WO2019235569A1 - キナーゼ阻害剤 - Google Patents

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WO2019235569A1
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泰斗 西野
敬一朗 大塚
菜月 深澤
宏之 中嶋
彩子 相原
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日産化学株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a kinase inhibitor, a Hippo signaling pathway inhibitor, a therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanied by cell growth failure, a proliferation promoter for cells or tissues for transplantation treatment, and nuclear translocation of YAP and / or TAZ.
  • the present invention relates to a method for screening a substance for treating and / or preventing a disease associated with an increase in cerebral dysfunction.
  • kinases protein kinases, protein kinases
  • kinases are enzymes that phosphorylate the serine, threonine, or tyrosine hydroxyl groups of proteins, and are a group of enzymes responsible for signal transmission such as cell growth and differentiation.
  • kinases are present throughout the cell and are deeply involved in the regulation and control of cell proliferation, differentiation, function expression, and the like (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 abnormal protein kinase activity has been confirmed in many diseases, and treatment of diseases by inhibiting protein kinase activity has also been performed.
  • Non-patent Document 3 it is known that many oncogenes involved in canceration of cells encode protein kinases, and Gleevec, a protein kinase inhibitor, is used as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia (non-patent literature).
  • Gleevec a protein kinase inhibitor
  • Herceptin Herceptin
  • Patent Document 1 Herceptin is sold as a breast cancer therapeutic drug
  • LATS1 or LATS2 (Largetumorsuppressor 1 or 2) is a protein kinase that is a major factor constituting the Hippo signal transduction pathway (Patent Document 2, Non-Patent Documents 4 and 5). It is known that this transmission pathway is activated when cell density is increased and contact inhibition is applied, or when cells are damaged by active oxygen, DNA damage, etc. (Non-patent Documents 6 and 7, 8). When this transmission pathway is activated, LATS phosphorylates transcription coupling factor YAP (Yes-associated protein) or TAZ (transcriptional protein co-activator with PD PD-binding binding motif).
  • YAP Yes-associated protein
  • TAZ transcriptional protein co-activator with PD PD-binding binding motif
  • CCDN1, CTGF, BIRC2, CYR61, AMOTL2, TGFB2, etc. are known as examples of genes that are regulated by YAP (Non-patent Documents 9, 10, 11, 12). Activation of the Hippo signaling pathway leads to suppression of the expression of these genes, causing cell growth suppression and cell death induction.
  • Hippo signaling pathway is known to control stem cell self-renewal and differentiation (Non-patent Document 13). Further, the Hippo signaling pathway is necessary for maintaining the skin, intestinal tract and nerves, and if YAP does not function normally, repair upon tissue damage is inhibited (Non-patent Document 14). Furthermore, it has been reported that deletion of the Hippo signaling pathway restores systolic heart failure after myocardial infarction (Non-patent Document 15). Thus, since the Hippo signaling pathway controls the growth, maintenance, and recovery of cells, tissues, and organs, inhibitors of the Hippo signaling pathway or activators of YAP and TAZ are caused by cell proliferation failure. It can be expected as a therapeutic drug for diseases.
  • Non-patent Document 16 XMU-MP-1 has been reported as an inhibitor of MST1 (Non-patent Document 16). XMU-MP-1 has been shown to promote recovery from liver damage by inhibiting the Hippo signaling pathway. Furthermore, the effect of promoting the repair of eyeballs, skin and liver by compounds that inhibit LATS1 and LATS2 has been reported (Patent Document 3). Further, IBS008738 has been reported as an activator of TAZ, and the effect of promoting the recovery of muscle damage by this activator has been shown (Non-patent Document 17). As described above, a Hippo signaling pathway regulator is expected as a therapeutic agent for various diseases.
  • the present invention aims to provide a novel kinase inhibitor.
  • an object of the present invention is to provide a therapeutic agent for diseases, a screening method for drug discovery, and the like to which such an inhibitor is applied.
  • the present inventors have found that a specific compound inhibits the activity of a plurality of protein kinases including LATS (particularly LATS2).
  • the present inventors have identified that the specific compound promotes the nuclear translocation of the YAP protein in the cell, promotes the expression of the target gene group of YAP or TAZ protein, and has a specific carbon.
  • the present inventors have found that the activity varies greatly depending on the optical isomers, and the present invention has been completed by further research based on this finding. That is, the present invention is as follows.
  • a kinase inhibitor comprising a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof:
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or —YW—Z—Ar (wherein Y and Z are each a single bond or an optionally substituted carbon atom having 1 to 6 carbon atoms).
  • W is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 3 is a hydroxyl group
  • n is 0, 1 or 2 It is. ⁇ .
  • a Hippo signaling pathway inhibitor comprising a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof:
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or —YW—Z—Ar (wherein Y and Z are each a single bond or an optionally substituted carbon atom having 1 to 6 carbon atoms).
  • W is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 3 is a hydroxyl group
  • n is 0, 1 or 2 It is. ⁇ .
  • a therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanying cell growth failure comprising a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof:
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or —YW—Z—Ar (wherein Y and Z are each a single bond or an optionally substituted carbon atom having 1 to 6 carbon atoms).
  • W is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 3 is a hydroxyl group
  • n is 0, 1 or 2 It is. ⁇ .
  • the agent according to [5], wherein the disease or tissue damage accompanied by failure of cell proliferation is a disease accompanied by suppression of nuclear translocation of YAP and / or TAZ.
  • a cell or tissue growth promoter for transplantation treatment comprising a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof:
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or —YW—Z—Ar (wherein Y and Z are each a single bond or an optionally substituted carbon atom having 1 to 6 carbon atoms).
  • W is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 3 is a hydroxyl group
  • n is 0, 1 or 2 It is. ⁇ .
  • X is —NHCO—.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and n is 0.
  • R 1 is —Y—W—Z—Ar
  • Y is a methylene group which may have an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • W is N (R 4 )
  • Z is a single bond
  • Ar is an aryl group optionally having a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, [1] -The agent according to any one of [10].
  • R 2 is a methyl group, an ethyl group, or an isobutyl group, n is 0,
  • Ar is a phenyl group which may be substituted with a hydroxyl group or a methyl group,
  • Y is a methylene group optionally substituted with a methyl group or an ethyl group.
  • R 1 is —Y—W—Z—Ar
  • Y is a single bond
  • W is N (R 4 )
  • R 4 is a hydrogen atom
  • Z is carbon.
  • a methylene group which may have an alkyl group of 1 to 6 and Ar may have a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group of 1 to 6 carbon atoms
  • the agent according to any one of [1] to [12], which is a good aryl group.
  • R 2 is a methyl group, an ethyl group, or an isobutyl group, n is 0,
  • Ar is a phenyl group which may be substituted with a hydroxyl group
  • Step 1 A step of culturing cells in a medium containing a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof:
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or —YW—Z—Ar (wherein Y and Z are each a single bond or an optionally substituted carbon atom having 1 to 6 carbon atoms).
  • W is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2 It is.
  • ⁇ (Step 2) a step of measuring the abundance of YAP and / or TAZ in the cell nucleus in the cells obtained in (Step 1) in the presence of the test substance; (Step 3) When the abundance of YAP and / or TAZ measured in (Step 2) in the cell nucleus is decreased as compared to the abundance in the absence of the analyte, the analyte Is a substance for treating and / or preventing a disease associated with enhanced nuclear translocation of YAP and / or TAZ.
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or —YW—Z—Ar (wherein Y and Z are each a single bond or an optionally substituted carbon atom having 1 to 6 carbon atoms).
  • W is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 3 is a hydroxyl group
  • n is 0, 1 or 2 is (provided that X is -NHCO-, R 2 is an ethyl group, when n is 0, R 1 is, -CH Not -NH-C 6 H 5.) .
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and n is 0.
  • R 1 is —Y—W—Z—Ar
  • Y is a methylene group having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • W is N (R 4 )
  • Z is [20] to [22], which is a single bond
  • Ar is an aryl group optionally having a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the optically active substance or salt thereof according to any one of [20] to [24], wherein the compound represented by the formula (I) is a compound selected from the group consisting of:
  • R 1 is —Y—W—Z—Ar, Y is a single bond, W is N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom, and Z is carbon.
  • a methylene group having an alkyl group of 1 to 6 and Ar is an aryl group optionally having a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group of 1 to 6 carbon atoms
  • the optically active substance or salt thereof according to any one of [20] to [22].
  • [27] The optically active substance or salt thereof according to any one of [20] to [22] and [26], wherein the optically active substance is an R form.
  • the present invention is as follows. [1 ′] A kinase inhibitor comprising a compound represented by the following formula (I ′) or a salt thereof:
  • X 0 is —NHCO— and R 10 is —Y—NH—Z—Ar (wherein Y and Z are a single bond or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent, and Ar is an aryl group which may have a substituent. ), R 2 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 3 is a hydroxyl group, and n is an integer of 0, 1 or 2.
  • ⁇ . [2 ′] Hippo signaling pathway inhibitor comprising a compound represented by the following formula (I ′) or a salt thereof:
  • a therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanying cell growth failure comprising a compound represented by the following formula (I ′) or a salt thereof:
  • a proliferation promoter for cells or tissues for transplantation treatment comprising a compound represented by the following formula (I ′) or a salt thereof:
  • X 0 is —NHCO— and R 10 is —Y—NH—Z—Ar (wherein Y and Z are a single bond or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent, and Ar is an aryl group which may have a substituent. ), R 2 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 3 is a hydroxyl group, and n is an integer of 0, 1 or 2. ⁇ .
  • R 2 is a methyl group, an ethyl group, or an isobutyl group, n is 0,
  • Ar is a phenyl group which may be substituted with a hydroxyl group or a methyl group,
  • Y is a methylene group optionally substituted with a methyl group or an ethyl group.
  • [6 ′] The agent according to any one of [1 ′] to [5 ′], wherein the compound (I ′) is a compound selected from the group consisting of:
  • [8 ′] The agent according to any one of [1 ′], [5 ′] to [7 ′], wherein the kinase is selected from the group consisting of CGK2, LATS2, MSK1, p70S6K, PKAC ⁇ , PKAC ⁇ , SGK2, and SGK3 .
  • [9 ′] The agent according to [8 ′], wherein the kinase is LATS2.
  • [11 ′] Diseases or tissue damage accompanied by cell proliferation failure are inflammatory diseases, neurodegenerative diseases, immune neurological diseases, muscular dystrophy, myopathy, trauma, burns, spinal cord injury, muscle injury, liver failure, skin injury, brain
  • Step 1 A step of culturing cells in a medium containing a compound represented by the following formula (I ′) or a salt thereof:
  • X 0 is —NHCO— and R 10 is —Y—NH—Z—Ar (wherein Y and Z may have a single bond or a substituent)
  • An alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, Ar is an aryl group which may have a substituent, and R 2 has 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent.
  • An alkyl group, R 3 is a hydroxyl group, and n is an integer of 0, 1 or 2.
  • Step 2 a step of measuring the abundance of YAP and / or TAZ in the cell nucleus in the cells obtained in (Step 1) in the presence of the test substance;
  • Step 3 When the abundance of YAP and / or TAZ measured in (Step 2) in the cell nucleus is decreased as compared to the abundance in the absence of the analyte, the analyte Is a substance for treating and / or preventing a disease associated with enhanced nuclear translocation of YAP and / or TAZ.
  • a cell culture medium comprising the agent according to any one of [1 ′], [2 ′], and [4 ′] to [7 ′].
  • Compound (I ′) is a compound represented by formula (I), wherein X is —NHCO—, and R 1 is —YW—Z—Ar (wherein Y and Z are , A single bond, or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent, W is NH, and Ar is an aryl group which may have a substituent. This is the case.
  • the present invention it is possible to inhibit the activity of a plurality of kinases including LATS, which is the main kinase in the Hippo signaling pathway.
  • LATS which is the main kinase in the Hippo signaling pathway.
  • LATS kinase by inhibiting the activity of LATS kinase, it is possible to efficiently inhibit the Hippo signaling pathway.
