMAX和100μg/ml维生素C)。

分化的心脏细胞的已知标志物可以用于鉴定通过心脏祖细胞的分化而产生的细胞的类型。例如，心肌肌钙蛋白I(cTnI)可用作心肌细胞分化的标志物。CD144(VE-钙粘蛋白)可用作内皮细胞的标志物。平滑肌肌动蛋白(SMA)可用作平滑肌细胞的标志物。MLC2v可用作心室肌细胞的标志物。在未成熟的心室肌细胞和心房肌细胞上均表达的MLC2a可用作这些细胞类型的标志物。另外，在心房肌细胞中特异性表达的肌脂蛋白可以用作心房肌细胞的标志物。主要在心室中以及较小程度上在心房中表达的受磷蛋白也可以用作标志物。在心房心肌细胞中表达的毛发相关转录因子1(HRT1)，也称为Hey1，可用作心房心肌细胞的标志物。在心室心肌细胞中表达的HRT2(Hey2)可用作心室心肌细胞的标志物。另外，IRX4在发育的所有阶段期间都具有心室限制性表达模式，并因此可用作心室谱系标志物。总之，在心室中表达并因此是合适的心室标志物的基因是：MLC2v、IRX4和HRT2，而在心房中表达并因此是合适的心房标志物的基因是：MLC2a、HRT1、肌脂蛋白和ANF(心房利钠因子)。心室分化的优选标志物是MLC2v。

人心脏心室祖细胞的克隆群

在另一方面，本发明提供了用于获得人心脏心室祖细胞的克隆群的方法，以及这些祖细胞的分离的克隆群。本发明允许心脏心室祖细胞的扩增和增殖，使得可以实现十亿或更多细胞的克隆群。将NRP1+心脏心室祖细胞克隆扩增到如此大量的能力是在体内成功使用这些细胞以增强心脏功能的必要特征，因为这种用途需要大约十亿或更多的细胞。

因此，在另一方面，本发明提供了用于获得人心脏心室祖细胞的克隆群的方法，该方法包括：

分离单个NRP1+人心脏心室祖细胞；和

在一定条件下培养单个NRP1+人心脏心室祖细胞，使得该细胞扩增到至少1×10⁹个细胞，从而获得人心脏心室祖细胞的克隆群。

在一种优选的实施方式中，单个NRP1+人心脏心室祖细胞在初始培养时为Islet 1阳性，Nkx2.5阴性和flk1阴性。如实施例中进一步描述的，可以在促进产生心肌原性祖细胞的条件下在培养的大约第6天获得这样的单个细胞。人心脏心室祖细胞的克隆群可以在体外进一步培养和分化，使得细胞表达心室标志物MLC2v。

优选地，通过荧光激活细胞分选分离单个NRP1+人心脏心室祖细胞。替代地，可以通过MACS或通过本领域已知和/或本文描述的其他细胞分选方法分离细胞。

优选地，使用一种或多种同NRP1反应的试剂，诸如抗NRP1抗体或如上所述的同NRP1反应的其他试剂，分离单个NRP1+人心脏心室祖细胞。

在其他实施方式中，人心脏心室祖细胞的克隆群是NRP1+且对于HVP的至少一个第二标志物(例如，Isl1、FZD4、LIFR、FGFR3、TNFSF9)呈阳性。在使用同NRP1反应的试剂和同第二标志物反应的试剂之前，可以如本文所述分离和克隆扩增这样的双阳性细胞。

在优选的实施方式中，如上所述，将单个NRP1+人心脏心室祖细胞在心脏祖细胞培养(CPC)培养基中培养。

在优选的实施方式中，将单个NRP1+人心脏心室祖细胞在使得细胞偏向心室分化的条件下培养。优选的培养条件包括在CPC培养基中培养。

在各个实施方式中，单个NRP1+人心脏心室祖细胞可以扩增为至少1×10⁹个细胞、至少2×10⁹个细胞、至少3×10⁹个细胞、至少4×10⁹个细胞、至少5×10⁹个细胞、至少6×10⁹个细胞、至少7×10⁹个细胞、至少8×10⁹个细胞、至少9×10⁹个细胞或至少10×10⁹个细胞。

因此，本发明还提供了至少1×10⁹个NRP1+人心脏心室祖细胞的克隆群，其通过本发明的用于获得人心脏心室祖细胞的克隆群的方法可获得或获得。在各种实施方式中，NRP1+人心脏心室祖细胞的克隆群包含至少1×10⁹个细胞、至少2×10⁹个细胞、至少3×10⁹个细胞、至少4×10⁹个细胞、至少5×10⁹个细胞、至少6×10⁹个细胞、至少7×10⁹个细胞、至少8×10⁹个细胞、至少9×10⁹个细胞或至少10×10⁹个细胞。祖细胞在体外向心室谱系的分化可通过在本文所述的用于偏向心室谱系的条件下培养来实现。此外，心脏心室祖细胞在体内的移植导致体内的心室分化。

本发明还提供了包含心脏心室祖细胞的克隆群的药物组合物。该药物组合物通常是无菌的，并且可以包含适合于药物给药的缓冲液、介质、赋形剂等。在一种实施方式中，将包含克隆群的药物组合物配制在三维(3D)基质上。配制在3D基质上的组合物特别优选用于形成心肌细胞补片，该补片可以在体内移植用于心肌修复。此外，可以将组合物配制成二维(2D)细胞片，例如在Domian,I.J.et al.(2009)Science 326:426-429中所述的肌肉薄膜(MTF)。这样的2D细胞组织片也可以用于形成心肌细胞补片，其可以在体内移植用于心肌修复。

人心室祖细胞(HVP)的产生

在通过前述方法分离之前，以及任选地通过前述方法获得克隆群之前，可以通过在适当的产生HVP的培养条件下培养人万能干细胞(hPSC)来获得人心室祖细胞(HVP)的非克隆群。示例性的一组培养条件和合适的起始细胞在实施例1和实施例10中详细描述，在本文中也称为人心室祖细胞产生(HVPG)方案。合适的hPSC起始细胞包括诱导性万能干细胞(iPSC)和人胚胎干细胞，例如ES细胞系。对于该方案，首先在hPSC中激活Wnt/β-连环蛋白信号传导，然后是温育期，然后抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导。通过与Gsk3抑制剂优选CHIR98014(CAS 556813-39-9；可从例如Selleckchem商购)一起温育来实现Wnt/β-连环蛋白信号传导激活。通过与Porcn抑制剂优选Wnt-C59(CAS 1243243-89-1；可从例如Selleckchem或Tocris商购)一起温育来实现Wnt/β-连环蛋白信号传导抑制。Gsk3抑制剂用于促进心脏中胚层分化，而Porcn抑制剂用于增强从中胚层细胞向心室祖细胞分化。

因此，在另一方面，本发明提供了产生人心室祖细胞(HVP)的方法，该方法包括在包含Gsk3抑制剂优选CHIR98014的培养基中培养人万能干细胞(hPSC)至少24小时，更优选2天或3天，然后在包含Porcn抑制剂优选Wnt-C59(且缺少Gsk3抑制剂)的培养基中培养hPSC至少48小时，使得产生HVP。实验表明，在用CHIR-98014处理24小时后，超过99％的hPSC表达中胚层标志物Brachyury，且在用CHIR-98014处理后三天，超过95％的分化细胞表达Mesp1，这标志了心脏中胚层。此外，用Wnt-C59处理48小时增强了从中胚层细胞向心室祖细胞分化。

因此，关于Gsk3和Porcn抑制剂的使用时间，通常在培养的第0天，将hPSC与Gsk3抑制剂一起培养，在培养的第3天，更换培养基以除去Gsk3抑制剂，并然后在培养的第5天用含有Porcn抑制剂的培养基培养细胞。HVP产生在培养的第5天和第7天之间(含端值)为最佳，且在培养的第6天达到峰值。关于培养条件和使用Gsk3和Porcn抑制剂的时间的其他非限制性的示例性细节在实施例1和10中详细描述。

体内组织工程

实施例6和7中描述的体内移植研究，其中在裸鼠中的肾囊下移植了人心室祖细胞(HVP)，证明了HVP自发组装到肾囊表面上的成熟功能性人心室肌大壁中的能力。通过将鼠的脉管系统调至心室肌壁，通过旁分泌途径发生血管化，同时通过细胞自主途径由祖细胞自身产生基质。实施例8中描述的体内心肌内移植研究，其中将HVP移植到正常鼠心脏中，证明了HVP自发地迁移到心外膜表面，它们在此处扩增，随后分化并成熟成心外膜表面上的人心室肌壁。综上所述，这些研究表明人心室形成(ventriculogenesis)可以通过纯化的HVP在体内经由完全的细胞自主途径发生，从而使其可以用于器官对器官的体内组织工程。

