JP5924750B2 - Cd82陽性心筋前駆細胞 - Google Patents
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Description
[細胞表面マーカーA群]
CD73、CD44、CD105、CD121a、CD18、CD120a
[細胞表面マーカーB群]
CD7、CD37、CD43、CD144、STRO−1、CD177、CD163
[細胞表面マーカーC群]
CD137L、CD140b、CD180、CD252、CD344、CD118、CD99R
[細胞表面マーカーD群]
CD49a、CD117、CD31、CD106、CD45、CD14、HLA−DR、CD38、CD121b、CD122、CD124、CD126、CD127、CD11a、CD104、CD62e、CD62l、CD62p、CD120b、CD34、CD4
[細胞表面マーカーE群]
CD166、CD304、CD90
[細胞表面マーカーF群]
ROR2、CD13、PDGFRα、KDR
(a)幹細胞を取得する工程;
(b)幹細胞に対して心血管系細胞への分化誘導処理を行う工程;
(c)工程(b)で分化誘導処理した幹細胞の中から、以下の[細胞表面マーカーA群]から選択される少なくとも1つの細胞表面マーカーが陰性であるCD82陽性細胞を分離する工程;
[細胞表面マーカーA群]
CD73、CD44、CD105、CD121a、CD18、CD120a
[細胞表面マーカーB群]
CD7、CD37、CD43、CD144、STRO−1、CD177、CD163
[細胞表面マーカーC群]
CD137L、CD140b、CD180、CD252、CD344、CD118、CD99R
[細胞表面マーカーD群]
CD49a、CD117、CD31、CD106、CD45、CD14、HLA−DR、CD38、CD121b、CD122、CD124、CD126、CD127、CD11a、CD104、CD62e、CD62l、CD62p、CD120b、CD34、CD4
[細胞表面マーカーE群]
CD166、CD304、CD90
[細胞表面マーカーF群]
ROR2、CD13、PDGFRα、KDR
ヒトiPS細胞(201B6)(京都大学山中教授より分与)の継代培養は、4ng/mL bFGF(basic fibroblast growth factor)(WAKO社製)を含有するマウス胚性線維芽細胞馴化培養液(MEF−CM;Mouse embryonic fibroblast-conditioned medium)(Knockout SR[Gibco社製]と2−ME[Gibco社製]を含有するKnockout DMEM[Gibco社製])(以下、「本件MEF馴化培養液」という)中で、マトリゲル(1:60希釈、Invitrogen社製)でコートした培養皿(10cmディッシュ[Falcon社製])に接着させ、37℃、5%CO2条件下で行った。
1)心筋細胞への分化誘導は、Modified DD protocol(Uosaki H, et al, PLoS One 2011; 6: e23657)(図1A)をさらに改変した本件プロトコール(図1B)を用いて行った。本件プロトコールの詳細を、以下の2)〜5)に示す。
2)接着培養したヒトiPS細胞を、細胞分散液(Versene[Invitrogen社製])を用いて37℃で3〜5分間インキュベーションすることで培養皿から剥離し、マトリゲルでコートした6ウェルプレート(Growth Factor Reduced Matrigel、BD Biosciences社製)へ1×105cells/cm2の濃度で播種し、約100%コンフルエントとなるまで本件MEF馴化培養液中で2〜3日間培養した。
3)マトリゲル(1:60希釈、Invitrogen社製)を培養液に添加し(マトリゲルサンドイッチ処理)、24時間培養した後、培養液を100ng/mL アクチビンA(R&D Systems社製)を含有する「RPMI+B27−インスリン」(2mM L−グルタミン及びB27サプリメント[インスリン不含][Life Technologies社製]を含有するRPMI1640[Life Technologies社製];以下、「本件無血清培養液(A)」という)培養液と交換し、心筋細胞への分化誘導を行った。なお、アクチビンAを含有する本件無血清培養液へ培養液を交換した時点を、分化誘導後0日(時間)とした。
4)24時間培養後、培養液を10ng/mLヒトbFGF(hbFGF)(WAKO社製)及び10ng/mL ヒトBMP4(hBMP4;Human bone morphogenetic protein 4)(R&D Systems社製)を含有する本件無血清培養液(A)と交換し、分化誘導後5日目まで培養を行った。