  • the translocation of the YAP protein into the nucleus is promoted, and as a result, the expression of the target gene group of the YAP or TAZ protein can be promoted. Since inhibition of the Hippo signaling pathway in cells enhances cell proliferation, it becomes possible to treat diseases associated with cell proliferation failure (particularly diseases associated with activation of the Hippo signaling pathway) or tissue damage.
  • MST1 and LATS2 genes can be deleted (gene knockout) or their expression can be suppressed (gene knockdown) using molecular biological techniques. ) was necessary. These methods are excellent from the viewpoint of selective inhibition, but complicated operations and time are required to obtain cells in which the target gene is knocked down or knocked out. It is necessary to add genetic manipulation.
  • the Hippo signaling pathway can be selectively inhibited simply by adding the compound to the medium during cell culture.
  • the compound is removed from the medium, the inhibitory effect is lost, and therefore, it is also optimal for use in temporarily inhibiting the Hippo signaling pathway.
  • FIG. 1 is a diagram in which the amounts of YAP, phosphorylated YAP and TAZ in SKOV3 cells cultured in a medium supplemented with a specific compound of the present invention were observed using a Western blotting method.
  • FIG. 2 is a diagram observing changes in liver weight in mice administered with a specific compound of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram observing changes in the length of the large intestine in mice administered with the specific compound of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram observing changes in the area of skin wounds in mice administered with the specific compound of the present invention.
  • n- means normal, i- means iso, sec- means secondary, and tert- means tertiary.
  • o- means ortho, m- means meta, and p- means para.
  • Halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.
  • the “halogeno group” is fluoro, chloro, bromo or iodo.
  • Alkyl group and “alkyl group having 1 to 6 carbon atoms” mean a linear or branched alkyl group, specifically, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl. , Sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, tert-pentyl, neopentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, n-hexyl, 2-hexyl, and the like.
  • Aryl group includes monocyclic, bicyclic, tricyclic and tetracyclic carbocyclic groups in which at least one ring is aromatic and each ring has from 5 to 8 ring atoms. Specific examples include phenyl, indenyl, naphthyl, fluorenyl and the like. In particular, the aryl group can be a C 6-10 aromatic phenyl, indenyl, naphthyl.
  • Alkylene group and “C 1-6 alkylene group” mean a linear carbon chain, and specific examples include groups such as methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene and the like.
  • alkyl group may have a substituent, and examples of such a substituent include the following.
  • substituent include the following.
  • an “alkyl group” the following (1) to (40) can be mentioned, and in the case of an “aryl group” and an “alkylene group”, the following (1) to (41) can be mentioned.
  • a halogeno group (2) hydroxyl group, (3) a cyano group, (4) Nitro group, (5) carboxyl group, (6) alkenyl group (C 2-10 alkenyl group; eg, vinyl, allyl, propenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, heptenyl, butadienyl, hexatrienyl, and isomers thereof), (7) alkynyl group (C 2-10 alkynyl group; eg, ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl, hexynyl, and isomers thereof), (8) a halogenoalkyl group (eg, monofluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, monofluoroethyl, difluoroethyl, trifluoroethyl, chloromethyl, chloroethyl, dichloroethyl
  • a carbamoyl group (27) a carbamoyl group, (28) a carbamoyl group (eg, methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl, diethylcarbamoyl, ethylmethylcarbamoyl) mono- or di-substituted with an alkyl group (synonymous with the “alkyl group” in (26) above), (29) sulfamoyl group, (30) A sulfamoyl group mono- or di-substituted with an alkyl group (same as “alkyl group” in (26) above) (eg, methylsulfamoyl, ethylsulfamoyl, dimethylsulfamoyl, diethylsulfamoyl, Ethylmethylsulfamoyl), (31) an alkanoyl group (eg,
  • the “C 1-6 alkyl group” is one having 1 to 6 carbon atoms in the above “alkyl group”
  • the “C 6-10 aryl group” is the above “aryl group”. Of these, those having 6 to 10 carbon atoms.
  • Specific examples of the acyl group include acetyl group, propionyl group, butyroyl group, isobutyroyl group, valeroyl group, isovaleroyl group, pivaloyl group, hexanoyl group, acryloyl group, methacryloyl group, crotonoyl group, isocrotonoyl group, benzoyl group, naphthoyl group. Groups, etc.
  • an alkoxycarbonylamino group eg, a carbonylamino group substituted with an alkoxy group (as defined in (12) above)
  • an alkylsulfonyl group eg, a sulfonyl group substituted with an alkyl group (synonymous with the “alkyl group” in (26) above)
  • an alkylsulfinyl group eg, a sulfinyl group substituted with an alkyl group (synonymous with the “alkyl group” in (26) above)
  • (40) alkoxycarbonyl group eg, methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group
  • (41) Alkyl groups C 1-6 alkyl groups; examples, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-penty
  • the compound represented by the formula (I) may be in the form of a salt.
  • the salt of the compound represented by the formula (I) include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid and hydrobromic acid, and acetic acid, propionic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, oxalic acid, And salts with organic acids such as succinic acid, citric acid and benzoic acid.
  • the compound represented by the formula (I) may have an E isomer having an E configuration and a Z isomer having a Z configuration depending on the type of the substituent.
  • the present invention encompasses these E-form, Z-form, or a mixture containing E-form and Z-form in an arbitrary ratio.
  • the compound represented by the formula (I) may have an optically active substance resulting from the presence of one or more asymmetric carbon atoms, but the compound represented by the formula (I) Includes optically active or racemic forms.
  • the reaction mixture is precipitated by adding distilled water, or when it does not precipitate, a normal post-treatment such as concentration after extraction with an organic solvent can be performed to obtain the target specific compound.
  • a normal post-treatment such as concentration after extraction with an organic solvent can be performed to obtain the target specific compound.
  • it can be separated and purified by any purification method such as recrystallization, column chromatograph, thin layer chromatograph, liquid chromatographic fractionation and the like.
  • optically active substance can be obtained by a method known per se such as a method using crystallization, a method using an enzyme reaction, or a method using HPLC (eg, an optically active support method).
  • an optically active substance can also be prepared using an asymmetric synthesis method or the like.
  • the “optically active substance” means an optical isomer that is judged to be more active at least in inhibiting the kinase activity of LATS1 or 2.
  • kinase inhibitor of the present invention provides a kinase inhibitor (hereinafter sometimes referred to as “kinase inhibitor of the present invention”) comprising the following specific compound or a salt thereof.
  • the compound contained in the kinase inhibitor of the present invention has the formula (I):
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or —YW—Z—Ar (wherein Y and Z are each a single bond or an optionally substituted carbon atom having 1 to 6 carbon atoms).
  • W is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 3 is a hydroxyl group
  • n is 0, 1 or 2 It is.
  • a salt thereof hereinafter, the compound represented by the formula (I) or a salt thereof may be simply referred to as “specific compound used in the present invention” or the like).
  • X in the formula (I) is —NHCO—
  • R 1 is —YW—Z—Ar
  • Y is an optionally substituted substituent having 1 to 6 carbon atoms.
  • An alkylene group preferably an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably a methylene group optionally substituted with a methyl group or an ethyl group).
  • W is N (R 4 ) (more preferably, N (R 4 ), wherein R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom), Z is a single bond, and Ar is an aryl group which may have a substituent (preferably has a substituent).
  • An optionally substituted phenyl group more preferably a halogeno group, a hydroxyl group, a methyl group or an ethoxy group.
  • W is N (R 4 (More preferably, N (R 4 ), wherein R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and particularly preferably N (R 4 ), and R 4 is hydrogen Atom) or an oxygen atom, and Z is an alkylene group which may have a single bond or a substituent (more preferably, an alkylene group which may have a substituent, particularly preferably a substituted group).
  • Ar is an aryl group (more preferably, an aryl having a hydroxyl group) which may have a substituent (such as a halogen atom, a hydroxyl group, a methyl group, or a methoxy group).
  • the compound represented by the formula (I) can be any of the compounds shown below.
  • the compound represented by the formula (I) may be an R-isomer among the optical isomers of the compounds shown below.
  • the amount of the specific compound used in the present invention blended in the kinase inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as a desired effect can be obtained, but is usually 0.01 to 100% by weight, preferably 0.1 to 100%. % By weight, more preferably 1 to 100% by weight, still more preferably 5 to 100% by weight, particularly preferably 10 to 100% by weight.
  • the kinase inhibitor of the present invention can be in any shape at the time of provision or storage.
  • the composition can be bound to formulated solids such as tablets, pills, capsules, granules, liquids such as solutions or suspensions dissolved in suitable solvents and solubilizers, or substrates or single bodies. It can be in the state.
  • suitable solvents and solubilizers or substrates or single bodies. It can be in the state.
  • the solvent for preparation include aqueous solvents such as water, physiological saline, dimethyl sulfoxide (DMSO), various alcohols such as methanol, ethanol, butanol, propanol, glycerin, propylene glycol, and butylene glycol.
  • Additives for formulation include antiseptics such as p-hydroxybenzoates; excipients such as lactose, glucose, sucrose, and mannitol; lubricants such as magnesium stearate and talc; polyvinyl Examples include binders such as alcohol, hydroxypropyl cellulose, and gelatin; surfactants such as fatty acid esters; and plasticizers such as glycerin. These additives are not limited to those described above, and can be freely selected as long as they are available to those skilled in the art.
  • the kinase inhibitor of the present invention may be sterilized as necessary.
  • the sterilization method is not particularly limited, and examples thereof include radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, autoclave sterilization, and filter sterilization.
  • the material of the filter part at the time of performing filter sterilization (hereinafter sometimes referred to as filter sterilization) is not particularly limited.
  • filter sterilization glass fiber, nylon, PES (polyethersulfone), hydrophilic PVDF (polyvinylidene fluoride), Examples include cellulose mixed ester, cellulose acetate, and polytetrafluoroethylene.
  • the pore size of the filter is not particularly limited, but is preferably 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, more preferably 0.1 ⁇ m to 1 ⁇ m, and most preferably 0.1 ⁇ m to 0.5 ⁇ m.
  • the specific compound may be in a solid state or a solution state.
  • inhibitor kinase means that the phosphorylation function of kinase is inhibited and its activity is lost or attenuated.
  • Examples of the type of kinase inhibited by the kinase inhibitor of the present invention include, but are not limited to, CGK2, LATS2, MSK1, p70S6K, PKAC ⁇ , PKAC ⁇ , SGK2, and SGK3.
  • “attenuating the activity of a kinase” means, for example, at least 5% or more, at least 10% or more, at least 15% or more compared to the phosphorylation activity level of a predetermined kinase as a control, At least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, It means that the kinase activity is attenuated by at least 75% or more, at least 80% or more, at least 85% or more, at least 90% or more, at least 95% or more, or at least 99% or more.
  • a method known per se such as the MSA method can be used as described in the following examples.
  • the kinase is a downstream effector, and the intracellular localization of YAP and / or TAZ, which are targets for phosphorylation, is known per se. It is also possible to indirectly evaluate the degree of attenuation of the kinase activity by confirming using a general method.
  • inhibiting LATS2 means that the function of LATS2 as a kinase is inhibited and its activity is lost or attenuated.
  • LATS2 is evolutionarily conserved in a wide range of species from yeast to humans.
  • LATS2 whose activity is inhibited by the kinase inhibitor of the present invention can be LATS2 in any organism, including rat, mouse, rabbit, guinea pig, squirrel, hamster, vole, platypus, dolphin, whale, dog, cat, It may be a mammalian LATS such as goat, cow, horse, sheep, pig, elephant, common marmoset, squirrel monkey, rhesus monkey, chimpanzee, human. LATS2 inhibited by the kinase inhibitor of the present invention may preferably be human LATS.
  • the simple description “LATS” includes both “LATS1” and “LATS2” and a complex of LATS1 and LATS2.
  • Examples of usage modes of the kinase inhibitor of the present invention include, but are not limited to, molecular biological tests and research use.