人心室心肌具有有限的再生能力，其中大部分在10岁以后就丧失了(Bergmann,O.et al.(2015)Cell 161:1566-1575)。因此，在心脏损伤期间产生心肌修复、再生和组织工程方法的新策略已成为再生生物学和医学中深入研究的主题(Sahara,M.et al.(2015)EMBO J.34:710-738；Segers,V.F.M.and Lee,R.T.(2008)Nature 451:937-942)。鉴于需要在任何实体器官的组织工程过程中实现协调的血管化和基质形成，因此假设在体内形成完整的3-D实体器官将最终需要添加血管细胞和/或导管，以及允许对齐和产生收缩力的生物材料和/或脱细胞基质(Forbes,S.J.and Rosenthal,N.(2014)Nature Med.20:857-869；Harrison,R.H.et al.(2014)Tissue Eng.Part B Rev.20:1-16)。添加这些各种组分以实现功能性实体器官的形成的复杂性使将其简化为临床实践的尝试挫败(Webber,M.J.etal.(2014)Ann.Biomed.Eng.43:641-656)。尽管hPSC具有广阔的前景，但迄今为止，在任何哺乳动物系统中都无法在心脏表面上在体内构建出纯的血管化功能齐全且成熟的3D人心室肌器官(Vunjak-Novakovic,G.et al.(2011)Annu.Rev.Biomed.Eng.13:245-267)。

从人ES或iPS细胞系的可再生来源产生数十亿纯化HVP的能力代表了在晚期心力衰竭的环境中产生功能性心室肌的新方法。祖细胞可以通过心肌内注射来递送，并然后自我迁移到心外膜表面，在那里它们会扩增并分化，从而失去祖细胞标志物。在数周的过程中，细胞退出细胞周期，并继续形成成年棒状细胞，其显示出成熟心室心肌的几个独立标志物，包括T小管的形成、儿茶酚胺反应性、自动节律性的丧失、具有对齐的sarcomenric结构的成体棒状构象，以及产生与源自hPSC分化的心肌细胞的其他心肌补片相当的力的能力(Tulloch,N.L.et al.(2011)Circ.Res.109:47-59)。这种细胞自主途径的可扩展性已允许异位产生人心室肌，其合并厚度超过1.5cm厚，接近与人心室自由壁相对应的水平(Basavarajaiah,S.et al.(2007)Br.J.Sports Med.41:784-788)。

HVP的独特功能是能够迁移到心外膜生境(niche)，即晚期阶段大多数成年心脏祖细胞的位置，并且在心室形成期间模仿心室紧致区扩张的过程中这些细胞的正常生境。先前的研究已表明，急性缺血性损伤的发生和血管通透性的破坏是将相对少量的ES细胞衍生的心肌细胞移植到受损心肌中的先决条件(van Laake,L.W.et al.(2007)Stem CellRes.1:9-24；Laflamme,M.A.et al.(2007)Nat.Biotechnol.25:1015-1024)，且即使如此存活率仍然很低(<5％)(Laflamme,M.A.and Murry,C.E.(2011)Nature 473:326-335；Laflamme,M.A.et al.(2005)Am.J.Pathol.167:663-671)。在没有急性缺血性损伤的情况下，心肌内HVP在心外膜表面上形成广泛的心室补片的能力为扩张型心肌病提供了一种新的治疗策略，而无需其他生物材料、细胞或外源基因和/或RNA的转移。

在体内正常心脏的心外膜表面上形成3-D心室肌壁的能力是心室祖细胞的独特特征，因为晚期祖细胞在心脏或非心脏背景中均未显示出形成三维心室组织的能力，强调了产生定型的心室谱系以及在特定的心室形成阶段纯化特定的心室祖细胞的重要性。

因此，本发明提供了使用本文所述的HVP在体内产生人心室组织的方法。在一种实施方式中，该方法包括将NRP1+祖细胞移植到非人类动物的器官中，并使祖细胞在体内生长，使得产生人心室组织。优选地，该非人类动物是免疫缺陷的，从而其不能引发针对人类祖细胞的免疫应答。在一种实施方式中，非人类动物是小鼠，例如免疫缺陷的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠或免疫缺陷的SCID-米色小鼠(可从Charles RiverFrance商购)。在一种实施方式中，器官是肾脏(例如，将细胞移植到肾囊下)。在另一种实施方式中，器官是心脏。在各种实施方式中，移植了至少1×10⁶个细胞、至少2×10⁶个细胞、至少3×10⁶个细胞、至少4×10⁶个细胞、至少5×10⁶个细胞、至少1×10⁷个细胞、至少5×10⁷个细胞、至少1×10⁸个细胞、至少1×10⁹个细胞。

为了获得用于移植的HVP，可以在导致生成HVP的条件下，在体外培养人万能干细胞(hPSC)，如本文所述(本文称为HVPG方案)。关于体外培养后移植HVP的时机，为了获得最佳的心室组织生成，应在可根据移植时由HVP表达的细胞标志物所限定的阶段移植细胞，在培养开始后几天确定，其定义为HVPG方案的第0天。在一种实施方式中，在心脏中胚层形成的峰值之后移植细胞，该峰值可以定义为中胚层标志物MESP1的峰值表达。通常，MESP1表达在培养的第2天至第4天之间(含端值)，并在第3天达到峰值。在一种实施方式中，在对应于峰值Islet-1表达的时间移植细胞。通常，Islet-1在培养的第4天至第8天之间(含端值)表达，并在培养的第6天达到峰值。在一种实施方式中，在NKX2.5表达的峰值之前移植细胞。通常，NKX2.5表达在培养的第6天开始，在培养的第10天达到峰值，并然后保持下去。在一种实施方式中，在下游基因MEF-2和TBX-1的峰值表达之前移植细胞。通常，这些下游基因在培养的第5天和第15天之间(含端值)表达，并在培养的第8天达到峰值。在一种实施方式中，在表达分化的收缩蛋白基因之前移植细胞。通常，收缩蛋白基因(包括TNNT2和MYH6)的表达从培养的第10天开始进行。在某些实施方式中，当存在两个、三个或四个前述标志物模式时移植细胞。在另一种实施方式中，当所有五个上述标志物模式都存在时移植细胞。在一种实施方式中，在培养的第4天至第8天之间(含端值)移植细胞。在更优选的实施方式中，在培养的第5天至第7天之间(含端值)移植细胞。在最优选的实施方式中，在培养的第6天移植细胞。

可以使移植的细胞在非人类动物中生长合适的时间，以允许产生所需大小、数量或厚度的心室组织。在各种实施方式中，使细胞生长一周、两周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月。该方法可以进一步包括在细胞生长并分化为心室组织之后，从非人类动物中收获心室组织。

增强心脏功能的方法

通过将细胞直接移植到心脏中，本发明的心脏心室祖细胞可用于体内以增强心脏功能。现已证明NRP1+祖细胞具有分化为所有三种类型的心脏谱系细胞(心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞)的能力(参见实施例3)。此外，当在偏向心室谱系的条件下培养时，现已证明NRP1+祖细胞在体内移植到天然的心室环境中时主要采用心室肌表型，表明了这些祖细胞“识别”心室环境并作出反应，并在体内适当地分化。由于对心室环境的损害是造成心脏疾病和疾患中心脏功能受损的主要原因，因此使用本发明的心室祖细胞恢复心室肌细胞的能力代表了本领域的重大进步。

因此，在另一方面，本发明提供了增强受试者的心脏功能的方法，该方法包括向受试者给药包含本发明的NRP1+心脏心室祖细胞的克隆群的药物组合物。优选地，将克隆群直接给药至受试者的心脏中。更优选地，将克隆群直接给药至受试者心脏的心室区域中。在一种实施方式中，给药至受试者的药物组合物包含配制在三维基质上的克隆群。

本发明用于增强受试者的心脏功能的方法可以用于涉及心脏损害或心功能降低或受损的多种临床情况。这样的临床情况的非限制性实例包括患有心肌梗死的受试者和患有先天性心脏病的受试者。

因此，在另一方面，本发明提供了治疗受试者的心血管病症、疾病或疾患的方法，该方法包括向受试者给药包含本发明的NRP1+心脏心室祖细胞的克隆群的药物组合物。可以给药治疗有效量的心脏心室祖细胞用于治疗心血管病症、疾病或疾患。优选的心血管病症、疾病或疾患的实例包括冠状动脉疾病和急性冠状动脉综合征。

体外使用心脏心室祖细胞的方法

本发明的心脏心室祖细胞可在体外用于研究心脏成熟和分化的各个方面，特别是用于鉴定参与心脏成熟和分化过程的细胞信号传导途径和生物介质。

此外，由于本发明的NRP1+心脏心室祖细胞定型为心脏谱系，并且还偏向心室分化，所以这些祖细胞也可用于评估测试化合物的心脏毒性。必须先评估所有潜在的新药和疗法对心脏细胞的毒性，然后才能认为它们用于人体是安全的。因此，能够在体外培养系统中评估心脏毒性是非常有利的。因此，在另一方面，本发明提供了筛选测试化合物的心脏毒性的方法，该方法包括：

提供NRP1+人心脏心室祖细胞；

使细胞与测试化合物接触；和

测量测试化合物对细胞的毒性，

其中测试化合物对细胞的毒性指示了测试化合物的心脏毒性。

在优选的实施方式中，通过根据本文所述的方法分离细胞来提供NRP1+人心脏心室祖细胞。在特别优选的实施方式中，通过使用抗NRP1抗体将NRP1+细胞与包含心脏祖细胞的细胞培养物分开来分离细胞。优选地，如本文所述使用FACS或MACS分离细胞。在又一种实施方式中，在与测试化合物接触之前，将NRP1+人心脏心室祖细胞进一步培养并分化为MLC2v+心室细胞。

