CN112805268A - 用于促进旁分泌因子的产生的培养基添加试剂 - Google Patents

用于促进旁分泌因子的产生的培养基添加试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂，其包含下述式(I)表示的化合物或其盐。式(I)中，各符号如说明书中所定义。

Description

用于促进旁分泌因子的产生的培养基添加试剂
技术领域
本发明涉及用于促进旁分泌因子的产生的培养基添加试剂、添加了该培养基添加试剂的培养基及使用了该培养基的促进了旁分泌因子产生的细胞的制造方法。另外，本发明涉及包含通过该细胞的制造方法制造的细胞的、炎症性疾病或缺血性疾病的治疗剂及移植用组合物。此外，本发明涉及旁分泌因子的制造方法，其包括在添加了该培养基添加试剂的培养基中培养细胞。
背景技术
近年来，利用了生物体的细胞或者组织的医药品的开发、再生医疗的研究有所进展而受到瞩目。尤其是使用了ES细胞、iPS细胞等多能干细胞的器官再生技术的研究持续加速。另一方面，利用间充质干细胞(以下有时称为“MSC”)、骨髓干细胞等成体干细胞的细胞疗法是利用成体干细胞的原有功能(修复因疾病而受到损伤的组织)的方法，在再生医疗之中也作为实现性更高的方法而受到瞩目并推进了研究。
关于MSC移植治疗的机理，推测有多种作用机制，如非专利文献1、非专利文献2中所示，移植的MSC所具有的旁分泌效应使得生物体内的修复功能亢进的机制是已知的。作为显示治疗效果的MSC的旁分泌效应，可举出由细胞因子、生长因子等旁分泌因子的分泌带来的血管新生作用、抗炎症作用等。
另外，近年来，明确了在单层培养体系的细胞与生物体内组织的细胞之间，各种性质、刺激响应性、细胞功能等存在差异，较之形成单层结构的单层培养而言，形成接近生物体内组织结构的3D结构的3D培养、尤其是球形(spheroid)培养的需求正在扩大。
关于MSC，也有通过球形培养使得旁分泌效应增强的报道。非专利文献3中记载了对于球形培养得到的MSC而言，作为抗炎症蛋白质的肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(TNF alphainduced protein 6)(以下为TSG-6)、斯钙素1(以下为STC-1)的分泌增加。另外，非专利文献4中记载了在球形培养得到的MSC中，作为促进血管新生的蛋白质的VEGF(血管内皮生长因子)、FGF-2(成纤维细胞生长因子2，Fibroblast growth factors-2)的产生量增加，并且将MSC球状体移植至小鼠的缺血肢后，促进血管新生，坏死得到了改善。
面向MSC球状体的移植疗法，为了制作具有更高的治疗效果的球状体而开发了各种培养方法。专利文献1中记载了通过使用生物亲和性高分子嵌段使MSC形成球状体，从而抗炎症蛋白质等的分泌量增加，炎症疾病得到了改善。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2017/221879号
非专利文献
非专利文献1：Gnecchi M等，Circ Res.2008Nov21；103(11):1204-19.
非专利文献2：Madrigal M等，J Transl Med.2014Oct 11；12:260.
非专利文献3：Bartosh TJ等，Proc Natl Acad Sci U S A.2010Aug3；107(31):13724-9.
非专利文献4：Bhang SH等，Tissue Eng Part A.2012Oct；18(19-20):2138-47.
发明内容
发明所要解决的课题
以上述MSC的例子为代表，利用了细胞的旁分泌效应的疾病的治疗方法会是非常有效的。然而，专利文献1中教导的方法中，需要将生物亲和性高分子嵌段与MSC形成球状体，要求繁杂的操作。另外，非专利文献1或2中教导的方法中，旁分泌因子的产生量不能说是充分的，等等，现有技术中应解决的课题也很多。因此，本发明的目的为提供简便且有效地促进细胞的旁分泌因子的产生量的手段。另外，本发明的目的为提供利用了使用该手段制造的、旁分泌因子的产生得到促进的细胞的新型治疗手段。
用于解决课题的手段
本申请的发明人针对上述课题进行了锐意研究，结果发现，特定的化合物能促进细胞的旁分泌因子的产生，并基于该见解进一步进行研究，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。
[1]用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂，其包含下述式(I)表示的化合物或其盐：
[化学式1]
Figure BDA0002994180810000031
{式(I)中，X为-NHCO-，R1为-Y-NH-Z-Ar(式中，Y及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，Ar为可具有取代基的芳基或杂芳基。)，R2为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R3为羟基，n为0、1或2的整数。}。
[2]如[1]所述的试剂，其中，
R2为甲基、乙基、或异丁基，
n为0，
Ar为可被羟基或甲基取代的苯基，
Y为可被甲基或乙基取代的亚甲基。
[3]如[1]或[2]所述的试剂，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，
[化学式2]
Figure BDA0002994180810000041
[化学式3]
Figure BDA0002994180810000042
[化学式4]
Figure BDA0002994180810000043
以及
[化学式5]
Figure BDA0002994180810000044
[4]如[1]所述的试剂，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式6]
Figure BDA0002994180810000045
[5]如[1]所述的试剂，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式7]
Figure BDA0002994180810000051
或者
[化学式8]
Figure BDA0002994180810000052
[6]如[1]～[5]中任一项所述的试剂，其中，旁分泌因子为选自由抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质组成的组中的至少1种蛋白质。
[7]如[6]所述的试剂，其中，抗炎症蛋白质为选自由TNF刺激基因6蛋白(TSG-6)及斯钙素1(STC-1)组成的组中的至少1种蛋白质。
[8]如[6]所述的试剂，其中，促进血管新生的蛋白质为选自由血管生成素(ANG)、表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、上皮来源的中性粒细胞活化肽78(ENA-78)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(Tissueinhibitors of matrix metalloproteinase)(TIMP)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)组成的组中的至少1种蛋白质。
[9]如[1]～[8]中任一项所述的试剂，其中，细胞为间充质干细胞。
[10]细胞培养用培养基，其包含[1]～[9]中任一项所述的试剂。
[11]旁分泌因子的产生得到促进的细胞的制造方法，其包括在包含下述式(I)表示的化合物或其盐的培养基中培养细胞：
[化学式9]
Figure BDA0002994180810000061
{式(I)中，X为-NHCO-，R1为-Y-NH-Z-Ar(式中，Y及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，Ar为可具有取代基的芳基或杂芳基。)，R2为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基、R3为羟基，n为0、1或2的整数。}。
[12]如[11]所述的方法，其中，
R2为甲基、乙基、或异丁基，
n为0，
Ar为可被羟基或甲基取代的苯基，
Y为可被甲基或乙基取代的亚甲基。
[13]如[11]或[12]所述的方法，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，
[化学式10]
Figure BDA0002994180810000062
[化学式11]
Figure BDA0002994180810000063
[化学式12]
Figure BDA0002994180810000071
以及
[化学式13]
Figure BDA0002994180810000072
[14]如[11]所述的方法，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式14]
Figure BDA0002994180810000073
[15]如[11]所述的方法，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式15]
Figure BDA0002994180810000074
或者
[化学式16]
Figure BDA0002994180810000081
[16]如[11]～[15]中任一项所述的方法，其中，旁分泌因子为选自由抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质组成的组中的至少1种蛋白质。
[17]如[16]所述的方法，其中，抗炎症蛋白质为选自由TNF刺激基因6蛋白(TSG-6)及斯钙素1(STC-1)组成的组中的至少1种蛋白质。
[18]如[16]所述的方法，其中，促进血管新生的蛋白质为选自由血管生成素(ANG)、表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、上皮来源的中性粒细胞活化肽78(ENA-78)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)组成的组中的至少1种蛋白质。
[19]如[11]～[18]中任一项所述的方法，其中，细胞为间充质干细胞。
[20]如[11]～[19]中任一项所述的方法，其中，培养通过三维培养进行。
[21]活体移植用组合物，其包含通过[11]～[20]中任一项所述的方法制造的细胞。
[22]炎症性疾病或缺血性疾病的治疗用组合物，其包含通过[19]或[20]所述的方法制造的细胞。
[23]如[22]所述的治疗用组合物，其中，炎症性疾病选自由炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肾炎、急性肾炎、慢性肾炎、肾小球肾炎、IgA肾病、糖尿病性肾病、膜性肾病、肾积水、造影剂肾病、肾盂肾炎、肾功能不全、间质性肾炎、肾损伤、肾病综合征、高血压性肾硬化症、糖尿病性肾小球硬化症、肾结石、淀粉样肾、肾静脉血栓症、Alport综合征、肝炎、肝硬化、胰腺炎、肺炎、鼻窦炎、鼻炎、关节炎、变形性膝关节病、变形性手关节病、变形性足关节病、变形性股关节病、类风湿性关节炎、周期性发热、口疮性口炎、咽炎、淋巴结炎综合征、成人斯蒂尔病、白塞病、痛风、假性痛风、Schnitzler综合征、慢性复发性多病灶性骨髓炎、冷卟啉相关周期热综合征、家族性寒冷性荨麻疹、Muckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤关节炎综合征、新生儿期发病的多系统炎性疾病、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期性综合征、高IgD综合征、Blau综合征、早发性结节病、家族性地中海热、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病、痤疮、中条-西村综合征、Majeed综合征、NLRP12相关周期热综合征、白细胞介素1受体拮抗剂缺乏症、白细胞介素36受体拮抗剂缺乏症、磷酯酶Cγ2相关抗体缺陷·免疫失调症(phospholipase Cγ2associated antibody deficiency and immunedysregulation)、HOIL-1缺损症、SLC29A3缺损症、CARD14异常症、腺苷脱氨酶2缺乏症、STING相关婴儿期发病血管病变(STING-Associated Vasculopathy with Onset inInfancy)、及NLRC4异常症组成的组。