  • the activity of a specific kinase was suppressed by administering the kinase inhibitor of the present invention to a cell expressing a specific kinase such as LATS2.
  • Cells can be easily prepared. The cells thus obtained can be useful for analyzing the function of a specific kinase, screening candidate substances that can regulate the function of the specific kinase, and the like.
  • the cell that expresses the specific kinase may be a mammal-derived cell.
  • examples of such cells include somatic cells, normal cell lines, cancer cell lines, progenitor cells, stem cells, cells that have been artificially modified from living organisms, and human cells that have been artificially modified from living organisms. Examples include, but are not limited to, cells with exchanged nuclei. The origin of these cells is not particularly limited, and rat, mouse, rabbit, guinea pig, squirrel, hamster, vole, platypus, dolphin, whale, dog, cat, goat, cow, horse, sheep, pig, elephant, common Examples include cells derived from mammals such as marmoset, squirrel monkey, rhesus monkey, chimpanzee, and human.
  • the tissue or organ from which such cells are derived is not particularly limited, and examples of the tissue include skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, and bladder. , Prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, bone, cartilage, vascular tissue, blood, heart, eye, brain or nerve tissue, etc., and examples of organs include liver, lung, kidney, Examples include the heart, pancreas, stomach, spleen, small intestine, large intestine, and genital organs.
  • the “stem cell” means a cell having the ability to replicate itself and the ability to differentiate into cells of other multiple lineages, and examples thereof are not limited to the following.
  • Embryonic stem cells ES cells
  • embryonic tumor cells embryonic germ stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • neural stem cells hematopoietic stem cells
  • mesenchymal stem cells mesenchymal stem cells
  • hepatic stem cells pancreatic stem cells
  • muscle stem cells Examples include germ stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, and hair follicle stem cells.
  • Examples of the pluripotent stem cells include ES cells, embryonic germ stem cells, and iPS cells among the stem cells.
  • Progenitor cells are cells that are in the process of being differentiated from the stem cells into specific somatic cells or germ cells.
  • the administration of the kinase inhibitor of the present invention to a cell expressing a specific kinase can be achieved by adding the kinase inhibitor of the present invention to a medium in which the cell is cultured.
  • the addition amount of the kinase inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained.
  • the concentration of the specific compound used in the present invention in the medium is usually 0.001 to It can be 100 ⁇ M, preferably 0.01 M to 50 ⁇ M, more preferably 0.1 to 30 ⁇ M, still more preferably 1 to 20 ⁇ M, and particularly preferably 5 to 10 ⁇ M.
  • a medium for culturing cells is not particularly limited, and a commercially available medium can also be used.
  • Suitable commercially available media include, for example, Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM), Ham F12 Medium (Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM / F12 Medium, McCoy's Medium (McCoy's 5) , Eagle MEM (Eagle's MiniummEssential Medium; EMEM), ⁇ MEM (alpha Modified Eagle's Minium Essential Medium; ⁇ MEM), MEM (Minum Essial Medium16) DM), MCDB131 medium, William medium E, IPL41 medium, Fischer's medium, StemPro34 (manufactured by Invitrogen), X-VIVO 10 (manufactured by Kemplecks), X-VIVO 15 (manufactured by Kem
  • Specific examples include basic fibroblast growth factor, transforming growth factor- ⁇ , transforming growth factor- ⁇ , epidermal growth factor, insulin-like growth factor, Wnt protein, amphiregulin, interferons, interleukins.
  • Vascular endothelial growth factor platelet-derived growth factor, hepatocyte growth factor, albumin, insulin, ⁇ -mercaptoethanol, Knockout Serum Replacement (KSR, manufactured by Thermo Fisher Scientific), Glutamax (Thermo Fisher Scientific) Manufactured), hydrocortisone, epinephrine, L-glutamine, pyruvic acid, selenious acid, and the like.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • Glutamax Thermo Fisher Scientific
  • Cell culture conditions may be those known per se, or may be appropriately modified according to the purpose.
  • the temperature at which the cells are cultured is usually 25 to 39 ° C., preferably 33 to 39 ° C. (eg, 37 ° C.).
  • the carbon dioxide concentration is usually 4 to 10% by volume in the culture atmosphere, and preferably 4 to 6% by volume.
  • the culture period is usually 1 to 35 days, but may be set appropriately according to the purpose of the culture.
  • Hippo Signaling Pathway Inhibitor also provides a Hippo signaling pathway inhibitor (hereinafter sometimes referred to as “Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention”) comprising the specific compound used in the present invention. To do.
  • Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention a Hippo signaling pathway inhibitor comprising the specific compound used in the present invention.
  • Hippo signaling pathway is a signaling pathway involved in cell proliferation, cell death, organ size, self-renewal, stem and progenitor cell differentiation, wound healing, and tissue regeneration. This pathway is evolutionarily conserved in a wide variety of organisms, particularly highly conserved in mammals.
  • Major factors of the Hippo signaling pathway in mammals include LATS1 and LATS2.
  • LATS is activated by association with the scaffold protein Mob1A / B.
  • LATS is also activated by phosphorylation by STE20 family protein kinases Mst1 and Mst2.
  • LATS phosphorylates downstream effectors YAP and TAZ, which are transcriptional coupling factors. The phosphorylation of YAP and TAZ by LATS is a very important event in the Hippo signaling pathway.
  • YAP and TAZ translocate from the nucleus to the cytoplasm and are degraded by the ubiquitin proteasome system.
  • YAP and / or TAZ are phosphorylated by LATS, translocate into the cytoplasm and degraded.
  • the Hippo signaling pathway is in an inactive state, YAP and / or TAZ are not phosphorylated and are localized in the cell nucleus.
  • YAP and / or TAZ are transcription coupling factors and are known to induce expression of various genes when localized in the cell nucleus. Many of the genes whose expression is induced by YAP and / or TAZ are known to mediate cell survival and proliferation. Examples of such genes include, but are not limited to, CCND1, CTGF, BIRC2, CYR61, AMOTL2, TGFB2, ANKRD1, and the like.
  • the CCND1 gene (also referred to as CYCLIN D1, “PRAD1”, etc.) is present on chromosome 11 in humans.
  • the protein encoded by the gene (295 amino acids, molecular weight: about 36 kDa) is associated with the promotion of the cell cycle.
  • the CTGF gene (also referred to as connective tissue growth factor, “CCN2”, etc.) is present in chromosome 6 in humans, and is a polypeptide (349 amino acids, molecular weight: about 35 kDa) that induces cell growth promotion and the like. Code.
  • the BIRC2 gene (also called baculovirural IAP repeat kontaining 2, “API1”, etc.) is a protein that exists in chromosome 11 and inhibits apoptosis by caspase degradation activity (618 amino acids, molecular weight: approximately 70 kDa).
  • the CYR61 gene (also referred to as cysteine rich angiogenic inductor 61, “CCN1”, etc.) is present on chromosome 1 in humans.
  • the protein encoded by the gene (381 amino acids, molecular weight: about 39 kDa) plays an important role in angiogenesis, VEGF enhancement, and bone formation.
  • the AMOTL2 gene (angiomotin like 2, also referred to as “LCCP”) is present on chromosome 3 (3q22.2) in humans.
  • a protein (837 amino acids, molecular weight: about 92 kDa) encoded by the gene is related to angiomotin that inhibits angiogenesis and belongs to the motin protein family.
  • the ANKRD1 gene (also called Ankyrinkrepeat domain-contining protein 1, Cardiac adriamicin-responsive protein, "CARP") is present on chromosome 10 in humans.
  • a protein (319 amino acids, molecular weight: about 36 kDa) encoded by the gene is highly expressed in the myocardium and skeletal muscle and functions as a transcription factor.
  • the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention inhibits the kinase activity of LATS (particularly LATS2) and inhibits the phosphorylation of YAP and / or TAZ by LATS. Since YAP and / or TAZ are not phosphorylated, YAP and / or TAZ translocation into the nucleus is promoted. As a result, gene expression of genes whose expression is induced by YAP and / or TAZ is enhanced. Therefore, the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention can be rephrased as “a YAP and / or TAZ nuclear translocation promoter” or “an expression promoter of a gene induced by YAP and / or TAZ”. .
  • promoting the nuclear translocation of YAP and / or TAZ means that YAP and / or TAZ in the nucleus rather than the cytoplasm is inhibited by inhibiting phosphorylation and proteolysis of YAP and / or TAZ. It means increasing the abundance of TAZ.
  • increasing the amount of YAP and / or TAZ is, for example, at least 1.3 times or more, at least 1.5 times or more compared to the amount of YAP and / or TAZ in the cell nucleus as a control, At least 2 times, at least 3 times, at least 4 times, at least 5 times, at least 6 times, at least 7 times, at least 8 times, at least 9 times, at least 10 times, YAP and / or TAZ
  • the measurement of the abundance of cell nuclei of YAP and / or TAZ is known per se, such as imaging analysis using an anti-YAP (or TAZ) antibody to which a fluorescent label is bound, as used in Examples described later. It can implement by the method of.
  • the abundance of YAP and / or TAZ cell nuclei can be indirectly measured by observing the phosphorylation state of YAP and / or TAZ using Western blotting or the like.
  • expression promotion of a gene induced by YAP and / or TAZ means a gene induced by YAP and / or TAZ as a result of promoting the transfer of YAP and / or TAZ to the cell nucleus. It means that the expression level of (for example, at least one of CCND1, CTGF, BIRC2, CYR61, AMOTL2, TGFB2, ANKRD1) is enhanced.
  • gene expression is increased, for example, at least 1.3 times or more compared to the expression level of a predetermined control level (for example, a cell group to which the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention is not added), at least 1.5 times or more, at least 2 times or more, at least 3 times or more, at least 4 times or more, at least 5 times or more, at least 6 times or more, at least 7 times or more, at least 8 times or more, at least 9 times or more, at least 10 times or more
  • a predetermined control level for example, a cell group to which the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention is not added
  • evaluation of the enhancement of gene expression may be evaluated at the transcription level using a microarray method, a real-time PCR method or the like, or may be evaluated at the protein translation level using a Western blotting method or the like.
  • Examples of usage modes of the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention include, but are not limited to, molecular biological tests and use for research purposes. Specific examples of use for molecular biological tests and research purposes include, for example, administration of the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention to cells having the Hippo signaling pathway, thereby inhibiting the Hippo signaling pathway.
  • the cells in the prepared state can be easily prepared.
  • the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention promotes the transfer of YAP and / or TAZ to the nucleus, the phenotype of the disease involving YAP and / or TAZ is more clearly defined in the cell. Can appear. Therefore, by using cells having such characteristics, it is possible to efficiently search for substances that can regulate the functions of YAP and / or TAZ.
  • the cell having the Hippo signaling pathway can be a mammal-derived cell.
  • examples of such cells include somatic cells, normal cell lines, cancer cell lines, progenitor cells, stem cells, cells that have been artificially modified from living organisms, and human cells that have been artificially modified from living organisms. Examples include, but are not limited to, cells with exchanged nuclei. The origin of these cells is not particularly limited, and rat, mouse, rabbit, guinea pig, squirrel, hamster, vole, platypus, dolphin, whale, dog, cat, goat, cow, horse, sheep, pig, elephant, common Examples include cells derived from mammals such as marmoset, squirrel monkey, rhesus monkey, chimpanzee, and human.
  • the tissue or organ from which such cells are derived is not particularly limited, and examples of the tissue include skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, and bladder. , Prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, bone, cartilage, vascular tissue, blood, heart, eye, brain or nerve tissue, etc., and examples of organs include liver, lung, kidney, Examples include the heart, pancreas, stomach, spleen, small intestine, large intestine, and genital organs.
  • the administration of the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention to cells having the Hippo signaling pathway is achieved by adding the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention to a medium in which the cells are cultured.
  • the addition amount of the kinase inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained.