5)分化誘導後5日目に、培養液を100ng/mL Dkk1(R&D Systems社製)を含有する「RPMI+B27」(2mM L−グルタミン及びB27サプリメント[Life Technologies社製]を含有するRPMI1640[Life Technologies社製];以下、「本件無血清培養液(B)」という)培養液に交換し、さらに48時間(分化誘導後7日目まで)培養した。
細胞を、細胞分散液(AccuMax[Innovative Cell Technologies社製])を用いて37℃で3〜5分間インキュベーションすることで培養皿から剥離し、5% FBS及び5mM EDTAを含むPBS溶液中に細胞を懸濁した後、標識物質で標識した5種類の細胞表面マーカー(KDR、PDGFRα、CD82、CD13、及びVCAM1)に対する抗体(表1参照)を用いて30分間、4℃条件下で抗原抗体反応を行った。また、細胞質に発現するTnTに関しては、4%PFA溶液を用いて15分間固定化処理し、界面活性剤(0.75%サポニン溶液[Sigma社製])で処理した後、抗cTnT抗体(1次抗体)(表1参照)と、蛍光物質で標識した2次抗体(表1参照)とのコンジュゲートを上記細胞懸濁液に加え、30分間、4℃条件下で抗原抗体反応を行った。それぞれの細胞は、FACS(FACS Aria II[BD biosciences社製])を用いて上記抗体で検出される細胞の純化(選別)を行った。また、上記抗体で検出される細胞表面マーカーの発現は、フローサイトメーター(FACS Aria II[BD biosciences社製])を用いて解析した。
上記[セルソーティング及びフローサイトメトリー解析]の項目に記載の方法にしたがって細胞を純化した後、マトリゲルでコートした6ウェルプレート(Growth Factor Reduced Matrigel、BD Biosciences社製)へ1〜1.5×105cells/cm2の濃度で播種し、10%FBSを含有する「RPMI」(2mM L−グルタミン及びB27サプリメント[Life Technologies社製]を含有するRPMI1640[Life Technologies社製])培養液(以下、「本件血清含有培養液」という)中で培養した。なお、ここで血清を含む本件血清含有培養液存在下で細胞を培養することにより、心筋細胞以外の細胞へも分化し得る条件下で培養し、心筋細胞へ特異的に分化するかどうかを検討した。また、播種後48時間までは、播種後の細胞死を防ぐために、Rho結合リン酸化酵素(Rho-associated protein kinase:ROCK)阻害剤であるY−27632(Wako社製)存在下で培養した。培養液は、2日毎新しい本件血清含有培養液に交換した。本件血清含有培養液中で培養を行ってから2週間後に、上記[セルソーティング及びフローサイトメトリー解析]の項目に記載の方法にしたがってフローサイトメトリー解析を行い、心筋細胞(cTnT陽性細胞)の割合を解析した。なお、心筋細胞の表面マーカーとして我々のグループが同定したVCAM1(CD106)陽性細胞(Uosaki H, et al, PLoS One 2011; 6: e23657)の割合も解析した。
上記[本件プロトコール]の項目に記載の方法にしたがってヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導を行い、分化誘導後4日目及び5日目に、上記[セルソーティング及びフローサイトメトリー解析]の項目に記載の方法にしたがって中胚葉由来の細胞(KDR陽性PDGFRα陽性細胞)を純化・単離し、RNeasy Mini kit(QIAGEN社製)を用いて全RNAの精製を行った後、Superscript II Reverse Transcriptase(Lifetechnology社製)を用いてcDNAを合成した。合成したcDNAを、Bioarray HighYield RNA transcript labeling kit(T7)(Enzo Life Science社製)を用いてCy3で蛍光標識した後、蛍光標識したcDNAをHuman Genome U133 Plus2.0 Array(Affymetrix社製)にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、GeneChip Hybridization Control Kit(Affymetrix社製)及びGeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix社製)を用いて45℃にて16時間の条件下で行った。蛍光シグナルのスキャニングは、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix社製)を用いて行い、取得した蛍光シグナルの画像解析は、GeneChip Operating Software(Affymetrix社製)を用いて行った。その後の統計学的解析は、GeneSpring GX(アジレント・テクノロジー社製)を用いてRMA法にて行った。選択基準(Fold-change>2.0、P値<0.05)を基に、分化誘導後4日目から5日目にかけて発現の増減が認められる細胞表面マーカーを同定した。
