JP2013510582A - 間葉幹細胞の球状集合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳類における炎症を減少させる方法及び組成を含む。本発明は、抗炎症性、抗アポトーシス、免疫調節及び抗腫瘍性を有する間葉幹細胞の一群を含む。

Description

本発明は、間葉ストローマ細胞（ＭＳＣ）が新規の治療特性を有するように培養でき、所望の病気の治療に有益である発見に関する。

骨髄は少なくとも２種類の幹細胞を含む。すなわち、造血幹細胞並びに間葉幹細胞又はストローマ細胞（ＭＳＣ）又は骨髄ストローマ細胞（ＢＭＳＣ）などと呼ばれる非造血組織の幹細胞を含む。本明細書では、これらの術語を同じ意味として用いる。ＭＳＣは、骨髄の少量の吸引液又は他の間葉幹細胞から簡単に分離でき且つ単一細胞由来のコロニーを生成するので、興味深い。骨髄細胞は腸骨稜、大腿、頸骨、背骨、肋骨、膝又は他の間葉幹細胞から得られる。ＭＳＣは、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、皮膚、脂肪、関節の滑膜組織及び血液からも得られる。モノクローナル抗体を特定の細胞表面マーカとすることにより、培養コロニーにおけるＭＳＣの存在が確認される（特許文献１及び２を参照）。単一細胞由来のコロニーは、約１０週内に５０倍まで拡大し、造骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞（非特許文献１〜４）、筋細胞（非特許文献５）、星状膠細胞、乏突起膠細胞及び神経細胞（非特許文献６〜９）に分化する。稀には、細胞が全ての３つの生殖細胞系列に分化することもある。このように、ＭＳＣは、骨、軟骨、靭帯、腱、脂肪、筋、心臓組織、基質、真皮及び他の結合組織を含む多重間葉細胞系列の前駆体としての役割を果たす（特許文献３、４参照）。このため、近年、ＭＳＣは、ヒトの病気の細胞及び遺伝子治療への可能性を試験するようになった（非特許文献１０、１１）。

ＭＳＣは、多能性幹細胞の別の源泉を構成する。生理学的条件下では、ＭＳＣは骨髄の構造を維持し、異なった細胞接着分子及びサイトカインの分泌の助けにより造血を調節する（非特許文献１２、１３）。組織培養樹脂の選択的付加装置により骨髄から成長したＭＳＣを、効率的に膨張させ（非特許文献６）遺伝子的に操作することができる（非特許文献１４）。

ＭＳＣは骨（非特許文献３）、軟骨（非特許文献１５）、脂肪（非特許文献３）及び筋肉（非特許文献５）を含む多数の中胚葉組織へと分化できるので、間葉幹細胞とも称される。更に、ＭＳＣが胚葉に拘束されないことを示唆する神経細胞標識を発現する神経細胞に似た細胞への分化も報告されている（非特許文献９、１６、１７）。

骨髄の移植の概念は別に研究されている。例えば、Ａｚｉｚｉ等はヒトの骨髄ストローマ細胞（ｈＢＭＳＣ）をシロネズミ（Ａｌｂｉｎｏ ｒａｔ）の脳に移植した（非特許文献６）。ｈＢＭＳＣは、ネズミの星状膠細胞と同様に移植、移動及び生存が観察された。更に、骨髄細胞は、成体マウスの脳に移植されるとミクログリア乾燥大膠細胞に分化できることが明らかとなった（非特許文献１８）。

米国特許第５４８６３５９号明細書 米国特許第７１５３５００号明細書 米国特許第６３８７３６９号明細書 米国特許第７１０１７０４号明細書

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本発明は病気の治療において、ＭＳＣによる治療効果を追加するのに必要なデータを提供することを目的としている。

本発明によれば、球状集合体の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞が提供される。この間葉幹細胞は、単層として培養された間葉幹細胞と比較すると少なくとも１つの治療タンパク質へと大量に発現する。

非限定的な実施例では、少なくとも１つの治療タンパク質は、球状集合体の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞により、単層として培養された間葉幹細胞よりも少なくとも２０％大きく発現される。別の非限定的な実施例では、少なくとも１つの治療タンパク質は、球状集合体の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞により、単層として培養された間葉幹細胞よりも少なくとも３倍大きく発現される。更に別の非限定的実施例では、少なくとも１つの治療タンパク質は、球状集合体の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞により、単層として培養された間葉幹細胞よりも少なくとも１０倍大きく発現される。更に限定的な実施例によっては、少なくとも１つの治療タンパクは、球状集合体の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞により、単層として培養された間葉幹細胞よりも少なくとも５０倍大きく発現される。また、別の非限定的な実施例では、少なくとも１つの治療タンパク質は、球状集合体の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞により、単層として培養された間葉幹細胞よりも少なくとも５００倍大きく発現される。また更に、別の非限定的な実施例では、少なくとも１つの治療タンパク質は、球状集合体の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞により、単層として培養された間葉幹細胞よりも少なくとも１０００倍大きく発現される。

非限定的な実施例では、少なくとも１つの治療タンパク質は、抗炎症性タンパク質、抗アポトーシスタンパク質、細胞の成長及び発生を調節するタンパク質、免疫応答を調節するタンパク質、造血を調節するタンパク質、腫瘍の成長を阻害、防止又は破壊するタンパク質、細胞のホーミングを調節するタンパク質、細胞接着及び／又は細胞シグナルに関与するタンパク質、血管形成を増進させるタンパク質及び前記タンパク質の組合せから成る群から選択されたものである。

例えば、非限定的な実施例では、ＭＳＣは、炎症、細胞のアポトーシス、自己免疫疾患を含む免疫異常調節、癌を含む腫瘍など（これらには限定されないが）を含む疾患を治療するのに使用できる。このことは、本発明によるＭＳＣは、抗炎症性タンパク質、抗アポトーシスタンパク質、造血を調節するタンパク質、腫瘍細胞及び／又は癌細胞を死滅させるタンパク質、免疫応答を調節するタンパク質、細胞のホーミングを調節するタンパク質、細胞接着及び／又は細胞シグナルに関与するタンパク質、血管形成を増進させるタンパク質など及び前記タンパク質の組合せ（これらには限定されないが）を含んだ、発現の結果として増量された１つ以上の治療タンパク質の特徴を有するように操作されるためである。

本発明の非限定的実施例では、ＭＳＣが抗炎症性治療への使用に提供される。別の非限定的な実施例では、ＭＳＣが酸素の欠損（虚血及び低酸素症）及び細胞及び組織の種々の損傷に関連するプログラム細胞死（アポトーシス）を減少ことへの使用に提供される。別の非限定的な実施例では、ＭＳＣは抗腫瘍治療、すなわち癌性腫瘍を含む腫瘍の成長の阻害、防止又は破壊への使用に提供される。別の非限定的な実施例では、ＭＳＣは、自己免疫疾患の治療（これには限定されないが）を含む免疫の調節への使用に提供される。

本発明は、懸滴又は非付着性皿においてＭＳＣを成長させると迅速に球状体へと集合するとの発見に関する。このようなＭＳＣは、ここでは「ＭＳＣの球状集合体」または「ＭＳＣ球状体」と称する。非限定的な実施例では、このようなＭＳＣ球状体は高い生存率を示し、治療タンパク質用に高水準の１つ以上の一連の遺伝子を発現する。このようなタンパク質の例として（下記には限定されないが）、ＴＮＦ−αに刺激された遺伝子タンパク質６（ＴＳＧ−６）、抗炎症性タンパク質：増殖分化因子−１５（ＧＤＦ−１５）、抗炎症性タンパク質：ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１（ＳＴＣ−１）、抗アポトーシス及び抗炎症性タンパク質：白血病阻害因子（ＬＩＦ）、細胞の成長及び発育を調節するタンパク質（ＩＬ−１１）、造血を調節するタンパク質：リガンドを誘発するアポトーシスに関するＴＮＦ−α（ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＩＬとしても知られている）、ある種の癌細胞を死滅させ免疫応答を調節するタンパク質（ＩＬ−２４）、ある種の癌細胞を死滅させるタンパク質：ＣＤ８２、癌細胞を死滅させ転移を抑制するタンパク質：ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）、細胞のホーミングを調整するタンパク質：ＩＴＧＡ２（インテグリンα２又はＣＤ９４ｂとしても知られている）、細胞接着及び細胞シグナルに関与するタンパク質：ＩＬ−８及び血管形成を増進させるタンパク質が含まれる。

本発明は、ＭＳＣが、ヒト及びヒト以外の動物へ投与する前に、（下記に限定されないが）抗炎症性タンパク質、抗アポトーシスタンパク質、免疫変調タンパク質、抗腫瘍性タンパク質など１つ以上の治療に有益なタンパク質へと発現するようにプレプログラミング（ｐｒｅ−ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）する方法を提供する。