  • the concentration of the specific compound used in the present invention in the medium is usually 0.001 to It can be 100 ⁇ M, preferably 0.01 to 50 ⁇ M, more preferably 0.1 to 30 ⁇ M, still more preferably 1 to 20 ⁇ M, and particularly preferably 5 to 10 ⁇ M.
  • the medium for culturing the cells is not particularly limited, and a commercially available medium can also be used.
  • the commercially available medium that can be used in the use of the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention is the same as the commercially available medium that can be used in the use of the kinase inhibitor of the present invention.
  • Cell culture conditions and the like are the same as those described for the kinase inhibitor of the present invention.
  • the present invention also includes a therapeutic agent for diseases or tissue damage with cell proliferation deficiencies (hereinafter referred to as “cell proliferation of the present invention” comprising the specific compound used in the present invention. Sometimes referred to as “therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanied by dysfunction of the cerebral dysfunction”).
  • the Hippo signaling pathway is a signaling pathway involved in cell proliferation, cell death, organ size, self-renewal, stem and progenitor cell differentiation, wound healing, tissue regeneration, in particular by inhibiting the Hippo signaling pathway Cell proliferation, wound healing, and tissue regeneration are enhanced. Therefore, in one aspect, the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention can also be used for regeneration of diseases or damaged tissues accompanied by cell growth failure.
  • sterilization treatment, etc. in the therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanied by cell growth failure according to the present invention The same as described in the kinase inhibitor of the present invention.
  • the therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanying cell growth failure of the present invention may be used alone or in combination with at least one other therapeutic agent. At that time, the therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanied by cell proliferation failure of the present invention may be administered simultaneously with the therapeutic agent, or may be administered prior to or after administration of the therapeutic agent. Good. The therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanying cell growth failure of the present invention may be administered by the same or different administration route as the therapeutic agent.
  • Such therapeutic agents include chemotherapeutic agents, supportive therapeutic agents, or combinations thereof.
  • treating means partially or completely reducing the degree of a disease, improving or improving clinical symptoms or indicators associated with the disease, delaying the progression of the disease, Includes partially or substantially achieving one or more of suppressing or preventing, or partially or completely delaying, suppressing or preventing the onset or progression of a disease .
  • the animal to which the therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanying cell growth failure of the present invention is applied is usually a mammal, preferably a human, but a pet (eg, dog, cat, guinea pig, rabbit, squirrel) Etc.) or livestock (cattle, sheep, pigs, horses, etc.).
  • a mammal preferably a human, but a pet (eg, dog, cat, guinea pig, rabbit, squirrel) Etc.) or livestock (cattle, sheep, pigs, horses, etc.).
  • the therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanied by cell growth failure of the present invention is usually an oral administration agent such as tablets, capsules, powders, granules, pills, syrups, rectal administration agents, and transdermal absorption agents.
  • an oral administration agent such as tablets, capsules, powders, granules, pills, syrups, rectal administration agents, and transdermal absorption agents.
  • the drug can be administered as a single therapeutic agent or as a mixture with other therapeutic agents. They may be administered alone, but are generally administered in the form of a pharmaceutical composition.
  • These preparations can be produced by a conventional method with addition of pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives. That is, additives such as ordinary excipients, lubricants, binders, disintegrants, wetting agents, plasticizers, and coating agents can be used for oral preparations.
  • Oral solutions may be in the form of an aqueous or oily suspension, solution, emulsion, syrup, elixir, etc., or provided as a dry syrup prepared with water or other suitable solvent prior to use.
  • the liquid preparation may contain conventional additives such as suspending agents, fragrances, diluents or emulsifiers.
  • Suppository uses cacao butter, lauric fat, macrogol, glycerogelatin, witepsol, sodium stearate or mixtures thereof as a base, and emulsifiers, suspending agents, preservatives as necessary Etc. can be added.
  • Injectables may be distilled water for injection, physiological saline, 5% glucose solution, propylene glycol and other solubilizers or solubilizers, pH adjusters, etc.
  • Pharmaceutical ingredients such as tonicity agents and stabilizers are used.
  • topical administration agent include sprays, aerosols, creams, ointments, lotions, liniments, and gels, preferably sprays, creams, ointments, and gels.
  • These preparations contain additives such as absorption promoters, pH adjusters, preservatives, flavoring agents, dispersants, wetting agents, stabilizers, preservatives, suspending agents, surfactants and antibacterial agents as necessary. can do.
  • the therapeutic agent of this invention can be used with a coating
  • examples thereof include gauze, polyurethane film, hydrocolloid, polyurethane foam, alginate coating material, hydrogel, hydrofiber, hydropolymer and the like.
  • Examples of the preparation of the therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanying cell growth failure of the present invention and methods for preparing the same are illustrated below, but the present invention is not limited thereto.
  • Formulation Example 1 A granule containing the following ingredients is produced.
  • Component Compound represented by formula (I) 10 mg Lactose 700mg Corn starch 274mg HPC-L 16mg 1000mg total
  • the compound represented by the formula (I) and lactose are passed through a 60 mesh sieve. Pass corn starch through a 120 mesh sieve. These are mixed in a V-type mixer. A low-viscosity hydroxypropylcellulose (HPC-L) aqueous solution is added to the mixed powder, kneaded and granulated (extruded granulated pore diameter 0.5 to 1 mm), and then dried. The obtained dried granules are sieved with a vibrating sieve (12/60 mesh) to obtain granules.
  • HPC-L low-viscosity hydroxypropylcellulose
  • Formulation Example 2 A powder for capsule filling containing the following components is produced.
  • Component Compound represented by formula (I) 10 mg Lactose 79mg Corn starch 10mg Magnesium stearate 1mg 100mg total
  • the compound represented by the formula (I) and lactose are passed through a 60 mesh sieve. Pass corn starch through a 120 mesh sieve. These and magnesium stearate are mixed in a V-type mixer. Fill 10 mg powder into a No. 5 hard gelatin capsule.
  • Formulation Example 3 A capsule filling granule containing the following ingredients is produced.
  • Component Compound represented by formula (I) 15 mg Lactose 90mg Corn starch 42mg HPC-L 3mg 150mg total
  • the compound represented by the formula (I) and lactose are passed through a 60 mesh sieve. Pass corn starch through a 120 mesh sieve. These are mixed in a V-type mixer. A low-viscosity hydroxypropylcellulose (HPC-L) aqueous solution is added to the mixed powder, kneaded, granulated, and dried. The obtained dried granule is sieved with a vibrating screen (12/60 mesh) and the size is adjusted, and 150 mg of the dried granule is filled into a No. 4 hard gelatin capsule.
  • HPC-L low-viscosity hydroxypropylcellulose
  • Formulation Example 4 A tablet containing the following ingredients is produced.
  • the compound represented by the formula (I), lactose, microcrystalline cellulose, and CMC-Na (carboxymethyl cellulose-sodium salt) are passed through a 60 mesh sieve and mixed. Magnesium stearate is added to the mixed powder to obtain a mixed powder for preparation. The mixed powder is directly hit to obtain a 150 mg tablet.
  • Formulation Example 5 The intravenous formulation is produced as follows. Compound represented by formula (I) 100 mg Saturated fatty acid glyceride 1000mL The solution of the above components is usually administered intravenously to the patient at a rate of 1 mL per minute.
  • Formulation Example 6 The liquid is produced as follows. 10 mg of the compound represented by formula (I) 1mL ethanol 99mL water Mix the above ingredients.
  • Formulation Example 7 The liquid is produced as follows. 1 g of a compound represented by the formula (I) Pluronic F-68 10g Propylene glycol 20mL 2.4 g trishydroxymethylaminomethane 970 mL of water Mix the above ingredients.
  • the dosage is determined by the age and condition of the patient, but in normal adults, oral or rectal administration,
  • the dosage of the specific compound used in the present invention is about 0.1 to 1000 mg / human / day, and about 0.05 mg to 500 mg / human / day for injections.
  • the dose is usually 0.01 mg / kg to 100 mg / kg per adult, and the administration frequency is usually 1 to 6 times a day.
  • Certain compounds used in the present invention that can be utilized as prodrugs are chemically or metabolically degradable groups that produce the pharmacologically active compounds of the present invention by solvolysis or in vivo under physiological conditions. It is the derivative
  • an acyloxy derivative obtained by reacting the compound with an appropriate acyl halide or an appropriate acid anhydride is exemplified as a prodrug.
  • Particularly preferred acyloxy as a prodrug includes —OCOC 2 H 5 , —OCO (t-Bu), —OCOC 15 H 31 , —OCO (m—CO 2 Na—Ph), —OCOCH 2 CH 2 CO 2 Na, — And OCOCH (NH 2 ) CH 3 , —OCOCH 2 N (CH 3 ) 2 and the like.
  • an amide derivative produced by reacting a compound having an amino group with an appropriate acid halide or an appropriate mixed acid anhydride is exemplified as a prodrug.
  • Particularly preferred amides as prodrugs include —NHCO (CH 2 ) 20 OCH 3 , —NHCOCH (NH 2 ) CH 3 and the like.
  • diseases to which the therapeutic agents for diseases or tissue damage associated with cell growth failure of the present invention can be applied include diseases or tissue damage that can be treated as a result of cell proliferation promotion, wound healing, tissue regeneration by inhibiting Hippo signaling pathway. If it is, it will not specifically limit.
  • the disease associated with impaired cell proliferation includes a disease associated with abnormal activation of the Hippo signaling pathway.
  • the disease associated with cell proliferation failure includes a disease associated with suppression of nuclear translocation of YAP and / or TAZ.
  • diseases or tissue damage associated with such cell growth failure include, for example, inflammatory diseases (eg inflammation, dermatitis, atopic dermatitis, hepatitis, nephritis, glomerulonephritis, pancreatitis, psoriasis, gout, Addison disease) (Addison's disease), inflammatory bowel disease (eg, Crohn's disease), ulcerative colitis, collagenous colitis, lymphocytic colitis, ischemic colitis, free-standing colitis, Behcet Syndrome, infectious colitis, and unclassifiable colitis), neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease) Spinocerebellar degeneration (SCD), multiple system atrophy (MSA), spinal muscular atrophy (SMA), bulbar spinal Muscle atrophy), immune neurological diseases (eg, multiple sclerosis, Guillain
  • the therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanied by cell growth failure is effective in promoting engraftment and recovery when cells, tissues, organs, etc. are transplanted into mammals.
  • Examples of cells to be transplanted include stem cells (hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.), ⁇ cells, and the like, but are not limited thereto.
  • Examples of tissues to be transplanted include, but are not limited to, blood, red blood cells, platelets, lymphocytes, bone marrow, umbilical cord blood, blood vessels, cornea, retina, eyeballs, skin, and the like.
  • organs to be transplanted include, but are not limited to, pancreas, lung, kidney, liver, heart, small intestine and the like.
  • the therapeutic agent for diseases or damaged tissues accompanied by cell growth failure of the present invention is also referred to as “cell, tissue, and / or organ transplant survival promoter”.
  • Cell or tissue growth promoter for transplantation treatment The present invention may also be referred to as a cell or tissue growth promoter for transplantation treatment (hereinafter referred to as "the growth promoter of the present invention") containing the specific compound used in the present invention. Is).
  • a cell in which the Hippo signaling pathway is suppressed or inhibited or a tissue containing the cell is suitable for transplantation treatment, and is compared with a cell or tissue in which the Hippo signaling pathway is not suppressed or inhibited after transplantation into a subject. Shortening the time required for engraftment and / or recovery is expected.
  • the cells cultured in the medium supplemented with the growth promoter of the present invention can be mammalian cells.
  • examples of such cells include somatic cells, normal cell lines, cancer cell lines, progenitor cells, stem cells, cells that have been artificially modified from living organisms, and human cells that have been artificially modified from living organisms. Examples include, but are not limited to, cells with exchanged nuclei.
  • the origin of these cells is not particularly limited, and rat, mouse, rabbit, guinea pig, squirrel, hamster, vole, platypus, dolphin, whale, dog, cat, goat, cow, horse, sheep, pig, elephant, common Examples include cells derived from mammals such as marmoset, squirrel monkey, rhesus monkey, chimpanzee, and human.