可以通过用于评估细胞活力或其他生理功能的多种不同方法中的一种或多种来测量测试化合物对细胞的毒性。优选地，使用标准细胞活力测定来测量测试化合物对细胞活力的影响，其中在存在测试化合物的情况下降低的细胞活力指示了测试化合物的心脏毒性。另外或替代地，可以测量细胞生长。另外或替代地，可以测量生理功能的其他指标，诸如细胞粘附、细胞信号传导、表面标志物表达、基因表达等。类似地，测试化合物对这些生理功能指标中任何一种的负面影响指示了测试化合物的心脏毒性。

本发明还提供了鉴定调节人心脏心室祖细胞分化的化合物的方法，该方法包括：

提供NRP1+人心脏心室祖细胞；

在存在或不存在测试化合物的情况下培养细胞；

在存在或不存在测试化合物的情况下测量细胞的分化；和

与不存在测试化合物的情况下的分化相比，选择调节人心脏心室祖细胞分化的测试化合物，从而鉴定出调节人心脏心室祖细胞分化的化合物。

在一种实施方式中，测试化合物刺激人心脏心室祖细胞分化。在另一种实施方式中，测试化合物抑制人心脏心室祖细胞分化。如本文所述，可以通过例如测量随时间出现在培养的细胞上的分化标志物的表达来测量细胞的分化。在优选的实施方式中，通过根据本文所述的方法分离细胞来提供NRP1+人心脏心室祖细胞。在特别优选的实施方式中，通过使用抗NRP1抗体将NRP1+细胞与包含心脏祖细胞的细胞培养物分开来分离细胞。优选地，如本文所述使用FACS或MACS分离细胞。

本发明还提供了鉴定调节人心室心肌细胞功能的化合物的方法，该方法包括：

提供NRP1+人心脏心室祖细胞；

在存在或不存在测试化合物的情况下，在产生人心室心肌细胞的条件下培养细胞；

在存在或不存测试化合物的情况下测量人心室心肌细胞的功能；和

与不存在测试化合物的情况下的功能相比，选择调节人心室心肌细胞功能的测试化合物，从而鉴定出调节人心室心肌细胞功能的化合物。

在一种实施方式中，测试化合物刺激人心室心肌细胞功能。在另一种实施方式中，测试化合物抑制人心室心肌细胞功能。可以通过测量任何合适的心室细胞功能指标来测量细胞功能，这样的指标包括但不限于，例如T小管的形成、成年棒状心室心肌细胞的获得以及响应电刺激而产生力的能力。用于测量这样的心室细胞功能指标的合适的测定法是本领域已知的。在优选的实施方式中，通过根据本文所述的方法分离细胞来提供NRP1+人心脏心室祖细胞。在特别优选的实施方式中，通过使用抗NRP1抗体将NRP1+细胞与包含心脏祖细胞的细胞培养物分开来分离细胞。优选地，如本文所述使用FACS或MACS分离细胞。

使用人心室祖细胞的体内动物模型

基于人iPS和ES细胞的心脏病模型的开发为心血管药物的开发和发现开辟了新的视野。然而，迄今为止，这些系统具有基于培养细胞系统中的2D结构的局限性。另外，细胞的胚胎和未成熟特性限制了它们对成年心脏的效用和保真性。人心脏疾病，尤其是心力衰竭，是一种复杂的多因素多器官疾病，其受环境、激素和其他关键器官的影响，这些器官是已知的治疗靶点部位(例如肾脏)。通过异位或在完整的正常鼠心脏表面上建立成熟的功能性人心室器官的能力，开辟了一种新的体内模型系统，从而允许实现通常只能在成熟的人心室肌腔上进行试验的研究，诸如室性心律失常、收缩力的产生、纤维化以及再生的潜力。因此，现在显然可以选择在体外组织培养系统之外以及直接在体内心力衰竭的情况下研究人心脏疾病。

因此，人心室祖细胞也可用于创建动物模型，其允许在体内评估人心脏组织功能并在体内筛选化合物，诸如以确定体内测试化合物的心脏毒性或鉴定在体内调节人心脏组织分化或功能的化合物。因此，本发明提供了使用本文所述的HVP在体内测试测试化合物对人心室组织的作用的方法。在一种实施方式中，该方法包括：

将NRP1+人心室祖细胞移植到非人类动物的器官中；

使祖细胞在体内生长，从而产生人心室组织；

向非人类动物给药测试化合物；和

评估测试化合物对非人类动物的人心室组织的作用。

在另一种实施方式中，该方法包括：

向非人类动物给药测试化合物，其中该非人类动物包含移植到该非人类动物的器官中的NRP1+人心室祖细胞；和

评估测试化合物对非人类动物中的NRP1+人心室祖细胞的作用。

在一种实施方式中，例如通过测量测试化合物对非人类动物中的人心室组织或NRP1+人心室祖细胞的活力的影响(与在没有测试化合物的情况下组织或祖细胞的活力相比)，来评估测试化合物的心脏毒性。细胞活力可以通过本领域已知的标准方法来评估。

在另一种实施方式中，可以例如通过测量测试化合物对非人类动物中的人心室组织或NRP1+祖细胞的分化的作用(与在没有测试化合物的情况下组织或祖细胞的分化相比)，来评估测试化合物调节心脏分化的能力。细胞的分化可以通过例如测量随时间出现在细胞上的分化标志物的表达来测量。

在另一种实施方式中，可以例如通过测量测试化合物对非人类动物中的人心室组织或NRP1+人祖细胞的功能的作用(与在没有测试化合物的情况下组织或祖细胞的功能相比)，来评估测试化合物调节心脏功能的能力。可以通过测量任何合适的心室细胞功能指标来测量组织或祖细胞的功能，这样的指标包括但不限于，例如T小管的形成、成年棒状心室心肌细胞的获得以及响应电刺激而产生力的能力。用于测量这样的心室细胞功能指标的合适的测定法是本领域已知的。

优选地，非人类动物是免疫缺陷的，使得其不能引发针对人祖细胞的免疫应答。在一种实施方式中，非人类动物是小鼠，诸如免疫缺陷的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠或免疫缺陷的SCID-米色小鼠(可从Charles River France商购)。在一种实施方式中，器官是肾脏(例如，将细胞移植到肾囊下)。在另一种实施方式中，器官是心脏。在各种实施方式中，移植了至少1×10⁶个细胞、至少2×10⁶个细胞、至少3×10⁶个细胞、至少4×10⁶个细胞、至少5×10⁶个细胞、至少1×10⁷个细胞、至少5×10⁷个细胞、至少1×10⁸个细胞、至少1×10⁹个细胞。

为了创建动物模型，可以如上所述通过在导致HVP产生的条件下体外培养hPSC来获得用于移植的HVP。关于体外培养后移植HVP的时机，为了获得最佳的心室组织生成，应在可根据移植时由HVP表达的细胞标志物所限定的阶段移植细胞，在培养开始后几天确定，其定义为HVPG方案的第0天。在一种实施方式中，在心脏中胚层形成的峰值之后移植细胞，该峰值可以定义为中胚层标志物MESP1的峰值表达。通常，MESP1表达在培养的第2天至第4天之间(含端值)，并且在第3天达到峰值。在一种实施方式中，在对应于峰值Islet-1表达的时间移植细胞。通常，Islet-1在培养的第4天至第8天之间(含端值)表达，在培养的第6天达到峰值。在一种实施方式中，在NKX2.5表达的峰值之前移植细胞。通常，NKX2.5表达在培养的第6天开始，在培养的第10天达到峰值，并然后保持下去。在一种实施方式中，在下游基因MEF-2和TBX-1的峰值表达之前移植细胞。通常，这些下游基因在培养的第5天至第15天之间(含端值)表达，并在培养的第8天达到峰值。在一种实施方式中，在表达分化的收缩蛋白基因之前移植细胞。通常，收缩蛋白基因(包括TNNT2和MYH6)的表达从培养的第10天开始进行。在某些实施方式中，当存在两个、三个或四个前述标志物模式时移植细胞。在另一种实施方式中，当所有五个上述标志物模式都存在时移植细胞。在一种实施方式中，在培养的第4天至第8天之间(含端值)移植细胞。在更优选的实施方式中，在培养的第5天至第7天之间(含端值)移植细胞。在最优选的实施方式中，在培养的第6天移植细胞。

在给药测试化合物(一种或多种)之前，可以使移植的细胞在非人类动物中生长一段合适的时间，以使得产生所需大小、数量或厚度的心室组织。在各种实施方式中，使细胞生长一周、两周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月。

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步限制。在本申请中引用的附图以及所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容均通过引用明确地并入本文。