上記[本件プロトコール]の項目に記載の方法にしたがってヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導を行い、分化誘導後6日目に細胞を、細胞分散液(AccuMax[Innovative Cell Technologies社製])を用いて37℃で3〜5分間インキュベーションすることで培養皿から剥離し、1% PBS、5mM EDTA及び5% FBSを含む溶液中に懸濁した後、抗CD82−PE抗体(Biolegend社製)を加えて、室温で30分間インキュベートした。続いて、抗PE−MACSビーズ(Miltenyi Biotec社製)を加えて、4℃で20分間インキュベートした。1% PBS、5mM EDTA及び5% FBSを含む溶液で2回洗浄後、自動磁気細胞分離装置(autoMACS[Miltenyi Biotec社製])を用いてCD82陽性細胞を単離した。なお、コントロールとして用いるために、CD13陽性細胞及びDGFRα陽性細胞を単離した。単離したCD82陽性細胞約5×106個を、本件血清含有培養液10μLとマトリゲル(1:60希釈、Invitrogen社製)10μLとの混合液中に懸濁し、C.B-17/lcr-scid/scidJclマウス(日本クレア社より入手)の腎被膜下に移植した。ここで、移植を心臓ではなく、腎被膜下に行うことにより、心臓とは関係のない環境下でも心筋細胞へ分化し得るかどうかを検討した。移植後2週間目に、マウスを安楽死させ、腎臓を切断して4% PFAにて固定し、30% スクロースにて脱水処理を行った後、OCT化合物(Sakura Finetek社製)に包埋し、クリオスタット(Carl Zeiss社製)を用いて厚さ6μmの腎被膜凍結切片を作製した。作製した腎被膜凍結切片を、0.1% TritonX-100/PBS溶液で透過処理を行った後、2%スキムミルクでブロッキング処理を行った。続いて、1次抗体(抗cTnT抗体[abcam社製]にて室温で1時間又は一晩抗原抗体反応処理を行った後、2次抗体(Alexa Fluor 488抗マウスIgG抗体)にて室温で1時間抗体反応処理を行い、その後、抗ヒト核抗原[HNA;Human Nuclear Antigen]抗体[stem cells社製])と、Zenon Alexa Fluor 564(Life Technologies社製)とのコンジュゲート抗体にて室温で2.5時間抗体反応処理を行い、細胞核を、10μg/mL DAPI(Life Technologies社製)で染色した。共焦点蛍光画像は、Zeiss LSM 710 laser scanning microscope(Carl Zeiss社製)を用いて取得した。
上記[本件プロトコール]の項目に記載の方法にしたがってヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導を行い、分化誘導後6日目に細胞を、細胞分散液(AccuMax[Innovative Cell Technologies社製])を用いて37℃で10〜15分間インキュベーションすることで培養皿から剥離し、1% PBS、5mM EDTA及び5% FBSを含む溶液中に懸濁した後、抗CD82−PE抗体(Biolegend社製)、抗CD13−FITC抗体(abcam社製)、及び抗PDGFRα−APC抗体(R&D Systems社製)を加えて、室温で30分間インキュベートした。1% PBS、5mM EDTA及び5% FBSを含む溶液で2回洗浄後、セルソーターを用いてCD82陽性細胞(CD82陽性CD13陽性PDGFRα陽性細胞)を単離し、約3×106個の細胞にHoechst33258(Invitrogen社製)を加えて37℃15分インキュベートし、細胞核の染色を行った後、冠動脈結紮した心筋梗塞モデルラットF344 N-Jcl rnu/rnuの心臓に移植した。移植後4週間目に、ラットを安楽死させ、心臓を切断して4% PFAにて固定し、30% スクロースにて脱水処理を行った後、OCT化合物(Sakura Finetek社製)に包埋し、クリオスタット(Carl Zeiss社製)を用いて厚さ6〜10μmの心臓凍結切片を作製した。作製した心臓凍結切片を、0.2% Tween20/PBS溶液で透過処理を行った後、2% スキムミルクでブロッキング処理を行った。続いて、1次抗体(抗cTnT抗体[abcam社製]にて室温で1時間又は一晩抗原抗体反応処理を行った後、2次抗体(Alexa Fluor 488抗マウスIgG抗体)にて室温で1時間抗体反応処理を行いで染色した。画像は、BIOREVO BZ-9000(KEYENCE社製)を用いて取得した。