[24]如[20]所述的治疗用组合物，其中，缺血性疾病选自由心绞痛、心肌梗塞、应激性心肌病、中枢性肺水肿、脑梗塞、缺血性脑中风、闭塞性动脉硬化症、及严重下肢缺血组成的组。
[25]旁分泌因子的制造方法，其包括以下的工序：
工序(1)，在[10]所述的培养基中培养细胞；以及
工序(2)，回收(1)中使用的培养基的上清液。
[26]如[25]所述的方法，其中，细胞为间充质干细胞。
[27]如[25]或[26]所述的方法，其中，旁分泌因子为选自由抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质组成的组中的至少1种蛋白质。
另外，一个方式中，本发明如下所述：
[1’]用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂，其包含下述式(I)表示的化合物或其盐：
[化学式17]
Figure BDA0002994180810000101
{式(I)中，X为-NHCO-，R1为-Y-NH-Z-Ar(式中，Y及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，Ar为可具有取代基的芳基。)，R2为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R3为羟基，n为0、1或2的整数。}。
[2’]如[1’]所述的试剂，其中，
R2为甲基、乙基、或异丁基，
n为0，
Ar为可被羟基或甲基取代的苯基，
Y为可被甲基或乙基取代的亚甲基。
[3’]如[1’]或[2’]所述的试剂，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，
[化学式18]
Figure BDA0002994180810000102
以及
[化学式19]
Figure BDA0002994180810000103
[4’]如[1’]所述的试剂，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式20]
Figure BDA0002994180810000111
[5’]如[1’]～[4’]中任一项所述的试剂，其中，旁分泌因子为选自由抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质组成的组中的至少1种蛋白质。
[6’]如[5’]所述的试剂，其中，抗炎症蛋白质为选自由TNF刺激基因6蛋白(TSG-6)及斯钙素1(STC-1)组成的组中的至少1种蛋白质。
[7’]如[5’]所述的试剂，其中，促进血管新生的蛋白质为选自由血管生成素(ANG)、表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、上皮来源的中性粒细胞活化肽78(ENA-78)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)组成的组中的至少1种蛋白质。
[8’]如[1’]～[7’]中任一项所述的试剂，其中，细胞为间充质干细胞。
[9’]细胞培养用培养基，其包含[1’]～[8’]中任一项所述的试剂。
[10’]旁分泌因子的产生得到促进的细胞的制造方法，其包括在包含下述式(I)表示的化合物或其盐的培养基中培养细胞：
[化学式21]
Figure BDA0002994180810000121
{式(I)中，X为-NHCO-，R1为-Y-NH-Z-Ar(式中，Y及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，Ar为可具有取代基的芳基。)，R2为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R3为羟基，n为0、1或2的整数。}。
[11’]如[10’]所述的方法，其中，
R2为甲基、乙基、或异丁基，
n为0，
Ar为可被羟基或甲基取代的苯基，
Y为可被甲基或乙基取代的亚甲基。
[12’]如[10’]或[11’]所述的方法，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，
[化学式22]
Figure BDA0002994180810000122
以及
[化学式23]
Figure BDA0002994180810000123
[13’]如[10’]所述的方法，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式24]
Figure BDA0002994180810000131
[14’]如[10’]～[13’]中任一项所述的方法，其中，旁分泌因子为选自由抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质组成的组中的至少1种蛋白质。
[15’]如[14’]所述的方法，其中，抗炎症蛋白质为选自由TNF刺激基因6蛋白(TSG-6)及斯钙素1(STC-1)组成的组中的至少1种蛋白质。
[16’]如[14’]所述的方法，其中，促进血管新生的蛋白质为选自由血管生成素(ANG)、表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、上皮来源的中性粒细胞活化肽78(ENA-78)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)组成的组中的至少1种蛋白质。
[17’]如[10’]～[16’]中任一项所述的方法，其中，细胞为间充质干细胞。
[18’]如[10’]～[17’]中任一项所述的方法，其中，培养通过三维培养进行。
[19’]活体移植用组合物，其包含通过[10’]～[18’]中任一项所述的方法制造的细胞。
[20’]炎症性疾病或缺血性疾病的治疗用组合物，其包含通过[17’]或[18’]所述的方法制造的细胞。
[21’]如[20’]所述的治疗用组合物，其中，炎症性疾病选自由炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肾炎、急性肾炎、慢性肾炎、肾小球肾炎、IgA肾病、糖尿病性肾病、膜性肾病、肾积水、造影剂肾病、肾盂肾炎、肾功能不全、间质性肾炎、肾损伤、肾病综合征、高血压性肾硬化症、糖尿病性肾小球硬化症、肾结石、淀粉样肾、肾静脉血栓症、Alport综合征、肝炎、肝硬化、胰腺炎、肺炎、鼻窦炎、鼻炎、关节炎、变形性膝关节病、变形性手关节病、变形性足关节病、变形性股关节病、类风湿性关节炎、周期性发热、口疮性口炎、咽炎、淋巴结炎综合征、成人斯蒂尔病、白塞病、痛风、假性痛风、Schnitzler综合征、慢性复发性多病灶性骨髓炎、冷卟啉相关周期热综合征、家族性寒冷性荨麻疹、Muckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤关节综合征、新生儿期发病的多系统炎性疾病、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期性综合征、高IgD综合征、Blau综合征、早发性结节病、家族性地中海热、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病、痤疮、中条-西村综合征、Majeed综合征、NLRP12相关周期热综合征、白细胞介素1受体拮抗剂缺乏症、白细胞介素36受体拮抗剂缺乏症、磷酯酶Cγ2相关抗体缺陷·免疫失调症、HOIL-1缺损症、SLC29A3缺损症、CARD14异常症、腺苷脱氨酶2缺乏症、STING相关婴儿期发病血管病变、及NLRC4异常症组成的组。
[22’]如[20’]所述的治疗用组合物，其中，缺血性疾病选自由心绞痛、心肌梗塞、应激性心肌病、中枢性肺水肿、脑梗塞、缺血性脑中风、闭塞性动脉硬化症、及严重下肢缺血组成的组。
[23’]旁分泌因子的制造方法，其包括以下的工序：
工序(1)，在[9’]所述的培养基中培养细胞；以及
工序(2)，回收(1)中使用的培养基的上清液。
[24’]如[23’]所述的方法，其中，细胞为间充质干细胞。
[25’]如[23’]或[24’]所述的方法，其中，旁分泌因子为选自由抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质组成的组中的至少1种蛋白质。
发明效果
根据本发明，能够非常简便且高效地促进细胞的旁分泌因子(例如，抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质)的产生。另外认为，利用本发明制造的细胞由于旁分泌因子的产生及分泌得到促进，因此非常适合作为移植用细胞。另外，对于利用本发明制造的细胞(例如，间充质干细胞)而言，旁分泌因子之中的多种抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质的产生及分泌得到显著促进。因此，利用本发明制造的细胞(例如，间充质干细胞)可优选用于炎症性疾病及缺血性疾病的治疗。此外，根据本发明，能够非常简便且高效地制造·回收可用于医药的来自细胞的旁分泌因子。
具体实施方式
本说明书中，使用的术语如下定义。
本说明书中，n-表示正，i-表示异，sec-表示仲，以及tert-表示叔。另外，本说明书中，o-表示邻位，m-表示间位，以及p-表示对位。
“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。“卤代基”是指氟、氯、溴、碘。
“烷基”及“碳原子数1～6的烷基”是指直链或支链状的烷基，具体而言，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基等基团。作为该烷基，碳原子数1～4的低级烷基、尤其甲基及乙基是优选的。
“芳基”可举出至少1个环为芳香族、各环具有5～8个环原子的单环式、二环式、三环式及四环式碳环式基团，具体而言，可举出苯基、茚基、萘基、芴基等。特别地，芳基可以是作为C6-10的芳香族的苯基、茚基、萘基。另外，“杂芳基”是指在环内具有一个或多个碳以外的原子的环状芳香族基团，具体而言，可举出呋喃基、噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡嗪基、萘啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、咔唑基等。
“亚烷基”及“碳原子数1～6的亚烷基”是指直链的亚烷基，具体而言，可举出亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基等基团。
“烷基”、“芳基”及“亚烷基”可各自具有取代基，作为这样的取代基，可举出例如以下。需要说明的是，作为针对“烷基”的取代基可举出下述(1)～(40)，作为针对“芳基”及“亚烷基”的取代基可举出下述(1)～(41)。
可举出：
(1)卤代基、
(2)羟基、
(3)氰基、
(4)硝基、
(5)羧基、
(6)链烯基(C2-10链烯基；例如，乙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、丁二烯基、己三烯基、及其各异构体)、
(7)炔基(C2-10炔基；例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、及其各异构体)、
(8)卤代烷基(例如，单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、单氟乙基、二氟乙基、三氟乙基、氯甲基、氯乙基、二氯乙基、及其各异构体)、
(9)环状烷基(环中可包含杂原子)(例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、吖丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基)、
(10)芳基(例如，苯基、萘基)、