实施例

实施例1：通过调节人万能干细胞中的Wnt信号传导来产生人Isl1+心肌源性祖细胞

已证实经典的Wnt信号转导的时间调制足以从许多hPSC系以高产率和纯度产生功能性心肌细胞(Lian,X.et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109:E1848-1857；Lian,X.et al.(2013)Nat.Protoc.8:162-175)。在这种方法中，首先在hPSC中激活Wnt/β-连环蛋白信号传导，然后是温育期，然后抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导。在最初公开的方案中，通过与Gsk3抑制剂CHIR99021(GSK-3α，IC₅₀＝10nM；GSK-3，βIC50＝6.7nM)一起温育来实现Wnt/β-连环蛋白信号传导激活，并通过与Porcn抑制剂IWP2(IC₅₀＝27nM)一起温育来实现Wnt/β-连环蛋白信号传导抑制。因为我们使用Gsk3抑制剂和Wnt产生抑制剂来进行心脏分化，所以该方案被称为GiWi方案。为了提高原始方案的效率并减少原始方案中使用的小分子的潜在副作用，开发了第二代方案，该方案使用另一组具有更高抑制能力的小分子。在第二代GiWi方案中，通过与Gsk3抑制剂CHIR98014(CAS 556813-39-9；可从例如Selleckchem商购)(GSK-3α，IC₅₀＝0.65nM；GSK-3，βIC50＝0.58nM)一起温育来实现Wnt/β-连环蛋白信号传导激活，并通过与Porcn抑制剂Wnt-C59(CAS 1243243-89-1；可从例如Selleckchem或Tocris商购)(IC₅₀＝74pM)一起温育来实现Wnt/β-连环蛋白信号传导抑制。Gsk3抑制剂CHIR98014用于促进心脏中胚层分化，而Porcn抑制剂Wnt-C59用于增强从中胚层细胞到心室祖细胞的分化。

对于通过使用这些小分子进行的心肌细胞分化，将hPSC维持在Matrigel(BDBiosciences)涂覆的平板(Corning)上于E8培养基(描述于Chen,G.et al.(2011)NatureMethods,8:424-429；可商购；STEMCELL Technologies)中或mTeSR1培养基(可商购；STEMCELL Technologies)中。合适的hPSC包括诱导性万能干细胞(iPSC)，诸如19-11-1、19-9-7或6-9-9细胞(Yu,J.et al.(2009)Science,324:797-801)，以及人胚胎干细胞(hESC)，诸如ES03(WiCell研究所)和H9细胞(Thomson,J.A.et al.(1998)Science,282:1145-1147)。

将维持在mTeSR1培养基中Matrigel涂覆的表面上的hPSC在37℃下用Accutase(Life Technologies)解离成单细胞，持续5分钟，并然后在补充有5μM ROCK抑制剂Y-27632(Selleckchem)的mTeSR1培养基中以100,000-200,000个细胞/cm²接种到Matrigel涂覆的细胞培养皿中(第﹣2天)，持续24小时。然后将细胞在mTeSR1中培养，每天更换一次。在第0天，然后在RPMI/B27-ins(500ml RPMI，有10ml B27补充剂，不含胰岛素)中用1μM Gsk3抑制剂CHIR98014(Selleckchem)处理细胞24小时(第0天至第1天)。然后在第3天将培养基更换为含有2μM Porcn抑制剂Wnt-C59(Selleckchem)的相应培养基，然后在第5天更换培养基期间将其除去。从第7天开始，将细胞维持在RPMI/B27(原液：500ml RMPI培养基+10ml B27补充剂)中，每三天更换一次培养基。图1示意性地说明了这种产生心肌原性祖细胞的示例性培养方案。

进行流式细胞术和免疫染色以检查特定谱系标志物的表达。在用CHIR-98014处理24小时后，超过99％的hPSC表达中胚层标志物Brachyury。在用CHIR-98014处理后三天，超过95％的分化细胞表达Mesp1，这标志了心脏中胚层。如通过cTnT流式细胞术和电生理学分析所确定的，该培养方案不仅允许细胞同步分化为心脏中胚层谱系，而且在分化14天后可重现地产生大于90％的心室肌细胞。

为了进一步评估hPSC随时间的心脏分化，在0-7天和第11天进行蛋白质印迹分析，以检查Isl1和Nkx2.5(心肌原性祖细胞标志物)和cTnI(心肌细胞标志物)的表达。在Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Pierce)的存在下，在M-PER哺乳动物蛋白提取试剂(Pierce)中裂解细胞。在变性条件下，通过10％Tris-甘氨酸SDS/PAGE(Invitrogen)分离蛋白质，然后将其转移到硝酸纤维素膜上。在用TBST中的5％干燥乳粉封闭后，将膜与一抗在4℃下温育过夜。然后将膜洗涤，与抗小鼠/兔过氧化物酶缀合的二抗在室温下一起温育1小时，然后通过SuperSignal化学发光(Pierce)显色。结果如图2所示。在hPSC的心脏分化过程中，Isl1表达在第4天开始，并在第6天增加到其最大表达，而NKx2.5仅在第6天开始表达，并在第10天后达到其最大表达。直到分化的第11天才诱导出心肌细胞(cTnI+细胞)。

另外，对第6天的细胞进行免疫染色用于Isl1表达。将细胞在室温下用4％甲醛固定15分钟，并然后在PBS加0.4％Triton X-100和5％脱脂干燥乳粉(Bio-Rad)中用一抗(抗Isl1)和二抗染色。将细胞核用含DAPI的Gold抗淬灭试剂(Gold Anti-Fade Reagent withDAPI)(Invitrogen)染色。使用带有

Retiga 4000R相机的落射荧光显微镜(Leica DM IRB)进行成像分析。结果显示大量的Isl1+细胞。

还进行了第6天细胞的流式细胞术分析用于Isl1表达。将细胞用Accutase解离成单个细胞10分钟，并然后在室温下用1％多聚甲醛固定20分钟，并用在PBS 0.1％Triton X-100和0.5％BSA中的一抗和二抗染色。在FACSCaliber流式细胞仪(Beckton Dickinson)上收集数据，并使用FloJo进行分析。如图3所示，结果表明，在此阶段超过95％的细胞表达了Isl1。

综上所述，该实施例提供了用于人心室祖细胞生成的方案(HVPG方案)，该方案允许在6天内高效大规模生产数十亿个Isl1+人HPV。

实施例2：Jagged 1作为心脏祖细胞的细胞表面标志物的鉴定

为了在基因组规模水平上描述心脏分化过程中发生的转录变化，在分化后的不同时间点进行RNA测序(RNA-seq)以建立心脏发育转录环境。我们在第0天到第7天的样品以及第19天和第35天的样品(每个时间点两个独立的生物学重复)上进行了RNA-seq实验。使用illumine Hiseq 2000平台进行了两批RNA-seq(读取长度为100bp和50bp)。总共检查了20个样品。使用Bowtie和Tophat将我们的读段映射到参考人类基因组(hg19)中，并使用RPKM方法(读数每千碱基转录本每百万读数)来计算每个基因表达(根据Refseq对基因进行注释)。hPSC分化为心肌细胞涉及五种主要细胞类型：万能干细胞(第0天)、中胚层祖细胞(第1天至第2天)、心脏中胚层细胞(第3天至第4天)、心场祖细胞(第5天、第6天和第7天)和心肌细胞(第10天后)。

使用HVPG方案从hPSC心脏分化的分子mRNA分析揭示了基因表达的动态变化，分化过程中万能性标志物OCT4、NANOG和SOX2下调。在添加CHIR-98014之后的最初24小时内，发生了原始条纹样基因T和MIXL1的诱导，并然后在第2天和第3天心肌中胚层标志物MESP1上调。在分化的后期(第10天后)检测到心肌标志物TNNT2、TNNC1、MYL2、MYL7、MYH6、MYH7和IRX4的表达。

通过该分析，鉴定了在每个分化阶段富集的基因，包括中胚层细胞、心脏祖细胞和心肌细胞。中胚层细胞，其与第1天分化的细胞有关，表达brachyury。我们鉴定了中胚层细胞的潜在表面标志物，包括：FZD10、CD48、CD1D、CD8B、IL15RA、TNFRSF1B、TNFSF13、ICOLSG、SEMA7A、SLC3A2、SDC1、HLA-A。通过类似的分析，我们还确定了心脏中胚层mesp1阳性细胞的表面标志物，包括：CXCR4、ANPEP、ITGA5、TNFRSF9、FZD2、CD1D、CD177、ACVRL1、ICAM1、L1CAM、NGFR、ABCG2、FZD7、TNFRSF13C、TNFRSF1B。

与蛋白质印迹分析一致，ISL1 mRNA最早在第4天表达，并在第5天达到峰值，即其蛋白质表达达到其峰值之前的一天。在分化的第5天(心脏祖细胞阶段，在第5天isl1 mRNA表达最大，在第6天isl1蛋白质表达最大)，将第5天富集的基因与抗CD抗体阵列(一组350种已知CD抗体)进行比较，并鉴定出许多潜在的细胞表面蛋白质标志物。我们鉴定了在此阶段表达的许多细胞表面蛋白，包括：FZD4、JAG1、PDGFRA、LIFR(CD118)、TNFSF9、FGFR3。

选择细胞表面蛋白Jagged 1(JAG1)和Frizzled 4(FZD4)进行进一步分析。如下以及实施例3和4中所述进一步研究Jagged 1表达。如实施例5中所述进一步研究Frizzled 4表达。

首先，使用双染色流式细胞术技术分析了Isl1和Jag1的表达。基本上如实施例1中所述进行流式细胞术分析，使用抗Isl1和抗Jag1抗体进行双重染色。结果示于图4。发现Jagged 1表达追踪Islet 1的表达，并且在分化的第6天，所有Islet 1阳性细胞也表达了Jagged 1，反之亦然。由于这两种标志物的共表达模式，使用Jagged 1抗体将94.1％Islet1+细胞分化群富集到99.8％的Islet1+Jagged1+细胞纯度。