ｈＭＳＣ球状体の生成及び間葉表面の特徴を維持する球状体由来の細胞の獲得の方法を示す一連の図であって、表面マーカＰＯＤＸＬの発現の減少及び表面マーカＣＤ４９ｂの発現の増加により標準的な単層培養したＭＳＣとは区別される。 ｈＭＳＣ球状体の生成及び間葉表面の特徴を維持する球状体由来の細胞の獲得の方法を示す一連の図であって、表面マーカＰＯＤＸＬの発現の減少及び表面マーカＣＤ４９ｂの発現の増加により標準的な単層培養したＭＳＣとは区別される。 培養球状体由来のＭＳＣの緩慢であるが生存可能な拡散を示す一連の図 球状体由来のＭＳＣ細胞は、単層培養したＭＳＣより際立って小さいことを示す一連の図 球状体由来のＭＳＣ細胞は、単層培養したＭＳＣより際立って小さいことを示す一連の図 懸滴培養されたＭＳＣ球状体は一連の治療遺伝子の単層から培養されたＭＳＣよりも発現のレベルが高いことを示す図であって、一連の治療遺伝子は、ＴＮＦ−α刺激遺伝子タンパク質６（ＴＳＧ−６、抗炎症性タンパク質）；ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ １（ＳＴＣ−１、抗アポトーシスタンパク質）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；細胞の成長及び発育を調節するタンパク質；ＩＬ−１１（造血を調節するタンパク質）；リガンドを含むアポトーシスに関連するＴＮＦ−α（ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＩＬとしても知られる、ある種の癌細胞を死滅させ免疫応答を調節するタンパク質）；ＩＬ−２４（ある種の癌細胞を死滅させるタンパク質）；ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４、細胞のホーミングを調節するタンパク質）；ＩＴＧＡ２（インテグリンα２としても知られる細胞の接着及び信号伝達に関与するタンパク質）；ＩＬ−８（血管形成を向上させるタンパク質）。本図は、ＭＳＣ球状体由来の細胞は、球状体として成長したヒト皮膚繊維芽細胞（ｈＤＦ）、肺上皮癌細胞系（Ａ５４９）及びヒト神経前駆体細胞の三種の細胞よりも遥かに高い水準の発現をすることも示している。 懸滴培養されたＭＳＣ球状体は一連の治療遺伝子の単層から培養されたＭＳＣよりも発現のレベルが高いことを示す図であって、一連の治療遺伝子は、ＴＮＦ−α刺激遺伝子タンパク質６（ＴＳＧ−６、抗炎症性タンパク質）；ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ １（ＳＴＣ−１、抗アポトーシスタンパク質）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；細胞の成長及び発育を調節するタンパク質；ＩＬ−１１（造血を調節するタンパク質）；リガンドを含むアポトーシスに関連するＴＮＦ−α（ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＩＬとしても知られる、ある種の癌細胞を死滅させ免疫応答を調節するタンパク質）；ＩＬ−２４（ある種の癌細胞を死滅させるタンパク質）；ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４、細胞のホーミングを調節するタンパク質）；ＩＴＧＡ２（インテグリンα２としても知られる細胞の接着及び信号伝達に関与するタンパク質）；ＩＬ−８（血管形成を向上させるタンパク質）。本図は、ＭＳＣ球状体由来の細胞は、球状体として成長したヒト皮膚繊維芽細胞（ｈＤＦ）、肺上皮癌細胞系（Ａ５４９）及びヒト神経前駆体細胞の三種の細胞よりも遥かに高い水準の発現をすることも示している。 懸滴培養由来のＭＳＣ球状体中において、抗炎症性タンパク質（ＴＳＧ−６）、抗アポトーシスタンパク質（ＳＴＣ−１）及び細胞調節タンパク質（ＬＩＦ）の生成が著しいことを示す一連の図 ＭＳＣ由来の細胞により、ＬＰＳ刺激マクロファージから生成されたＴＮＦαの量が著しく減少することを示す一連の図。ＭＳＣ球状体由来の細胞の効果は、単層培養のＭＳＣ球状体由来の細胞よりも遥かに大きい。 ＭＳＣ球状体由来の細胞は生体内において抗炎症効果があることを示す図。実験では、マウスに刺激薬ザイモサンを注射することにより、腹膜炎が誘発され、次いでＭＳＣ球状体由来の細胞を腹腔に注射した。炎症のマーカである血清中のプラスミンの活量が減少することから、ＭＳＣ球状体由来の細胞が炎症を減少させること示される。 ｈＭＳＣを懸滴又は無癒着性表面において成長させると、迅速に球状体へと集合することを示す一連の図 小さな球状体におけるｈＭＳＣが高い生存率を示す一連の図 小さな球状体におけるｈＭＳＣが高い生存率を示す一連の図 ｈＭＳＣ球状体が高水準の抗炎症性分子ＴＳＧ−６を発現することを示す一連の図 マイクロアレイの解析から得られた、細胞周期及び細胞体質遺伝子を下方制御する間に、ｈＭＳＣ球状体は高水準の一連のサイトカイン及び細胞接着分子に発現することを示す図。データは、ｈＭＳＣ球状体において発現された遺伝子のプロファイルは、単層培養されたｈＭＳＣにおいて発現された遺伝子のプロファイルと著しく異なっていることを示している。 ｈＭＳＣ球状体が高度の治療効果を有する分子に発現することを示す一連の図；ＴＳＧ−６（抗炎症性タンパク質）；ＳＴＣ−１、（抗アポトーシスタンパク質）；ＬＩＦ（細胞の成長及び発育を調節するタンパク質）；ＩＬ−２４（ある種の癌細胞を死滅させるタンパク質）；ＴＲＡＩＬ（ある種の癌細胞を死滅させ免疫系を調節するタンパク質） ｈＭＳＣ球状体が高度の治療効果を有する分子に発現することを示す一連の図；ＴＳＧ−６（抗炎症性タンパク質）；ＳＴＣ−１、（抗アポトーシスタンパク質）；ＬＩＦ（細胞の成長及び発育を調節するタンパク質）；ＩＬ−２４（ある種の癌細胞を死滅させるタンパク質）；ＴＲＡＩＬ（ある種の癌細胞を死滅させ免疫系を調節するタンパク質） ｈＭＳＣ球状体が多量のタンパク質ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１及びＬＩＦを分泌することを示す一連の図 ｈＭＳＣ球状体と共に培養されるとＬＰＳ刺激マクロファージの分泌するＴＮＦ−αが少なくなることを示す一連の図。単層培養されたＭＳＣは効果が薄い。 マウスの腹膜炎において、ｈＳＭＣ球状体はｈＭＳＣ球状体由来の細胞（図６）と同じ抗炎症効果を現すことを示す図 懸滴においてｈＭＳＣが球状体に集合するに従い、ＴＳＧ−６の発現が増大することを示す図。Ａ：懸滴において、時間経過と共に２５０００のｈＭＳＣが集合して球状体となることを示す位相差顕微鏡像（サイズ：５００μｍ）。Ｂ：Ｈ＆Ｅ染色した懸滴において３日培養したｈＭＳＣの断面（上から順位球状体の表面、中心部、中心部を示す、サイズ：５０μｍ）。 懸滴においてｈＭＳＣが球状体に集合するに従い、ＴＳＧ−６の発現が増大することを示す図。Ｃ：Ａｄｈ Ｌｏｗ試料（ｎ＝３）と対比してＴＳＧ−６のｈＭＳＣへの発現を即時ＲＴ−ＰＣＲ法で測定した結果。Ｄ：高密度において３日間成長さるか又は異なった密度（ｎ＝４）における懸滴として成長させたｈＭＳＣから分泌されるＴＳＧ−６を２４時間ＥＬＩＳＡ法で測定した結果。Ｅ：懸滴にて３日間成長させた２つの供与体からのｈＭＳＣにより生成された球状体の大きさを示す図であって、大きさは転移球状体（ｎ＝７−１３）の画像を測定した。Ｆ：低密度において成長させたｈＭＳＣ（ｎ＝３）と対比して高密度において、又は懸滴内（滴当たりの細胞数２５０００）において１−４日間成長させたＴＳＧ−６のｈＭＳＣへの発現を即時ＲＴ−ＰＣＲ法で測定した結果。図には平均値±標準偏差を示す。図中の略号は、ＲＱ：相対量、Ａｄｈ Ｌｏｗ：平板へｈＭＳＣを１００細胞／ｃｍ^２の密度で塗布し、７−８間で７０％の集約率となる密度、Ａｄｈ Ｈｉｇｈ：Ａｄｈ Ｌｏｗから採取したｈＭＳＣを５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で塗布し３日間培養した密度、Ｓｐｈ １０ｋ−２５０ｋ：Ａｄｈ Ｌｏｗから採取したｈＭＳＣを塗布して３日間培養した密度が１０，０００−２５０，０００細胞／ｃｍ^２である。 ｈＭＳＣ球状体の生存率を示す図。ＰＩ摂取及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣの標識をフローサイトメトリーによりｈＭＳＣの生存率を測定した結果。球状体はトリプシン／ＥＤＴＡで解離させた。代表的な蛍光ドットの記録とデータの要約が示されている。図の値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。 ｈＭＳＣ球状体の生存率を示す図。ＰＩ摂取及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣの標識をフローサイトメトリーによりｈＭＳＣの生存率を測定した結果。球状体はトリプシン／ＥＤＴＡで解離させた。代表的な蛍光ドットの記録とデータの要約が示されている。図の値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。１ｄ−４ｄは図１６−２のＦと同様に培養日数を示す。 大きさの分析及びｈＭＳＣ球状体の静脈への注入を示す図。Ａ：フローサイトメトリーによる細胞の大きさの分析結果であって、ｈＭＳＣの大きさは既知の径（３、７、１５及び２５μｍ）のビーズと比較して生存群（ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ^＋／７ＡＡＤ⁻）が前方散乱（挿入図）する性質から推定した。Ｂ：細胞の大きさを示す顕微鏡像を示す図。Ｃ：静脈に注入したｈＭＳＣの相対的な組織分布を示す図。ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの静脈に１０^６単層又は球状体由来のｈＭＳＣを注入し、ヒトのＡｌｕ及びＧＡＰＤＨに対するＰＣＲ法によりゲノムＤＮＡ及びｈＭＳＣの組織分布を測定するために１５分後に試料を採取し（ｎ＝４−５）、Ａｄｈ Ｈｉｇｈと比較して示した。図において＊は確率＜０．０５、＊＊は確率＜０．０１及び＊＊＊は確率＜０．００１で有意でないことを意味する。値は平均値±標準偏差を示す。略号は図１６−２と同じである。 球状体ｈＭＳＣが付着培養からのｈＭＳＣの性質を保持していることを示す図。Ａ：骨形成培地（Ｏｓｔｅｏ Ｄｉｆ）と比較培地（Ｏｓｔｅｏ Ｃｏｎ）におけるｈＭＳＣの分化を示す図。培地は１５日後にアリザリン赤で染色した（サイズ：２００μｍ）。Ｂ：脂肪成培地（Ａｄｉｐｏ Ｄｉｆ）と比較培地（Ａｄｉｐｏ Ｃｏｎ）におけるｈＭＳＣの分化を示す図。培地は１５日後にオイル赤Ｏで染色した（サイズ：２００μｍ）。Ｃ：高密度及び懸滴培培養を平板に低密度（細胞数；５５００／板）で塗布し７日毎に継代したｈＭＳＣ（供与体２）の単層としての成長を示す図（ｎ＝４）。継代毎の集団倍加（ＰＤ）が示されている（挿入図）。略号は図１６−２と同じ。 球状体ｈＭＳＣが付着培養からのｈＭＳＣの性質を保持していることを示す図。Ｄ：ｈＨＳＣ（供与体２）のＣＦＵ−Ｆアッセイを平板に塗布（８３細胞／平板）し１４日間培養した結果を示す図。１９Ｅ：ｈＭＳＣ上の表面タンパク質の発現のフローサイトメトリーの結果を示す図。略号は図１６−２と同じ。 ２つの供与体からのｈＭＳＣのマイクロアッセイの結果を示す図。Ａ：分化発現した遺伝子の階層的クラスタリングを示す図。少なくとも付着培養（Ａｄｈ Ｌｏｗ及びＡｄｈ Ｈｉｇｈ）の２倍の、上方制御された（２３６遺伝子）又は下方制御された（２３０遺伝子）球状の一方の遺伝子（Ｓｐｈ ２５ｋ）が階層クラスタリングに使用された。重要な遺伝子群（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ）の用語はヒートマップの横に示した。Ｂ：分化発現した表面エピトープ、すなわち、ＣＤ８２（転移の抑圧に関連するタンパク質）及びＣＤ４９ｂ並びにｈＭＳＣ上のＭＣＡＭの下方制御（ＣＤ１４６）、ＡＬＣＡＭの下方制御（ＣＤ１６６））の発現結果を示す図。略号は図１６−２と同じ。 高水準の抗炎症性及び抗腫瘍分子を発現する球状ｈＭＳＣを示す図。Ａ：２つの供与体の抗炎症性遺伝子（ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１及びＬＩＦ）、抗腫瘍遺伝子（ＩＬ−２４及びＴＲＡＩＬ）、ＭＳＣホーミング受容体遺伝子（ＣＸＣＲ４）及びＷｎｔ信号阻害遺伝子（ＤＫＫＩ）の即時ＲＴ−ＰＣＲ測定結果を示す図。測定値は、三組のアッセイの平均ＲＱ（Ａｄｈ Ｌｏｗ試料に対する）±９５％の有意幅を示す。Ｂ：転移して表面への付着（Ａｄｈ）又は非付着（Ｎｏｎａｄｈ）２４時間後の高密度単層（Ａｈｈ Ｈｉｇｈ）、球状体（Ｓｐｈ ２５ｋ）及びｈＭＳＣ由来の球状体（Ｓｐｈ ２５ｋ ＤＣ）の画像を示す図。培養は１．５ｍｌのＣＣＭ、並びに高密度培養からの２００，０００のＭＳＣ、８つの球状体又は球状体から解離した２００，０００のＭＳＣのいずれか含む６ウェル・プレートにて行った。２４時間後、培地をＥＬＩＳＡ用に回収し細胞はタンパク質アッセイ用に溶解した結果を示す図（サイズ：２００μｍ）。 高水準の抗炎症性及び抗腫瘍分子を発現する球状ｈＭＳＣを示す図。Ｃ：全細胞性タンパク質へ標準化された培地上のＴＳＧ−６ＥＬＩＳＡの結果を示す図。Ｄ：全細胞性タンパク質へ標準化された培地上のＳＴＣ−１のＥＬＩＳＡの結果を示す図。Ｅ：全細胞性タンパク質へ標準化された培地上のＬＩＦのＥＬＩＳＡの結果を示す図。値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示す。略号は図１６と同じであるが、更に、ＮＤは検出せず、Ｓｐｈ ２５ｋ ＤＣ−ＡｄｈはＳｐｈから解離したＭＳＣを平板に付着させたことを意味する。 ＭＳＣ球状体の試験管及び生体における増進された抗炎症効果を示す図。Ａ：マウス・マクロファージ（ｍＭΦ）アッセイの模式図。ｍＭΦは、転移井戸の上部チャンバに播種されＬＰＳで９０分間刺激してＬＰＳを除去し、チャンバは単層（Ａｄｈ）、球状体（Ｓｐｈ）又は球状体由来のｈＭＳＣ（Ｓｐｈ ＤＣ）が同一の細胞密度に塗付されたｓｉｘ−ｗｅｌｌ皿に転送される。ＭΦ：ｈＭＳＣ（２：１）。ＥＬＩＳＡのため５時間後に培地を採集した。Ｂ：共存培養からの培地におけるｍＴＮＦαに対するＥＬＳＩＡの結果を示す図（ｎ＝３）。Ｃ：腹膜炎のマウスにおけるｈＭＳＣの抗炎症活性を示す図。炎症を誘発させるためにＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内にザイモサンを注入した。１５分後に１．５×１０^６の単層ｈＭＳＣ、６０の球状体又は１．５×１０^６の球状体由来細胞をマウスの腹腔内に注入した。６時間後腹腔洗浄液を回収し、ＥＬＩＳＡ法を用いてｍＴＮＦαの量を測定した。洗浄液内の全分子の量を図示した（ｎ＝４〜８）。２４時間後血液を回収して血清中のプラスミン活性を測定した（ｎ＝３〜６）。値は平均値±標準偏差。図において、無印は確率≧０．０５、＊は確率＜０．０５、＊＊は確率＜０．０１、＊＊＊は確率＜０．００１でそれぞれが有意でないことを意味する。その他の略号は図１６〜２１と同じ。 ＭＳＣ球状体の試験管及び生体における増進された抗炎症効果を示す図。Ｄ：図２２−１のＣと同様の操作によりＥＬＩＳＡ法を用いてｍＭＰＯを測定した。Ｅ：図２２−１のｐＣと同様の操作によりＥＬＩＳＡ法を用いてＰＧＥ_２を測定した。値は平均値±標準偏差。図において、無印は確率≧０．０５、＊は確率＜０．０５、＊＊は確率＜０．０１、＊＊＊は確率＜０．００１でそれぞれが有意でないことを意味する。その他の略号は図１６〜２１と同じ 球状体ｈＭＳＣは、動物由来の製品を含まない培地において培養した後凍結すると高い生存率を維持することを示す図。球状体は、市販の異物の無い培地で培養した。３日後トリプシン／ＥＤＴＡを用いて球状体を解離させ、ＤＳＭＯにおいて凍結した。細胞を解凍し、フローサイトメトリーによりＰＩ摂取及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣ細胞表面標識を測定することにより生存率を決定した。標識の無い細胞は生存していると見なした。図中のＣＣＭ：完全培地（１７％のＦＢＳを含むαＭＥＭ）、ＨｕＳＡ：ヒトの血清アルブミン（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ社）、Ｓｔｐｒｏ．：ＳｔｅｍＰｒｏ Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ培地（Ｇｉｂｅｏ社）、Ｍｅｓ．：Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。 動物由来の製品を含まない培地において培養した球状体ｈＭＳＣの大きさの分布を示す図。市販の異物の無い培地で３日間培養した球状体をフローサイトメトリーにより測定した。球状体を解離させて得たｈＭＳＣをＤＳＭＯにおいて凍結した。少なくとも１週間後に、細胞を解凍し、死んだ細胞を測定対象から除くために、生存染料カルセインＡＭ及び７ＡＡＤで標識を付した。生存する細胞の線状分布が図示されている。細胞の前方散乱の性質と既知の径（３、７、１５、２５μｍ）を有するビーズとを比較して大きさを定量した。ビーズの大きさに対応する位置の縦線を加えた（Ｉ：０、Ｊ：３、Ｋ：７、Ｌ：１５、Ｍ：２５μｍ）。その他の略号は図２３と同じ 動物由来の製品を含まない培地において球状体として培養したｈＭＳＣにより発現した治療遺伝子の解析結果を示す図。球状体は、上記培地において３日間培養した。抗炎症性遺伝子ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１及びＧＤＦ−１５を即時ＲＴ−ＰＣＲにより解析し、それぞれの結果を２５Ａ，２５Ｂ及び２５Ｃに示す。値は、Ａｄｈ Ｌｏｗの試料と比較したＲＱの平均値±標準偏差（ｎ＝３）。その他の略号は図２３と同じ。 動物由来の製品を含まない培地において球状体として培養したｈＭＳＣの抗炎症性を示す図。球状体は上記培地において３日間培養した。球状体によりならされた調整培地（ＣＭ）は回収され、５０倍に希釈されＬＰＳ存在下（１００ｎｇ／ｍｌ）でマウスのマクロファージ上に添加された。ＬＰＳの存在下で培養したマクロファージ（ｓＭＯ）又はＬＰＳ無しに培養したマクロファージ（ＭＯ）並びにＬＰＳ存在下での非調整培地は比較の対象とした。１８時間後、マクロファージ培地は採取され、ＥＬＩＳＡ法によりｍＴＮＦαが分析された。値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。その他の略号は図２３と同じ。