(11)杂芳基(例如，吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基(例如，1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基)、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、噁二唑基(例如，1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基)、噻二唑基(例如，1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基)、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基(cinnolinyl)、酞嗪基(phthalazinyl)、喹唑啉基、喹喔啉基、蝶啶基、咪唑并噁唑基、咪唑并噻唑基、咪唑并咪唑基)、
(12)烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、叔戊氧基、新戊氧基、2-戊氧基、3-戊氧基、正己氧基、2-己氧基)、
(13)烷基硫基(例如，甲基硫基、乙基硫基、正丙基硫基、异丙基硫基、正丁基硫基、异丁基硫基、仲丁基硫基、叔丁基硫基、正戊基硫基、异戊基硫基、叔戊基硫基、新戊基硫基、2-戊基硫基、3-戊基硫基、正己基硫基、2-己基硫基)、
(14)经芳基(与上述(10)含义相同)取代的烷氧基(与上述(12)含义相同)、
(15)经芳基(与上述(10)含义相同)取代的烷基硫基(与上述(13)含义相同)、
(16)经杂芳基(与上述(11)含义相同)取代的烷氧基(与上述(12)含义相同)、
(17)经杂芳基(与上述(11)含义相同)取代的烷基硫基(与上述(13)含义相同)、
(18)环状烷基(环中可包含杂原子)氧基(例如，环丙基氧基、环丁基氧基、环戊基氧基、环己基氧基、四氢呋喃基氧基、四氢吡喃基氧基、吖丙啶基氧基、氮杂环丁烷基氧基、吡咯烷基氧基、哌啶基氧基、吗啉基氧基)、
(19)芳基氧基(例如，芳基(与上述(10)含义相同)与氧原子键合而成的基团)、
(20)杂芳基氧基(例如，杂芳基(与上述(11)含义相同)与氧原子键合而成的基团)、
(21)卤代烷氧基(例如，卤代烷基(与上述(8)含义相同)与氧原子键合而成的基团)、
(22)卤代烷基硫基(例如，卤代烷基(与上述(8)含义相同)与硫原子键合而成的基团)、
(23)经羟基取代的烷氧基(与上述(12)含义相同)、
(24)经烷氧基(与上述(12)含义相同)取代的烷氧基(与上述(12)含义相同)、
(25)氨基、
(26)经烷基单取代或二取代的氨基、
此处，“烷基”可举出C1-6烷基，具体而言，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基等，
(27)氨基甲酰基、
(28)经烷基(与上述(26)中的“烷基”含义相同)单取代或二取代的氨基甲酰基(例如，甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、乙基甲基氨基甲酰基)
(29)氨基磺酰基(sulfamoyl)、
(30)经烷基(与上述(26)中的“烷基”含义相同)单取代或二取代的氨基磺酰基(例如，甲基氨基磺酰基、乙基氨基磺酰基、二甲基氨基磺酰基、二乙基氨基磺酰基、乙基甲基氨基磺酰基)、
(31)烷酰基(例如，在碳原子上键合有氢原子或烷基(与上述(26)中的“烷基”含义相同)的羰基)、
(32)芳酰基(例如，在碳原子上键合有芳基(与上述(10)含义相同)的羰基)、
(33)烷基磺酰基氨基(例如，经烷基(与上述(26)中的“烷基”含义相同)取代的磺酰基氨基)
(34)芳基磺酰基氨基(例如，经芳基(与上述(10)含义相同)取代的磺酰基氨基)、
(35)杂芳基磺酰基氨基(例如，经杂芳基(与上述(11)含义相同)取代的磺酰基氨基)、
(36)酰基氨基(例如，经酰基取代的氨基)、
此处，“酰基”是指具有C1-6烷基、或C6-10芳基的酰基。此处，“C1-6烷基”是指上述“烷基”之中、碳原子数为1～6的烷基，“C6-10芳基”是指上述“芳基”之中、碳原子数为6～10的芳基。作为酰基，具体而言，可举出乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基、丙烯酰基、甲基丙烯酰基、巴豆酰基、异巴豆酰基、苯甲酰基、萘甲酰基等，
(37)烷氧基羰基氨基(例如，经烷氧基(与上述(12)含义相同)取代的羰基氨基)、
(38)烷基磺酰基(例如，经烷基(与上述(26)中“烷基”含义相同)取代的磺酰基)、
(39)烷基亚磺酰基(例如，经烷基(与上述(26)中“烷基”含义相同)取代的亚磺酰基)、
(40)烷氧基羰基(例如，甲氧基羰基、乙氧基羰基)、
(41)烷基(C1-10烷基；例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基等)等。
存在2个以上取代基的情况下，它们可相同也可不同。
式(I)所示的化合物可以是盐的形态。作为前述式(I)表示的化合物的盐，可举出例如与盐酸及氢溴酸等无机酸形成的盐、以及与乙酸、丙酸、酒石酸、富马酸、马来酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸及苯甲酸等有机酸形成的盐。这些盐可通过本身已知的方法制造。
式(I)所示的化合物根据取代基的种类而有时存在具有E构型的E型及具有Z构型的Z型这样的几何异构体。本发明包含上述E型、Z型或以任意比例含有E型及Z型的混合物。
另外，式(I)所示的化合物存在光学活性体，所述光学活性体是由于存在1个或2个以上非对称碳原子而产生的，式(I)所示的化合物包含全部的光学活性体或外消旋体。
[式(I)所示的化合物的合成]
式(I)所示的化合物优选如下式所示，分别各使用1当量的酮化合物和H2N-X-R1(式中，X及R1表示前述的含义，例如，酰肼化合物、氨基脲化合物等)，在甲苯、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等溶剂中，于100℃以上的温度范围反应1小时至3天。
[反应式1]
[化学式25]
Figure BDA0002994180810000201
对于反应结束后的反应混合物而言，加入蒸馏水使其析出，或在不进行析出的情况下，实施有机溶剂萃取后浓缩这样的常规后处理，可得到作为目标的特定化合物。另外，在需要纯化时，可利用重结晶、柱色谱法、薄层色谱法、液相色谱分选等任意的纯化方法进行分离、纯化。
[光学活性体的取得]
通过上述的方法合成的化合物之中，对于具有光学异构体的化合物而言，可能存在光学活性体(优对映体(eutomer))。光学活性体可使用利用结晶的方法、利用酶反应的方法、或利用HPLC的方法(例如，光学活性担载法)等本身已知的方法来获得。另外，也可使用不对称合成法等制备光学活性体。
1.用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂
本发明提供包含以下的特定化合物或其盐的、用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂(以下有时称为“本发明的培养基添加试剂”)。
本发明的培养基添加试剂中所含的化合物为式(I)所示的化合物或其盐：
[化学式26]
Figure BDA0002994180810000211
{式中，X为-NHCO-，
R1为-Y-NH-Z-Ar(式中，Y及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，Ar为可具有取代基的芳基或杂芳基。)，R2为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R3为羟基，n为0、1或2的整数。}(以下，有时将式(I)表示的化合物或其盐仅总称为“本发明所使用的特定化合物”等)。
一个方式中，Y为单键的情况下，Z为可具有取代基的亚烷基(更优选不具有取代基的亚烷基，特别优选亚甲基)，Ar为可具有取代基(更优选卤素原子、甲基、羟基、或甲氧基)的芳基(更优选具有羟基的芳基或不具有取代基的芳基，特别优选苯基或具有羟基的苯基)、或可具有取代基(更优选卤素原子、甲基、羟基、或甲氧基)的杂芳基(更优选可具有取代基的吡啶基，特别优选不具有取代基的吡啶基或具有氟基的吡啶基)，R2为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选乙基)，n为0、1或2的整数，优选n为0。
另外，Y为可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基(更优选不具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，特别优选亚甲基、乙叉基或亚丙基)的情况下，Z为单键，Ar为可具有取代基的芳基(更优选具有取代基的芳基，特别优选具有卤代基、甲基、羟基或乙氧基的苯基、或者萘基)、或可具有取代基的杂芳基(更优选可具有卤代基的杂芳基，特别优选不具有取代基的吡啶基或具有氟基的吡啶基)，R2为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选甲基、乙基、或异丙基)，n为0、1或2的整数，优选n为0。
在本发明的培养基添加试剂中配合的、本发明所使用的特定化合物的量只要能得到所期望的效果则没有特别限定，通常可以为0.01～100重量％，优选为0.1～100重量％，更优选为1～100重量％，进一步优选为5～100重量％，特别优选为10～100重量％。
本发明的培养基添加试剂在提供时或者保存时可以是任意的形状。本发明的培养基添加试剂可以是固体状、液体状、及凝胶状等形状。
另外，本发明的培养基添加试剂可根据需要施以灭菌处理。灭菌方法没有特别限定，可配合本发明的培养基添加试剂的形状而适宜选择。作为灭菌方法，可举出例如放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压釜灭菌、过滤器灭菌等。对于进行过滤器灭菌(以下有时也称为过滤灭菌)时的过滤器部分的材质没有特别限定，可举出例如玻璃纤维、尼龙、PES(聚醚砜)、亲水性PVDF(聚偏氟乙烯)、纤维素混合酯、纤维素乙酸酯、聚四氟乙烯等。过滤器的微孔的大小没有特殊限定，优选为0.1μm～10μm，更优选为0.1μm～1μm，最优选为0.1μm～0.5μm。
本发明的培养基添加试剂中，“促进细胞的旁分泌因子的产生”是指：提高细胞的旁分泌因子的产生能力，使该因子的向细胞外的分泌量增加。需要说明的是，在本说明书中是指：就利用本发明的培养基添加试剂而增加的旁分泌因子的量而言，与作为对照的规定的旁分泌因子的分泌量相比，蛋白质的产生·分泌量增大至少120％以上、至少130％以上、至少140％以上、至少150％以上、至少160％以上、至少170％以上、至少180％以上、至少190％以上、至少200％以上、至少300％以上、至少400％以上、至少500％以上、至少600％以上、至少700％以上、至少800％以上、至少900％以上、至少1000％以上。所分泌的蛋白质量的测定可以如在以下的实施例中所说明的那样，使用ELISA(酶联免疫吸附分析，Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法、流式细胞术等本身已知的方法。
利用本发明的培养基添加试剂来促进产生的旁分泌因子可举出TSG-6(TNF刺激基因6蛋白)及STC-1(斯钙素1)等抗炎症蛋白质、以及ANG(血管生成素)、EGF(表皮生长因子)、MCP-1(单核细胞趋化蛋白1)、ENA-78(上皮来源的中性粒细胞活化肽78)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、IL-6(白细胞介素6)、IL-8(白细胞介素8)、VEGF(血管内皮生长因子)、VEGF-D(血管内皮生长因子D)、TIMP(基质金属蛋白酶组织抑制因子)、PDGF(血小板源性生长因子)、TGF-β(转化生长因子β)等促进血管新生的蛋白质，但不限于这些。尤其细胞为间充质干细胞的情况下，能够使TSG-6、STC-1ANG、及MCP-1的产生·分泌量显著增加。