使用HVP中ISL1和NKX2.5表达的双重免疫染色，还证实了Islet 1是比Nkx2.5基因更早发育的基因。纯化的HVP一致地表达ISL1基因，但是在这一阶段，只有少数细胞开始表达Nkx2.5。

此外，在第4周的人胎儿心脏组织、新生儿心脏组织和8岁的心脏组织上，基本上如实施例1所述，进行用抗Isl1和抗Jag 1两者的免疫染色。结果显示，在体内胎儿心脏中，所有Islet-1阳性细胞也表达了Jagged 1。但是，新生儿心脏和8岁的心脏没有表达Islet 1或Jagged 1。在第4周人胎儿心脏的心室中，心脏肌钙蛋白T(cTnT)染色显示出可见肌节结构。此外，在第4周胎儿心脏中，超过50％的心室细胞同时表达Islet1和Jagged 1，其在随后的成熟过程中明显降低，而在人新生儿心脏的心室肌细胞中，Islet1和Jagged 1两者的表达均缺少。

上述实验证明，Jagged 1是Islet-1阳性心肌原性祖细胞的细胞表面标志物。

实施例3：Isl1+Jag1+心脏祖细胞的克隆分化

为了表征Isl1+Jag1+细胞的克隆分化潜能，通过实施例1中所述的培养方案产生心肌原性祖细胞，并将一个单独的Isl1+Jag1+细胞接种到Matrigel涂覆的48孔板的一个孔中。用Jag1抗体纯化细胞，并然后将一个单细胞接种到一个孔中。然后将单个细胞在心脏祖细胞培养(CPC)培养基(高级DMEM/F12，补充有2.5mM GlutaMAX、100μg/ml维生素C、20％Knockout血清替代品)中培养3周。

然后用三种抗体对3周分化细胞群进行免疫染色：心肌肌钙蛋白I(cTn1)用于心肌细胞，CD144(VE-钙粘蛋白)用于内皮细胞，以及平滑肌肌动蛋白(SMA)用于平滑肌细胞。结果显示，单细胞培养的Isl1+Jag1+细胞产生cTnI阳性和SMA阳性细胞，但不产生VE-钙粘蛋白阳性内皮细胞，表明这些产生的Islet1+细胞是心肌祖细胞，其对内皮谱系具有有限的分化潜能。用HVPG方案从人诱导性万能干细胞(iPSC 19-9-11系)分化的纯化的Islet1+Jagged1+细胞也显示出相似的体外分化潜力，且主要分化为cTnI+SMA+细胞，但不分化为VE-钙粘蛋白+细胞。在数周的过程中，这些细胞表达了心室特异性标志物MLC2v，表明初始ISL1+亚组已经定型为心室细胞命运。由于使用HVPG方案生成的Islet1+细胞的血管分化潜力有限，因此这些生成的Islet1+细胞可能代表了与先前报道的KDR+群体(Yang,L.et al.(2008)Nature 453:524-528)或多能ISL1+细胞(Bu,L.et al.(2009)Nature 460:113-117；Moretti,A.et al.(2006)Cell 127:1151-1165)不同的祖细胞群，其可产生所有三种谱系的心血管细胞。

这些结果表明，Isl1+Jag1+心肌原性祖细胞可以成功地从单个细胞体外培养为包含所有三种类型的心脏谱系细胞(主要是心肌细胞)的显著扩增的细胞群(1×10⁹个细胞或更多)。此外，这些细胞可以在体外培养更长的时间，至少2-3周，且甚至几个月(例如六个月或更长时间)。由于心肌原性祖细胞逐渐分化为不增殖的心肌细胞，因此优选大约2-3周的培养期。

实施例4：Isl1+Jag1+心脏祖细胞的体内发育潜力

ES03人胚胎干细胞(hESC)系(从WiCell研究所获得)表达由心脏特异性cTnT启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)。使用实施例1中描述的培养方案，将ES03细胞用于产生Isl1+Jag1+心肌原性祖细胞。将Isl1+Jag1+心肌原性祖细胞移植到严重的联合免疫缺陷(SCID)米色小鼠的心脏中，以证明其体内的发育潜力。

简言之，在开胸手术中将Isl1+Jag1+细胞(每接受者1,000,000个细胞)直接注射到NOD/SCID-γ小鼠的左心室壁中。手术后2-3周收集心脏，在1％PFA中固定，并切成10μm的切片(n＝12)。对移植小鼠心脏的组织学分析显示，通过落射荧光和通过用抗GFP抗体染色检测到GFP+供体细胞的存在，表明Isl1+Jag1+心肌原性祖细胞当在体内移植时能够分化为心肌细胞。

与类似移植的正常小鼠相比，Isl1+Jag1+心肌源性祖细胞也被直接移植到SCID米色小鼠(“受伤小鼠”)的梗死心脏中。两周后进行分析时，移植了Isl1+Jag1+心肌原性祖细胞的受伤小鼠具有的移植物尺寸比类似移植的正常小鼠更大，这证明了Isl1+Jag1+心肌原性祖细胞在体内的心肌细胞再生能力。

实施例5：Frizzled 4作为心脏祖细胞的细胞表面标志物的鉴定

如实施例2中所述，通过RNA-seq分析鉴定Frizzled 4(FZD4)在心脏祖细胞中被表达。因此，为了确认FZD4是心脏祖细胞的细胞表面标志物，在心脏分化过程中通过蛋白质印迹分析评估FZD4表达。如图5所示，结果证明FZD4在万能干细胞和前3天分化的细胞中不表达。但是，FZD4在第4天开始表达，并在表达的第5天使其表达最大化。

为了定量在单个细胞水平上FZD4和Isl1的共表达模式，进行FACS分析。如图6所示，在分化的第5天，超过83％的细胞同时表达isl1和FZD4，这表明在使用GiWi方案的心脏祖细胞分化期间，FZD4是isl1阳性细胞的细胞表面标志物。

为了确认JAG1和FZD4确实都与ISL1在人心室祖细胞上共表达，用针对Islet-1、Jagged 1和Frizzled 4的抗体对第6天从hPSC分化的细胞进行三重免疫荧光分析。三重染色实验证明Isl1+细胞同时表达Jagged 1和Frizzled 4。

实施例6：人心室祖细胞(HPV)在体内产生3-D心室心肌器官

心室心肌腔的构建是人类器官生成过程中最关键和最早的步骤之一，且需要一系列协调的步骤，包括迁移、增殖、血管化、组装和基质排列。为了测试HVP在体内驱动心室生成的能力，我们在免疫受损小鼠的肾囊下移植了纯化的HVP或未纯化的HVP(92.0±1.9％ISL1+)。移植后2个月之后，移植有未纯化HVP的动物形成了肿瘤，导致肿瘤形成效率为100％(100％，4/4)，而移植有纯化HVP的动物没有形成任何肿瘤(0％，0/10)。

对纯化的HVP移植的肾脏进一步测定进行组织学分析。苏木精和曙红(H&E)染色显示出在小鼠肾脏的表面上有长度超过0.5cm且厚度超过1mm的器官，并且其均匀表达心室特异性标志物MLC2v(O’Brien,T.X.et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5157-5161)。产生的人体肌器官已完全血管化，并且可在血管中检测到红细胞。对cTnT、MLC2v和MLC2a免疫染色的分析进一步表明，移植的HVP不仅分化为心肌细胞(cTnT+细胞)，而且还进一步成熟成为MLC2v+心室肌细胞，这些细胞对MLC2a表达呈阴性。产生的心室肌器官被鼠源性血管细胞完全血管化，这与其血管化通过源自HVP的旁分泌路径(cues)发生的观念一致。

通过针对VE-钙粘蛋白和平滑肌肌动蛋白表达的抗体的免疫染色分析揭示了结构化的血管。另外，使用靶向层粘连蛋白γ-1链的人特异性单克隆层粘连蛋白抗体，HVP分泌其自己的人层粘连蛋白作为其细胞外基质(小鼠肾区域对人层粘连蛋白免疫染色呈阴性)。此外，我们发现使用单克隆人纤连蛋白抗体可将人纤连蛋白表达限制在血管附近的区域。

为了评估晚期心脏细胞驱动心室生成的能力，将NKX2.5+细胞(分化后第10天)移植到免疫受损的NSG小鼠的肾囊下。在移植后三周，移植有NKX2.5+细胞的动物没有形成任何可见的人肌移植物，这表明在峰值Islet-1表达后，HVP丧失了其体内心室生成的能力。

综上所述，这些研究表明，HVP可以合成并释放其自身的心脏层粘连蛋白衍生基质以及纤连蛋白，其用于稳定新生心室器官的脉管系统。

实施例7：HVP通过细胞自主途径在体内创建成熟功能性心室肌器官

hPSC在人类心脏生物学和疾病的研究中应用的关键限制之一是它们缺乏胎同种型的表达的成熟性和持久性。为了确定HVP衍生的器官是否可以成为功能成熟的心室肌，进行了长期移植研究，然后详细分析了成年心室心肌的一系列公认特征，包括T小管的形成(Brette,F.and Orchard,C.(2003)Circ.Res.92:1182-1192；Marks,A.R.(2013)J.Clin.Invest.123:46-52)，与工程化心室组织的其他研究可比较的产生力的能力，自动节律性的丧失，以及成年棒状心室心肌细胞的获得。