〔用語の定義〕
本明細書においては、用語を以下のように意味で用いられる。

不定冠詞″ａ″及び″ａｎ″は、１つ又は１つよりも多い意味で用いる。

「約（ａｂｏｕｔ）」は当業者には自明であり、文脈により意味がやや変動する。

「自己由来（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」は、同じ個体に由来する物質で、また同じ個体に再導入される。

「生体適合格子（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｌａｔｔｉｃｅ）」は組織発育を伝達する三次元構造へ形成を促進することが可能な基盤を意味する。例えば、細胞は細胞外マトリックス、合成高分子、サイトカイン、増殖因子などの生体適合格子上にて培養又は播種することができる。組織の発育を促進するように、格子は所望の形状に形成できる。また、少なくとも細胞を培養する初期段階においては、培地及び／又は基盤に適切な組織型及び構造への発育を促進する因子（例えば、増殖因子、サイトカイン、細胞外マトリックスなど）を付加することができる。

「骨髄ストローマ細胞」、「ストローマ細胞」「間葉幹細胞」又は「ＭＳＣ」は、互いに入替わって用いられ、骨髄（非特許文献４）、末梢血（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２００１）、脂肪組織（Ｇｕｉｌａｋ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、臍帯血（Ｒｏｓａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２００３）、滑膜（Ｄｅ Ｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１）及び歯根膜（Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、皮膚及び血液（特許文献１、２）、脂肪及び滑液由来の細胞を意味する。ＭＳＣは、可塑性の組織培地表面に付着するとの特徴（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．； ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ， １９８８）及び造血幹細胞の効率的な支持細胞層であると特徴（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１）がある。更に、ＭＳＣは培養及び生体内においても、骨芽細胞及び軟骨細胞へと分化、脂肪細胞、筋肉細胞（非特許文献５）及び心筋細胞（Ｆｕｋｕｄａ ａｎｄ Ｙｕａｓａ， ２００６）へと分化、神経前駆体（非特許文献９、１５、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００６、Ｍａｒｅｓｅｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６、Ｋｒａｍｐｅｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００７）へと分化し、骨、軟骨、靭帯、腱、脂肪、筋肉、心臓組織、ストローマ、真皮及びその他の結合組織を含む間葉細胞系列の前駆体として働く（特許文献３、４）。

間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、既存の方法により精製することもできる（非特許文献５、Ｆｕｋｕｄａ ａｎｄ Ｙｕａｓａ， ２００６、非特許文献９、１５、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００６、Ｍａｒｅｓｅｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６、Ｋｒａｍｐｅｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。

「移植片（ｇｒａｆｔ）」は、細胞、組織、臓器又はその他移植用の生体適合格子を意味する。

「同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）」は、同じ種の別の動物由来の移植片を意味する。

「異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）」は、別の種の動物由来の移植片を意味する。

「移植組織（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）」は、移植されるべき生体適合格子又は供与者の組織、臓器又は細胞を意味する。例えば、移植組織には、（下記に限定されないが）皮膚細胞又は組織、骨髄、並びに心臓、膵臓、腎臓、肺及び肝臓など固形の臓器が含まれる。ある実施例では、移植組織はヒトの神経幹細胞である。

ここで定義したように、「同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）の骨髄ストローマ細胞（ＢＭＳＣ）」は、受容者と同じ種の異なった個体から得られる。

「供与者の抗原（ｄｏｎｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）」は、受容者へ移植すべき供与者の組織により発現される抗原を意味する。

「アロ抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ）」は、受容者により発現される抗原とは異なった抗原を意味する。

「エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）」は、抗原に対する免疫応答を仲介する細胞を意味する。受容者に移植が為された状況においては、エフェクター細胞は供与者の移植組織に在る抗原に対する免疫応答を惹起する受容者自身の細胞である。別の状況では、エフェクター細胞は、移植組織の一部であり、受容者に移植細胞を導入すると、移植組織中に在るエフェクター細胞が受容者の移植組織に対する免疫応答を惹起する結果となる。

「治療に効果的な量」とは、ＢＭＳＣを投与する被検者に有効な効果を与えるのに十分な量のＢＭＳＣを意味する。

「内生（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」とは、生体、細胞又は系統（ｓｙｓｔｅｍ）から又は内部で生成された物質を意味する。

「外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」とは、生体、細胞又は系統（ｓｙｓｔｅｍ）外からの物質又は外部で生成された物質を意味する。

「符号化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」とは、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）の定義された配列又はアミノ酸の定義された配列及びそれに伴う生物学的性質のいずれかを有する、他の高分子及び巨大分子を合成する鋳型として働く遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特有な配列の固有の性質を意味する。ｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生体系（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ）において遺伝子の生成するタンパク質に相当する場合、その遺伝子には該タンパク質の配列が符号化されていることになる。ｍＲＮＡ配列と同一で通常配列リストに提供されているヌクレオチド配列であるコード鎖、並びに遺伝子又はｃＤＮＡの転写用鋳型として用いられる非コード鎖の双方とも、タンパク質、又はその遺伝子又はｃＤＮＡの他の生成物が符号化されていることを意味する。

特に規定しない場合には、「アミノ酸の配列が符号化されたヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、互いが退化型であり同一のアミノ酸並列を符号化している全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡが符号化されたヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。

「分離された核酸（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、通常の状態では配列の側面にある配列から分離された核酸部分又は断片を意味し、例えば、ＤＮＡ断片は通常は隣接した配列から除去されたものである、例えば通常はゲノム内において配列は断片に隣接している。この用語は、通常核酸を伴っている例えばＲＮＡ又はＤＮＡから精製された核酸にも当てはまる。従って、この用語は、例えばベクター、自律複製プラスミド又はウィルス、又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに組込まれた組換えＤＮＡ、又は他の配列に依存しないで分離している分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノム、又はＰＣＲ又は制限酵素消化により生成されたｃＤＮＡ段片）。また、用語は、付加的なポリペプチド配列を符号化している雑種遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。

本発明の記載においては、核酸塩基には次の略号を用いている。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを意味する。

「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、分離された核酸を含み、分離された核酸を細胞の内部へ運搬する物質の組成を意味する。多数のベクターが知られており、下記に限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は親水性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウィルスが含まれる。従って、この用語は、自律複製プラスミド又はウィルスを含む。この用語は、例えば、ポリリシン化合物、リプソームなど核酸の細胞内への伝達を促進する、非プラスミド及び非ウィルス化合物も含むと見なすべきである。

「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、発現すべきヌクレオチド配列に連鎖した発現調整配列を含む組換えポリプクレオチドを含むベクターを意味する。発現ベクターは、発現するのに十分なシス作用領域を含む。発現するのに必要な他の領域は宿主細胞又はインビトロ 発現系より供給される。発現ベクターは、既知のコスミド、（例えば、裸又はリポソームに包まれた）プラスミド及び組換えポリヌクレオチドに組込まれたウィルスなどを含む。

本発明は、ＭＳＣ、特にヒトのＭＳＣ（ｈＭＳＣ）が球状体へと集合すると、ｈＭＳＣ球状体及びｈＭＳＣ球状体から得られた細胞は１つ以上の遺伝子符号化治療タンパク質を高水準で発現するとの発見に関する。そのような治療タンパク質は、抗炎症薬、抗アポトーシス薬、免疫応答を調節するタンパク質、造血を調節するタンパク質、腫瘍の成長を阻害、防止及び破壊する薬剤、細胞のホーミングを調節するタンパク質、細胞接着及び細胞シグナルに関与するタンパク質及び血管形成を増進するタンパク質並びにこれらの組合わせを含むが、これらに限定されるものではない。このようなタンパク質には、ＴＳＧ−６（抗炎症性タンパク質）、増殖分化因子１５又はＧＤＦ−１５（抗炎症性タンパク質）、ＳＴＣ（抗アポトーシス及び抗炎症性タンパク質）；ＬＩＦ（細胞の成長及び発育を調節するタンパク質）；ＩＬ−１１（造血を調節するタンパク質）；リガンドを含むアポトーシスに関するＴＮＦ−α又はＴＮＦＳＦ−１０、ＴＲＡＩＬとしても知られる（ある種の癌細胞を死滅させ免疫系を調節するタンパク質）；ＩＬ−２４（ある種の癌細胞を死滅させるタンパク質）；ＣＤ８２（癌細胞を死滅させ転移を抑制するタンパク質）；ＣＸＣケモカイン受容体４又はＣＸＣＲ４（細胞のホーミングを調節するタンパク質）；ＩＴＧＡ２、インテグリンα２又はＣＤ４９ｂとしても知られる（細胞接着及び信号伝達に関与するタンパク質）及びＩＬ−８（血管形成を向上させるタンパク質）があるが、これらに限定されるものではない。本明細書では、ｈＭＳＣ球状体及びｈＭＳＣ球状体からのｈＭＳＣはインビトロの炎症アッセイにおいて抗炎症効果を示し且つインビボの腹膜炎のマウスにおいて抗炎症性である。従って、ｈＭＳＣ球状体及びｈＭＳＣ球状体からのｈＭＳＣは、多くの疾患における抗炎症治療に有用である。幾つかの例では、ｈＭＳＣ球状体及びｈＭＳＣ球状体からのｈＭＳＣは、多くの癌において抗腫瘍治療に有用である。

本発明は、哺乳類の炎症の減少又は阻害に有効なＭＳＣ球状体又はｈＭＳＣ球状体から得られた細胞を用いて、哺乳類を治療することにより、炎症反応を減少させ且つ／又は消滅させる方法及び組成を含む。

本発明は、治療タンパク質が増大して発現するように、ＭＳＣを投与又は移植する前に、予めプログラムする方法を提供する。このような治療タンパク質には、抗炎症性、抗アポトーシス、免疫調節及び抗腫瘍性タンパク質がふくまれるが、これに限定されるものではない。患者に投与した際に、抗炎症性、抗アポトーシス、免疫調節及び／又は抗腫瘍性タンパク質が極大に発現するように、本発明の方法には、ＭＳＣの活性化及びＭＳＣの投与が含まれる。

〔炎症を抑制する治療及び／又は抗腫瘍治療〕
本発明は、ＭＳＣ球状体又はｈＭＳＣ球状体から得られた細胞を用いて炎症を抑制又は調節する治療を含む。本発明は、ＭＳＣが集合すると迅速に球状体を形成するとの発見に基づいている。ｈＭＳＣ球状体は、高い生存率を示し、高水準の抗炎症、抗アポトーシス、免疫調節及び／又は抗腫瘍性タンパク質を発現する。ｈＭＳＣ球状体又はｈＭＳＣ球状体から得られた細胞は、高水準の抗炎症性タンパク質を分泌する。ｈＭＳＣ球状体又はｈＭＳＣ球状体から得られた細胞は、インビトロの炎症アッセイ及びインビボの腹膜炎のマウスにおいても抗炎症効果を示す。

当業者であれば、ここに提供された開示に基づき、ｈＭＳＣ球状体又はｈＭＳＣ球状体から得られた細胞の炎症を抑制する能力は抗炎症治療の手段を提供すると評価する。

ここに提供された開示に基づき、ＭＳＣは、どのような原料からも得られることがわかる。受容者に対しては、ＭＳＣは自己由来（同一の宿主からえられた）であるか又は同種である。更に、ＭＳＣは受容者に対して異種移植（異種の動物から得られた）のこともある。例えば、ヒトの炎症を抑制するのにネズミＭＳＣが使われることがある。

別の実施例では、ＭＳＣが、（下記に限定されないが）ヒト、マウス、ネズミ、サル、テナガザル、ウシなどの骨髄から分離されている。非限定的な実施例では、ＭＳＣが、ヒト、マウス又はネズミ（の骨髄）から分離されている。別の非限定的な実施例では、ＭＳＣが、ヒト（の骨髄）から分離されている。

本願の開示に基づき、ここで述べられた方法に用いるのに十分な数の細胞を得るために、ＭＳＣが集合を促進し球状体を形成するように、ＭＳＣが分離されてインビトロの培地に展開される。例えば、ヒトの骨髄からＭＳＣが分離されて完全培地（４ｍＭのグルタミン、１０％ＰＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ低グルコース）、懸滴又は非接着性皿において培養されるが、分離法又は培地は上記に限定してされるものではない。むしろ、ＭＳＣが集合を促進し球状体を形成するようにＭＳＣを培養できる、分離方法及び培地は全て本発明に含まれると考えてよい。

インビトロにおいてＭＳＣを支援できる培地は、ＭＳＣを培養するのに用いられる。ＭＳＣの増殖を支援できる調整された培地には、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）により修正されたイーグル（Ｅａｇｌｅ）の培地（ＤＭＥＭ）、α修正した最少必須培地（αＭＥＭ）及びＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ培地１６４０）などがあるが、これに限定されるものではない。ＭＳＣの増殖を支援するために、２０％までのウシ胎仔血清（ＰＢＳ）又は１−２０％のウマ血清が上記培地に添加されることが多い。しかしながら、ＭＳＣの培養に必要な増殖因子であるサイトカイン及び成長ホルモンが培地に適切な濃度で提供される場合には、上記に定義した培地のまま用いられる。本発明の方法に有用な培地は、ＭＳＣの培養に有用な抗生物質、分裂促進化合物又は分化促進化合物などの興味深い化合物を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。非限定的な実施例では、細胞は２７℃〜４０℃で、別の実施例では３１℃〜３７℃で、更に別の実施例では湿度調整されたインキュベータにおいて増殖する。炭酸ガス濃度は２％〜１０％、酸素濃度１％〜２２％に保たれる。しかし、本発明は、ＭＳＣを分離、培養する１つの方法に限定されるものではない。むしろ、ＭＳＣを分離、培養する全てに方法が本発明に含まれると考えてよい。