能在添加有本发明的培养基添加物的培养基中进行培养的细胞只要能得到所期望的效果则没有特别限定，可以是来源于哺乳动物的细胞。作为该细胞的例子，可举出构成生物体的体细胞、正常细胞株、癌细胞株、前体细胞、干细胞、被从生物体分离并经过人工基因改造的细胞、被从生物体分离并经过人工核更换的细胞等细胞，但不限于这些。需要说明的是，这些细胞的来源也没有特别限定，可举出来源于大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸、犬、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、大象、普通狨、松鼠猴、猕猴、黑猩猩、人等哺乳动物的细胞。另外，作为所述细胞来源的组织或器官也没有特别限定，作为组织的例子，可举出皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、脾脏、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液、心脏、眼、脑或神经组织等组织，另外，作为器官的例子，可举出肝脏、肺、肾脏、心脏、胰腺、胃、脾脏、小肠、大肠、生殖器等器官。需要说明的是，本说明书中“干细胞”是指兼具自我复制能力和分化成其他多个系统的细胞的能力的细胞，作为其例子，不限于以下，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等。作为多能干细胞，可举出前述干细胞之中的ES细胞、胚胎生殖干细胞、iPS细胞。前体细胞是指处于从前述干细胞分化为特定的体细胞、生殖细胞的中途阶段的细胞。一个优选方式中，细胞为人间充质干细胞(hMSC)。
对于本发明的培养基添加试剂在培养基中的优选添加量而言，只要能得到本发明的所期望的效果则没有特别限定，例如，可向培养基中以本发明所使用的特定化合物的培养基中的浓度通常为0.001～100μM、优选为0.01M～50μM、更优选为0.1～30μM、进一步优选为1～20μM、特别优选为5～10μM的方式添加本发明的培养基添加试剂。
可应用本发明的培养基添加试剂的培养基没有特别限定，可通过添加至市售的培养基中来得到本发明的培养基添加试剂的所期望的效果。作为优选的市售培养基，可举出例如杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM)、Ham F12培养基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy 5A培养基(McCoy’s 5Amedium)、Eagle MEM(Eagle最低基础培养基；EMEM)、αMEM(alpha Modified Eagle’sMinimum Essential Medium；αMEM)、MEM(Minimum Essential Medium，最低基础培养基)、RPMI1640培养基、Iscove改良杜氏培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培养基、William培养基E、IPL41培养基、Fischer’s培养基、StemPro34(Thermo Fisher scientific公司制)、X-VIVO 10(Cambrex公司制)、X-VIVO 15(Cambrex公司制)、HPGM(Cambrex公司制)、StemSpan H3000(STEMCELL Technologies公司制)、StemSpanSFEM(STEMCELL Technologies公司制)、StemlineII(Sigma Aldrich公司制)、QBSF-60(Qualitybiological公司制)、StemProhESCSFM(Thermo Fisher scientific公司制)、Essential8(注册商标)培养基(Gibco公司制)、mTeSR1或2培养基(STEMCELLTechnologies公司制)、TeSR-E8培养基(STEMCELL Technologies公司制)、ReproFF或ReproFF2(ReproCELL Incorporated制)、Primate ES Cell Medium(ReproCELLIncorporated制)、PSGro hESC/iPSC培养基(System Biosciences公司制)、NutriStem(注册商标)培养基(Biological Industries公司制)、StemFit(注册商标)培养基(味之素公司制)、CSTI-7培养基(细胞科学研究所公司制)、MesenPRO RS培养基(Gibco公司制)、MF-Medium(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(东洋纺株式会社制)、间充质干细胞用培养基(PromoCell公司制)、间充质干细胞用培养基2(PromoCell公司制)、MSCGM(Lonza公司制)、MesenCult XF(STEMCELL Technologies公司制)、StemPro MSC XF(Thermo Fisherscientific公司制)、Sf-900II(Thermo Fisher scientific公司制)、Opti-Pro(ThermoFisher scientific公司制)等培养基，但不限于这些。
另外，可向上述的培养基中适宜添加钠、钾、钙、镁、磷、氯、各种氨基酸、各种维生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖、细胞生长因子、分化诱导因子、细胞粘附因子、抗体、酶、细胞因子、激素、凝集素、细胞外基质、生理活性物质等其他物质。作为具体的例子，可举出TNF(肿瘤坏死因子，Tumor Necrosis Factor)α、LPS(脂多糖)、BMP2(骨形态发生蛋白2，BoneMorphogenetic Protein 2)等。
细胞培养条件(例如，温度、二氧化碳浓度、培养时间等)使用本身已知的条件即可，或者可根据目的而适当改变。例如，就培养细胞时的温度而言，通常为25～39℃，优选为33～39℃(例如，37℃)。就二氧化碳浓度而言，通常，培养的气氛中为4体积％～10体积％，优选为4体积％～6体积％。就培养时间而言，通常为1至35天，根据培养的目的适当设定即可。
将本发明的培养基添加试剂添加至三维细胞培养培养基中后，能够得到更显著的促进旁分泌因子产生的效果。本说明书中的三维细胞培养(3D细胞培养)是指使用例如包埋培养法、微载体培养法、球体(sphere)培养法、悬滴培养法等在三维环境中培养细胞。包埋培养是在Matrigel(注册商标)、Geltrex(注册商标)、琼脂、甲基纤维素、胶原蛋白、明胶、血纤维蛋白、琼脂糖、海藻酸盐等固态或半固体的凝胶基材中埋入细胞、将其固定来进行培养的方法。微载体培养法是下述这样的方法：在比水稍重的微粒(下文也称为微载体)的表面上使细胞进行单层增殖，在培养瓶等培养容器内搅拌该微粒，进行悬浮状态下的培养。球体培养法是下述这样的方法：使目标细胞形成由数十～数百个细胞构成的凝集块(下文中也称为球体或球状体)，之后在培养基中使该凝集块静置或进行振荡来培养。悬滴培养法可举出下述方法：例如，将细胞悬浮液的液滴(就容量而言为10～50μL左右)滴加于培养容器的盖等的顶板侧，以所载置的液滴垂下的方式在倒置状态下进行培养。通过如此进行培养，细胞因与平面的接触而受到的影响为最小限度，在液滴的下部形成球体。上述液滴也可使用GravityPLUS Plate(PerkinElmer公司制)这样的特殊培养容器进行制备。另外，作为可应用本发明的培养基添加试剂的三维细胞培养(3D细胞培养)，也可使用下述方法：通过使透明质酸、脱酰基结冷胶、黄原酸胶等多糖类或它们的派生物在培养基中分散来形成不规则形态的三维网络，将其作为支架而使粘附细胞在培养基中维持悬浮的状态，从而在更接近于生物体内的三维状态下对细胞进行培养。此时，三维细胞培养中的细胞被该三维网络捕获而不会沉淀，因此能够在不需要振荡、旋转操作等的情况下进行培养。三维细胞培养可利用本身已知的方法来实施(例如，参见WO2014/017513)。
细胞的培养可使用通常用于细胞培养的培养皿、培养瓶、塑料袋、Teflon(注册商标)袋、皿、陪替氏培养皿(Petri Dish)、组织培养用皿、多皿、微孔培养板、微孔板、多片板(multiplate)、多孔板、腔室载玻片(chamber slide)、管、盘、培养袋、滚瓶等培养容器实施。一个方式中，作为培养容器，也可使用培养容器的表面基于提高与细胞的粘合性的目的而进行了人工处理(例如，利用细胞外基质等的包被处理)的培养容器。作为这样的容器的例子，可举出包被有Matrigel(注册商标)、Geltrex(注册商标)、胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、腱生蛋白、选择素、透明质酸、血纤维蛋白等的容器，但不限于此。另外，也可使用用于阻碍细胞粘附于培养器材的包被材料。作为这样的包被材料，可举出水凝胶、prevelex(注册商标)、硅、聚(甲基丙烯酸2-羟基甲酯)、聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)等，但不限于这些。
对于细胞的培养而言，也可在机械控制下且于封闭环境中自动地实施细胞接种、培养基的更换、细胞图像的获取、培养细胞的回收，一边控制pH、温度、氧浓度等，一边通过能够实现高密度培养的生物反应器、自动培养装置进行。使用这些装置在培养中途补充新的培养基、将所要求的物质适量地供给至细胞及/或组织的方法包括分批补料式培养(fed-batch culture)、连续培养、灌流培养，但不限于这些。
2.细胞培养用培养基
本发明还提供包含本发明的培养基添加试剂的、细胞培养用培养基(以下有时称为“本发明的培养基”)。
本发明的培养基可通过向用于细胞培养的培养基中添加本发明的培养基添加试剂来制备。可用于制备本发明的培养基的细胞培养用培养基包括“1.用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂”中示例的市售培养基，但不限于这些。本发明的培养基添加试剂中含有的本发明所使用的特定化合物的浓度也可与“1.用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂”中所作说明同样。
一个优选方式中，本发明的培养基可以是能进行三维细胞培养的细胞培养用培养基。
3.旁分泌因子的产生得到促进的细胞的制造方法
本发明还提供旁分泌因子的产生得到促进的细胞的制造方法(以下有时称为“本发明的制造方法”)，其包括在含有本发明所使用的特定化合物的培养基中培养细胞。
本发明的制造方法中的、本发明所使用的特定化合物、其培养基中的浓度、可使用的培养基、可培养的细胞种类、培养条件等可与“1.用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂”中所作说明同样。另外，作为用于本发明的制造方法的培养基，也可使用上述的本发明的培养基。
本发明的制造方法的一个方式中，细胞的培养可使用三维细胞培养法实施。通过在三维细胞培养法中进行培养，能够更显著地促进旁分泌因子的制造。关于三维细胞培养法，如上所述。
4.活体移植用组合物
本发明还提供包含通过本发明的制造方法制造的细胞的、活体移植用组合物(以下有时称为“本发明的组合物”)。
供本发明的组合物移植的组织根据所含有的细胞种类确定即可。例如，主要含有间充质干细胞的情况下，可优选用于作为由间充质细胞构成的组织的骨组织、软骨组织、脂肪组织、及血管组织等的修复以及再生，但不限于这些。
本发明的组合物所含的细胞的含量没有特别限定，根据应用的部位、应用、途径等适宜确定即可。
本发明的组合物除了含有使用本发明的方法制造的细胞以外，可还含有药学上可允许的医药品添加物。医药品添加物可举出等渗剂、缓冲剂、pH调节剂、稳定剂、螯合剂、防腐剂等，但不限于这些。
等渗剂可示例氯化钠、氯化钾、糖类、甘油等。缓冲剂可示例硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、及与它们对应的盐(例如它们的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等碱金属盐、碱土金属盐)等。pH调节剂可示例盐酸、硫酸、磷酸、多聚磷酸、硼酸、或硼砂等无机酸类；乙酸、丙酸、草酸、葡糖酸、富马酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸等有机酸类；氢氧化钾、或氢氧化钠等无机碱；单乙醇胺、三乙醇胺、二异丙醇胺、或三异丙醇胺等有机碱；乙酸铵、乳酸钠、柠檬酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、乳酸钙等。稳定剂可示例人血清白蛋白、常规的L-氨基酸、糖类、纤维素衍生物等，这些可单独使用或与表面活性剂等组合使用。上述L-氨基酸可以是甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等中的任何，但不限于这些。糖类可以是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等单糖类、甘露糖醇、肌醇、木糖醇等糖醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖等二糖类、葡聚糖、羟丙基淀粉、硫酸软骨素、透明质酸等多糖类等、及它们的衍生物等中的任何，但不限于这些。纤维素衍生物可以是甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等中的任何，但不限于这些。螯合剂可示例乙二胺四乙酸钠、柠檬酸等。