  • the tissue or organ from which such cells are derived is not particularly limited, and examples of the tissue include skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, and bladder.
  • stem cells are preferred as cells to be cultured.
  • stem cells are preferred as cells to be cultured.
  • ES cells and iPS cells are cultured in vitro using a medium to which the growth promoter of the present invention is added, the proliferation of the cells is promoted, and a large amount of ES cells or iPS cells can be efficiently prepared. it can.
  • the ES cells or iPS cells thus obtained can be suitably used for transplantation treatment by differentiating them into the target tissue by a method known per se.
  • the amount of the growth promoter of the present invention added to the medium is not particularly limited as long as the Hippo signaling pathway in the cell is inhibited.
  • the concentration of the specific compound used in the present invention in the medium is usually 0.001. It can be set to ⁇ 100 ⁇ M, preferably 0.01 M to 50 ⁇ M, more preferably 0.1 to 30 ⁇ M, further preferably 1 to 20 ⁇ M, and particularly preferably 5 to 10 ⁇ M.
  • the addition timing of the growth promoter of the present invention to the medium may be added at any timing as long as the cells are cultured and amplified, but from the viewpoint of the effect of promoting cell growth. It is preferable to add from the beginning of the culture.
  • the medium to which the growth promoter of the present invention can be added is not particularly limited as long as it is a medium that can maintain or proliferate cells, and a commercially available medium can also be used.
  • the commercially available medium that can be used when using the growth promoter of the present invention is the same as the commercially available medium that can be used when using the kinase inhibitor of the present invention.
  • the culture conditions in the medium to which the growth promoter of the present invention is added are not particularly limited as long as the cells can be maintained or amplified, but the culture temperature is, for example, in the range of 30 to 40 ° C., preferably in the range of 36 to 38 ° C. Of these, 37 ° C. can be preferably exemplified.
  • the frequency of medium exchange is not particularly limited as long as cells can be maintained or amplified, but may be, for example, every 1 to 5 days, preferably every 3 days.
  • the frequency of passage is not particularly limited as long as the cells can be maintained or amplified, and can be appropriately performed at the timing when the population of cells (preferably organoid) becomes large. For example, every 4 to 12 days, Preferably, it may be every 6 to 10 days.
  • Cell and / or tissue culture is performed using petri dishes, flasks, plastic bags, Teflon (registered trademark) bags, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi dishes, microplates, microwell plates commonly used for cell culture. It can be carried out using a culture container such as a multi-plate, multi-well plate, chamber slide, tube, tray, culture bag or roller bottle.
  • a culture container such as a multi-plate, multi-well plate, chamber slide, tube, tray, culture bag or roller bottle.
  • the culture container one in which the surface of the culture container is artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion with cells may be used.
  • Examples of such containers include Matrigel®, Geltrex®, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, iMatrix-511, iMatrix-411, iMatrix-221.
  • attachment with respect to the culture apparatus of a cell and / or a tissue can also be used.
  • coating materials include, but are not limited to, hydrogel, prevelex (registered trademark), silicon, poly (2-hydroxymethyl methacrylate), poly (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine), and the like.
  • coating materials include, but are not limited to, hydrogel, prevelex (registered trademark), silicon, poly (2-hydroxymethyl methacrylate), poly (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine), and the like.
  • those in which the surface of the culture vessel is artificially treated for the purpose of reducing adhesion with cells can be used.
  • Examples of such a culture container include Sumilon Celtite Plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), PrimeSurface (registered trademark) plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), ultra-low adhesion surface plate (manufactured by Corning), Nunkronsfera A plate (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) and the like are exemplified, but not limited thereto.
  • Cell and / or tissue culture is performed under automatic control of cell seeding, medium exchange, cell image acquisition, and cultured cell collection under mechanical control, and controls pH, temperature, oxygen concentration, etc. However, it can also be performed by a bioreactor capable of high-density culture or an automatic culture apparatus. Methods that use these devices to replenish a new medium during culture and supply the required substances to cells and / or tissues without excess or deficiency include fed-batch culture, continuous culture, and perfusion culture. It is not limited.
  • the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention can be inhibited.
  • Cells in which the Hippo signaling pathway is inhibited mimics the cellular environment of the disease with enhanced nuclear translocation of YAP and / or TAZ. Therefore, by using such cells, a candidate substance that can be applied to the treatment or prevention of the disease can be screened.
  • the present invention is a method for screening a substance for treating and / or preventing a disease associated with enhanced nuclear translocation of YAP and / or TAZ (hereinafter sometimes referred to as “the screening method of the present invention”). I will provide a.
  • cells are first cultured in a medium to which the specific compound used in the present invention (or the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention may be added) is added (step 1).
  • the amount of cells, medium, specific compound added to the medium, etc. that can be used in Step 1 are the same as those described in the kinase inhibitor of the present invention.
  • the test substance is brought into contact with the cells obtained in step 1.
  • Contact of the test substance can be performed by adding the test substance to the cell culture medium.
  • the cells are usually maintained and cultured for 1 to 5 days (preferably 2 to 4 days).
  • the Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention it is preferable to add to the culture medium for maintenance culture so that the inhibition of the Hippo signaling pathway in the cells is maintained.
  • the abundance of YAP and / or TAZ in the cell nucleus is measured in the cells contacted with the test substance (step 2).
  • the test substance may have a disease associated with increased nuclear translocation of YAP and / or TAZ. It can be determined as a therapeutic and / or prophylactic agent (step 3).
  • the decrease in the amount of YAP and / or TAZ is, for example, at least 5% or more, at least 10% or more, at least 15% or more compared to the amount of YAP and / or TAZ in the cell nucleus as a control.
  • the measurement of the abundance of cell nuclei of YAP and / or TAZ is known per se, such as imaging analysis using an anti-YAP (or TAZ) antibody to which a fluorescent label is bound, as used in the examples described later. It can implement by the method of.
  • the disease accompanied by enhanced nuclear translocation of YAP and / or TAZ includes cancer, specifically, colorectal cancer, pancreatic cancer, lung cancer, ovarian cancer, liver cancer, breast cancer, renal cancer, Examples include, but are not limited to, prostate cancer, gastrointestinal cancer, melanoma, cervical cancer, bladder cancer, glioblastoma, and head and neck cancer.
  • Method of Inhibiting Kinase The present invention is referred to as a method of inhibiting a specific kinase activity, which comprises contacting a cell with a specific compound used in the present invention (hereinafter referred to as “method of inhibiting the kinase of the present invention”). Is). Since the method for inhibiting the kinase of the present invention can be suitably carried out using the above-described kinase inhibitor of the present invention, the embodiment can be applied to this method. In one embodiment, the method of inhibiting a kinase of the present invention inhibits the phosphorylation activity of LATS2 in a cell.
  • the present invention comprises a method for inhibiting Hippo signaling pathway, which comprises contacting a cell with a specific compound used in the present invention (hereinafter referred to as “inhibiting Hippo signaling pathway of the present invention”). Sometimes referred to as "method"). Since the method of inhibiting the Hippo signaling pathway of the present invention can be preferably carried out using the aforementioned Hippo signaling pathway inhibitor of the present invention, the embodiment can be applied to this method.
  • the present invention relates to treating diseases or tissue damage associated with impaired cell proliferation, comprising administering to a subject a specific compound used in the present invention.
  • the treatment method of the present invention Since the therapeutic method of the present invention can be suitably carried out using the therapeutic agent for diseases or tissue damage accompanied by the failure of cell growth of the present invention described above, the embodiment can be applied to this method.
  • the treatment method of the present invention is carried out for the purpose of promoting engraftment and recovery particularly when cells, tissues, organs, etc. are transplanted into mammals, the treatment method of the present invention is “cells, tissues, and In other words, it is also referred to as “a method for promoting survival of organ transplantation”.
  • the present invention relates to a method for promoting the growth of transplanted cells or tissues (hereinafter referred to as "the method") comprising administering to a cell the specific compound used in the present invention. , Sometimes referred to as “proliferation promoting method of the present invention”). Since the growth promoting method of the present invention can be suitably carried out using the above-described growth promoting agent of the present invention, the embodiment can be applied to this method. In addition, since the cell or tissue for transplantation treatment can be efficiently prepared by the method for promoting proliferation of the present invention, the method for promoting proliferation of the present invention is also referred to as “method for producing cells or tissue for transplantation treatment”.
  • the present invention also includes a cell culture medium (hereinafter referred to as “the growth inhibitor of the cell or tissue for transplantation of the present invention” or the inhibitor of the present invention, the Hippo signal transduction pathway inhibitor of the present invention, or the present invention. Sometimes referred to as “medium of the present invention”).
  • the medium of the present invention comprises the kinase inhibitor of the present invention, the Hippo signal transduction pathway inhibitor of the present invention, and the cell or tissue growth promoter of the present invention for transplantation of these agents into cell culture.
  • the concentration of CO 2 in the CO 2 incubator (%) was expressed by% by volume of CO 2 in the atmosphere.
  • PBS phosphate buffered saline (manufactured by Sigma Aldrich Japan)
  • FBS fetal bovine serum (manufactured by Biological Industries).
  • (w / v) represents the weight per volume.
  • 1 H-NMR represents a proton nuclear magnetic resonance spectrum and was measured in deuterated dimethyl sulfoxide at 270 MHz or 400 MHz. The chemical shift value is described with the value of deuterated dimethyl sulfoxide being 2.49 ppm.
  • the symbol s represents a singlet.
  • brs represents a broad singlet
  • d represents a doublet
  • dd represents a doublet
  • t represents a triplet
  • q represents a quartet
  • m represents a multiplet.
  • the synthesized 34 compounds are listed in Table 1.
  • the description of Me represents methyl
  • the description of Et represents ethyl
  • n-Pr represents normal propyl
  • i-Bu represents isobutyl
  • Ph represents phenyl
  • Naph represents naphthyl.
  • the description of “—” in (R 3 ) n represents unsubstituted, and the number described in the structural formula represents the substitution position of (R 3 ) n . [Table 1]
  • k-1, k-2 and k-5 can be synthesized by known methods (SumSTH et al., Tetrahedron. 2015 Jul 1; 71 (26-27): 4557 -4564.) Of the 10 hydrazides, H-1, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-9, D-2 and D-4 were synthesized by known methods. (Samal RP et al., Chem Biol Drug Des. 2013 Jun; 81 (6): 715-29. Etc.). Therefore, the synthesis method of k-3 and H-7 will be described in detail below.
  • the intermediate compound (1.04 g, 7.42 mmol) obtained as described above was suspended in propionic acid (7 mL), propionic anhydride (1.15 mL, 8.90 mmol), BF 3 -Et 2 O (1.12 mL, 8.90 mmol) was added and heated to reflux at 130 ° C. for 1 hour. After allowing to cool, the reaction solution was diluted with ethyl acetate (100 mL), and washed successively with water (100 mL ⁇ 3), saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (100 mL ⁇ 2), and brine (100 mL).
  • the intermediate compound (5.11 g, 26.4 mmol) obtained as described above was dissolved in methanol (26 mL), hydrazine monohydrate (12.8 mL, 264 mmol) was added, and 4.5 hours at room temperature. Stir. Water (150 mL) was added and extracted with methylene chloride (30 mL ⁇ 5).
  • k-1 100 mg, 0.55 mmol
  • glycine ethyl hydrochloride (A-1) 100 mg, 0.72 mmol
  • sodium acetate 64 mg, 0.78 mmol
  • DMSO 1.1 mL
  • the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
  • k-1 (100 mg, 0.55 mmol) was dissolved in DMSO (1.1 mL), n-octylamine (A-3) (120 mL, 0.72 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours and at 100 ° C. for 17 hours. Stir. After allowing to cool, water (20 mL) and ethyl acetate (20 mL) were added and the phases were separated, and the organic layer was washed with saturated brine (20 mL). The extract was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
  • the obtained solid was washed with IPE to obtain k-1: A-3 (60.1 mg, 0.206 mmol, yield 37%) as a yellow solid.