上記[インビボでの心筋細胞への分化能の評価法1]の項目に記載の方法にしたがって、CD82陽性細胞を単離し、細胞凍結保存液(セルバンカー3[十慈フィールド社製])を1.0×106細胞/mLとなるように加え、CryoELITE Cyogenic vials(WHEATON社製、W985866)に1.0×106細胞/チューブとなるように分注した。Cryo Box(Thermo社製、5025-0505)に入れ、−80℃フリーザーに保存した。その後、凍結したチューブを液体窒素中に移して保存した。CD82陽性細胞ストックを液体窒素から取り出し、37℃の湯浴器中で迅速に融解し、遠心処理により上清(細胞凍結保存液)を除き、細胞をPBSで洗浄した後、マトリゲルでコートした6ウェルプレート(Growth Factor Reduced Matrigel、BD Biosciences社製)へ1〜1.5×105cells/cm2の濃度で播種し、上記[インビトロでの心筋細胞への分化能の評価法]の項目に記載の方法にしたがって、心筋細胞への分化能を評価した。
ヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導過程において、心筋細胞への分化能を有する細胞、すなわち心筋前駆細胞が誘導される時期を特定するために、上記[本件プロトコール]の項目に記載の方法にしたがってヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導を行い、分化誘導後4日目及び5日目に、上記[セルソーティング及びフローサイトメトリー解析]の項目に記載の方法にしたがって中胚葉由来の細胞(KDR陽性PDGFRα陽性細胞)を純化し、上記[インビトロでの心筋細胞への分化能の評価法]の項目に記載の方法にしたがって心筋細胞(cTnT陽性細胞)の割合を解析した(図2参照)。
上記結果1により、ヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導後4日目から5日目にかけて、心筋特異的前駆細胞が誘導されることが示されたので、かかる時期で発現の増減が認められる細胞表面マーカーを有する細胞が、心筋特異的前駆細胞である可能性が高いと考えた。そこで、分化誘導後4日目から5日目にかけて、発現の増減が認められる細胞表面マーカーを探索するために、上記[RNAマイクロアレイ解析]の項目に記載の方法にしたがって分化誘導後4日目から5日目にかけて発現の増減が認められる細胞表面マーカーを解析した。その結果、CD82が同定された。この結果は、CD82を発現する細胞、すなわちCD82陽性細胞は心筋特異的前駆細胞であることを示唆している。
上記結果2により、ヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導後4日目から5日目にかけて、CD82陽性細胞が誘導されることが示されたので、分化誘導後のCD82陽性細胞の継持的変化を解析した。上記[本件プロトコール]の項目に記載の方法にしたがってヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導を行い、分化誘導後3〜11日目に、上記[セルソーティング及びフローサイトメトリー解析]の項目に記載の方法にしたがってCD82及びPDGFRαの発現を、フローサイトメーターを用いて解析した(図3参照)。
これらの結果は、CD82陽性細胞はこれまで報告されていた心血管前駆細胞群であるPDGFRα陽性細胞やCD13陽性細胞よりも心筋細胞への分化が進行した細胞であることを示している。
この結果は、CD82は心筋細胞(cTnT陽性細胞)へ分化が完了すると発現しないことを示している。
上記結果2及び3より、CD82陽性細胞は心筋特異的前駆細胞であることが示唆されたので、CD82陽性細胞が心筋細胞へ特異的に分化するかどうかを解析した。上記[本件プロトコール]の項目に記載の方法にしたがってヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導を行い、分化誘導後5日目に、上記[セルソーティング及びフローサイトメトリー解析]の項目に記載の方法にしたがってCD82陽性CD13陽性細胞及びCD82陰性CD13陽性細胞をそれぞれ純化し、上記[インビトロでの心筋細胞への分化能の評価法]の項目に記載の方法にしたがって心筋細胞(cTnT陽性細胞)の割合を解析した(図6参照)。
上記結果4により、CD82陽性細胞は、心筋細胞へ特異的に分化誘導する心筋前駆細胞であることがインビトロでの実験により示されたので、インビボでも同様に心筋細胞へ特異的に分化誘導するかどうかを検討した。上記[インビボでの心筋細胞への分化能の評価法1]の項目に記載の方法にしたがってCD82陽性細胞をマウスの腎被膜下に移植したところ、移植したCD82陽性細胞に由来するHNA陽性細胞のうち、ほぼすべての細胞(95%以上)がcTnT陽性細胞(心筋細胞)であることが明らかとなった(図7参照)。他方、CD13陽性細胞やPDGFRα陽性細胞をマウスの腎被膜下に移植した場合、腎被膜下での生着は認められなかった。