在纯化的HVP移植后5个月之后，在所有动物中均未形成肿瘤。处死动物并取出移植的肾脏用于进一步分析。5个月的人体移植物为半球形结构，半径为0.4cm(直径为0.8cm)。对于一个肾脏，5个月的人体移植物的体积为约0.13cm³，该体积表明了生成人心室肌的可行性，其达到了与体内成人心脏相当的厚度。在人肌器官中观察到棒状成熟人心室肌细胞。此外，从成熟的人肌器官中取出的肌肉运动会响应电刺激而产生力(0.36±0.04mN)，并在使用β-肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素处理后增加其力产生(0.51±0.02mN，相比对照p<0.05)。综上所述，这些研究表明，HVP能够通过细胞自主途径，即在不添加其他细胞、基因、基质蛋白或生物材料的情况下，在体内生成功能齐全的成熟的人心室肌器官。

实施例8：HVP向心外膜生境迁移并在体内在正常鼠心脏表面上自发地形成人心室肌补片

心外膜是心脏祖细胞的已知生境，在紧凑区域扩展过程中驱动心室腔的生长，并充当成年心外膜祖细胞的住所，成年心外膜祖细胞可在心肌损伤后扩张并可响应已知的血管细胞命运开关，例如VEGF(Giordano,F.J.et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5780-5785；Masters,M.and Riley,P.R.(2014)Stem Cell Res.13:683-692；Zangi,L.etal.(2013)Nat.Biotechnol.31:898-907)而驱动血管生成。为了确定HVP是否可能自发迁移到正常心脏的心外膜表面，将纯化的绿色荧光蛋白(GFP)标记的HVP心肌内注射到免疫受损小鼠的心脏中。移植后一周或一个月后，处死动物并取出植入的心脏进行组织学检查。移植后一周后，大部分GFP+细胞保留在心肌中。然而，移植后一个月后，几乎所有的GFP+细胞都迁移到了心外膜。另外，移植后一周后，GFP+细胞为ISL1+和Ki67+。

为了追踪Islet1+细胞的分化潜力，将由cTnT启动子驱动的表达绿色荧光蛋白(GFP)的hESC系(H9-cTnT-GFP)产生的纯化的ISL1+JAG1+细胞移植到严重的联合免疫缺陷(SCID)米色小鼠中，以证明其体内的发育潜力。在将Isl1+Jag1+细胞直接移植到SCID米色小鼠的心脏的心室中一个月后，苏木精和曙红染色显示在鼠心脏的心外膜中存在人肌肉条带移植物。另外，免疫组织学分析揭示了存在通过落射荧光和通过用抗GFP抗体染色检测到的GFP+供体细胞。更重要的是，当用MLC2v和MLC2a抗体进行分析时，移植的人肌肉条带呈MLC2v阳性(100％细胞+)，而对心房标志物MLC2a呈阴性，这表明移植的ISL1+细胞不仅进一步分化为心肌细胞，也变成了心室肌细胞。

综上所述，这些研究表明，HVP可以迁移到上心外膜生境，它们在此处扩展，并随后分化为同质的心室肌补片，而无需添加外源细胞、基因、基质或生物材料。

实施例9：其他实验材料和方法

在该实施例中，提供了在实施例1-8中使用的实验材料和方法的其他细节。

hPSC的保持

根据先前公开的方法(Lian,X.et al.(2013)Nat.Proc.8:162-175；Lian,X.etal.(2013)Stem Cells 31:447-457)，将hESC(ES03，H9)和人类iPSC(19-9-11)保持在mTeSR1培养基(STEMCELL Technologies)中的Matrigel(BD Biosciences)涂覆的平板上。

人心室祖细胞生成(HVPG)方案

将保持在mTeSR1中Matrigel涂覆的表面上的hPSC用Accutase在37℃下解离成单个细胞10分钟，并然后在补充有5μM ROCK抑制剂Y-27632(第﹣2天)的mTeSR1中以100,000-200,000细胞/cm²接种到Matrigel涂覆的细胞培养皿中，持续24小时。在第﹣1天，在mTeSR1中培养细胞。在第0天，在补充有B27不含胰岛素(RPMI/B27-ins)的RPMI中用1μM CHIR-98014(Selleckchem)处理细胞24小时(第0天至第1天)，然后在第1天更换培养基期间将其除去。在第3天，将一半培养基换成含有2μM Wnt-C59(Selleckchem)的RPMI/B27-ins培养基，然后在第5天更换培养基期间将其除去。在第6天，将细胞解离成单个细胞并用抗JAG1或抗FZD4抗体纯化。

RNA-seq文库构建

将RNA分离(RNeasy Mini试剂盒，Qiagen)、定量(Qubit RNA分析试剂盒，LifeTechnologies)并进行质量控制(BioAnalyzer 2100,Agilent)。每个样品的RNA(800ng)用作Illumina TruSeq mRNA样品制备试剂盒v2(Illumina)的输入，并根据制造商的方案创建测序文库。简言之，使用附接有poly-T oligo的磁珠纯化含有poly-A的mRNA分子。纯化后，使用随机引物和逆转录酶将mRNA片段化并复制到第一链互补DNA中。然后使用DNA聚合酶I和RNase H完成第二链cDNA合成。将cDNA连接至衔接子，并用PCR富集以创建最终的cDNA文库。根据制造商的说明，将文库合并并在HiSeq 2000(Illumina)仪器上测序。

RNA-seq数据处理

修剪RNA-seq读数，并使用Tophat 2映射到hg19参考。平均每个样品产生约2300万个读数，并且这些读数的76％被唯一地映射。使用python脚本rpkmforgenes量化每个基因的表达水平，并使用RefSeq注释。从分析中除去没有至少一个具有至少十个读数的样品的基因。分别使用R和Gene-E构建主成分分析和热图。

移植

将2百万份纯化的HVP的等分试样收集到艾本德(eppendorf)管中。将细胞旋转沉降，并弃去上清液。按照先前描述的方案(Shultz,L.D.et al.(2005)J.Immunol.174:6477-6489)，将每管细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下，或心肌内注射到免疫缺陷小鼠的心脏中，免疫缺陷小鼠分别是NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ或SCID-米色(CharlesRiver France)。在不同的时间间隔收获移植的肾脏或心脏，以进行组织学和生理学分析。

流式细胞仪

用Accutase将细胞解离成单个细胞10分钟，并然后在室温下用1％多聚甲醛固定20分钟，并在PBS加0.1％Triton X-100和0.5％BSA中用一抗和二抗染色。在FACSCaliber流式细胞仪(Beckton Dickinson)上收集数据，并使用FlowJo进行分析。

免疫染色

在室温下用4％多聚甲醛将细胞固定15分钟，并然后在PBS加0.4％Triton X-100和5％非脂肪干燥乳粉(Bio-Rad)中用一抗和二抗染色。细胞核用含DAPI的Gold抗淬灭试剂染色(Invitrogen)。使用落射荧光显微镜和共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 700)进行成像分析。

蛋白质印迹分析

在Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Pierce)的存在下，在M-PER哺乳动物蛋白提取试剂(Pierce)中裂解细胞。在变性条件下，通过10％Tris-甘氨酸SDS/PAGE(Invitrogen)分离蛋白质，然后将其转移至硝酸纤维素膜。在用TBST中的5％干燥乳粉封闭后，将膜与一抗在4℃下温育过夜。然后将膜洗涤，与抗小鼠/兔过氧化物酶缀合的二抗在室温下温育1小时，并通过SuperSignal化学发光法(Pierce)显色。

电生理学(膜片钳技术)

在记录之前，将搏动的心室肌细胞簇显微解剖并重新铺在玻璃盖玻片上。使用填充有由120mM K D-葡萄糖酸、25mM KCl、4mM MgATP、2mM NaGTP、4mM Na2-磷酸-肌酸、10mMEGTA、1mM CaCl₂和10mM HEPES组成的细胞外溶液(在25℃下用HCl调节为pH 7.4)的硼硅酸玻璃移液管评估动作电位活性。将接种在盖玻片上的培养的心肌细胞浸入含有140mMNaCl、5.4mM KCl、1mM MgCl2、10mM葡萄糖、1.8mM CaCl2和10mM HEPES(在25℃下用NaOH调节为pH 7.4)的细胞外溶液(Tyrode溶液)中。使用膜片钳技术(全细胞，电流钳配置)在37℃下记录自发动作电位，该技术使用Multiclamp 700B放大器(Molecular Devices，CA，美国)软件以1kHz低通滤波进行，使用Digidata 1322A和Clampex 9.6软件(Molecular Devices，CA，USA)数字化并存储。

统计

数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。统计显著性由两组之间的学生t检验(双侧)确定。P<0.05被认为是统计学上显著的。

实施例10：无异种人心室祖细胞分化方案

在此实施例中，提供了用于分化人心室祖细胞的替代分化方案，该方案利用已定义的无异种的培养基Essential 8。Essential 8培养基被开发用于人万能干细胞(hPSC)的生长和扩增，并进一步描述于Chen,G.et al.(2011)Nat.Methods 8:424-429中(在本文称为“E8”培养基)。