培地に添加する抗生物質には、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むが、これに限定されるものではない。培地のペニシリン濃度は約１０〜２００単位／ｍｌであり、ストレプトマイシン濃度は約１０〜２００μｇ／ｍｌである。

一般に、間葉幹細胞は、上記の培地において、間葉幹細胞が球状体へと集合し、治療タンパク質へ最適に発現する条件下で培養される。

非限定的な実施例においては、間葉幹細胞は、例えば上記の１つ以上の治療タンパク質を上方制御するのに有効な量の血清を含んだ完全培地（ＣＣＭ）のような培地において培養される。例えば、培地は２０％までのウシ胎仔血清を含んでもよい。非限定的な実施例においては、ウシ胎仔血清の量は１７％である。間葉幹細胞は、更に培養できるのに十分な数の細胞が提供できる条件下及び期間（例えば７又は８日間）培養される。培地は、上記の１つ以上の治療タンパク質を上方制御するように、血清以外又は血清に加えて増殖因子を含んでもよい。

細胞は、球状集合体の形成を促進する条件下において培養される。非限定的な実施例では、細胞は懸滴において培養される。各懸滴は、少なくとも１つの治療タンパク質が最適な発現する量の間葉幹細胞を含む。非限定的な実施例では、細胞の懸滴は、２０％までのウシ胎仔血清を含む完全培地のような培地で培養される。非限定的な実施例においては、ウシ胎仔血清の量は１７％である。

別の非限定的な実施例では、各懸滴には、約１０，０００〜５００，０００個の細胞が含まれている。別の非限定的な実施例では、約１０，０００〜２５０，０００個の細胞が含まれている。更に別の非限定的実施例では、約１０，０００〜２５，０００個の細胞が含まれている。また、別の非限定的な実施例では、約２５，０００の細胞が含まれている。

間葉幹細胞の懸滴は、間葉細胞の球状体集合が形成されるのに十分な期間培養される。一般に、細胞の懸滴は４日まで培養される。

間葉幹細胞の球状集合体が形成されたから、必要ならば、間葉幹細胞は例えばトリプシン及び／又はＥＤＴのような解離剤の存在下で定温度培養することにより球状体から解離してもよい。

間葉幹細胞の球状集合体又は球状集合体由来の間葉幹細胞は、所望の治療効果を提供するように動物に投与される。動物は、ヒト及びヒト以外の霊長類を含む哺乳類であるが、これらに限定はされない。

本発明の実施例には、移植の受容者へのＭＳＣの投与も含まれる。ＭＳＣは、移植片即ち、移植すべき生体適合格子又は供与者の組織、臓器又は細胞の配置に適した経路により投与される。ＭＳＣは、非経口的に静脈注射によるか又は骨髄のような特定の組織又は臓器を目標として投与してもよい。ＭＳＣは、皮下移植によるか又は例えば筋肉のような結合組織に注入することにより投与してもよい。

ＭＳＣは、適切な薬物担体又は希釈剤に懸濁させてもよい。注入液に適当な賦形剤は、ＭＳＣ及び受容者に生体的にも生理的にも適合する、緩衝塩溶液又は他の賦形剤である。投与する組成は、適当な不稔及び安定性に適合する標準的な方法に従って、調整、製造及び貯蔵することができる。

ＭＳＣの投与量は、広範囲に変化し、個々の場合の要求により調整される。使用される細胞数は、年齢、体重、性別並びに受容者の状況、投与の回数及び／又は頻度、治療中の疾患又は障害及びその疾患の程度又は発病度並びに他の変動要因によって変わる。

〔ＭＳＣを用いる利点〕
本明細書の開示によれば、本発明によるＭＳＣは、最近の方法と共に、例えば抗炎症治療、炎症に関連する疾患、障害又は状況の治療に使用できることを予想している。抗炎症剤の代わり又は抗炎症剤と共にＭＳＣを使用する利点は、受容者の炎症の発病度を改善するために、本発明の方法を用いることにより、使用される抗炎症剤の量及び／又は抗炎症剤の投与の頻度を減少させることができることである。抗炎症剤の使用量が減少すると、抗炎症剤による副作用が軽減されるとの利点がある。本発明の細胞は、炎症を治療するのに受容者へ一回の投与で済むように意図している。ＭＳＣの受容者への一回の投与により、慢性的な抗炎症治療の必要性が無くなる。必要ならば、複数回のＭＳＣの投与を採用することもできる。

炎症の防止、処置又は改善するために、予防又は治療に効果的な量のＭＳＣを投与することによる炎症の防止又は治療方法も本発明に含まれる。ＭＳＣの効果的な量は、投与に先立っての炎症の程度を投与後の程度と比較することにより決められる。受容者にＭＳＣを用いての炎症の減少又は増大しないことは、投与したＭＳＣの数が治療に効果的な量であることを示している。

本明細書の開示によれば、本発明によるＭＳＣは、最近の方法と共に、例えば抗腫瘍治療、癌の治療に使用できることを予想している。本発明による間葉幹細胞によって治療される癌には、肺癌、カポシ肉腫、直腸癌、グリオーマ、転移を含む乳癌、転移を含む黒色腫、肝癌、膵臓癌及び骨肉腫が含まれるが、これに限定されるものではない。ＭＳＣを抗腫瘍剤の代わり又は抗腫瘍剤と共に用いる利点は、受容者の腫瘍の発病度を改善するために、本発明の方法を用いることにより、使用される抗腫瘍剤の量及び／又は抗腫瘍剤の投与の頻度を減少させることができることである。抗腫瘍剤の使用量が減少すると、抗腫瘍剤による副作用が軽減されるとの利点がある。

本発明の細胞は、癌を治療するのに受容者へ一回の投与で済むように意図している。ＭＳＣの受容者への一回の投与により、慢性的な抗腫瘍治療の必要性が無くなる。必要ならば、複数回のＭＳＣの投与を採用することもできる。

癌の防止、処置又は改善するために、予防又は治療に効果的な量のＭＳＣを投与することによる炎症の防止又は治療方法も本発明に含まれる。ＭＳＣの効果的な量は、投与に先立っての癌の程度を投与後の程度と比較することにより決められる。受容者にＭＳＣを用いての癌の減少又は増大しないことは、投与したＭＳＣの数が治療に効果的な量であることを示している。

移植で使用する場合、間葉幹細胞は全身に移動が可能であり、腫瘍は形成する傾向はなく、ドナーのミスマッチを横断した免疫応答を寛容化するように見える。本明細書の開示によれば、本発明によるＭＳＣは、最近の方法と共に、例えば、移植による拒絶の処置又は防止をするために骨髄又は臓器の移植に続く移植片対宿主病、又は糖尿病Ｉ型、慢性関節リウマチ、甲状腺炎及び乾癬及び自己増殖性疾患のような狼瘡及び自己免疫に関連した自己免疫疾患に対する免疫調整治療への使用を予想している。

本明細書の開示に基づいて、本発明のＭＳＣは、最近の方法と共に、例えば、酸素欠乏（虚血又は低酸素症）又はアルツハイマー病、パーキンソン症候群及びその他神経退化性疾患並びに発作、脳損傷又は振とう症のような疾患による組織の損傷に続くプログラム細胞死を制限するための治療への使用を予想している。

本発明の範囲において、球状集合体中の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、上記の治療に加えて別の治療において上述した１つ以上の治療タンパク質が増量されて発現するとの利点もある。例えば、本発明の間葉幹細胞が所望の細胞型に分化し且つ／又は動物に所望の組織を生成又は再生するように、間葉幹細胞を動物に投与してもよい。例えば、本発明の間葉幹細胞が骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、筋細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、神経細胞のような細胞に分化し且つ／又は骨、軟骨、靭帯、腱、脂肪組織、筋肉、心臓組織、ストローマ、皮膚組織及び／又は他の結合組織を生成するように、動物に投与してもよい。従って、本発明の間葉幹細胞は、動物に上記の治療タンパク質を提供して、動物内に所望の細胞型を提供し且つ／又は所望の組織を生成又は再生するのに用いてもよい。

例えば、球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、軟骨形成、膝及び関節の修復を含む骨、腱、及び／又は軟骨が修復又は再生するように動物に投与するか又はタンパク質の生成及び免疫の仲介による補助的治療に用いてもよい。球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、同時移植された造血幹細胞を支持するようにサイトカインのインビボ生成及び動物モデルのリソソーム蓄積障害において欠乏する酵素を生成するのに用いてもよい。

更に、球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、心筋梗塞後の心臓組織の再生及び／又は効果的な心臓組織の血管再生、並びに椎間板の欠損の修復及び脊椎の治療、発作により損傷した組織又は血管の修復、てんかんの治療及び骨格組織の修復に用いてもよい。

球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、創傷の治療に用いてもよい。球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、体系的に投与するか又は創傷に局所的に用いてもよい。球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は創傷に入り込むと、パラクリン機構を通して他の創傷細胞と相互に作用し、血管内皮細胞への相互作用及び免疫調節が創傷の治癒を速め、形成される傷痕が小さくなる。

他の非限定的な実施例では、球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、肺の疾患又は障害の治療に用いてもよい。本発明の範囲は理論的な根拠に限定されるものではないが、間葉幹細胞は、肺組織の損傷域又は疾患域に向かい、そこで損傷部又は疾患部を更新するか又は修復すると信じられている。球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞により治療できる肺の疾患又は損傷には、肺癌、嚢胞性繊維症、α１アンチトリプシン欠損症及び特発性肺芽繊維症（ＩＰＦ）が含まれるが、これに限定されるものではない。

別の非限定的な実施例では、球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、脳の損傷又は障害の治療及び脳組織の修復及び／又は再生、並びに脳内の血管の修復及び／又は再生、又は脳の血管形成を促進させるのに用いてもよい。例えば、球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、発作又は振とうにより損傷した脳組織及び／又は脳内の血管の修復及び／又は再生に用いてもよい。

更に、球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、投与した際、肺への閉じ込めを逃れ、それによって、癌及び上述の他の疾患又は障害を含む末端器官の疾患を治療できるとの利点が生じる。

更に、間葉幹細胞を球状集合体として培養することにより、間葉幹細胞は、「予備活性化（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」され、すなわち球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、動物に投与されると直ちにインビボにおいて１つ以上の治療タンパク質を多量に発現する。一方球状集合体でない間葉幹細胞又は球状集合体から得られていない間葉幹細胞は、投与されてから約１０〜２４時間後に遅延して治療タンパク質を発現する。

非限定的な実施例では、球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、単独か又は治療に供する既知の薬剤と組合せて投与される。

別の非限定的な実施例では、球状集合体内の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞は、外生ポリヌクレオチド符号化治療剤と共に、遺伝子的に操作されてもよい。そのようなポリヌクレオチドは、上述したような適切な発現ベクター含んでもよく、そのようなベクターは当業者には周知の手段により間葉幹細胞内に導入される。このように、遺伝子的に操作された間葉幹細胞は１つ以上の治療剤を多量に発現するとの特徴があるので、遺伝子治療に用いてもよい。

出願人は、球状集合体が培養された培地が上述のような治療効果を提供することも発見した。このように、本発明の別の面は、間葉幹細胞の球状集合体が培養された培地を含む組成を動物に投与することも含めた動物へ治療効果をもたらす方法を提供することである。前記組成には、動物に治療効果をもたらすのに有効な量の培地も含まれている。治療効果には、抗炎症効果、抗腫瘍効果又は免疫応答の調節が含まれるが、これに限定されるものではない。

非限定的な実施例では、そのような培地は、間葉幹細胞の球状体の集合及び形成を促進し且つ間葉幹細胞の球状集合体の形成を促進する培地において、上述した条件下及び期間に渉って間葉幹細胞を培養することにより調整される。間葉幹細胞の球状集合体が形成されると、間葉幹細胞は球状体から解離され培地から分離される。

調整された培地とも称される培地は、所望の治療効果をもたらす量を動物に投与される。非限定的な実施例では、調整された培地は、例えば緩衝塩溶液又は上述した他の賦形剤などの薬剤の担体又は希釈剤と共に投与される。組成は、適当な不稔及び安定性に適合する標準的な方法に従って、調整、製造及び貯蔵することができる。

調整された培地の投与量は、広範囲に変化し、個々の場合の要求により調整される。投与される培地の量は、年齢、体重、性別並びに受容者の状況、投与の回数及び／又は頻度、治療中の疾患又は障害及びその疾患の程度又は発病度並びに他の変動要因によって変わる。

以下、本発明の利点、特徴及び詳細について、図面を用いて実施例を説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、開示から明白である変形も含まれる。

〔多細胞球状培地由来のヒト間葉幹細胞の独特な特性〕
ヒト間葉ストローマ細胞（ｈＭＳＣ）は、損傷されて機能不全となった組織の修復に大きな期待を示す。我々の予備試験では、懸滴として培養されたｈＭＳＣは、抗炎症性の性向を有した球状体へと集合することが示された。最近は、ｈＭＳＣ単層培養及び別の細胞型由来の球状体とは異なった、球状体由来細胞（ＳＤＣ）の独特の特性を探し求めている。ＳＤＣは、球状体をトリプシン／ＥＤＴＡで解離させ、遠心分離により細胞を摘出している。顕微鏡で測定したＳＤＣの径は、単層ｈＭＳＣの約１／２で、容積は約１／４であった。興味深いことには、ＳＤＣの大きさは、懸滴内の初期の細胞数、すなわち球状体の大きさには依存しない。ＳＤＣの生存率が高いことも、トリパンブルー及びアネキシン／ＰＩを用いて顕微鏡並びにフローサイトメトリーにより確認された。更に、フローサイトメトリー（ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋）及びＣＦＵ−Ｆアッセイにより、ＳＤＣが間葉細胞の特性を維持していることを確認した。しかし、ＣＤ４９ｂのＳＤＣ発現は増大する一方で、ＰＯＤＸＬ，ＣＤ４９ｄ及びＣＤ４９ｆは減少した。驚いたことには、ｈＭＳＣ球状体は成長せずまた細胞も、神経細胞球体及び癌細胞球体とは異なり、繊維芽細胞と同様な集合内においては殆んど分裂しない（Ｓ期では３％以下）ことがわかった。抗腫瘍遺伝子（ＴＲＡＩＬ及びＩＬ−２４）及び抗炎症性遺伝子（ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１及びＬＩＦ）は、他の球体型とは異なってｈＭＳＣ球状体内において上方制御される。ＥＬＩＳＡ法により、ｈＭＳＣのＳＤＣにおいては抗炎症性因子の分泌が高いことが測定され、ＬＰＳで活性化されたマクロファージを用いて腹膜炎のマウス内における共存培養により、抗炎症特性が明らかになった。結論として、形態、表現型、成長、生存率及び抗炎症性に関して、ｈＭＳＣのＳＤＣの際立った特徴を確認した。この結果は、ＳＤＣは、再生治療において有益な効果を示す独特の予備活性化された細胞であることを示唆している。