  • Table 3 shows compounds synthesized by a method according to the above synthesis method. [Table 3]
  • Table 4 shows the 1 H-NMR measurement results of the compounds listed in Table 3.
  • Methyl 2-bromopropionate (109) (500 mg, 3.0 mmol) was dissolved in DMSO (6 mL) and aniline (0.36 mL, 3.9 mmol) and potassium carbonate (0.54 g, 3.9 mmol) were added. Stir at room temperature for 21 hours. Ethyl acetate (30 mL) and water (50 mL) were added for liquid separation, and the organic layer was washed with saturated brine (30 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • 113 (96 mg, 0.43 mmol) obtained as described above was dissolved in methanol (1 mL), hydrazine monohydrate (0.042 mL, 0.87 mmol) was added, and hydrazine monohydrate was added at 50 ° C. for 4 hours. Hydrate (0.2 mL, 4.1 mmol) was added for 20 hours, and hydrazine monohydrate (0.1 mL, 2.1 mmol) was added and further stirred for 23 hours.
  • 117 (256 mg, 1.08 mmol) obtained as described above was dissolved in methanol (2.2 mL), and hydrazine monohydrate (0.10 mL, 2.2 mmol) was added thereto at 50 ° C. for 4 hours. Hydrazine monohydrate (0.50 mL, 10.3 mmol) was added for 20 hours, and hydrazine monohydrate (0.25 mL, 5.2 mmol) was added and further stirred for 23 hours.
  • Phenylpuruvic acid (119) (1.0 g, 6.1 mmol) was dissolved in DMF (5 mL), and DBU (1.0 mL, 6.7 mmol), methyl iodide (0.42 mL, 6.7 mmol) was cooled with ice. ) And stirred at room temperature for 3 hours. Ethyl acetate (30 mL) and 1M hydrochloric acid (50 mL) were added for liquid separation, and the organic layer was washed with saturated brine (50 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Boc-Gly-OH (121) (0.70 g, 4.0 mmol) was dissolved in methylene chloride (13 mL), and WSC (0.84 g, 4.4 mmol), phenylhydrazine (122) (0.47 mL, 4. 8 mmol) was added and stirred at room temperature for 4 hours. Water (20 mL) was added for liquid separation, and the organic layer was washed with saturated brine (20 mL).
  • Boc-Gly-OH (121) (0.70 g, 4.0 mmol) was dissolved in methylene chloride (13 mL), WSC (0.84 g, 4.4 mmol), benzylamine (125) (0.52 mL, 4. mmol). 8 mmol) was added and stirred at room temperature for 3 hours. Water (20 mL) and methylene chloride (20 mL) were added for liquid separation, and the organic layer was washed with saturated brine (20 mL).
  • 3-Benzyloxyaniline (129) (2.44 g, 12.2 mmol) was dissolved in DMF (24 mL), sodium acetate (1.10 g, 13.5 mmol), ethyl bromoacetate (128) (1.49 mL, 13 0.5 mmol) was added and stirred at room temperature for 4 hours. Water (300 mL) and ethyl acetate (150 mL) were added for liquid separation, and the organic layer was washed with saturated brine (100 mL).
  • N-methyl-aniline (142) (0.50 g, 4.7 mmol) was dissolved in ethanol (9 mL), potassium carbonate (0.97 g, 7.0 mmol), ethyl bromoacetate (128) (0.57 mL, 5 mL). 0.1 mmol) and stirred at 60 ° C. for 21 hours. Insoluble matter was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ethyl acetate (30 mL) and water (30 mL) were added to the resulting residue for liquid separation. The organic layer was washed with saturated brine (30 mL), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
  • K-1 L-1 (65 mg, white solid) was synthesized using resorcinol as a starting material by a method according to Synthesis Example 22 described above.
  • K-1 M-1 (119 mg, white solid) was synthesized using 3-mercaptophenol as a starting material by a method according to Synthesis Example 22 described above.
  • N-ethyl-aniline (145) (0.50 g, 4.1 mmol) was dissolved in ethanol (8 mL), potassium carbonate (0.86 g, 6.2 mmol), ethyl bromoacetate (128) (0.50 mL, 4 mL) 0.1 mmol) and stirred at 60 ° C. for 21 hours. Insoluble matter was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ethyl acetate (30 mL) and water (30 mL) were added to the resulting residue for liquid separation. The organic layer was washed with saturated brine (30 mL), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
  • 2-hydroxybenzyl alcohol (1.0 g, 8.1 mmol) was suspended in methylene chloride (10 mL) and water (10 mL), sodium bicarbonate (2.0 g, 24 mmol) was added, and phenyl chloroformate (2.0 mL under ice-cooling) was added. 2.0 mL, 16 mmol) was slowly added dropwise. The mixture was gradually warmed to room temperature and stirred for 5.5 hours, and methylene chloride (20 mL) and water (20 mL) were added to separate the layers. The organic layer was washed with saturated brine (30 mL), dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
  • D-alanine methyl hydrochloride (157) (1.40 g, 10.0 mmol), 3-benzyloxyphenylboronic acid (158) (3.43 g, 15.1 mmol), copper (II) acetate monohydrate (3 0.000 g, 15.1 mmol) and molecular sieve 4A (MS4A; 20 g) were dissolved in methylene chloride (200 mL), triethylamine (4.17 mL, 30.1 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 23 hours under an oxygen atmosphere.
  • MS4A molecular sieve 4A
  • the reaction solution was filtered through celite, and the filtrate was concentrated to half under reduced pressure, and a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (50 mL) was added to separate the layers.
  • the organic layer was washed with saturated brine (20 mL), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • reaction solution was filtered through Celite, and the filtrate was concentrated to half under reduced pressure, and methylene chloride (25 mL) and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (25 mL) were added to separate the layers.
  • the organic layer was washed with saturated brine (10 mL), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • kinases inhibitory activity evaluation 1 Compound k-1: B-1 was evaluated for inhibitory activity (calculation of 50% inhibitory concentration (IC 50 )) against 8 types of kinases (CGK2, LATS2, MSK1, p70S6K, PKAC ⁇ , PKAC ⁇ , SGK2, SGK3). . The activity was measured using the Off-chip Mobility Shift Assay (MSA method) described below. The test concentration of k-1: B-1 was added in 10 steps from a final concentration of 10 ⁇ M to 0.3 nM.
  • the average signal of control wells including all reaction components was 0% inhibition, the average signal without enzyme addition was 100% inhibition, and the inhibition rate was calculated from the average signal of each test substance test 2 well.
  • the IC 50 value was obtained by approximating a plot based on the test substance concentration and the inhibition rate to a four-parameter logistic curve by the nonlinear least square method using Excel solver add-in.
  • MSA method 5 ⁇ L of 4 ⁇ concentration k-1: B-1 solution, 5 ⁇ L of 4 ⁇ concentration substrate / ATP / metal prepared in assay buffer (20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH 7.5) The solution and 10 ⁇ L of double concentration kinase solution were mixed in wells of a polypropylene 384 well plate and allowed to react at room temperature for 1 or 5 hours. Subsequently, 70 ⁇ L of Termination Buffer (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences) was added to stop the reaction.
  • the substrate peptide and phosphorylated peptide in the reaction solution were separated and quantified by LabChip system (Perkin Elmer).
  • the kinase reaction was evaluated by the product ratio (P / (P + S)) calculated from the substrate peptide peak height (S) and the phosphorylated peptide peak height (P).
  • IC 50 values of k-1 B-1 are shown in Table 5.
  • k-1 B-1 inhibited CGK2, LATS2, MSK1, p70S6K, PKAC ⁇ , PKAC ⁇ , SGK2, and SGK3 kinases.
  • MSA method 5 ⁇ L of 4 ⁇ concentration compound solution prepared in assay buffer (20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH 7.5), 5 ⁇ L of 4 ⁇ concentration substrate / ATP / metal solution and 10 ⁇ L of 2 ⁇
  • concentration kinase solution was mixed in the well of a polypropylene 384 well plate and allowed to react at room temperature for 1 or 5 hours. Subsequently, 70 ⁇ L of Termination Buffer (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences) was added to stop the reaction.
  • the substrate peptide and phosphorylated peptide in the reaction solution were separated and quantified by LabChip system (Perkin Elmer).
  • the kinase reaction was evaluated by the product ratio (P / (P + S)) calculated from the substrate peptide peak height (S) and the phosphorylated peptide peak height (P).
  • compound k-1: H-7, k-1: H-1, k-1: D-1, k-1: J-1, and k-1: B-1 were 8 at 100 nM.
  • An activity inhibition rate of 40% or more was shown for various types of kinases (CGK2, LATS2, MSK1, p70S6K, PKAC ⁇ , PKAC ⁇ , SGK2, and SGK3).
  • the average signal of control wells including all reaction components was 0% inhibition, the average signal without enzyme addition was 100% inhibition, and the inhibition rate was calculated from the average signal of each test substance test 2 well.
  • the IC 50 value was obtained by approximating a plot based on the test substance concentration and the inhibition rate to a 4-parameter logistic curve by the nonlinear least square method using Excel solver add-in.
  • MSA method 5 ⁇ L of 4-fold concentration k-1: I-1, k-1: D-1, k-1 prepared in assay buffer (20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH 7.5) : J-1, k-1: H-1, k-1: H-7, k-1: B-1, k-5: H-1, k-1: H-3, k-1: D -4 and k-1: I-10 solution, 5 ⁇ L of 4 ⁇ substrate / ATP / metal solution and 10 ⁇ L of 2 ⁇ kinase solution are mixed in wells of a polypropylene 384 well plate, and 1 or 5 at room temperature. Reacted for hours.
  • Termination Buffer Quality of Service
  • k-1 I-1
  • k-1: The IC 50 values of B-1, k-5: H-1, k-1: H-3, k-1: D-4 and k-1: D-10 are shown in Table 7. These compounds have an IC 50 against LATS2 of 100 nM or less and were shown to have an inhibitory effect on LATS2.
  • AlexaFluor (R) 647-labeled YAP antibody (Cell Signaling Technology), anti-mouse TAZ (D-8) antibody (Santa Cruz), AlexaFluor (R) 555-labeled anti-mouse IgG antibody (ThermoFisherScientific) against fixed cells was used for immunostaining according to the recommended protocol of Cell Signaling Technology, and the cell nucleus was further stained with 10 ⁇ g / mL Hoechst 33342 solution.
  • Table 8 shows the nuclear translocation rates when no compound is added and k-1: B-1, k-1: H-1, and k-1: J-1 are added.
  • compounds k-1: B-1, k-1: H-1, and k-1: J-1 have an action of promoting nuclear translocation of YAP protein and TAZ protein. Became clear.
  • Example 5 Action of specific compound on nuclear translocation of YAP protein
  • k-1 B-1, k-1: H-1 and k-1: J-1
  • nuclei of YAP protein and TAZ protein An assessment was made of internal migration. Intranuclear transfer was performed by human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (PromoCell) and imaging analysis using the Operatta CLS (PerkinElmer) described in Example 4. The test concentrations of k-1: B-1, k-1: H-1 and k-1: J-1 were added so that the final concentration was 10 ⁇ M.
  • Sample preparation Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured by the protocol recommended by PromoCell are seeded in a 96-well plate with a cycloolefin bottom (manufactured by PerkinElmer, CellCarrier-Ultra) at 25,000 cells / 90 ⁇ L / well, and CO 2. The cells were cultured for 1 day in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). After incubation, k-1: B-1, k-1: H-1, and k-1: J-1 solutions at a concentration of 100 ⁇ M were added. The cells were fixed by culturing in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 4 hours, exchanging the medium with a 4% paraformaldehyde solution, and allowing to stand at room temperature for 10 minutes. The fixed cells were immunostained by the method described in Example 4.