さらに、上記[インビボでの心筋細胞への分化能の評価法2]の項目に記載の方法にしたがってCD82陽性細胞(CD82陽性CD13陽性PDGFRα陽性細胞)を、心筋梗塞モデルラットの心臓に移植したところ、移植したCD82陽性細胞に由来するHoechst33258陽性細胞のうち、ほぼすべての細胞(95%以上)がcTnT陽性細胞(心筋細胞)であることが明らかとなった(図8参照)。
これらの結果は、上記インビトロの結果を支持するとともに、CD82陽性細胞は、これまで報告のあるCD13陽性細胞やPDGFRα陽性細胞等の心血管前駆細胞群よりも、心臓へ効果的に生着でき、かつ心臓において特異的に心筋細胞へ分化できる心筋前駆細胞であることを示している。
上記結果5により、心筋細胞へ特異的に分化誘導する心筋前駆細胞を治療に用いるにあたり、CD82陽性細胞を凍結保存可能かどうかについて検討した。上記[凍結保存したCD82陽性細胞の心筋細胞への分化能の評価法]の項目に記載の方法にしたがって、凍結保存したCD82陽性細胞の心筋細胞への分化能の評価を行ったところ、cTnT陽性細胞(心筋細胞)の割合は94.4%と高いことが明らかとなった(図9参照)。この結果は、CD82陽性細胞は、凍結・融解処理を行った後でも心筋細胞への高い分化能を有することを示しており、凍結保存が可能であることを示している。
上記[本件プロトコール]の項目に記載の方法にしたがってヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導を行い、分化誘導後4日目及び6.5日目に、上記[セルソーティング及びフローサイトメトリー解析]の項目に記載の方法にしたがって、細胞を培養皿から剥離し、human PDGFRα-PE(PRa292、R&D Systems社製)を用いて30分間、4℃条件下で反応させた。その後、細胞表面マーカーの発現を網羅的に解析するために、抗体ライブラリー(BD Lyoplate Screening Panels、BD biosciences社製)を用いて30分間、4℃条件下で反応させた。検出される細胞表面マーカーの発現は、フローサイトメーター(BD LSRFortessa セルアナライザー[BD biosciences社製])を用いて解析した。
Claims (16)
- CD105陰性かつCD82陽性であり、さらに、PDGFRα陽性及び/又はCD13陽性である心筋前駆細胞。
- CD31陰性及び/又はCD45陰性である、請求項1記載の心筋前駆細胞。
- 幹細胞から心血管系細胞への分化誘導過程の細胞集団中に含まれる、請求項1又は2記載の心筋前駆細胞。
- 幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項3記載の心筋前駆細胞。
- 細胞集団中に少なくとも40%の割合で含まれる、請求項1〜4のいずれか記載の心筋前駆細胞。
- 単離処理が施された請求項1〜5のいずれか記載の心筋前駆細胞。
- 細胞集団中に少なくとも80%の割合で含まれる、請求項6記載の心筋前駆細胞。
- 凍結保存された請求項1〜7のいずれか記載の心筋前駆細胞。
- 請求項1〜8のいずれか記載の心筋前駆細胞を含む心疾患治療剤。
- 以下の工程(a)及び(b)を備えた心筋前駆細胞の調製方法。
(a)幹細胞に対して心血管系細胞への分化誘導処理を行う工程;
(b)工程(a)で分化誘導処理した幹細胞の中から、CD105陰性かつCD82陽性であり、さらに、PDGFRα陽性及び/又はCD13陽性である心筋前駆細胞を含む細胞集団を得る工程; - 工程(b)において、細胞集団中に少なくとも40%の割合で心筋前駆細胞が含まれるように細胞集団を得る請求項10記載の調製方法。
- 心筋前駆細胞が、CD31陰性及び/又はCD45陰性である、請求項10又は11記載の調製方法。
- 幹細胞がヒト多能性幹細胞である請求項10〜12のいずれか記載の調製方法。
- 工程(b)において、工程(a)で分化誘導処理後CD82陽性細胞が表れる時期に心筋前駆細胞に対して単離処理を施す請求項10〜13のいずれか記載の調製方法。
- 工程(b)において、CD82陽性であることを指標として心筋前駆細胞に対して単離処理 を施す請求項10〜14のいずれか記載の調製方法。
- 工程(b)において、心筋前駆細胞に対して、細胞集団中に少なくとも80%の割合で含まれるように単離処理を施す請求項10〜15のいずれか記載の調製方法。
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