〔ｈＭＳＣ球状体の生成する方法及び間葉表面特性を維持する球状体由来の細胞の獲得〕
ｈＭＳＣを得るには、有核細胞が骨髄の吸引物から密度勾配遠心分離法により分離されて、完全培地（ＣＣＭ：αーＭＥＭ、１７％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン）に再懸濁させた。有核細胞は平板に塗布され、２４時間後に非付着細胞は廃棄される。付着細胞は約７０％集約的になるまで展開されてトリプシン／ＥＤＴＡにより得られ、５０細胞／ｃｍ^２の密度で平板に再塗布される。細胞は７０％集約的になるまで展開されてから継代Ｉ細胞として凍結される。継代ＩＭＳＣの凍結バイアルは解凍されて平板に１００細胞／ｃｍ^２の密度で塗付され７日間展開されてから凍結される。この研究においては、継代Ｉ又はＩＩの凍結ＭＳＣが得られて、１００細胞／ｃｍ^２の密度になるように、種々のアッセイ用に得られまで７、８日間（Ａｄｈ Ｓｔ）成長させる。多細胞球状体が生成されるように、培養皿の縁に懸滴として２５，０００細胞／滴（２５ｋ Ｄｒｏｐ）の濃度のＭＳＣが塗付され３５μｌのＣＣＭ中で３日間培養される（図１−１のＡ）。球状体由来の細胞（ＳＤＣ）が得られるように、ＭＳＣ球状体は擦取って収穫され、５〜１０分間トリプシン／ＥＤＴＡにより解離され（図１−１のＢ）、ＳＤＣ及び１細胞／ｃｍ２の密度で塗付されＣＣＭ中で１４日間培養された付着単層由来のＭＳＣ（Ａｄｈ）への分析が行われる。細胞はメタノール中に固定されクリスタルバイオレットにより５分間標識付けされる。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＶｅｒｓａＤｏｃ 画像システムにより画像が取込まれる。フローサイトメトリー分析のため、ＳＤＣは室温において、２０〜３０分間抗体で標識付けされる。細胞は、ＰＢＳ中で洗浄されてＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ベンチトップアナライザーにより表面標識が測定された。目盛は５０μｍである（図１−２のＣ）。

〔培養された球状体由来のＭＳＣは緩慢に増殖するが生存率は高く維持される〕
付着細胞の増殖率及び生存率を球状体由来の細胞（ＳＤＣ）と比較するために、ＭＳＣを平板に単層として１００細胞／ｃｍ^２で６日間（Ａｄｈ ６）、５，０００細胞／ｃｍ^２で３日間（Ａｄｈ）並びに懸滴として２５，０００細胞／滴で３日間培養した。付着ＭＳＣはトリプシン／ＥＤＴＡを用いて収穫した。ＳＤＣを得るために、球状体が収集されてトリプシン／ＥＤＴＡを用いて解離される。細胞周期を解析するためＭＳＣは７０％エタノールで固定され、ＰＢＳ中で洗浄され、ＲＮアーゼを用いて培養してからヨウ化プロジウム（ＰＩ）で夜通し染色した（図２のＡ）。Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒのフローサイトメータによりＤＮＡ量が測定され、ＭｕｌｔｉＣｙｃｌｅ （Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）によりデータ解析された。トリパンブルーを用いて顕微鏡により且つＳＤＣをアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩで標識つけてフローサイトメトリーにより、単層由来のＭＳＣ（Ａｄｈ）及び培養スフェレオイド（ＳＤＣ）の生存率が決定された（図２のＢ）。

〔球状体由来のＭＳＣは単層培養のＭＳＣよりも著しく小さい〕
顕微鏡及びフローサイトメトリー（ＦＣＭ）により、単層及び球状体として懸滴中で３日間培養されたＭＳＣの大きさが決定された。付着単層培養由来の細胞（Ａｄｈ）及び球状体（ＳＤＣ）が血球計数器に移されて分析された。画像はニコン社のＥｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ−Ｓ倒立顕微鏡により撮影した（図３−１のＡ）。ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲ３０（ソフトウェア）を用いて、細胞の径（５０細胞以上）を算出し図示した。ＳＤＣの大きさは、球状体の解離により得られた細胞をその濃度を：１０，０００個／滴（Ｄｒｏｐ−１０ｋ）、２５，０００個／滴（Ｄｒｏｐ−２５ｋ）、１００，０００個／滴（Ｄｒｏｐ−１００ｋ）、２５０，０００個／滴（Ｄｒｏｐ−２５０ｋ）変えて懸滴中に３日間懸濁してから測定して得られた（図３−１のＢ）。Ａｈｄ細胞及びＳＤＣを平板に塗布して２４時間後でもＳＤＣの径が小さかった（目盛＝５０μｍ）。フローサイトメトリーの前に、２００，０００個のＡｄｈ細胞及びＳＤＣを染料ｃａｌｃｉｎｅ ＡＭ （生存細胞）及び７ＡＡＤ（脂肪細胞）と共に室温で１０〜２０分間培養した（図３−２のＣ）。既知の大きさのビーズ（３、７、１５、２５μｍ）を用いて、生存している（Ｃａｌｃｉｎｅ＋／７ＡＡＤ）細胞数から前方散乱の特性を解析することにより細胞の大きさを推定した（図３−２のＤ）。図に示されるようにビーズの大きさに相当する位置に縦線を付した。ビーズの大きさに基づいて、Ａｄｈ及びＳＤＣを５群（＜３μｍ、３〜５μｍ、７〜１５μｍ、１５〜２５μｍ、２５μｍ＞）に分類した（図３−２のＥ）。

〔懸滴内で培養したＭＳＣは、抗炎症性、抗アポトーシス、免疫調節及び抗腫瘍性へと独特の発現を示す〕
ヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）、ヒト皮膚繊維芽細胞（ｈＤＦ）、Ａ５４９肺癌種細胞（Ａ５４９）及びヒト神経細胞前駆体（ｈＮＰＣ）は、球状体への成長を促進させるため懸滴として培養した（２５，０００細胞／滴）。３日後、マイクロアレイ用にＲＮＡを遊離するために、生成された球状体を収穫した。試料は、Ｈｕｍａｎ Ｅｘｏｎ １．０ ＳＴ ａｒｒａｙ上で雑種形成されてＰａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６．４を用いて遺伝子水準の解析を行った。選択された遺伝子を図示した。数値は、単層と比較したフォールドの変化を示す（図４−１のＡ）。ＴＳＧ−６，ＳＴＣ−１及びＬＩＦのマイクロアレイの結果を、１８Ｓを内生調節として用い即時ＲＴ−ＰＣＲを３回行って検証した。結果は、単層培養（Ａｄｈ）と比較した量（ＲＴ）として図示した（図４−２のＢ、目盛＝５０μｍ）。

〔懸滴培養由来のＭＳＣ中においては抗炎症性タンパク質ＴＳＧ−６及びＳＴＣ−１の生成が極めて増大する〕
懸滴内にＭＳＣを懸濁（２５，０００細胞／滴）させることにより生成された多細胞球状体は、トリプシン／ＥＤＴＡ用いて解離される。得られた細胞（ＳＤＣ）は、６ウェル・プレートの１５ｍｌのＣＣＭ中に２００，０００細胞／ウェルの密度で塗付された。２４時間後に調整された培地が収穫されＥＬＩＳＡに用いられた。得られた結果は、容積当たり同じ密度で種付けして２４時間培養した単層培地由来のＭＳＣ（Ａｄｈ）と比較した。ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１及びＬＩＦの分泌量（ｐｇ／ｍｌ）の平均値を図示する（図５）。実験は３回行った。

〔ＭＳＣ球状体由来の細胞によりＬＰＳ刺激マクロファージから生成されたＴＮＦ−αの水準は著しく減少する〕
トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、４．６７ｃｍ２の成長域、０．４μｍの孔径）の上室に４００，０００細胞／ｗｅｌｌの密度で種付けされたマウスマクロファージ（ｍＭΦ）は、０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳで９０分間刺激された。ＬＰＳを除いてから、付着単層由来のＭＳＣ（Ａｄｈ）及び懸滴法による生成されたスフェレオイド由来のＭＳＣ（ＳＤＣ）はトランスウェルの下方に２００，０００細胞／ウェルの密度で塗付された。５時間後ｍＭΦで調整された培地は、ｍＴＮＦ−α・ＥＬＩＳＡ用に収集された（図６のＡ）。次いで、ＲＴ−ＰＣＲにより発現レベルを計量するために、細胞はＲＮＡ用に収穫された（図６のＢ）。値は平均値±標準偏差（１グループ当たりのｎ＝３）で、有意性の水準（＊＊＊Ｐ＜０．００１）を評価するために分散分析を行った。

〔ＭＳＣ球状体由来の細胞はインビボにおいて抗炎症効果を示す〕
炎症を誘発するようにＣ５７１３Ｌ／６マウスに１％のザイモサンを伴うＩＰを注入した。１５分後に付着単層由来の１．５×１０^６個ＭＳＣ（Ａｄｈ）及び懸滴由来の１．５×１０^６個のＭＳＣ（ＳＤＣ）を腹腔に投与した。２４時間後に右心室から血液が採取され、血清を分離するために凝固させた。炎症の状態の指標である、時間に依存する基質クロモザイムＰＬの４−ニトロアニリンへの分解（４０５ｎｍにおける吸光度）を測定することにより、血清のプラスミン活性を確認した。１分間の吸光度の差が、プラスミン活性（Ｕ／ｍｌ）を算定するのに用いられた。各群は、４〜６の動物により構成された。統計的有意性は、分散分析により決められた（図７）。

得られ結果は以下の通りである。高密度で懸滴中に懸濁されたｈＭＳＣは、集合して密集した多細胞球状体を形成する；間葉的な表面特性及び成長特性は維持され且つ／又は多細胞球状体由来のｈＭＳＣの大部分がそれらの特性を再獲得する；懸滴中で多細胞球状体として培養されたｈＭＳＣは、低い増殖率を示すが、生存率は高い；ｈＭＳＣ球状体由来の細胞は、付着皿上で培養されたＭＳＣよりも著しく小さいことは、ＳＤＣは血管系に注入された後に移動度が増大することを示唆している。ヒトの繊維芽細胞、癌細胞及び神経細胞前駆体が集合とは対照的に、ｈＭＳＣ球状体は、多数の抗炎症性遺伝子（例えばＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１、ＬＩＦ）及び抗腫瘍性遺伝子（例えばＩＬ−１１、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＬ−２４）の発現において活発な上方制御を示すことが観察された。ホーミング受容体ＣＸＣＲ４及び原始血管形成因子ＩＬ−８の著しい上方制御もＭＳＣ球状体限られている。ｈＭＳＣ球状体由来の細胞は、マウスのマクロファージから分泌されたＴＮＦ−αを減少させ、マウスの腹膜炎モデルにザイモサンによって誘発された炎症反応を弱毒化させることが観察された。特定の理論に拘束される必要もなく、ここに示された結果は、移植に先立って、ＭＳＣが、治療に有益な抗炎症性タンパク質、抗アポトーシスタンパク質、免疫調節性タンパク質及び抗腫瘍性タンパク質へと発現をするように、予め設定されるのに懸滴法が有用であることを示している。

〔ヒト間葉幹細胞の３次元多細胞球状体への集合はその抗炎症性特性を高める〕
最近の研究により、マウスの肺に閉じ込められたヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）が、心筋梗塞を快方に導く有効な抗炎症性分子、ＴＳＧ−６を分泌することが明らかになった。更に、懸滴培養では、ｈＭＳＣが３次元の球状体へと集合し、原始血管形成因子を分泌することも明らかになった。更に、我々は最近、抗炎症性特性に注目し、ｈＭＳＣが懸滴中又は低付着性皿上で迅速に集合して、ＴＳＧ−６の発現を増大させる球状体を形成するｈＭＳＣ球状体培養の詳細な研究を試みた。７２〜９６時間後に懸滴中のＴＳＧ−６の発現は頂点に達し、単層の１０００倍以上であったが、７２時間後には球状体由来の細胞の生存率は著しく低下した。球状体及び単層のマイクロアレイ分析により、球状体において抗炎症性分子及び細胞付着分子の発現が高くなる一方、細胞周期遺伝子の発現は下方制御されることが明らかになった。球状体中におけるＴＳＧ−６、ＬＩＦ及びＳＴＣ−１の発現は、即時ＲＴ−ＰＣＲにより確認された。タンパク質に特定されたＥＬＩＳＡを用いて、細胞当たりのこれら抗炎症性タンパク質の生成は、球状体中においては、単層培養と比較して著しく高められることが明らかになった。更に、我々は、単層ｈＭＳＣではなく、ｈＭＳＣ球状体が抗炎症性能力を有していることを示す、共存存培養系においてＬＰＳで刺激されたマクロファージによるｍＴＮＦ−αの分泌を著しく抑制することを明らかにした。更に、ｈＭＳＣ球状体は、腹膜炎のマウスモデルにおいては抗炎症性であった。以上をまとめると、我々は、化学的誘導なしに、ｈＭＳＣを懸滴中又は球状体として低付着皿上で培養することにより、ｈＭＳＣは多量の抗炎症性サイトカインを分泌するように活性化することができることを明らかにした。これらの結果は、ｈＭＳＣ球状体が、多くの疾患において抗炎症治療に使用できることを示唆している。