将在Essential 8培养基中维持在玻连蛋白(或层粘连蛋白521)涂覆的表面上的hPSC在37℃下用维尔烯(Versene)溶液解离成单个细胞，持续10分钟，并然后在补充有5μMROCK抑制剂Y-27632(第﹣2天)的Essential 8培养基中以100,000-200,000个细胞/cm²接种到玻连蛋白(或层粘连蛋白521)涂覆的细胞培养皿上，持续24小时。在第﹣1天，将细胞在Essential 8培养基中培养。在第0天，将细胞在RPMI中用0.5μM CHIR-98014处理24小时(第0天至第1天)，然后在第1天更换培养基期间将其除去。在第3天，将一半培养基更换为含有0.5μM Wnt-C59的RPMI培养基，然后在第5天更换培养基期间将其除去。在第6天，将细胞(人心室祖细胞)解离为单个细胞，并用抗JAG1或抗FZD4抗体纯化。替代地，用抗LIFR或抗FGFR3抗体纯化细胞。

实施例11：可植入人心室祖细胞的血管生成标志物

在该实施例中，鉴定了在人心室祖细胞(HVP)中表达的血管生成家族的基因。如实施例1或10中所述产生HVP，并如实施例1中所述在分化后的不同时间点进行RNA测序(RNA-seq)。在HVP分化过程中不同时间点的基因表达谱的聚类分析鉴定了阶段特异性标记基因。这些基因根据其表达谱的相似性分层聚类。首先，鉴定出在四个不同类别中显示表达的基因：(i)细胞表面表达；(ii)与Islet-1共表达；(iii)在分化的第5天高表达；和(iv)高d5/d0比率。该分析证实了HVP的细胞表面标志物：JAG1、FZD4、FGFR3、LIFR(CD118)和TNFSF9。接下来，从鉴定细胞表面标志物的此同一HVP群中，进行基因诠释检索(gene ontogeny search)以鉴定在此HVP群中表达的血管生成家族基因，从而鉴定出识别对细胞植入至关重要的基因的基因指纹谱。

统计学上，与Isl1表达的皮尔逊相关性用于鉴定那些在HVP中的表达与Isl1表达最相关的血管生成基因。下表1列出了皮尔逊相关系数为0.50或更高的与Isl1表达相关的血管生成基因。

表1：具有0.50或更高的与Isl1表达的皮尔逊相关性的在HVP中表达的血管生成基因

下表2列出了具有0.49-0.00的皮尔逊相关性的与Isl1表达相关的血管生成基因。

表2：具有0.49-0.00的与Isl1表达的皮尔逊相关性的在HVP中表达的血管生成基因

还鉴定了其表达与HVP中的Isl1表达负相关的血管生成基因。下表3列出了皮尔逊相关系数为-0.50或更小的与Isl1表达负相关的血管生成基因。

表3：与Isl1表达的皮尔逊相关性为-0.50或更小的在HVP中表达的血管生成基因

下表4列出了皮尔逊相关系数为-0.01至-0.49的与Isl1表达负相关的血管生成基因。

表4：与Isl1表达的皮尔逊相关性为-0.01至-0.49的在HVP中表达的血管生成基因

实施例12：可植入人心室祖细胞的细胞外基质标志物

在该实例中，鉴定了在人心室祖细胞(HVP)中表达的细胞外基质家族的基因。如实施例1或10中所述产生HVP，并如实施例1中所述在分化后的不同时间点进行RNA测序(RNA-seq)。在HVP分化过程中不同时间点的基因表达谱的聚类分析鉴定了阶段特异性标记基因。这些基因根据其表达谱的相似性分层聚类。首先，鉴定出在四种不同类别中显示表达的基因：(i)细胞表面表达；(ii)与Islet-1共表达；(iii)在分化的第5天高表达；和(iv)高d5/d0比率。该分析证实了HVP的细胞表面标志物：JAG1、FZD4、FGFR3、LIFR(CD118)和TNFSF9。接下来，从鉴定细胞表面标志物的此同一HVP群中，进行基因诠释检索以鉴定在此HVP群中表达的细胞外基质家族基因，从而鉴定出识别对细胞植入至关重要的基因的基因指纹图谱。

统计学上，与Isl1表达的皮尔逊相关性用于鉴定那些在HVP中的表达与Isl1表达最相关的细胞外基质基因。下表5列出了皮尔逊相关系数为0.50或更高的与Isl1表达相关的细胞外基质基因。

表5：与Isl1表达的皮尔逊相关性为0.50或更高的在HVP中表达的细胞外基质基因

下表6列出了皮尔逊相关系数为0.49-0.00的与Isl1表达相关的细胞外基质基因。

表6：与Isl1表达的皮尔逊相关性为0.49至0.00的在HVP中表达的细胞外基质基因

还鉴定了其表达与HVP中的Isl1表达负相关的细胞外基质基因。下面的表7列出了皮尔逊相关系数为-0.50或更小的与Isl1表达负相关的细胞外基质基因。

表7：与Isl1表达的皮尔逊相关性为-0.50或更小的在HVP中表达的细胞外基质基因

下面的表8列出了皮尔逊相关系数为-0.01至-0.49的与Isl1表达负相关的细胞外基质基因。

表8：与Isl1表达的皮尔逊相关性为-0.01至-0.49的在HVP中表达的细胞外基质基因

实施例13：第6天Islet 1阴性细胞的基因表达谱

在该实施例中，确定了第6天HVP群中的Islet 1阴性细胞的基因表达谱，以进一步表征第6天群体中的细胞亚群，这些亚群不表达作为可移植的HVP的必要标记。如实施例1或10中所述产生第6天HVP群，并如实施例2中所述在分化后进行RNA测序(RNA-seq)。对Islet1阴性(Isl1-)的细胞进一步对其基因表达谱进行分析。下表9中示出了在Isl1-细胞中表达的平均RNA拷贝数为2000或更高的基因。

表9：第6天Islet 1阴性细胞的基因表达谱

因此，表9中显示的数据提供了在第6天HVP群体中不适合移植的Islet1阴性不可移植细胞的基因表达谱，并因此在选择用于移植和植入的细胞时要针对其进行选择。

实施例14：HVP的单细胞测序

在该实施例中，从分化的第4、5、6、8、9或15天对HVP进行单细胞测序，从而鉴定处于不同分化阶段的单个细胞中的表达的基因。对细胞群体批量进行测序会掩盖该群体中的细胞亚型。单细胞测序提供了一种无偏见的方法来对群体中的细胞类型进行分类。

本文使用的单细胞测序方法包括三个步骤：文库制备、测序和分析。为了制备文库，收集单个细胞并裂解。获取RNA转录组，转化为DNA，并准备进行测序。获取的细胞转录组称为“文库”。使用下一代测序仪进行测序。为了分析，读取序列并将其映射到基因。这为每个细胞创建了转录组范围的表达谱。然后将表达谱相互比较。相似的细胞被“聚类”在一起以代表细胞类型。

为了获得用于单细胞测序的单细胞，如先前所述进行HVP分化(参见实施例1和10)。胰蛋白酶处理后，收集第4、5、6、8、9和15天的细胞，并用移液管管嘴手动挑选。每天挑选128个细胞。如前所述，使用Smart-seq2方案对单个细胞进行文库制备(Picelli,S.etal.(2013)Nature Methods 10:1096–1098)。在Illumina HiSeq 2500测序系统上对单细胞文库进行测序。使用BowTie将读数映射到人类基因组(Langmead,B.et al.(2009)GenomeBiol.10(3):R25)。使用Seurat软件包进行数据分析(Sajita,R.et al.(2015)NatureBiotechnology 33:495–502)。

使用t-SNE降维来可视化第4、5、6、8、9和15天中的数据，观察到四种主要细胞类型：非心脏群体、上皮样群体、心脏祖细胞和心肌细胞。使用Seurat软件包中的FindMarker函数提取心脏祖细胞的差异表达基因。参数是心脏祖细胞簇中差异表达的基因，其在心脏祖细胞簇中的至少10％的细胞中表达。心脏祖细胞簇中差异表达的基因列表如下表10所示。

表10：心脏祖细胞簇中差异表达的基因

从基因列表中，选择神经纤毛蛋白1(NRP1)作为HVP阳性分选的候选者。与MACS分选相容的抗NRP1抗体是可商购的。

进一步检查了第5天的数据集，因为在第5天表达的RNA将在第6天转化为蛋白质，这是这些细胞可以植入的关键窗口。第5天数据集的tSNE图如图11所示，显示了两个具有相似表达模式的细胞簇，任意标记为0和1。一个簇中的细胞表达相似的基因。不同簇中的细胞表达不同的基因。tSNE图上每个细胞之间的距离代表其基因表达谱的差异程度。标记为1的簇具高的Isl1表达水平。

图12示出了Isl1和NRP1在第5天细胞中的表达，其中深灰色表示高表达，中灰色表示低表达，而浅灰色表示无表达。因此，图12证明了许多具有高Isl1表达水平的细胞也具有高NRP1表达水平。

通过图13所示的Isl1和NRP1表达水平的小提琴图证实了这一点。簇1(图11中所示)中的细胞具有高的Isl1表达水平。图13的小提琴图证明了Isl1+细胞和NRP1+细胞在同一簇中，因为它们具有相似的基因表达谱。因此，NRP1是用于HVP的阳性选择的合适的细胞表面标志物(例如，第5-6天Isl1+HVP)。