作为本发明的组合物的形状，只要是能移植至生物体的形状即可，没有特别限定，例如，可示例由细胞和合适的分散介质形成的液体状、使细胞固定于合适的生物相容性材料上而成的片状等形状。
本发明的组合物所含的、通过本发明的方法制造的细胞如上所述，旁分泌因子的产生·分泌得到了促进。例如，通过本发明的方法制造的间充质干细胞与未利用本发明所使用的特定化合物实施处理的间充质干细胞相比，具有更高的抗炎症效果及血管新生促进效果。因此，通过将包含该间充质干细胞作为成分的本发明的组合物移植至生物体，可期待应用部位的更高的再生效果。
5.炎症性疾病或缺血性疾病治疗用组合物
本发明还提供包含通过本发明的制造方法制造的间充质干细胞的、炎症性疾病或缺血性疾病的治疗用组合物(以下有时称为“本发明的治疗用组合物”)。本发明的治疗用组合物能够通过施予至患有炎症性疾病或缺血性疾病的对象来治疗疾病。
本发明的治疗组合物向对象中的施予方法只要能得到所期望的效果即可，没有特别限定，血内施予由于非常简便，故而优选。另外，尤其在治疗对象中确认到重症部的情况等时，也可将本发明的治疗用组合物直接移植至该部位。
本发明的治疗用组合物所含的间充质干细胞只要是通过本发明的方法制造的间充质干细胞即可。
本发明的治疗用组合物所含的间充质干细胞的含量只要是治疗有效量即可，没有特别限定，考虑组合物的形状等适宜确定即可。
作为本发明的治疗用组合物的形状，只要是能非经口施予至对象的形状即可，没有特别限定，例如，可以是由细胞和合适的分散介质形成的液体状。另外，在将本发明的治疗用组合物直接移植至重症部等情况下，也可将本发明的治疗用组合物的形状设为使间充质干细胞固定于生物相容性材料上而成的片状。
本发明的治疗用组合物施予至对象的量没有特别限定，只要是治疗有效量，则可以是任意的量。治疗有效量可在考虑疾病的程度、对象的年龄、体重、施予方法、施予次数、本发明的治疗组合物的形状等的基础上适宜确定。
本发明的治疗用组合物除了含有使用本发明的方法制造的间充质干细胞之外，可还含有药学上可允许的医药品添加物。医药品添加物可举出等渗剂、缓冲剂、pH调节剂、稳定剂、螯合剂、防腐剂等，但不限于这些。医药品添加物的具体例与“4.活体移植用组合物”中的记载同样。
作为可优选使用本发明的治疗用组合物的疾病，可举出炎症性疾病及缺血性疾病。
作为可应用本发明的治疗用组合物的炎症性疾病，可举出炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肾炎、急性肾炎、慢性肾炎、肾小球肾炎、IgA肾病、糖尿病性肾病、膜性肾病、肾积水、造影剂肾病、肾盂肾炎、肾功能不全、间质性肾炎、肾损伤、肾病综合征、高血压性肾硬化症、糖尿病性肾小球硬化症、肾结石、淀粉样肾、肾静脉血栓症、Alport综合征、肝炎、肝硬化、胰腺炎、肺炎、鼻窦炎、鼻炎、关节炎、变形性膝关节病、变形性手关节病、变形性足关节病、变形性股关节病、类风湿性关节炎、周期性发热·口疮性口炎·咽炎·淋巴结炎综合征(PFAPA)、成人斯蒂尔病、白塞病、痛风、假性痛风、Schnitzler综合征、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、冷卟啉相关周期热综合征(CAPS)、家族性寒冷性荨麻疹、Muckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤关节炎综合征(CINCA综合征)/新生儿期发病的多系统炎性疾病(NOMID)、TNF(肿瘤坏死因子)受体相关周期性综合征(TRAPS)、高IgD综合征(甲羟戊酸激酶缺损症)、Blau综合征/早发性结节病、家族性地中海热、PAPA(化脓性关节炎·坏疽性脓皮病·痤疮)综合征、中条-西村综合征、Majeed综合征、NLRP12相关周期热综合征(NAPS12)、白细胞介素1受体拮抗剂缺乏症(DIRA)、白细胞介素36受体拮抗剂缺乏症(DITRA)、磷酯酶Cγ2相关抗体缺陷·免疫失调症(PLAID)、HOIL-1缺损症、SLC29A3缺损症、CARD14异常症、ADA2(腺苷脱氨酶2)缺乏症、STING相关婴儿期发病血管病变(SAVI)及NLRC4异常症等，但不限于这些。
另外，作为可应用本发明的治疗用组合物的缺血性疾病，可举出心绞痛、心肌梗塞、应激性心肌病、中枢性肺水肿、脑梗塞、缺血性脑中风、闭塞性动脉硬化症、严重下肢缺血等，但不限于这些。
6.炎症性疾病或缺血性疾病治疗用组合物
本发明还提供包括以下的工序的、旁分泌因子的制造方法(以下有时称为“本发明的旁分泌因子的制造方法”)：
工序(1)，在本发明的培养基中培养细胞；以及
工序(2)，回收(1)中使用的培养基的上清液。
本发明的旁分泌因子的制造方法的工序(1)中使用的细胞可以是能制造·分泌旁分泌因子的任何细胞，例如，可举出“1.用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂”中所说明的细胞。一个优选方式中，细胞为间充质干细胞。
细胞培养的条件没有特别限定，只要是培养的细胞维持·增殖的条件，则可以是任何条件。本领域技术人员可使用已知的方法容易地确定优选的细胞培养条件。一个优选方式中，细胞通过三维培养进行培养。
对于细胞的培养而言，也可在机械控制下且于封闭环境中自动地实施细胞接种、培养基的更换、细胞图像的获取、培养细胞的回收，一边控制pH、温度、氧浓度等，一边通过能够实现高密度培养的生物反应器、自动培养装置进行。使用这些装置在培养中途补充新的培养基、将所要求的物质适量地供给至细胞的方法包括分批补料式培养、连续培养、灌流培养，但不限于这些。
通过使用本发明的培养基培养细胞，该细胞高效地产生旁分泌因子，结果，所制造的旁分泌因子被大量分泌至培养基中。因此，通过回收该培养基的上清液，能够回收大量所产生·分泌的旁分泌因子。
本发明的旁分泌因子的制造方法的工序(2)中的上清液的回收方法也没有特别限定，使用已知的上清液回收方法即可。例如，可将含有培养后的细胞的培养基供于离心分离，使细胞沉淀，然后使用移液器等回收上清液，但不限于此。
也可以通过将经沉淀的细胞再次供于工序(1)的培养、重复本发明的旁分泌因子的制造方法，从而进一步回收大量的旁分泌因子。
以下的实施例中对本发明进行了更具体的说明，但本发明不受这些例子的任何限定。
实施例
[化合物的合成例]
关于本说明书中2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮(有时也称为“k-1”)的酮，可通过本身已知的方法合成(Sum TH等，Tetrahedron.2015Jul1；71(26-27):4557-4564.)。另外，2-(苯基氨基)乙酰肼(有时也称为“H-1”)的肼也可通过本身已知的方法合成(Samal RP等，Chem Biol Drug Des.2013Jun；81(6):715-29.)。
[合成例1]k-1：B-1的合成法
使2-溴代丙酸甲酯(109)(500mg、3.0mmol)溶解于DMSO(6mL)中，加入苯胺(0.36mL、3.9mmol)、碳酸钾(0.54g、3.9mmol)，于室温搅拌21小时。加入乙酸乙酯(30mL)、水(50mL)，进行分液，将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝2/98～15/85)纯化，得到淡黄色液体形态的N-苯丙氨酸甲酯(110)(343mg、1.91mmol、收率为64％)。
使如上述那样得到的110(340mg、1.9mmol)溶解于甲醇(3.8mL)中，加入肼一水合物(0.18mL、3.8mmol)，于60℃搅拌24小时。补加肼一水合物(0.36mL、7.4mmol)，于60℃进一步搅拌17小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(胺硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝0/100～20/80)纯化，得到无色固体形态的2-(苯基氨基)丙酰肼(111)(321mg、1.79mmol、收率为94％)。
使如上述那样得到的111(168mg、0.937mmol)、2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮(k-1)(130mg、0.72mmol)溶解于DMSO(1.4mL)中，于100℃搅拌19小时。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，滤取析出的固体，干燥，将得到的黄色固体用二氯甲烷悬浮洗涤后，在减压下干燥，得到淡黄色固体形态的k-1：B-1(173mg、0.507mmol、收率为70％)。
[合成例2]k-1：D-1的合成法
使3-苄氧基苯胺(129)(2.44g、12.2mmol)溶解于DMF(24mL)中，加入乙酸钠(1.10g、13.5mmol)、溴代乙酸乙酯(128)(1.49mL、13.5mmol)，于室温搅拌4小时。加入水(300mL)、乙酸乙酯(150mL)，进行分液，将有机层用饱和食盐水(100mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶50g、乙酸乙酯/己烷＝2/98～10/90)纯化，得到淡黄色固体形态的N-(3-苄氧基苯基)甘氨酸乙酯(130)(2.82g、9.88mmol、收率为81％)。
使如上述那样得到的130(1.0g、3.5mmol)悬浮于甲醇(18mL)中，加入10％Pd/C(0.1g)，在氢气氛下于室温搅拌5小时。用硅藻土过滤反应溶液，将滤液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝3/97～35/65)纯化，得到淡黄色液体形态的N-(3-羟基苯基)甘氨酸乙酯(131)(295mg、1.51mmol、收率为43％)。
使如上述那样得到的131(0.29g、1.5mmol)溶解于乙醇(3.5mL)中，加入肼一水合物(0.32mL、6.5mmol)，于60℃搅拌18小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(胺硅胶10g、甲醇/二氯甲烷＝1/99～10/90)纯化。将得到的固体用IPE悬浮洗涤后，在减压下干燥，得到淡黄色固体形态的2-[(3-羟基苯基)氨基]乙酰肼(132)(239mg、1.32mmol、收率为88％)。
使如上述那样得到的132(130mg、0.72mmol)、2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮(k-1)(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌21小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝5/95～50/50)纯化。将得到的固体用水、及IPE悬浮洗涤后，在减压下干燥，得到无色固体形态的k-1：D-1(95.9mg、0.279mmol、收率为51％)。
[合成例3]k-1：J-1的合成法
向冰冷却后的THF(10mL)中依次加入氢化铝(1.0g、26mmol)、3-氰基苯酚(148)(0.63g、5.3mmol)，于室温搅拌1.5小时，于60℃搅拌3.5小时。放冷后，补加氢化铝(1.0g、26mmol)、THF(10mL)，于60℃进一步搅拌16小时。对反应溶液进行冰冷却，依次加入水(1.5mL)、15％氢氧化钠水溶液(1.5mL)、水(4.5mL)，于室温搅拌3小时。用硅藻土过滤悬浮溶液，将滤液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(胺硅胶10g、甲醇/二氯甲烷＝0/100～8/92)纯化。将得到的固体用IPE悬浮洗涤后，在减压下干燥，得到无色固体形态的3-(氨基甲基)苯酚(149)(477mg、3.87mmol、收率为73％)。