〔ｈＭＳＣは懸滴中又は非付着性表面上で成長すると急速に３次元の球状体へと集合する〕
ヒトＭＳＣは、通常の大人の提供者の腸骨稜から取出された１−４ｍｌの骨髄の吸引物から分離された。有核細胞は、密度勾配遠心分離法により分離されて、完全培地（ＣＣＭ：αーＭＥＭ、１７％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン）に再懸濁させた。有核細胞は１７５ｃｍ２の培養フラスコに塗布され、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養された。２４時間後に非付着細胞は廃棄された。付着細胞は約７０％集約的になるまで４〜１１日間培養され、０．２５％トリプシン及び１ｍＭＥＤＴＡにより５分間、３７℃で収穫され、５０細胞／ｃｍ^２の密度で培養フラスコの内部連結系（ｉｎｔｅｒｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）に再塗布される。細胞は７０％集約的になるまで７〜１２日間培養されて、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて収穫されて、継代Ｉ細胞として５％ＤＭＳＯ及び３０％ＦＢＳ中に凍結される。継代ＩＭＳＣ（提供者１又は２）の凍結バイアルは解凍されて、ＣＣＭ中の１４５ｃｍ^２の培養皿に塗付された。２４時間培養されてから付着細胞はトリプシン／ＥＴＤＡを用いて収穫され、１００細胞／ｃｍ^２の密度で塗付され、凍結前に７日間展開される。この研究においては、継代Ｉ又はＩＩの凍結ＭＳＣが回収され、収穫され且つ１００細胞／ｃｍ^２の密度になるように、種々のアッセイ用に７、８日間成長させる。画像用の球状体が生成されるように、培養皿の縁の３５μｍのＣＣＭ中に懸滴としてＭＳＣを塗付する（２５，０００細胞／滴）か、又は非付着表面にＭＳＣを塗付して（２００，０００細胞／ｍｌ）で３日間まで培養される。ｈＭＳＣは、懸滴又は非付着性表面において成長させると、急速に３次元の球状体に集合することが観察された（図８）。目盛は１００μｍである。

〔より小さな球状ｈＭＳＣが高い生存率を示す〕
二人の提供者からのＭＳＣを平板に単層として１００細胞／ｃｍ^２塗布し７、８日間成長させ収穫し（Ａｄｈ−Ｓｔ）、アネキシン（Ａｎｘ）及びヨウ化プロジウム（ＰＩ）用いて染色しＦＡＣＳにより生存率分析を行った。収穫された細胞は、付着皿に５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で塗付され（Ａｄｈ）、非付着皿に２００，０００細胞／ｍｌの密度で塗付され（Ｎｏｎ−ａｄｈ）また懸滴（Ｄｒｏｐ）として種々の濃度、１０，０００細胞／滴（１０ｋ）、２５，０００細胞／滴（２５ｋ）、１００，０００細胞／滴（１００ｋ）及び２５０，０００細胞／滴（２５０ｋ）に調整された。このように調整された細胞は、第３日に収穫されて生存率の分析を行った。単層培養の細胞（Ａｄｈ）及び２５ｋ球状体培養（２５ｋ Ｄｒｏｐ）の第１日（１ｄ）、第２日（２ｄ）、第３日（４ｄ）及び第４日（４ｄ）の生存率の分析も行った。より小さな球状ｈＭＳＣが高い生存率を示すことが観察された（図９−１、２）。

〔ｈＭＳＣ球状体は高水準の抗炎症性分子ＴＳＧ−６を発現する〕
二人の提供者からのＭＳＣを平板に単層として１００細胞／ｃｍ^２塗布し７、８日間成長させＲＮＡ用（Ａｄｈ−Ｓｔ）及び以後の培養用に収穫した。収穫した細胞は、付着皿に５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で塗付され（Ａｄｈ）、非付着皿に２００，０００細胞／ｍｌの密度で塗付され（Ｎｏｎ−ａｄｈ）また懸滴（Ｄｒｏｐ）として種々の濃度、１０，０００細胞／滴（１０ｋ）、２５，０００細胞／滴（２５ｋ）、１００，０００細胞／滴（１００ｋ）及び２５０，０００細胞／滴（２５０ｋ）に調整された。細胞はＲＮＡ用に、第１日（１ｄ）、第２日（２ｄ）、第３日（３ｄ）及び第４日（４ｄ）に収穫された。内生調節としての１８Ｓと共にＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いてＴＳＧ−６に対する即時ＲＴ−ＰＣＲが３回実行された。結果はＡｄｈ−Ｓｔ試料に対する相対量（ＲＱ）として図示されている（図１０）。図には、９５％の信頼範囲もＩ状の線で示されている。

〔細胞周期及び細胞骨格遺伝子の発現が下向きに調節されている間はｈＭＳＣ球状体は高水準の幾つかのサイトカイン及び細胞付着分子を発現する〕
二人の提供者からのＭＳＣを平板に単層として１００細胞／ｃｍ^２塗布し７日間成長させＲＮＡ用（Ａｄｈ−Ｓｔ）及び以後の培養用に収穫した。収穫した細胞は、付着皿に５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で塗付され（Ａｄｈ）、非付着皿に２００，０００細胞／ｍｌの密度で塗付され（Ｎｏｎ−ａｄｈ）また懸滴（Ｄｒｏｐ）として濃度、２５，０００細胞／滴（２５ｋ）に調整された。細胞はＲＮＡ用に、第３日（３ｄ）に収穫され、Ｗｈｏｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｓｅｎｓｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ａｓｓａｙを用いたマイクロアレイ用に調整された。標識付けされ且つ断片化された試料はＨｕｍａｎ Ｅｘｏｎ １．０ ＳＴアレイ上で雑種形成され、Ｐａｒｔｅｋ ＧｅｎｏｍｉｃｓＳｕｉｔｅ ６．４を用いて遺伝子水準が解析された。球状体中で上方制御した遺伝子並びに下方制御した遺伝子（２５ｋ−Ｄｒｏｐ ３ｄ）少なくとも２フォールドを単層の場合（Ａｄｈ−Ｓｔ及びＡｄｈ−３ｄ）と比較して、階層クラスタリングされた。上向き及び下方制御された遺伝子の最も重要な遺伝子群（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）の用語は図１１のヒートマップに隣接して示されている。

〔ｈＭＳＣ球状体は高水準の抗炎症性分子及び抗腫瘍性分子を発現する〕
幾つかの抗炎症性分子（ＴＳＧ−６，ＳＴＣ−１及びＬＩＦ）及び抗腫瘍性分子（ＩＬ−２４及びＴＲＡＩＬ）並びにＷｎｔシグナル阻害剤（ＤＫＫＩ）に対するマイクロアレイの結果は、即時ＲＴ−ＰＣＲを用いて確認された（図１２−１、２）。図の値は、１００細胞／ｃｍ^２の密度で付着皿に塗布し７日間成長させたＭＳＣ（Ａｄｈ Ｓｔ）に対する相対量（ＲＱ）で示した。１８Ｓを内生調節として用い、ＭＳＣを付着皿上で５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で３日間（Ａｄｈ ３ｄ）、非付着皿上で２００，０００細胞／ｍｌの濃度で３日間（Ｎｏｎ−ａｄｈ ３ｄ）並びに懸滴として２５，００細胞／滴の濃度で３日間（２５ｋ−Ｄｒｏｐ ３ｄ）成長させた。図には、３回繰り返した結果の９５％の信頼範囲もＩ状の線で示されている。

〔ｈＭＳＣ球状体は多量の抗炎症性サイトカインを分泌する〕
ＭＳＣを平板に単層として１００細胞／ｃｍ^２塗布し７日間成長させた。細胞は収穫され、付着皿上に５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で塗布し、また懸滴として２５，０００細胞／滴の密度で培養した。３日後に単層培養は収穫され、２００，０００細胞／１５ｍｌＣＣＭウェルの濃度で３つの付着皿に塗付した。３日間成長させた球状体を、８球状体／１５ｍｌＣＣＭウェルの濃度でそれぞれ３つの付着皿（２５ｋ−Ａｄｈ）並びに非付着皿（２５ｋ−Ｎｏｎ Ａｄｈ）に塗布した。２４時間後に、調整された培地が回収され、細胞物質が取除かれてＥＬＩＳＡに用いられた。全細胞タンパク質を測定して転移中のロスを把握するために、細胞は分解された。図１３には、ＣＣＭに起因する信号を差し引いた後分泌されたＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１又はＬＩＦの量（μｇ／ｍｌ）、又は細胞タンパク質当たり分泌されたＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１又はＬＩＦの量（μｇ）が示されている。図には、３回繰り返した結果の９５％の信頼範囲もＩ状の線で示されている。

〔ｈＭＳＣ球状体と共存培養した場合ＬＰＳに刺激されたマクロファージは少量のＴＮＦ−αを分泌する〕
マウスマクロファージ（ｍＭΦ）をトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、０．４μｍ）の上部チャンバに４００，０００細胞／ウェルの密度で塗付した。１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンで補強したＤＭＥＭ中の０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳにより、塗付された細胞を刺激した。９０分後にＬＰＳを取除き、新しい培地と置換え、ＭＳＣをトランスウェルの底部チャンバに２００，０００細胞／ウェル（Ａｄｈ）又は８球状体／ウェル（２５ｋ）の密度で塗付した。５時間後に、ＲＮＡ及びそれに続くＴＮＦ−αに対する即時ＲＴ−ＰＣＲのためにｍＭΦが収穫された。更に、調整されたＴＮＦ−αＥＬＩＳＡ用に収穫された（図１４）。図には、３回繰り返した結果の９５％の信頼範囲もＩ状の線で示されている。分散分析により有意水準を算定した。

〔ｈＭＳＣは腹膜炎のマウスモデルにおいて抗炎症効果を示す〕
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に１％のザイモサンを含む１ｍｌのＨＢＳＳを注射した。１５分後に、全体で１．５×１０^６個の単層ＭＳＣ（Ａｄｈ）又は６０個の球状体（２５ｋ）を含む１６０μｌのＨＢＳＳを腹腔内に注射した。２４時間後に右心室から血液が採集され血清が分離された。クロモザイムＰＬの分解反応により血清のプラスミン活性を測定した（図１５）。Ｉ状の線は、１群当たり４〜６個体の動物の標準偏差を示す。分散分析により有意水準を算定した。

本実施例から次のことが明らかとなった。ｈＭＳＣを懸滴内又は非付着皿上で成長させると、急速に球状体へと集合する；ｈＭＳＣ球状体は、高い生存率を示し、ｈＭＳＣ球状体を小さな球状体（２５ｋ）として３日間成長させるとＴＳＧ−６を発現する；ｈＭＳＣ球状体は、高水準の抗炎症性分子（ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１及びＬＩＦ）及び抗腫瘍性分子（ＩＬ−２４及びＴＲＡＩＬ）を発現し且つ高水準の抗炎症性タンパク質を分泌する；球状体は、インビトロの炎症アッセイにおいては抗炎症効果を示し且つマウスモデルの腹膜炎では抗炎症性である；これらの結果は、ｈＭＳＣ球状体が多くの疾患における抗炎症治療に有用であることを示唆している。

［素材及び方法］
＜ｈＭＳＣ細胞培養＞ 骨髄からの継代１のｈＭＳＣの凍結バイアルは、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （ｈｔｔｐ：／／Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｔａｍｈｓｃ．ｅｄｕ／ｉｒｍ／ｍｓｃ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ） から入手した。２４時間の回復後、ｈＭＳＣは低密度（１００細胞／ｃｍ^２）で播種され１７％のＦＢＳを含む完全培地（ＣＣＭ）において７０％の集約率になるまで７〜８日間培養した。同一条件下で３継代を経たｈＭＳＣのみがアッセイに使用される。

＜球状体の生成及び分離＞ ｈＭＳＣは、１０，０００〜２５０，０００個の細胞含まれるように、ＣＣＭを含んだ３５μｌの懸滴にｈＭＳＣを塗付し、４日間まで培養した。球状体由来の細胞を得るために、球状体はトリプシン／ＥＤＴＡと共に（球状体の大きさに応じて）５〜３０分間培養しながら、２〜３分毎にピペットで試料採取した。

＜ｈＭＳＣの静脈への注入及びＡｌｕ−ＰＣＲ法＞ オスのＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに１０^６の単層又は球状体由来のｈＭＳＣに静脈注射して、１５分後に組織を採集した。ゲノムＤＮＡが分離され、即時にＰＣＲを用いてヒトＡｌｕ及びＧＡＰＤＨ並びにマウスＧＡＰＤＨを測定して各組織中のヒトＤＮＡの相対量を決定した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．５， ｐｇｓ． ５４−６３ （２００９）； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌ．１１３， ｐｇｓ． ８１６−８２６ （２００９）； ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｖｏｌ．５， ｐｇｓ． ７−１８ （２００３））。

＜腹膜炎のマウスモデル及び炎症の測定＞ オスのＣ５７８Ｌ／６Ｊの腹腔に１．５×１０^６個の単層ｈＭＳＣ、１．５×１０^６個の球状体由来の細胞又は６０個の球状体の何れかを注射してから１５分後に、ザイモサン溶液を投与して腹腔に炎症を誘発させた。６時間後に腹腔洗滌により炎症浸出物を収集し、細胞の無い上澄み液を、全タンパク質、好中球活性度（分泌されたｍＭＰＯ）及び炎症誘発分子であるｍＴＮＦα、ｍＩＬ−１β、ｍＣＸＣＬ２／ＭＩＰ−２及びＰＧＥ２のレベルを測定した。細胞を注射してから２４時間後に、右心室から血液が収集され、血清からマウスのプラスミン活性度が測定された。