  • Table 9 shows the nuclear translocation rates when the compound-free group and k-1: B-1, k-1: H-1, and k-1: J-1 were added.
  • compounds k-1: B-1, k-1: H-1, and k-1: J-1 have an action of promoting nuclear translocation of YAP protein and TAZ protein. Became clear.
  • k-1 B-1 dissolved in DMSO was added to the cell suspension to a final concentration of 10 ⁇ M. Further, after culturing in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 6 or 24 hours, 11 mL of phosphate buffered saline (PBS, manufactured by Sigma-Aldrich Japan) was added to the cell culture solution, followed by centrifugation (400G, 3 The cells were allowed to settle. After removing the supernatant, the cells were suspended in 10 mL of PBS, and a cell pellet was obtained by further centrifugation (400 G, 5 minutes).
  • PBS phosphate buffered saline
  • RNA ribonucleic acid
  • RNAeasy Mini Kit manufactured by Qiagen
  • This RNA was subjected to DNA microarray using HumanGene2.0ST Array (manufactured by Affymetrix), and the changes in human gene expression due to the addition of specific compounds were comprehensively analyzed. Use, product number; GA0312).
  • genes whose expression was increased by addition of k-1: B-1 and whose expression is controlled by YAP are shown in Table 10.
  • the numerical values in Table 10 represent the magnification of the expression level when k-1: B-1 is added when the gene expression level when no compound is added is 1.
  • Table 10 it was revealed that the compound k-1: B-1 has an effect of increasing the expression level of a gene whose expression is controlled by the YAP protein.
  • Example 7 Effect of specific compounds on protein amount of YAP, phosphorylated YAP, TAZ 2D culture conditions: Human ovarian cancer cell line SKOV3 cultured according to DS Pharma Biomedical recommended protocol, 15% (v / v) Suspended in McCoy's5a medium (manufactured by Sigma Aldrich) containing FBS, seeded in a 100 mm dish (Corning, # 430167) at 1,000,000 cells / 10 mL, and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours did. Thereafter, k-1: B-1 dissolved in DMSO was added to the culture solution to a final concentration of 1,5,10 ⁇ M. As controls, those without addition and those with DMSO added were cultured.
  • SDS sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis was performed on the lysate.
  • the protein was transferred to a membrane (BioRad) and stored in a blocking buffer. Thereafter, the probe was probed with a primary antibody that recognizes YAP (manufactured by CST Japan), phosphorylated YAP (Ser127, manufactured by CST Japan), TAZ (manufactured by CST Japan), and GAPDH (manufactured by Santa Cruz).
  • 3D culture conditions 0.015% (w / v) deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.), 30 ng / mL human EGF (PEPROTECH) according to the method of patent literature (WO2014 / 017513) And McCoy's 5a medium (Sigma Aldrich) containing 15% (v / v) FBS.
  • Human ovarian cancer cell line SKOV3 cultured according to DS Pharma Biomedical's recommended protocol is suspended in this medium and seeded in a low adhesion 100 mm dish (Corning, # 3262) at 2,000,000 cells / 10 mL. And cultured for 24 hours in a CO 2 incubator.
  • k-1 B-1 dissolved in DMSO was added to the culture solution to a final concentration of 1,5,10 ⁇ M.
  • those without addition and those with DMSO added were cultured.
  • the culture solution was transferred to a 50 mL tube, and 40 mL of ice-cooled phosphate buffered saline (PBS, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. After centrifugation at 10,000 rpm for 3 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed. Again, 50 mL of ice-cooled PBS was added and centrifuged at 10,000 rpm for 3 minutes at 4 ° C., and then the supernatant was removed.
  • PBS ice-cooled phosphate buffered saline
  • Example 8 Effect of specific compound on increase in liver weight in mouse liver partial resection model A partial liver resection model in which a part of the mouse liver was partially excised was prepared as described below. The liver weight increase effect of a specific compound was evaluated by comparing the liver weight.
  • Evaluation sample A 0.5 w / v% methylcellulose aqueous solution (0.5% MC, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and k-1: B-1 and k-1: J-1 were evaluated. k-1: B-1 and k-1: J-1 were suspended in 0.5% MC and prepared to a final concentration of 1 mg / mL.
  • mice were BALB / cAnNCrlCrlj, 5 weeks old, and males were purchased from Nippon Charles River Co., Ltd.
  • 0.5% MC-treated hepatectomy group 0.5% MC 10 mL / kg was continuously administered into the abdominal cavity every 24 hours for a total of 4 times.
  • k-1: B-1 or k-1: J-1 administration-the control group received a single dose of 10 mg / kg or 10 mL / kg of k-1: B-1 or k-1: J-1 intraperitoneally After 24 hours, the liver was completely removed and the liver weight was measured (n 5).
  • k-1 B-1 or k-1: J-1-hepatectomy group
  • k-1 B-1 or k-1: J-1 10 mg / kg, 10 mL / kg intraperitoneally for 24 hours
  • k-1 B-1 or k-1: J-1 10 mg / kg, 10 mL / kg intraperitoneally for 24 hours
  • FIG. 2 the change in the liver weight ratio of partially hepatectomized mice administered with 0.5% MC, k-1: B-1 or k-1: J-1 is shown in FIG.
  • k-1: B-1 and k-1: J-1 have an effect of promoting recovery of liver weight after excision. That is, k-1: B-1 and k-1: J-1 were found to have a therapeutic effect on tissue damage.
  • Example 9 Evaluation of kinase inhibitory activity of optical isomers
  • Compound k-1 LATS1 and LATS2 (carna bioscience) for B-1 (racemate), GA-002A, GA-002B, GA-005A and GA-005B Inhibitory activity evaluation (IC 50 calculation) was performed. The activity was measured using the Kinase Assay method described below.
  • Test concentrations of B-1 (racemate), GA-002A, GA-002B, GA-005A and GA-005B are 8 levels (10 ⁇ M, 1 ⁇ M, 100 nM, 30 nM, final concentration from 10 ⁇ M to 0.3 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0.3 nM).
  • the analysis method of the data is that the average signal of control wells containing reaction components other than the evaluation compound is 0% inhibition, the average signal without enzyme addition is 100% inhibition, and the inhibition rate is calculated from the average signal of each test substance test 2 well. Calculated.
  • the IC 50 value was calculated using EXSUS (version 7.1.6, manufactured by CAC Excicare).
  • kinase Assay method 2 ⁇ L of 2.5-fold concentration of the compound solution of the present invention prepared in assay buffer (20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, 50 ug / mL BSA, pH 7.5), 1 ⁇ L of 5-fold concentration substrate ( SGKtide: NH 2 —CKKRNRRLSVA-COOH, manufactured by SignalChem), ATP (manufactured by Sigma Aldrich), MgCl 2 (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (final concentration is 10 ⁇ M, 400 ⁇ M or 5 mM) and 2.5 ⁇ L of 2.5 ⁇ L A double-concentration kinase solution (LATS1 or LATS2 final concentration of 5 ⁇ g / mL) was mixed in the wells of a polypropylene 384-well plate (Greiner Bio-One, # 784900) and reacted at room temperature for 5 hours.
  • a detection solution (Fluorospark (registered trademark) Kinase / ADP Multi-Assay Kit; manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • 5 ⁇ L of a reaction stop solution (Fluorospark (registered trademark) Kinase / ADP Multi-Assay Kit; manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to stop the reaction. Thereafter, the ADP concentration in the reaction solution was quantified with EnSpire (manufactured by Perkin Elmer) to detect the kinase reaction.
  • k-1 B-1 (racemic), GA-002A (left-handed k-1: B-1, R-type), GA-002B (right-handed k-1: B-1) , S-form), GA-005A (R-form) and GA-005B (S-form) IC 50 values are shown in Table 11, and inhibition rates are shown in Table 12.
  • GA-002A and GA-005A were shown to have a high inhibitory effect on LATS1 and LATS2.
  • GA-002A had an IC 50 decrease that was more than twice that of k-1: B-1 (racemate).
  • the cells were cultured for 4 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. As a control, DMSO was added to a final concentration of 0.1%. After culturing, the number of viable cells was counted using ATP reagent (Promega, CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay). 64 ⁇ L / well of ATP reagent was added to the culture solution in the flat bottom plate and suspended, and 100 ⁇ L / well of the suspension was transferred to a white plate for assay (Corning, # 3912). After leaving still at room temperature for 10 minutes, the light-emission amount was measured using the plate reader (Perkin Elmer, EnSpire).
  • the compound of the present invention has an effect of promoting proliferation of epidermal keratinocytes.
  • Example 11 Effects of specific compounds on gene expression of human primary representative keratinocytes and human primary corneal epithelial cells
  • human representative representative keratinocytes (ATCC, # PCS-200-010) Pre-culture was performed by a monolayer culture method using an epidermal cell basal medium (ATCC, # PCS-200-030) supplemented with an additive kit for keratinocytes (ATCC, # PCS-200-040). Further, human primary corneal epithelial cells (ATCC, # PCS-700-010) were added to a corneal epithelial cell line basal medium (ATCC, #PCS) supplemented with a corneal epithelial cell line additive kit (ATCC, # PCS-700-040).
  • Corneal epithelial cells and epidermal keratinocytes were seeded in a 24-well flat bottom plate (Corning, # 3526) at 100,000 cells / 380 ⁇ L / well, and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours. Subsequently, the specific compound used in the present invention dissolved in DMSO was replaced with a medium added to a final concentration of 10 ⁇ M, and further cultured for 24 hours. After culturing, the cell culture medium was removed, and 500 ⁇ L / well of D-PBS (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., # 049-29793) was added and removed.
  • D-PBS Flujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., # 049-29793
  • RNA ribonucleic acid
  • RNeasy Mini Kit Qiagen
  • the RNA was subjected to gene expression analysis using Taqman Assay (Applied BioSystems) to analyze changes in human gene expression downstream of YAP and TAZ proteins due to the addition of specific compounds.
  • the analyzed gene name and Assay ID of the probe used are shown below.
  • Gene name AssayID GAPDH Hs02758991_g1 CYR61 Hs00155479_m1 ANKRD1 Hs00173317_m1 CCND1 Hs00765553_m1 About the obtained expression level, the relative value with respect to GAPDH was computed.
  • the relative expression level increased by adding the specific compound. That is, it was revealed that the specific compound used in the present invention has an effect of increasing the expression level of a gene whose expression is controlled by the YAP protein.
  • Example 12 Action of specific compound on nuclear translocation of YAP protein and TAZ protein
  • the specific compound used in the present invention was evaluated for nuclear translocation of YAP protein and TAZ protein. Intranuclear transfer was performed by human ovarian cancer cell line SKOV3 (DS Pharma Biomedical) and imaging analysis using the following OperaCLS (PerkinElmer). Test concentrations of specific compounds used in the present invention were added so that the final concentration was 10 ⁇ M.
  • the cells were cultured for 1 day in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). After the culture, a solution of the specific compound used in the present invention dissolved in DMSO was added. Furthermore, the cells were fixed by culturing in a CO 2 incubator at 37 ° C.
  • AlexaFluor (R) 647-labeled YAP antibody CellSignaling Technology
  • anti-mouse TAZ (D-8) antibody SantaCruz
  • AlexaFluor (R) 555-labeled anti-mouse IgG antibody ThermoFisherScientific
  • the case where the fluorescence intensity ratio was 1.4 or more was defined as the cell population in which the YAP protein and the TAZ protein were transferred into the nucleus, and the ratio was calculated.
  • the relative value with respect to the control group (DMSO) was calculated with respect to the calculated proportion of the cell population, the following compounds were added, so that the YAP protein was 6 times or more, the TAZ protein was 1.5 times or more, and the cell population increased. From this, it was revealed that the specific compound used in the present invention has an action of promoting the nuclear translocation of the YAP protein and the TAZ protein.