使如上述那样得到的149(200mg、1.6mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)、水(2mL)中，加入碳酸氢钠(0.27g、3.2mmol)，在冰冷却条件下缓缓滴入氯代甲酸苯酯(136)(0.22mL、1.7mmol)。于室温搅拌20小时，加入乙酸乙酯(20mL)、水(20mL)，进行分液。将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝5/95～35/65)纯化，得到无色液体形态的(3-羟基苄基)氨基甲酸苯酯(150)(369mg、1.52mmol、收率为95％)。
使如上述那样得到的150(365mg、1.50mmol)悬浮于乙腈(3.8mL)中，加入肼一水合物(0.18mL、3.8mmol)，于室温搅拌2.5小时，补加肼一水合物(0.18mL、3.8mmol)，于55℃进一步搅拌20小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的固体用IPE/二氯甲烷(3/1)悬浮洗涤后，在减压下干燥，得到无色固体形态的N-(3-羟基苄基)肼甲酰胺(151)(233mg、1.29mmol、收率为86％)。
使如上述那样得到的151(130mg、0.72mmol)、2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮(k-1)(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌15小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝10/90～55/45)纯化。向得到的纯化物中加入水，滤取析出的固体后，在减压下干燥，得到无色固体形态的k-1：J-1(102mg、0.297mmol、收率为54％)。
[合成例4]k-1：H-1的合成法
使k-1(100mg、0.555mmol)、H-1(110mg、0.666mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌14小时。放冷后，加入蒸馏水(11mL)，再次于100℃搅拌后，趁热过滤，得到淡黄色固体形态的k-1：H-1(70.1mg、0.214mmol、收率为39％)。
[合成例5]GA-002A的合成法
对于前述的合成例1中合成的k-1：B-1(外消旋体)，按照下述分选条件，通过Waters公司制超临界流体色谱仪(SFC)实施光学拆分，获得以下的2种对映体。两种对映体的比旋光度使用旋光度计P-1020(日本分光公司制)测定。另外，对映体的构型(R型、S型)通过X射线晶体结构分析来确定。
化合物GA-002A(k-1：B-1的左旋对映体)；保留时间11.95分钟、分选量475.1mg、光学纯度99.9ee％、纯度99.0％、比旋光度[α]22D-10.5(c＝0.1019、乙醇)、构型为R型
＜分选条件＞
柱：CHIRALPAK IA＜Daicel公司制、20＊250mm、5μm＞、弱溶剂：CO2(70％)、强溶剂：MeOH(30％)、柱温：40℃、总进样量：1g、流速：15mL/分钟
[合成例6]GA-005A的合成法
[化学式27]
Figure BDA0002994180810000361
(式中，Bn表示苄基)
使D-丙氨酸甲酯盐酸盐(157)(1.40g、10.0mmol)、3-苄氧基苯基硼酸(158)(3.43g、15.1mmol)、乙酸铜(II)一水合物(3.00g、15.1mmol)、分子筛4A(MS4A；20g)溶解于二氯甲烷(200mL)中，加入三乙胺(4.17mL、30.1mmol)，在氧气氛下于室温搅拌23小时。用硅藻土过滤反应溶液，将滤液在减压下浓缩至一半，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)，进行分液。将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩。将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝1/99～10/90)纯化，得到黄色液体形态的159(595mg、2.09mmol、收率为21％)。
[化学式28]
Figure BDA0002994180810000362
(式中，Bn表示苄基)
使如上述那样得到的159(595mg、2.09mmol)溶解于甲醇(21mL)中，加入钯碳乙二胺复合体(241mg)，在氢气氛下，于室温搅拌3.5小时。过滤出钯碳，将滤液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～30/70)纯化，得到黄色液体形态的160(413mg、2.12mmol、quant.)。
[化学式29]
Figure BDA0002994180810000371
使如上述那样得到的160(413mg、2.12mmol)溶解于甲醇(4.2mL)中，加入肼一水合物(1.0mL、21mmol)，于60℃搅拌3.5小时。将反应溶液在减压下浓缩，进行甲苯共沸，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱纯化，(硅胶10g、甲醇/二氯甲烷＝1/99～10/90)纯化，得到褐色非晶形态的161(391mg、2.00mmol、收率为95％)。
[化学式30]
Figure BDA0002994180810000372
如上述那样得到的161(72mg、0.37mmol)、2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮(100)(60mg、0.33mmol)溶解于DMSO(0.67mL)中，于100℃搅拌3天。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝5/95～50/50)纯化，将得到的纯化物依次用蒸馏水、异丙醇(IPA)/己烷、蒸馏水悬浮洗涤，得到淡棕色固体形态的GA-005A(ZX-01-R(40.5mg、0.113mmol、收率为34％))。比旋光度使用旋光度计P-1020(日本分光公司制)测定。
1H-NMR(270MHz)；；δ13.65(s,1H),10.75(s,1H),9.70(s,1H),8.97(s,1H),7.25(d,J＝8.1Hz,1H),6.83(t,J＝8.1Hz,1H),6.39(d,J＝8.1Hz,1H),6.15-5.95(m,3H),5.81(d,J＝8.1Hz,1H),4.18(m,1H),2.78(q,J＝8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.37(d,J＝8.1Hz,3H),1.03(t,J＝8.1Hz,3H).
化合物GA-005A；光学纯度99.9ee％、纯度99.2％、比旋光度[α]22D-11.4(c＝0.0264、乙醇)、构型为R型
[合成例7]A-004的合成法
通过基于合成例1的方法，从2-(吡啶-3-氨基)丙酰肼135mg及2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮135mg合成81.6mg的A-004。
[合成例8]A-004A的合成法
使用Waters公司制超临界流体色谱仪(SFC)将A-004光学拆分，得到6.6mg的A-004A。
〔光学拆分条件〕
柱：CHIRALPAK IA-3(20x250mm、5μm；Daicel公司制)
流动相：CO2:MeOH＝60:40(体积比)
柱温：40℃
流速：15mL/分钟
在上述条件下，A-004A(光学纯度99.9ee％)的保留时间为8.14分钟。
[合成例9]A-007的合成法
通过基于合成例1的方法，从2-(吡啶-3-氨基-5-氟)丙酰肼143mg及2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮100mg合成94.4mg的A-007。
式(I)所示的化合物可基于前述的合成例1～9合成。通过前述的合成例合成的式(I)所示的化合物的例子示于第1个表至第3个表中，但本发明所使用的特定化合物并非仅限于这些。
表中，Me的记载表示甲基，以下同样地，Et的记载表示乙基，n-Pr及Pr-n表示正丙基，i-Bu表示异丁基。另外，R5为芳基的取代基，与前文所述同样。需要说明的是，(R3)n及(R5)m中的“-”的记载表示无取代。结构式中记载的编号表示(R3)n或(R5)m的取代位置。n为0、1或2的整数，m为0、1、2、3、4或5的整数。R5存在多个的情况下，R5可以各自相同或不同。
〔第1个表〕
[化学式31]
Figure BDA0002994180810000381
[表1]
化合物编号 R2 (R3)n R4 (R5)m
k-1：B-1 Et - Me -
k-1：D-1 Et - H 3-OH
k-1：H-1 Et - H -
GA-005A Et - Me 3-OH
〔第2个表〕
[化学式32]
Figure BDA0002994180810000391
[表2]
化合物编号 R2 (R3)n R4 (R5)m
k-1：J-1 Et - H 3-OH
〔第3个表〕
[化学式33]
Figure BDA0002994180810000392
[表3]
化合物编号 R2 (R3)n R4 (R5)m
A-004 Et - Me -
A-007 Et - Me 5-F
式(I)所示的化合物之中，第1个表至第3个表中记载的化合物的1H-NMR数据如下所示(GA-005A的NMR数据见上文，因此以下省略)。
对于质子核磁共振化学位移值而言，将氘代二甲基亚砜的值设为2.49ppm，在氘代二甲基亚砜中以270MHz或400MHz进行测定。需要说明的是，表中的符号表示下述含义。s：单峰、brs：宽单峰、d：二重峰、dd：双二重峰、t：三重峰、q：四重峰、m：多重峰。
k-1:B-1；400MHz
δ10.82(s,1H),9.71(s,1H),7.25(d,J＝8.0Hz,1H),7.07(t,J＝8.0Hz,2H),6.63(d,J＝8.0Hz,2H),6.56(t,J＝8.0Hz,1H),6.39(d,J＝8.0Hz,1H),5.93(d,J＝12Hz,1H),4.28(m,1H),2.80(q,J＝8.0Hz,2H),1.95(s,3H),1.40(d,J＝8.0Hz,3H)1.03(t,J＝8.0Hz,3H).(NH的一个信号未观测到)
k-1:D-1；270MHz
δ13.66(s,1H),10.76(s,1H),9.70(s,1H),8.98(s,1H),7.25(d,J＝10.8Hz,1H),6.86(t,J＝10.8Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.20-5.95(m,3H),5.87(t,J＝5.4Hz,NH),3.88(d,J＝5.4Hz,2H),2.78(q,J＝8.0Hz,2H),1.97(s,3H),1.05(t,J＝8.1Hz,3H).
k-1:J-1；270MHz
δ13.45(br,1H),9.57(s,1H),9.53(s,1H),9.36(s,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,1H),7.11(d,J＝8.1Hz,1H),6.80-6.70(m,3H),6.64(br,NH),6.37(d,J＝8.1Hz,1H),4.25(d,J＝5.4Hz,2H),2.65(q,J＝8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.08(t,J＝8.1Hz,3H).
k-1:H-1；270MHz
δ13.98(s,1H),11.13(s,1H),10.01(s,1H),7.58(d,J＝8.1Hz,1H),7.41(t,J＝8.1Hz,2H),6.95(d,J＝8.1Hz,2H),6.89(t,J＝8.1Hz,1H),6.72(d,J＝8.1Hz,1H),6.29(t,J＝8.1Hz,NH),4.27(d,J＝8.1Hz,2H),3.11(q,J＝8.1Hz,2H),2.29(s,3H),1.37(t,J＝8.1Hz,3H).