［結果］
＜懸滴内のｈＭＳＣの球状体への集合＞ 我々は懸滴プロトコルを用いてｈＭＳＣを集合させた。時間差顕微鏡により、懸滴中で培養したｈＭＳＣは最初に緩い網状組織、次いで多数の小さな集合を形成し、それらの集合が懸滴の下表面に沿って徐々に１つの中心球状体へと合体していくことが、時間差顕微鏡により明らかとなった（図１６−１のＡ）。一旦集合すると、球状体は、その大きさは増大せず、４８〜９６時間の間に徐々に緊密になっていった。断面をＨ＆Ｅ染色することにより、球状体は、中実であり小さな円形の細胞が均一に分散して基質に埋込まれていることが明らかとなった（図１６−１のＢ）。球状体の表面は、より細長く平らな上皮に似た細胞の層を有していた。予想通り、球状体の大きさは、懸滴中に懸濁されたｈＭＳＣの数に依存した（図１６−２のＥ）。高密度又は低密度の単層培養と比較して、全ての大きさのｈＭＳＣが、高水準の抗炎症性分子であるＴＳＧ−６を発現及び分泌したが、その内２５，０００細胞の球状体（Ｓｐｈ ２５ｋ）が最も高いＴＳＧ−６の発現及び分泌であった（図１６−２のＣ及びＤ）。更に、２５，０００の球状体は、時間の経過と共にＴＳＧ−６の発現が増大し且つ付着ｈＳＭＣの標準培養よりも常に高水準であった（図１６−２のＦ）。

＜球状体中のｈＭＳＣの生存率＞ 球状体中のｈＭＳＣは、栄養分に接近し難いので、細胞が生存可能であるかどうかを実証することに関心があった。ヨウ化プロジウム（ＰＩ）の摂取及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣで標識付けることにより、３日間培養した１０，０００又は２５，０００のｈＭＳＣの球状体から収穫した９０％に近い細胞が生存していることが確認された（図１７−１のＡ）。１００，０００又は２５０，０００ｈＭＳＣから調整した球状体において、アポトーシス細胞又は壊死細胞の数が大きかった（図１７−１のＡ）。また、培養期間を３日から４日に延長すると、アポトーシス細胞又は壊死細胞の数が僅かに増大した（図１７−２のＢ）。

＜インビトロでの球状体ｈＭＳＣの大きさの解析及び静脈注射後の相対的な組織分布＞ 細胞組織の記載（図１６−１のＢ）において示唆したように、球状体中のｈＭＳＣは、標準的な単層培養からのｈＭＳＣよりも小さく見えた。フローサイトメトリー（図１８のＡ）及び顕微鏡図（図１８のＢ）から明らかなように、トリプシン処理により球状体から放出された細胞は、付着培養由来のｈＭＳＣの径のほぼ半分であり、体積は１／４であった。

球状体から解離された小さなｈＭＳＣが肺の微小筋系を通過させて他の組織へ効率的に分配されるか否かの試験を行うため、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの尾の静脈に、単層ｈＭＳＣ及び球状体ｈＭＳＣを注射した。注入１５分後、即時のＰＣＲによる肺におけるヒトＡｌｕ配列は、捕獲された細胞の数が球状体由来のｈＭＳＣでは、単層ｈＭＳＣを用いた場合よりも約２５％少ないことを示唆した。同時に、注入された球状体ｈＭＳＣの大部分が肝臓、脾臓、腎臓及び心臓において回収されることが判った（図１８のＣ）。

＜球状体から解離されたｈＭＳＣは付着ｈＭＳＣの特性を保持する＞ 球状体から解離されたｈＭＳＣは、石灰化細胞及び脂肪細胞へと分化する能力を保持した（図１９−１のＡ、Ｂ）。ほぼ同じ集団倍加数において、初期の継代では解離された細胞は付着ｈＭＳＣより緩やかに展開し，次いで老化に達するまえの４継代を通して付着ｈＭＳＣよりもより迅速に展開した（図１９−１のＣ）。更に、解離された細胞は、クローン密度（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）に塗付されると簡単にコロニー（ＣＦＵ）を生成した（図１９−２のＤ）。増殖率のデータ（図１９の１９Ｃ）と同様に、球状体からのＣＦＵの数は、初期においては付着培養からのＣＦＵの数より少ないが、後の継代では多くなっている（図１９−２のＤ）。トリプシンを用いて同じ条件下（１０ｍｍ、３７℃）で解離された場合には、球状体から解離されたｈＭＳＣの表面エピトープは付着単層からのｈＭＳＣの表面エピトープと類似していた。解離された細胞は、細胞の小さいため、造血マーカに対しては陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対してはやや陽性であった（図１９−２のＥ）。

＜球状体ｈＭＳＣにおけるトランスクリプトーム変化＞ マイクロアレイ・アッセイを用いての観察により、球状体細胞は、付着単層からのｈＭＳＣとの比較において、２３６の遺伝子が上方制御され、２３０の遺伝子が下方制御されていることが明らかとなった（図２０のＡ）。ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ， ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ， ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ， ｃｅｌｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ， ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ 及びｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ に対する遺伝子群には増加があった（図２０のＡ）。また、ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｍｉｔｏｓｉｓ， ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ 及びｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ に対する遺伝子群には減少があった（図２０のＡ）。特に興味深いのは、ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｗｏｕｎｄｉｎｇ及びｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅに対する遺伝子群が増加していることであった（図２０のＡ）。即時ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、抗炎症性タンパク質／坑アポトーシス性タンパク質であるＴＳＧ−６、ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｅｉｎ−１（ＳＴＣ−１）；成長及び発生に対するサイトカインである白血病抑制因子（ＬＩＦ）；腫瘍抑制タンパク質であるＩＬ−２４；ある種の癌細胞を選択的に死滅させるタンパク質であるリガンド（ＴＲＡＩＬ）を含むＴＮＦ−αに関したアポトーシス及びＭＳＣホーミングに関与する受容体であるＣＸＣケモカイン受容子４（ＣＸＣＲ４）における発現に著しい増加があることが明らかになった（図２１−１のＡ）。ＭＳＣ増殖の賦活効果（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２７８， ｐｇｓ． ２８０６７−２８０７８ （２００３））から予想されたように、Ｗｎｔシグナルの阻害剤であるｄｉｃｋｋｏｐｆ １（ＤＫＫ１）の発現は減少した。

＜細胞表面タンパク質発現における変化及びｈＭＳＣにおける細胞周期分布＞ フローサイトメトリーによるアッセイにより、坑細胞接着タンパク質であるポドカルシキンの特徴を有するタンパク質（ＰＯＤＸＬ）及びリンパ球ホーミング関連するインテグリン・サブユニットであるα４−インテグリン（ＣＤ４９ｄ）の発現が減少することが明らかになった。内皮細胞及び周皮細胞のマーカとして用いる黒色腫細胞接着分子（ＭＣＡＭ又はＣＤ１４６）及び接着分子であるＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）には部分的に下方制御が認められた（図２０のＢ）。同時に、細胞接着用のインテグリン・サブユニット（ＣＤ４９ｂのα２−インテグリン）及び転移の抑制に関連するタンパク質（ＣＤ８２）には発現の増加が認められた（図２０の２０Ｂ）。マイクロアッセイの結果から予想されたように、フローサイトメトリーによる分析からも、単層ｈＭＳＣと比較してＳ期における球状体ｈＳＭＣの減少が明らかとなった。

＜球状体ｈＭＳＣは坑炎症性タンパク質を分泌する＞ 付着培養表面に塗布されたｈＭＳＣの球状体は、徐々に紡錘体形状の細胞を生成し、その細胞は球状体から離れていった（図２１−１のＢ）。非付着性表面に塗布した球状体には移動は見られなかった（図２１−１のＢ）。ＥＬＩＳＡによって、球状のｈＭＳＣ又は球状体から解離されたｈＭＳＣのいずれも、培養皿に２４時間塗布しておくと、ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１及びＬＩＦを分泌し続けることが明らかになった（図２１−２のＣ〜Ｅ）。いずれの分泌水準とも付着単層ｈＭＳＣの場合よりも遥かに高かった。付着（Ａｄｈ）又は非付着（Ｎｏｎ−ａｄｈ）のいずれの培養でもＳＴＣ−１及びＬＩＦの分泌量は同じ水準（図２１−２のＤ、Ｅ；ｐｇ／ｍｇ）であったが、非付着（Ｎｏｎ−ａｄｈ）皿上で培養された球状体は遥かに多量のＴＳＧ−６を分泌した（図２１−２のＣ；ｐｇ／μｇ）。ｈＭＳＣが球状体から解離されて付着平板上で培養した場合には、ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１及びＬＩＦの分泌量が減少した（図２１の２１Ｃ〜２１Ｅ；Ｓｐｈ ２５ｋ ＤＣ Ａｄｈ）が、付着性単層の場合よりは遥かに高い水準を保った（図２１−２のＣ〜Ｅ；Ａｄｈ Ｈｉｇｈ）。

＜球状体ｈＭＳＣはインビトロのマクロファージ活性並びにインビボの炎症活性を減少させる＞ 球状体ｈＭＳＣにより坑炎症性分子であるＴＳＧ−６及びＳＴＣ−１の分泌が増加することから、炎症性応答の減少において細胞の方がｈＭＳＣの付着単層培養よりもより効果的であることが示唆された。この示唆を検証するために、マウスのマクロファージがトランスウェルの上部チャンバにおいてＬＰＳで予備活性化され、テストウェルのチャンバに移送された（図２２−１のＡ）。実験条件下では、接着単層からのｈＭＳＣのテストウェルが在っても、刺激されたマクロファージによるＴＮＦαの発現又は分泌に対して有意な効果はなかった（図２２−１のＢ）。それに反して、無傷の球状体又は球状体から解離されたｈＭＳＣのテストウェル存在下では、ＴＮＦαの発現及び分泌は著しく減少した（図２２−１のＢ）。従って、これらの結果は、球状体由来のｈＳＭＣは、より効果的な坑炎症性因子を分泌することを明らかにした。

更に、ＳＴＣ−１も反応性酸素類又はＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）を減少させるので、ＳＴＣ−１の発現が増大することは重要である。ＲＯＳは、炎症及び高水準におけるアポトーシスの初期の引き金である。従って、ＳＴＣ−１は坑炎症性及び坑アポトーシス性である。

インビボにおいて球状体ｈＭＳＣの炎症に対する効果を検証するために、ザイモサン誘発腹膜炎のマウスモデルが用いられた（Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．４４７， ｐｇｓ． ８６９−８７４ （２００７））。単層、球状体又は球状体由来のｈＭＳＣを腹腔に投与して６時間後に、炎症性浸出物が収集され、炎症の水準を推定するのに用いられた。分泌されたミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）により分析の結果、ｈＭＳＣ球状体は、洗浄液のタンパク質の含有量及び容量、好球中活性度（図２２−２のＤ）、促炎症性分子であるＴＮＦα（図２２−２のＥ）、ＩＬ−１β、ＣＸＣＬ２／ＭＩＰ−２及びＰＧＥ_２（図２２−２のＥ）の水準を著しく減少させることが明らかなった。更に、ｈＳＭＣ球状体により、プラスミン活性度の血清の水準、ＴＳＧ−６により阻害されるプロテアーゼに関連した炎症（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， Ｖｏｌ．１５， ｐｇｓ．１２９−１４６ （２００４））は著しく減少させられることが明らかとなった（図２２−２のＦ）。血清プラスミン活性度は、ほぼ、球状体を注射してから２４時間後の非炎症性対照動物の水準まで減少することが明らかとなった（図２２−２のＦ）。無傷の球状体ほどではないが、球状体由来のｈＭＳＣは、検証に用いられた炎症性マーカの水準をかなり減少させることが明らかとなった（図２２の２２Ｃ−２２Ｆ）。更に、炎症の阻害においては、ｈＭＳＣ球状体は接着単層ｈＭＳＣよりも遥かに効果的であった（図２２−１のＣ、図２２−２のＤ〜Ｆ）。

［考察］
ｈＭＳＣは、付着単層培養として伝統的な方法で分離、展開されていたが、マイクロペッレット又は大きな集合形成するのに、細胞の遠心分離が、数週間に渉って起こる軟骨形成の分化を大いに促進することが認められた（Ａｒｕｆｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．１４８， ｐｇｓ．１４５−１５５ （２００９）； Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．２３８， ｐｇｓ．２６５−２７２ （１９９８））。しかしながら、最近の幾つかの発表では、内皮細胞への付着又はＩＬ−２４の付着を促進するＣＸＣＲ４のような、増大した遺伝子の発現により、短時間の３次元又は球状体としてのＭＳＣ培養の治療潜在能力が改善されることが明らかになった（Ｐｏｔｏｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２８３， ｐｇｓ．１３１００−１３１０７ （２００８）； Ｆｒｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌ．１６， Ｎｏ．４， ｐｇｓ．７３５−７４９ （２０１０）； Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｖｏｌ．２７， ｐｇｓ．７２４−７３２ （２００９））。ここで述べた実験は、ｈＭＳＣが静脈に注入された後に肺において、心筋梗塞のマウスにおいて有益な効果を発揮する抗炎症性タンパク質であるＴＳＧ−６を最大に発現するように球状体としてのｈＭＳＣを調整するために設定されたものであった（Ｌｅｅ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ２００９）。

この結果、球状体として培養されたｈＭＳＣの特性は、実験条件に大きく依存することが明らかになった。懸滴内では、細胞は最初にネットワークを形成してから大部分の細胞が単一の球状体へと集合した。径が約５００μｍの球状体を３日間培養して、ＴＳＧ−６の発現の最適な水準が観察された。発現の水準は高く保たれるが、球状体が大きいほどその水準が低く、球状体が大きいほど、より多くの細胞が枯死（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）又は壊死（ｎｅｃｒｏｔｉｃ）した。また、培養時間が長いほど、より多くの細胞が枯死又は壊死した。球状体中の細胞は、付着培養からのｈＭＳＣの表面エピトープの大部分を保持していた。球状体から解離されたｈＭＳＣも石灰化細胞と脂肪細胞に分化する潜在能力を保持していた。１継代を経た後は、このｈＭＳＣも、付着単層培養からのｈＭＳＣと同様の速度で展開した。更に、球状体から解離されたｈＭＳＣは、高いクローン形成能を維持した。