实施例15：NRP1+HVP的进一步表征

在该实施例中，进一步检查了NRP1在人胚胎干细胞系上的表达。将H9干细胞系(在本领域中也称为WA09；Thomson,J.A.et al.(1998)Science 282:1145-1147；WiCellResearch Institute)用于这些实验。在心脏分化条件下(例如，如实施例1和10中所述)培养H9细胞，以产生第6天人心室祖细胞(HVP)。

在第一组实验中，将来自H9细胞的第6天HVP用抗NRP1、抗TRA-1-60或抗NRP1和抗TRA-160两者进行染色，然后进行流式细胞术分析。结果显示在图14A(对NRP1+细胞进行单一染色)、图14B(对TRA-1-60+细胞进行单一染色)和图14C(对NRP1+TRA-1-60+细胞进行双重染色)中。结果确定了92％的第6天HVP是NRP1+，且17％的第6天HVP是TRA-1-60+。双重染色分析确定了在NRP1+群体中，这些细胞的15.5％是TRA-1-60+。

在第二组实验中，用抗NRP1、抗ISL1或抗NRP1和抗ISL1两者对来自H9细胞的第6天HVP进行染色，然后进行流式细胞术分析。结果显示在图15A(对NRP1+细胞进行单一染色)、图15B(对ISL1+细胞进行单一染色)和图15C(对NRP1+ISL+细胞进行双重染色)中。结果确定了78％的第6天HVP是NRP1+，80％的第6天HVP是ISL1+，且73％的第6天HVP是NRP1+ISL1+。

这些结果证实了NRP1在大部分第6天HVP的表面上表达，以及与ISL1和与TRA-1-60共表达，从而确认了NRP1作为阳性选择、ISL1作为阳性共选择标志物和TRA-1-60作为阴性选择标志物的适用性。

等同方式

仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文描述的本发明的特定实施方式的许多等同方式。这些等同方式旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims (53)

1.一种用于分离人心脏心室祖细胞的方法，所述方法包括：

使含有心脏祖细胞的人细胞培养物与一种或多种同神经纤毛蛋白-1(NRP1)反应的试剂接触；和

将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出人心脏心室祖细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，使所述人细胞培养物进一步与同人心脏心室祖细胞反应的至少一种第二试剂接触；并且使NRP1反应性/第二试剂反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出人心脏心室祖细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述至少一种第二试剂与JAG1、FZD4、LIFR、FGFR3和/或TNFSF9反应。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，使所述人细胞培养物在与所述至少一种第二试剂接触之前与所述同NRP1反应的试剂接触。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，使所述人细胞培养物在与所述同NRP1反应的试剂接触之前与所述至少一种第二试剂接触。

6.根据权利要求2所述的方法，其中，使所述人细胞培养物与所述同NRP1反应的试剂并与所述至少一种第二试剂同时接触。

7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述人心脏心室祖细胞与一种或多种同在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物反应的试剂接触，以及将标志物非反应性阴性细胞与反应性细胞分开，从而进一步分离出人心脏心室祖细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物选自由TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-54、SSEA1、SSEA3、SSEA4、CD9、CD24、E-钙粘蛋白和足萼蛋白及其组合组成的组。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物是TRA-1-60。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述同TRA-1-60反应的试剂是抗TRA-1-60抗体。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述同NRP1反应的试剂是抗NRP1抗体。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述同NRP1反应的试剂是可溶性NRP1配体融合蛋白。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述NRP1配体是VEGF-A或Sema3A。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁性激活细胞分选(MACS)将所述NRP1反应性阳性细胞与所述非反应性细胞分开。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述人心脏心室祖细胞被进一步培养和分化，使得它们是MLC2v阳性的。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述含有心脏祖细胞的人细胞培养物源自人诱导性万能干细胞的人胚胎干细胞。

17.一种用于分离人心脏心室祖细胞的方法，所述方法包括：

在产生心脏祖细胞的条件下培养人万能干细胞以获得细胞培养物；

使所述细胞培养物与一种或多种同神经纤毛蛋白-1(NRP1)反应的试剂接触；和

将NRP1反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出人心脏心室祖细胞。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，使所述人细胞培养物进一步与同人心脏心室祖细胞反应的至少一种第二试剂接触；并且使NRP1反应性/第二试剂反应性阳性细胞与非反应性细胞分开，从而分离出人心脏心室祖细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种第二试剂与JAG1、FZD4、LIFR、FGFR3和/或TNFSF9反应。

20.根据权利要求18所述的方法，其中，使所述人细胞培养物在与所述至少一种第二试剂接触之前与所述同NRP1反应的试剂接触。

21.根据权利要求18所述的方法，其中，使所述人细胞培养物在与所述同NRP1反应的试剂接触之前与所述至少一种第二试剂接触。

22.根据权利要求18所述的方法，其中，使所述人细胞培养物与所述同NRP1反应的试剂并与所述至少一种第二试剂同时接触。

23.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括使所述人心脏心室祖细胞与一种或多种同在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物反应的试剂接触，以及将标志物非反应性阴性细胞与反应性细胞分开，从而进一步分离出人心脏心室祖细胞。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物选自由TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-54、SSEA1、SSEA3、SSEA4、CD9、CD24、E-钙粘蛋白和足萼蛋白及其组合组成的组。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述在人万能干细胞表面上表达的至少一种标志物是TRA-1-60。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述同TRA-1-60反应的试剂是抗TRA-1-60抗体。

27.根据权利要求17-26中任一项所述的方法，其中，所述同NRP1反应的试剂是抗NRP1抗体。

28.根据权利要求17-26中任一项所述的方法，其中，所述同NRP1反应的试剂是可溶性NRP1配体融合蛋白。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述NRP1配体是VEGF-A或Sema3A。

30.根据权利要求17-29中任一项所述的方法，其中，通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁性激活细胞分选(MACS)将所述NRP1反应性阳性细胞与所述非反应性细胞分开。

31.根据权利要求17-30中任一项所述的方法，其中，所述人心脏心室祖细胞被进一步培养和分化，使得它们是MLC2v阳性的。

32.根据权利要求17-31中任一项所述的方法，其中，所述含有心脏祖细胞的人细胞培养物源自人诱导性万能干细胞的人胚胎干细胞。

33.一种用于获得人心脏心室祖细胞的克隆群的方法，所述方法包括：

通过使人心脏心室祖细胞的培养物与一种或多种同NRP1反应的试剂接触来分离单个NRP1+人心脏心室祖细胞；和

在一定条件下培养所述单个NRP1+人心脏心室祖细胞，使得所述细胞扩增到至少1×10⁹个细胞，从而获得人心脏心室祖细胞的克隆群。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述单个NRP1+人心脏心室祖细胞在初始培养时为Islet-1阳性、Nkx2.5阴性和flk1阴性。

35.根据权利要求33所述的方法，其中，通过荧光激活细胞分选或磁性激活细胞分选来分离所述单个NRP1+人心脏心室祖细胞。

36.根据权利要求33所述的方法，其中，所述同NRP1反应的试剂是抗NRP1抗体。

37.根据权利要求33所述的方法，其中，在使得细胞偏向心室分化的条件下培养所述单个NRP1+人心脏心室祖细胞。

38.根据权利要求33所述的方法，其中，所述单个NRP1+人心脏心室祖细胞被扩增为至少10×10⁹个细胞。

39.通过权利要求33的方法获得的至少1×10⁹个NRP1+人心脏心室祖细胞的克隆群。

40.通过权利要求38的方法获得的至少10×10⁹个NRP1+人心脏心室祖细胞的克隆群。

41.一种增强受试者的心脏功能的方法，所述方法包括向所述受试者给药包含根据权利要求39所述的克隆群的药物组合物。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，将所述克隆群直接给药到所述受试者的心脏中。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中，所述受试者患有心肌梗死。

44.根据权利要求41或42所述的方法，其中，所述受试者患有先天性心脏病。

45.根据权利要求42所述的方法，其中，将所述克隆群直接给药到所述受试者的心脏的心室区域中。

46.根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其中，所述药物组合物包含配制在二维或三维基质上的克隆群。

47.一种用于产生人心室组织的方法，包括：

将NRP1+人心脏心室祖细胞移植到非人类动物的器官中；和

使所述祖细胞在体内生长，从而产生人心室组织。

48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述非人类动物是免疫缺陷小鼠。

49.根据权利要求47所述的方法，其中，所述器官是肾脏或心脏。

50.根据权利要求47所述的方法，其中，在当存在以下细胞标志物模式中的一种、两种、三种、四种或五种时，移植所述细胞：(i)在心脏中胚层形成的峰值之后；(ii)在峰值Islet-1表达时；(iii)在NKX2.5表达的峰值之前；(iv)在下游基因MEF-2和TBX-1的峰值表达之前；以及(v)在分化的收缩蛋白基因表达之前。

51.根据权利要求47所述的方法，其中，在产生人心室祖细胞的条件下，在人万能干细胞的体外培养的第5天至第7天(含端值)之间移植所述细胞。

52.根据权利要求51所述的方法，其中，在产生人心室祖细胞的条件下，在人万能干细胞的体外培养的第6天移植所述细胞。

53.一种筛选测试化合物的心脏毒性的方法，所述方法包括：

提供NRP1+人心脏心室祖细胞；

使所述细胞与所述测试化合物接触；和

测量所述测试化合物对所述细胞的毒性，

其中所述测试化合物对所述细胞的毒性指示了所述测试化合物的心脏毒性。

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