A-004；270MHz
δ13.63(s,1H),10.91(s,1H),9.71(s,1H),8.02(d,J＝2.7Hz,1H),,7.79(d,J＝5.4Hz,1H),7.26(d,J＝8.1Hz,1H),7.08(t,J＝8.1Hz,1H),6.94(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.23(d,J＝8.1Hz,1H),4.33(m,J＝8.1Hz,1H),2.82(q,J＝8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.42(d,J＝8.1Hz,3H),1.05(t,J＝8.1Hz,3H).
A-007；270MHz
δ13.61(s,1H),10.97(s,1H),9.73(s,1H),7.89(brs,1H),7.71(brs,1H),7.26(d,J＝8.1Hz,1H),6.98(d,J＝8.1Hz,1H),6.79(d,J＝13.5Hz,1H),6.69(d,J＝8.1Hz,1H),6.38(d,J＝8.1Hz,1H),4.34(m,1H),2.82(q,J＝8.1Hz,2H),1.93(s,3H),1.40(d,J＝8.1Hz,3H),1.05(t,J＝8.1Hz,3H).
[实施例1]旁分泌因子释放量试验1
(培养上清液的回收)
通过使用了间充质干细胞增殖培养基2(PromoCell公司制)的单层培养法(2D)对来源于人骨髓的间充质干细胞(hMSC、PromoCell公司制)进行预培养。将hMSC悬浮于相同的培养基中后，在三维培养法(3D)中，以成为5×105个细胞/2mL/孔的方式接种于在底面具有凹部的细胞非粘附性的6孔EZSPHERE板(AGC TECHNO GLASS公司制，#4810-900)。在2D中，以成为5×105个细胞/2mL/孔的方式接种于6孔平底板(Corning公司制，#3516)。然后，以最终浓度成为5μM的方式，以2μL/孔添加已溶解于DMSO中的化合物k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1，在37℃、5％CO2培养箱中培养48小时。作为对照，以最终浓度成为0.05％的方式添加DMSO。48小时后，更换为不含化合物的培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，在48小时后回收培养上清液。另外，回收培养上清液时的细胞数量通过下述方法来计量：使用Detach Kit(PromoCell公司制)分散成单细胞，将一部分悬浮于台盼蓝(和光纯药工业公司制)中，使用TC-20(BIO-RAD公司制)来计数活细胞数量。
(使用了ELISA的定量)
使用微孔板检测仪，对培养上清液中含有的旁分泌因子之一、作为细胞因子的血管生成素(ANG)进行定量。在定量时，使用了人血管生成素ELISA试剂盒(Abcam plc.制，#ab99970)。
基于细胞数量校正ANG的培养上清液中浓度，将相对于进行2D培养的对照组的相对值示于表4。结果，通过添加化合物k-1：B-1、k-1：D-1、及化合物k-1：J-1，在2D培养及3D培养中分泌量均增加。由此可见，通过向间充质干细胞添加化合物k-1：B-1、k-1：D-1、及化合物k-1：J-1，促进了旁分泌因子的分泌。
[表4]
(每10000个细胞的分泌量(pg)的相对值)
Figure BDA0002994180810000421
[实施例2]旁分泌因子释放量试验2
(培养上清液的回收)
通过使用了间充质干细胞增殖培养基2(PromoCell公司制)的单层培养法(2D)对来源于人骨髓的间充质干细胞(hMSC、PromoCell公司制)进行预培养。将hMSC悬浮于相同的培养基中后，在三维培养法(3D)中，以成为5×105个细胞/2mL/孔的方式接种于在底面具有凹部的细胞非粘附性的6孔EZSPHERE板(AGC TECHNO GLASS公司制，#4810-900)。在2D中，以成为5×105个细胞/2mL/孔的方式接种于6孔平底板(Corning公司制，#3516)。然后，以最终浓度成为5μM的方式，以2μL/孔添加已溶解于DMSO中的化合物k-1：B-1，在37℃、5％CO2培养箱中培养48小时。作为对照，以最终浓度成为0.05％的方式添加DMSO。48小时后，更换为不含化合物的培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，在48小时后回收培养上清液。另外，回收培养上清液时的细胞数量通过下述方法来计量：使用Detach Kit(PromoCell公司制)分散成单细胞，将一部分悬浮于台盼蓝(和光纯药工业公司制)中，使用TC-20(BIO-RAD公司制)来计数活细胞数量。
(使用了ELISA的定量)
使用微孔板检测仪，对培养上清液中含有的旁分泌因子之一、作为细胞因子的斯钙素1(STC-1)进行定量。在定量时，使用了人斯钙素ELISA试剂盒(Abcam plc.制，#ab213829)。
基于细胞数量校正STC-1的培养上清液中浓度，将相对于进行2D培养的对照组的相对值示于表5。结果，与2D培养相比，其分泌量在3D培养中增加。另外，通过添加化合物k-1：B-1，在2D培养及3D培养中分泌量均增加，与2D培养的对照组相比，在3D培养的化合物添加组中，STC-1的分泌量增加至8.95倍。由此可见，通过向经3D培养的间充质干细胞添加化合物k-1：B-1，以最大程度促进了旁分泌因子的分泌。
[表5]
(每10000个细胞的分泌量(pg)的相对值)
Figure BDA0002994180810000431
[实施例3]炎症刺激下的旁分泌因子释放量试验
(培养上清液的回收)
通过使用了间充质干细胞增殖培养基2(PromoCell公司制)的单层培养法(2D)对来源于人骨髓的间充质干细胞(hMSC、PromoCell公司制)进行预培养。将hMSC悬浮于相同的培养基中后，在三维培养法(3D)中，以成为5×105个细胞/2mL/孔的方式接种于在底面具有凹部的细胞非粘附性的6孔EZSPHERE板(AGC TECHNO GLASS公司制，#4810-900)。在2D中，以成为5×105个细胞/2mL/孔的方式接种于6孔平底板(Corning公司制，#3516)。然后，以最终浓度成为5μM的方式，以2μL/孔添加已溶解于DMSO中的化合物k-1：J-1，在37℃、5％CO2培养箱中培养48小时。作为对照，以最终浓度成为0.05％的方式添加DMSO。48小时后，更换为仅添加了10ng/mL的TNFα(R&Dsystemes，#210-TA-020)的培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，在48小时后回收培养上清液。另外，回收培养上清液时的细胞数量通过下述方法来计量：使用Detach Kit(PromoCell公司制)分散成单细胞，将一部分悬浮于台盼蓝(和光纯药工业公司制)中，使用TC-20(BIO-RAD公司制)来计数活细胞数量。
(使用了ELISA的定量)
使用微孔板检测仪，对培养上清液中含有的旁分泌因子之一、作为细胞因子的肿瘤坏死因子刺激基因6蛋白(TSG-6)进行定量。在定量时，将TSG-6抗体(SantaCruz公司，#sc-65886)固相化至NuncMaxisorp(ThermoFisherScientific公司，#44-2404-21)板，使其与培养上清液试样反应，使用生物素修饰TSG-6抗体(R&Dsystems公司，#BAF-2104)、链霉亲和素-HRP(Abcam plc.，#ab7403)、底物溶液(KPL公司，#52-00-03)、反应终止液(KPL公司，#50-85-06)进行检测。标准曲线使用重组人TSG-6蛋白(R&Dsystems公司，#2104-TS)制作。
(使用了流式细胞仪的定量)
使用流式细胞仪，对培养上清液中含有的旁分泌因子之一、作为细胞因子的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)进行定量。定量分析使用BDTM CBA Flex Set(BD公司制558287)，按照BD公司方案实施。
基于细胞数量校正TSG-6、MCP-1的培养上清液中浓度，将相对于进行2D培养的对照组的相对值示于表6。结果，对于TSG-6而言，与2D培养相比，其分泌量在3D培养中增加。另外，通过添加化合物k-1：J-1，TSG-6的分泌量在2D培养及3D培养中均增加，与2D培养的对照组相比，在3D培养的化合物添加组中，TSG-6的分泌量增加至3.21倍。对于MCP-1而言，分泌量仅在3D培养的化合物添加组中增加。可见，虽然TNFα刺激促进TSG-6、MCP-1的产生是已知的事实，但通过向经3D培养的间充质干细胞添加化合物k-1：J-1，对于TNFα刺激的响应性提高，旁分泌因子的分泌得到了促进。该结果表明，化合物k-1：J-1提高对于炎症刺激的响应性，释放较多的抗炎症细胞因子，表明化合物k-1：J-1作为抗炎症治疗剂非常有用。
[表6]
(每10000个细胞的分泌量(pg)的相对值)
Figure BDA0002994180810000451
[实施例4]旁分泌因子释放量试验3
(培养上清液的回收)
通过使用了间充质干细胞增殖培养基2(PromoCell公司制)的单层培养法(2D)对来源于人骨髓的间充质干细胞(hMSC、PromoCell公司制)进行预培养。将hMSC悬浮于相同的培养基中后，在三维培养法(3D)中，以成为5×105个细胞/2mL/孔的方式接种于在底面具有凹部的细胞非粘附性的6孔EZSPHERE板(AGC TECHNO GLASS公司制，#4810-900)。在2D中，以成为5×105个细胞/2mL/孔的方式接种于6孔平底板(Corning公司制，#3516)。然后，以最终浓度成为5μM的方式，以2μL/孔添加已溶解于DMSO中的化合物k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1，在37℃、5％CO2培养箱中培养48小时。作为对照，以最终浓度成为0.05％的方式添加DMSO。48小时后，更换为不含化合物的培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，在48小时后回收培养上清液。另外，回收培养上清液时的细胞数量通过下述方法来计量：使用Detach Kit(PromoCell公司制)分散成单细胞，将一部分悬浮于台盼蓝(和光纯药工业公司制)中，使用TC-20(BIO-RAD公司制)来计数活细胞数量。
(使用了ELISA的定量)
使用微孔板检测仪，对培养上清液中含有的旁分泌因子之一、作为细胞因子的血管内皮生长因子(VEGF)进行定量。在定量时，使用了人VEGF ELISA试剂盒(Abcam plc.制，#ab100662)。
基于细胞数量校正VEGF的培养上清液中浓度，将相对于进行2D培养的对照组的相对值示于表7。结果，通过添加化合物k-1：B-1、k-1：D-1、及化合物k-1：J-1，在2D培养及3D培养中分泌量均增加。由此可见，通过向间充质干细胞添加化合物k-1：B-1、k-1：D-1、及化合物k-1：J-1，促进了旁分泌因子的分泌。
[表7]
(每10000个细胞的分泌量(pg)的相对值)
Figure BDA0002994180810000461
[实施例5]3D培养条件下的旁分泌因子释放量试验
(培养上清液的回收)