大きな球状体（Ｐｏｔｏｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｖｏｌ．２５， ｐｇｓ． １７６１−１７６８ （２００７））及び３次元培養のｈＭＳＣ（Ｆｒｉｔｈ、２０１０）で観察されたように、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた調査により、付着培養からのｈＭＳＣと比べてトランスクリプトームにおいて著しい差異があることが明らかになった。定量分析により、重要な差異の幾つかが確認された。予想されたように、抗細胞接着タンパク質ＰＯＤＸＬ（Ｌｅｅ， Ｂｌｏｏｄ， ２００９）が著しく減少し、細胞周期に減少が在った。差異の幾つかは、ｈＭＳＣの治療への使用の可能性の示唆していることは、特に留意すべきことであった。抗炎症性タンパク質ＴＳＧ−６の発現の水準は、ｈＭＳＣの予備培養で観察されたＴＮＦα（Ｌｅｅ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００９）よりも高かった。抗炎症性並びに抗アポトーシスタンパク質ＳＴＣ−１の発現の水準も高かった（Ｂｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｖｏｌ．２７， ｐｇｓ．６７０−６８１ （２００９）； Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｏｌ． Ｖｏｌ．１７４， ｐｇｓ．１３６８−１３７８ （２００９））。細胞が球状体から解離されてから少なくとも１日間は、ＴＳＧ−６とＳＴＣ−１の双方の発現は高い水準を保った。従って、この結果は、炎症性反合を調節するのに、球状体及び球状体由来のｈＭＳＣは、付着培養からのｈＭＳＣよりも遥かに効果的であることを示唆している。このことは、球状体及び球状体由来のｈＭＳＣは、ＬＰＳに刺激された培養マクロファージによるＴＮＦαの生成を抑制するのに、より効果的であるとの実証により確認された。更に、インビボのザイモサンに誘発された腹膜炎に対しては、球状体及び球状体由来のｈＭＳＣが炎症を抑制するのにより効果的であった。以前に、スピナーフラスコ及び回転壁容器バイオリアクターを用いて調整した３次元培養のｈＭＳＣを用いた観察（Ｆｒｉｔｈ， ２０１０）において、球状体ｈＳＭＣが、腫瘍抑制タンパク質ＩＬ−２４に対して、高水準のトランスクリプトを発現したことは特に興味深い。更に、ＴＳＧ−６を発現するように最適化して調整した球状体ＭＳＣも、ある種の癌細胞の死滅に効果的なＴＲＡＩＬに対して（Ｍａｈｍｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． Ｖｏｌ．３１６， ｐｇｓ．８８７−８９９ （２０１０）； Ｍｅｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ． Ｖｏｌ．３１， ｐｇｓ．９３−１１２ （２０１０））並びにある種の転移を抑制するＣＤ８２に対して（Ｓｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ， Ｖｏｌ．９， ｐｇｓ．２５３−２６４ （２００９））高水準のトランスクリプトを発現した。臨床試験において、細胞の表面に発現されたＴＲＡＩＬは、癌細胞を死滅させるのに、可溶性のタンパク質よりも遥かに効果的であったので、球状体由来のｈＭＳＣの表面にＴＲＡＩＬの発現が増大することは重要である。従って、球状体及び球状体由来のｈＭＳＣは、ある種の癌への補助治療、特にアスピリン又はステロイドのような抗炎症性薬剤に敏感な癌の治療に特に効果的であると思われる（Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ，１４０， ｐｇｓ．８８３−８８９ （２０１０））。更に、球状体ｈＭＳＣは、付着培養からのｈＭＳＣの容積の１／４よりも小さいとの利点がある。そのため、静脈注射後、極めて少量が肺に捕捉され、大部分は種々の組織内に見出された（Ｌｅｅ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ２００９； Ｌｅｅ， Ｂｌｏｏｄ， ２００９）。

ｈＭＳＣにおける抗炎症性及び抗腫瘍性遺伝子の発現を増大させる分子力が球状体へと集合させることは、興味をそそるが、明確ではない。球状体中の細胞は、互いに密接に会合し、単に一部の細胞が他の細胞と接触して、互いに確実に連絡を保つには多量の分子の分泌を必要とする単層培養中よりも、遥かに簡単にシグナルを出し合っていると思われる。球状体を形成するようなｈＭＳＣにおける変化は、懸滴の非付着培養条件、高い培養密度、養分欠乏、気−液界面及び微小重力の結果であると思われる。ｈＭＳＣが球状体へと集合する際のｈＭＳＣの変化をより深く理解するには、上記条件及び考えられる他の要因の詳細な検討を行う必要がある。

上述の結果から、ｈＭＳＣが懸滴内おいて非化学的に活性化されて、多量の抗炎症性タンパク質を分泌し且つ抗腫瘍性分子を発現することが明らかとなった。従って、ｈＭＳＣは、多くの治療に適用できると思われる。更に、球状体から解離されたｈＭＳＣは、極めて小さな活性化された細胞を提供するので、静脈への投与に好都合である。

ヒト間葉幹細胞の球状体を、１７％ＦＢＳを伴うα−ＭＥＭ、ヒト血清アルブミン（ＨｕＳＡ）を含む完全培地（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ培地（Ｓｔｐｒｏ）（Ｇｉｂｅｏ）、又はＭｅｓｅｎｃｕｌｔ Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又はＭｅｓにおいて培養した。３日後に、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて球状体を解離してからジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で凍結した。次いで、細胞を解凍しフローサイトメトリーにより、ＰＩ摂取及び細胞表面のアネキシンＶ−ＦＩＴＣの標識を測定して細胞の生存率を決定した。標識の無い細胞を生存していると見なした。図２３に示すように、ヒト間葉幹細胞の球状体培養は、培地が異なっても細胞の生存率に影響を及ぼさなかった。

ヒト間葉幹細胞の球状体を、実施例４において述べたように、完全培地又は商業的に入手可能な種々の Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ培地において３日間培養した。トリプシン／ＥＤＴＡを用いて球状体を解離してからジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で凍結した。最短で１週間後、細胞を解凍して、死滅した細胞を分析の対象から除外するために、染料カルサインＡＭ及び７ＡＡＤで標識を付した。フローサイトメトリーにより決定された生存細胞の線状に散乱した分布の代表例を図２４に示した。細胞の大きさは、細胞の前方散乱を既知の径（３、７、１５及び２５μｍ）を有するビーズと比較して、細胞の大きさを決定した。分布図には、対応する大きさの位置を縦線（Ｉ＝０、Ｊ＝３、Ｋ＝７、Ｌ＝１５、Ｍ＝２５μｍ）で示した。図２４に示されるように、完全培地（ＣＣＭ）に見られるウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含まない培地において球状体が培養されると、大きな前方散乱光（ＦＳ Ｌｉｎ）で示されるように、球状体から解離された間葉幹細胞はより大きくなる。

ヒト間葉幹細胞の球状体を、実施例４において述べたように、完全培地又は商業的に入手可能な種々の Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ培地において３日間培養した。抗炎症性タンパク質ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１をコード化している遺伝子及び増殖分化因子１５（ＧＤＦ−１５）の発現を即時ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。分析結果は、Ａｈｈ Ｌｏｗとの相対値±標準偏差（ｎ＝３）である。

図２５に示すように、球状体をウシ胎仔血清が含まれない培地において培養すると、治療タンパク質ＴＳＧ−６，ＳＴＣ−１及びＧＤＦ−１５は発現されないが、ヒトの血清アルブミン（ＨｕＳＡ）を添加するとそれらタンパク質の発現が増大した。

ヒト間葉幹細胞の球状体を、実施例４において述べたように、商業的に入手可能な種々の Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ培地において３日間培養した。球状体により調整された培地（ＣＭ）が収集されて１／５０に希釈されてから、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳが存在するマウスのマクロファージに添加された。比較用にＬＰＳを用いて培養したマクロファージ（ｓＭＯ）又はＬＰＳを用いない培養（ＭＯ）を用意した。１８時間後にマクロファージ培地は収穫され、ＥＬＩＳＡによりｍＴＮＦαが分析された。分析値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。

図２６の右側６つの棒グラフが示すように、ウシ胎仔血清が含まれる培地（例えばＣＣＭ）において球状体により調整された培地（ＣＭ）は、ＴＮＦαの生成を抑制するのに著しく効果的であった。他の球状体により調整された培地はＴＮＦαの抑制に効果的であるが、その程度が低く、変化程度が大きかった。

ここに引用したそれぞれの特許、特許出願及び出版物の開示は全体として、参考文献に組込んだ。

本発明は、特定の実施例に関連して開示したが、発明の真の精神及び範囲を逸脱することなく、他の実施例及び本発明の変形が、この技術分野に知識を有する他者により考案されることは明らかである。添付した請求項には、そのような実施例及びその変形も含まれるものと解釈する。従って、記載したように発明が実施されなくても、発明は添付した請求項の範囲内である。

Claims (36)

1. 球状集合体中の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞であって、
   前記間葉幹細胞は、単層として培養された間葉幹細胞と比較して、少なくとも１つの治療タンパク質の発現量が増大することを特徴とする間葉幹細胞。
2. 前記タンパク質は、抗炎症性タンパク質、抗アポトーシスタンパク質、細胞の成長及び発生を調節するタンパク質、免疫応答を調節するタンパク質、造血を調節するタンパク質、腫瘍の成長を阻害、防止又は破壊するタンパク質、細胞のホーミングを調節するタンパク質、細胞接着及び細胞シグナルに関与するタンパク質、血管形成を増進させるタンパク質並びに前記タンパク質の組合せから成る群から選択されたタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の間葉幹細胞。
3. 前記タンパク質は、抗炎症性タンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の間葉幹細胞。
4. 前記タンパク質は、ＴＳＧ−６であることを特徴とする請求項３に記載の間葉幹細胞。
5. 前記タンパク質は、抗アポトーシスタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の間葉幹細胞。
6. 前記タンパク質は、ＳＴＣ−１であることを特徴とする請求項５に記載の間葉幹細胞。
7. 前記タンパク質は、細胞の成長及び発生を調節するタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の間葉幹細胞。
8. 前記タンパク質は、ＬＩＦであることを特徴とする請求項７に記載の間葉幹細胞。
9. 前記タンパク質は、造血を調節するタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の間葉幹細胞。
10. 前記タンパク質は、ＩＬ−１１であることを特徴とする請求項９に記載の間葉幹細胞。
11. 前記タンパク質は、腫瘍の成長を阻害、防止又は破壊するタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の間葉幹細胞。
12. 前記タンパク質は、リガンドを誘発するアポトーシスに関するＴＮＦ−αであることを特徴とする請求項１１に記載の間葉幹細胞。
13. 前記タンパク質は、ＩＬ−２４であることを特徴とする請求項１１に記載の間葉幹細胞。
14. 前記タンパク質は、ＣＤ８２であることを特徴とする請求項１１に記載の間葉幹細胞。
15. 前記タンパク質は、細胞のホーミングを調節するタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の間葉幹細胞。
16. 前記タンパク質は、ＣＸＣＲ４であることを特徴とする請求項１５に記載の間葉幹細胞。
17. 前記タンパク質は、細胞接着及び細胞シグナルに関与するタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の間葉幹細胞。
18. 前記タンパク質は、ＩＴＧＡ２であることを特徴とする請求項１７に記載の間葉幹細胞。
19. 前記タンパク質は、血管形成を増進させるタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の間葉幹細胞。
20. 前記タンパク質は、ＩＬ−８であることを特徴とする請求項１９に記載の間葉幹細胞。
21. 患者の炎症を治療する方法であって、
    球状集合体中の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞を投与する段階を含み、
    前記間葉幹細胞は、単層として培養された間葉幹細胞と比較して、抗炎症性タンパク質の発現量を増大させ、
    前記患者の炎症の治療に効果的な量の間葉幹細胞を投与することを特徴とする方法。
22. 前記抗炎症性タンパク質は、ＴＳＧ−６であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 患者の腫瘍を治療する方法であって、
    球状集合体中の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞を投与する段階を含み、
    前記間葉幹細胞は、単層として培養された間葉幹細胞と比較して、腫瘍の成長を阻害、防止又は破壊するタンパク質の発現量を増大させ、
    前記患者の腫瘍を腫瘍の成長を阻害、防止又は破壊するのに効果的な量の間葉幹細胞を投与することを特徴とする方法。
24. 前記腫瘍の成長を阻害、防止又は破壊するタンパク質は、リガンドを誘発するアポトーシスに関するＴＮＦ−αであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
25. 前記腫瘍の成長を阻害、防止又は破壊するタンパク質は、ＩＬ−２４であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
26. 患者の免疫応答を調節する方法であって、
    球状集合体中の間葉幹細胞又は球状集合体から得られた間葉幹細胞を投与する段階を含み、
    前記間葉幹細胞は、単層として培養された間葉幹細胞と比較して、免疫応答を調節するタンパク質の発現量を増大させ、
    前記患者の免疫応答を調節するのに効果的な量の間葉幹細胞を投与することを特徴とする方法。
27. 間葉幹細胞の球状集合体を生成する方法であって、
    前記間葉幹細胞が、ウシ胎仔血清及びウマ血清から成る群から選択された血清を含む培地において培養される工程を含むことを特徴とする方法。
28. 前記血清は、ウシ胎仔血清であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
29. 前記培地中に、２０％の量までの前記ウシ胎仔血清が存在することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
30. 前記培地中に、１７％の量の前記ウシ胎仔血清が存在することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
31. 前記間葉幹細胞は、間葉幹細胞の懸滴としての培地中で培養されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
32. 前記間葉幹細胞の懸滴には、１０，０００〜５００，０００個の細胞が含まれていることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
33. 前記間葉幹細胞の懸滴には、１０，０００〜２５０，０００個の細胞が含まれていることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
34. 前記間葉幹細胞の懸滴には、１０，０００〜２５，０００個の細胞が含まれていることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
35. 前記間葉幹細胞の懸滴には、２５，０００個の細胞が含まれていることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
36. 動物中に治療効果を提供する方法であって、
    間葉幹細胞の球状集合体を培養した培地含む組成を動物に投与する段階を含み、
    前記培地は動物に治療効果を与えるのに効果的な量であることを特徴とする方法。

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