通过使用了间充质干细胞增殖培养基2(PromoCell公司制)的单层培养法(2D)对来源于人骨髓的间充质干细胞(hMSC、PromoCell公司制)进行预培养。将hMSC悬浮于相同的培养基中后，以成为20000个细胞/250μL/孔的方式接种于在底面具有凹部的细胞非粘附性的24孔EZSPHERE板(AGC TECHNO GLASS公司制，#4820-900SP)。然后，以最终浓度成为10μM的方式，以250μL/孔添加已溶解于DMSO中的本发明所使用的特定化合物，在37℃、5％CO2培养箱中培养72小时。作为对照，以最终浓度成为0.1％的方式添加DMSO。72小时后，更换为不含特定化合物的培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，在24小时后回收培养上清液。回收培养上清液时的细胞数量的校正使用了利用蛋白分析BCA试剂盒(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制，#297-73101)测得的总蛋白量。
(使用了ELISA的定量)
使用微孔板检测仪，对培养上清液中含有的旁分泌因子之一、作为细胞因子的血管内皮生长因子(VEGF)及血管生成素(ANG)进行定量。在定量时，分别使用了人VEGF ELISA试剂盒(Abcam plc.制，#ab100662)、人血管生成素ELISA试剂盒(Abcam plc.制，#ab99970)。
基于总蛋白量校正VEGF及ANG的培养上清液中浓度，算出相对于对照组的相对值。细胞因子的相对分泌量增加的化合物编号记载于下文中。本试验的结果表明，本发明所使用的特定化合物促进了旁分泌因子的分泌。
VEGF的相对分泌量增加了1.2倍以上的化合物编号：
k-1：B-1、k-1：J-1、A-004、GA-002A、A-004A
VEGF的相对分泌量增加了2倍以上的化合物编号：
k-1：B-1、A-004A
ANG的相对分泌量增加了2倍以上的化合物编号：
k-1：H-1、k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1、A-004、GA-002A、A-004A、A-007、GA-005A
ANG的相对分泌量增加了4倍以上的化合物编号：
k-1：H-1、k-1：B-1、k-1：D-1、A-004A
产业上的可利用性
根据本发明，能够非常简便且高效地促进细胞的旁分泌因子的产生。另外认为，利用本发明制造的细胞由于旁分泌因子的产生及分泌得到促进，因此非常适合作为移植用细胞。另外，对于利用本发明制造的细胞(例如，间充质干细胞)而言，旁分泌因子之中的多种抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质的产生及分泌得到显著促进。因此，利用本发明制造的细胞(例如，间充质干细胞)可优选用于炎症性疾病及缺血性疾病的治疗。综上，本发明在细胞培养领域、医疗领域中是极其有益的。
本申请以在日本提出申请的日本特愿2018-185799(申请日：2018年9月28)为基础，其内容全部包括在本说明书中。

Claims (27)

1.用于促进细胞产生旁分泌因子的培养基添加试剂，其包含下述式(I)表示的化合物或其盐：
[化学式1]
Figure FDA0002994180800000011
式(I)中，X为-NHCO-；R1为-Y-NH-Z-Ar，式中，Y及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，Ar为可具有取代基的芳基或杂芳基；R2为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基；R3为羟基；n为0、1或2的整数。
2.如权利要求1所述的试剂，其中，
R2为甲基、乙基、或异丁基，
n为0，
Ar为可被羟基或甲基取代的苯基，
Y为可被甲基或乙基取代的亚甲基。
3.如权利要求1或2所述的试剂，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，
[化学式2]
Figure FDA0002994180800000012
[化学式3]
Figure FDA0002994180800000021
[化学式4]
Figure FDA0002994180800000022
以及
[化学式5]
Figure FDA0002994180800000023
4.如权利要求1所述的试剂，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式6]
Figure FDA0002994180800000024
5.如权利要求1所述的试剂，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式7]
Figure FDA0002994180800000031
或者
[化学式8]
Figure FDA0002994180800000032
6.如权利要求1～5中任一项所述的试剂，其中，旁分泌因子为选自由抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质组成的组中的至少1种蛋白质。
7.如权利要求6所述的试剂，其中，抗炎症蛋白质为选自由TNF刺激基因6蛋白(TSG-6)及斯钙素1(STC-1)组成的组中的至少1种蛋白质。
8.如权利要求6所述的试剂，其中，促进血管新生的蛋白质为选自由血管生成素(ANG)、表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、上皮来源的中性粒细胞活化肽78(ENA-78)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)组成的组中的至少1种蛋白质。
9.如权利要求1～8中任一项所述的试剂，其中，细胞为间充质干细胞。
10.细胞培养用培养基，其包含权利要求1～9中任一项所述的试剂。
11.旁分泌因子的产生得到促进的细胞的制造方法，其包括在包含下述式(I)表示的化合物或其盐的培养基中培养细胞：
[化学式9]
Figure FDA0002994180800000041
式(I)中，X为-NHCO-；R1为-Y-NH-Z-Ar，式中，Y及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，Ar为可具有取代基的芳基或杂芳基；R2为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基；R3为羟基；n为0、1或2的整数。
12.如权利要求11所述的方法，其中，
R2为甲基、乙基、或异丁基，
n为0，
Ar为可被羟基或甲基取代的苯基，
Y为可被甲基或乙基取代的亚甲基。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，
[化学式10]
Figure FDA0002994180800000042
[化学式11]
Figure FDA0002994180800000043
[化学式12]
Figure FDA0002994180800000051
以及
[化学式13]
Figure FDA0002994180800000052
14.如权利要求11所述的方法，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式14]
Figure FDA0002994180800000053
15.如权利要求11所述的方法，其中，所述化合物为以下所示的化合物或其盐，
[化学式15]
Figure FDA0002994180800000054
或者
[化学式16]
Figure FDA0002994180800000061
16.如权利要求11～15中任一项所述的方法，其中，旁分泌因子为选自由抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质组成的组中的至少1种蛋白质。
17.如权利要求16所述的方法，其中，抗炎症蛋白质为选自由TNF刺激基因6蛋白(TSG-6)及斯钙素1(STC-1)组成的组中的至少1种蛋白质。
18.如权利要求16所述的方法，其中，促进血管新生的蛋白质为选自由血管生成素(ANG)、表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、上皮来源的中性粒细胞活化肽78(ENA-78)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)组成的组中的至少1种蛋白质。
19.如权利要求11～18中任一项所述的方法，其中，细胞为间充质干细胞。
20.如权利要求11～19中任一项所述的方法，其中，培养通过三维培养进行。
21.活体移植用组合物，其包含通过权利要求11～20中任一项所述的方法制造的细胞。
22.炎症性疾病或缺血性疾病的治疗用组合物，其包含通过权利要求19或20所述的方法制造的细胞。
23.如权利要求22所述的治疗用组合物，其中，炎症性疾病选自由炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肾炎、急性肾炎、慢性肾炎、肾小球肾炎、IgA肾病、糖尿病性肾病、膜性肾病、肾积水、造影剂肾病、肾盂肾炎、肾功能不全、间质性肾炎、肾损伤、肾病综合征、高血压性肾硬化症、糖尿病性肾小球硬化症、肾结石、淀粉样肾、肾静脉血栓症、Alport综合征、肝炎、肝硬化、胰腺炎、肺炎、鼻窦炎、鼻炎、关节炎、变形性膝关节病、变形性手关节病、变形性足关节病、变形性股关节病、类风湿性关节炎、周期性发热、口疮性口炎、咽炎、淋巴结炎综合征、成人斯蒂尔病、白塞病、痛风、假性痛风、Schnitzler综合征、慢性复发性多病灶性骨髓炎、冷卟啉相关周期热综合征、家族性寒冷性荨麻疹、Muckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤关节炎综合征、新生儿期发病的多系统炎性疾病、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期性综合征、高IgD综合征、Blau综合征、早发性结节病、家族性地中海热、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病、痤疮、中条-西村综合征、Majeed综合征、NLRP12相关周期热综合征、白细胞介素1受体拮抗剂缺乏症、白细胞介素36受体拮抗剂缺乏症、磷酯酶Cγ2相关抗体缺陷·免疫失调症、HOIL-1缺损症、SLC29A3缺损症、CARD14异常症、腺苷脱氨酶2缺乏症、STING相关婴儿期发病血管病变、及NLRC4异常症组成的组。
24.如权利要求20所述的治疗用组合物，其中，缺血性疾病选自由心绞痛、心肌梗塞、应激性心肌病、中枢性肺水肿、脑梗塞、缺血性脑中风、闭塞性动脉硬化症、及严重下肢缺血组成的组。
25.旁分泌因子的制造方法，其包括以下的工序：
工序(1)，在权利要求10所述的培养基中培养细胞；以及
工序(2)，回收(1)中使用的培养基的上清液。
26.如权利要求25所述的方法，其中，细胞为间充质干细胞。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中，旁分泌因子为选自由抗炎症蛋白质及促进血管新生的蛋白质组成的组中的至少1种蛋白质。
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