  • Example 13 YAP phosphorylation inhibitory action of the compound of the present invention Pre-culture (monolayer) of human ovarian cancer cell line SKOV3 (DS Pharma Biomedical) in McCoy's 5a medium (Sigma Aldrich) containing 15% FBS Culture). The cells in the logarithmic growth phase were washed with PBS. Adherent cells were detached by adding 0.25% (w / v) trypsin-1 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution (manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. for 3 minutes. .
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • DMEM medium containing 10% FBS (Phenol-red) containing 0.015% (w / v) deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.)
  • FCeM-series Preparation Kit Fluji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the plate was centrifuged, and 16 ⁇ L of the supernatant was transferred to a 384-well white plate (Corning, # 4512), and each antibody solution (pYAP d2 antibody or Total-YAP d2 antibody and pYAP Cryptate antibody or Total-YAP Cryptate attached to the kit).
  • Antibody was added in a total amount of 4 ⁇ L / well and allowed to stand overnight at room temperature.
  • As a blank control cells not subjected to compound stimulation were treated similarly by adding only pYAP Cryptate antibody or Total-YAP Cryptate antibody (Non-treatment).
  • k-1: B-1, k-1: H-1, k-1: J-1, GA-002A, and GA-005A are YAP phosphorous in both 2D and 3D culture conditions. It was shown to have an oxidation inhibitory effect.
  • Example 14 Inflammatory inhibitory effect in colitis model mice A colitis model administered with dextran sulfate sodium (DSS, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was prepared as described below. In the evaluation of colitis, the length of the large intestine is used as a morphological parameter, and the large intestine is shortened according to the degree of inflammation. For this reason, the inflammation suppression effect of the compounds was evaluated by comparing the length of the large intestine. Evaluation sample: Compound K-1: J-1 was prepared to 0.5 mg / mL in 0.5 w / v% methylcellulose aqueous solution (0.5% MC, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries). It was administered internally. Negative control received 0.5% MC.
  • mice were C57BL / 6NCrl, 6 weeks old, and males were purchased from Nippon Charles River Co., Ltd.
  • As drinking water distilled water or a 2.5 w / v% DSS aqueous solution was allowed to drink freely.
  • the DSS drinking water start date was day 1 and water was consumed until day 8.
  • Compound K-1 J-1 was intraperitoneally administered at 50 mg / kg every 24 hours from the first day.
  • the large intestine was dissected and the length of the large intestine was measured. It was carried out with 4 cases in each group. As a result of this test, the length of the large intestine of the mouse is shown in FIG. As shown in FIG.
  • the DSS drinking group had a shorter colon compared to the distilled water drinking group, but the DSS drinking water-compound K-1: J-1 administration group was the DSS drinking water-0.5% MC administration group. More shortening of the large intestine was suppressed. From the above, it was revealed that Compound K-1: J-1 has an effect of suppressing the onset of DSS-derived colitis.
  • Example 15 Effect of promoting wound healing in mouse skin full-thickness wound model Creating a full-thickness skin wound from which the skin on the back of the mouse has been partially removed is prepared as described below, and the reduction rate of the wound area is compared. Thus, the wound healing promoting effect of the compound was evaluated.
  • the wound area on the first day was defined as 100%, and the measured total area was calculated as a percentage (%) with respect to the wound creation date. It was carried out with 6 cases in each group.
  • the change in the wound area of the all-skin-deficient wound-producing mouse is shown in FIG.
  • the area under the wound area ratio (Area Under the Curve (AUC),% ⁇ day) calculated from the results of the change in wound area ratio over time was 854.2 ⁇ 119.2, K ⁇ 1: J ⁇ in the negative control.
  • One administration group had 659.6 ⁇ 163.7.
  • FIG. 4 and the value of AUC it was revealed that Compound K-1: J-1 has a wound healing promoting effect.
  • the present invention it is possible to inhibit a plurality of kinases including LATS (particularly LATS2) which is a main kinase of the Hippo signaling pathway. It can also treat diseases or tissue damage associated with cell growth failure. Therefore, the present invention is useful in the field of research such as cell functions and diseases in which the Hippo signaling pathway is involved. Furthermore, it is useful in the medical field for treating such diseases.
  • LATS particularly LATS2

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Abstract

本発明は、新規キナーゼ阻害剤等の提供、及びかかる阻害剤等を応用した疾患の治療剤や創薬スクリーニング方法等の提供を目的とする。下記、式（Ｉ）で示される化合物、またはその塩は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の主要キナーゼであるＬＡＴＳ（特にＬＡＴＳ２）を含む、複数のキナーゼを阻害することができ、また、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療することができる。従って、本発明は、例えば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が関与する細胞機能や疾病等の研究分野において有益である。さらに、かかる疾病等を治療する医療分野において有益である：｛式中、各記号は明細書中で定義される通りである。｝

Description

キナーゼ阻害剤
　本発明は、キナーゼ阻害剤、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤、およびＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療及び／または予防するための物質のスクリーニング方法等に関する。
　キナーゼ（タンパク質リン酸化酵素、プロテインキナーゼ）は、タンパク質のセリン、スレオニン、あるいはチロシンの水酸基をリン酸化する酵素であり、細胞の増殖や分化等のシグナル伝達を担う酵素群である。キナーゼをコードする遺伝子としては、これまでに５００種以上がクローニングされている。そして、プロテインキナーゼは細胞内のいたる所に存在し、細胞の増殖や分化或いは機能発現等の調節や制御に深く関与している（非特許文献１）。
　また、多数の疾患において異常なプロテインキナーゼ活性が確認されており、プロテインキナーゼ活性を阻害することによる疾患の治療も行われている（非特許文献２）。例えば、細胞の癌化に関与する癌遺伝子の多くがプロテインキナーゼをコードしていることが知られており、プロテインキナーゼ阻害剤であるグリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）は慢性骨髄性白血病治療薬として（非特許文献３）、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は乳癌治療薬として販売されている（特許文献１）。
　ＬＡＴＳ１或いはＬＡＴＳ２（Ｌａｒｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ １或いは２）は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を構成する主要因子のプロテインキナーゼである（特許文献２、非特許文献４、５）。本伝達経路は、細胞密度が上昇してｃｏｎｔａｃｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎがかかるとき、あるいは、活性酸素、ＤＮＡ損傷などにより細胞が傷害されるときに活性化することが知られている（非特許文献６、７、８）。本伝達経路が活性化された際には、ＬＡＴＳが転写共役因子であるＹＡＰ（Ｙｅｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）あるいはＴＡＺ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｗｉｔｈ ＰＤＺ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉf）をリン酸化する。リン酸化されたＹＡＰあるいはＴＡＺは細胞核から細胞質へと移行し、タンパク質分解を受けるため、ＹＡＰあるいはＴＡＺのターゲット遺伝子の発現が抑制される。ＹＡＰによる発現調節を受ける遺伝子の例としては、ＣＣＤＮ１、ＣＴＧＦ、ＢＩＲＣ２、ＣＹＲ６１、ＡＭＯＴＬ２、ＴＧＦＢ２などが知られている（非特許文献９、１０、１１、１２）。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の活性化はこれらの遺伝子の発現抑制につながり、細胞増殖抑制、細胞死誘導を引き起こす。
　Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は幹細胞の自己複製・分化を制御することが知られている（非特許文献１３）。また、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は皮膚、腸管や神経の維持に必要であり、ＹＡＰが正常に機能しないと、組織損傷時の修復が阻害される（非特許文献１４）。さらに、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の欠失は心筋梗塞後の収縮期心不全を回復させることが報告されている（非特許文献１５）。このように、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は細胞、組織、臓器の増殖、維持や回復を制御しているため、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害剤或いはＹＡＰ及びＴＡＺの活性化剤は細胞増殖の不全によって引き起こされる疾患の治療薬として期待できる。このような疾患の例としては、火傷、外傷、筋委縮、虚血性の疾患、神経変性疾患（例えばアルツハイマーやパーキンソンやハンチントン病）などが挙げられる。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害剤の例としては、ＭＳＴ１の阻害剤としてＸＭＵ―ＭＰ―1が報告されている（非特許文献１６）。ＸＭＵ―ＭＰ―1は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害することにより肝障害からの回復を促進することが示されている。さらに、ＬＡＴＳ１及びＬＡＴＳ２を阻害する化合物による眼球、皮膚や肝臓の修復促進効果が報告されている（特許文献３）。また、ＴＡＺの活性化剤としてＩＢＳ００８７３８が報告されており、本活性化剤による筋損傷の回復促進効果が示されている（非特許文献１７）。以上の様に、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の制御剤が各種の疾患の治療薬として期待されている。
米国特許第５７０５１５１号 米国特許第５９９４５０３号 国際公開第２０１８／１９８０７７号
Robert Roskoski Jr., Pharmacological Research 2016,100: 1-23 Doriano F et al, Br J Pharmacol. 2015, 172(11): 2675-2700 Druker BJ et al, Nat Med. 1996, 2(5):561-566 Justice RW et al, Genes Dev. 1995, 9(5):534-546 Hergovich A, Cell Biosci. 2013, 3(1):32 Pefani DE et al, FEBS J. 2016, 283(8):1392-1403 Meng Z et al, Genes Dev. 2016, 30(1):1-17 Zhao B et al, Curr Opin Cell Biol. 2008, 20(6):638-646 Imajo M et al, EMBO J. 2012, 31:1109-1122 Hong W et al, Semin Cell Dev Biol. 2012, 23(7):785-793 Gujral TS et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017, 114(18):E3729-E3738 Lee DH et al, Nat Commun. 2016, 7:11961 Aylon Y et al, Cell Death Differ. 2014, 21(4):624-633 Johnson R et al, Nat Rev Drug Discov. 2014, 13(1):63-79 Leach JP et al, Nature. 2017, 550(7675):260-264 Fan F et al, Sci Transl Med. 2016, 8(352):352ra108 Yang Z et al, Mol Cell Biol. 2014, 34(9):1607-1621
　本発明は、新規キナーゼ阻害剤の提供を目的とする。特に、本発明はＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する新規キナーゼ阻害剤の提供を目的とする。加えて、本発明は、かかる阻害剤を応用した疾患の治療剤や創薬スクリーニング方法等の提供をも目的とする。
　本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、特定の化合物がＬＡＴＳ（特にＬＡＴＳ２）を含む複数のプロテインキナーゼの活性を阻害することを見出した。また、本発明者らは、当該特定の化合物が細胞内のＹＡＰタンパク質の核内移行を促進すること、ＹＡＰまたはＴＡＺタンパク質の標的遺伝子群の発現を促進すること、及び、不斉炭素を有する特定の化合物においては、光学異性体によっては活性が大きく異なること等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、キナーゼ阻害剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
［２］キナーゼが、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３からなる群から選択される、［１］に記載の剤。
［３］キナーゼが、ＬＡＴＳ２である、［２］に記載の剤。
［４］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
［５］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
［６］細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の抑制を伴う疾患である、［５］に記載の剤。
［７］細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、炎症性疾患、炎症性腸疾患、神経変性疾患、免疫性神経疾患、筋ジストロフィー、ミオパチー、外傷、火傷、薬傷、皮膚潰瘍、外傷性潰瘍、下肢潰瘍、凍傷潰瘍、免疫性潰瘍、帯状疱疹後潰瘍、放射線潰瘍、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、巨大色素性母斑、瘢痕、刺青による障害、尋常性白斑、白皮症、脊髄損傷、筋肉損傷、肝不全、薬剤性肝障害、アルコール性肝障害、虚血性肝障害、ウイルス性肝障害、自己免疫性肝障害、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、皮膚損傷、脳浮腫、心筋梗塞、脳出血、および脳梗塞からなる群から選択される、［５］に記載の剤。
［８］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
［９］Ｘが、－ＮＨＣＯ－である、［１］～［８］のいずれかに記載の剤。
［１０］Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基であり、ｎが０である、［１］～［９］のいずれかに記載の剤。
［１１］Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［１］～［１０］のいずれかに記載の剤。
［１２］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
　ｎが０であり、
　Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
　Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、［１］～［１１］のいずれかに記載の剤。
［１３］式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、［１］～［１２］のいずれかに記載の剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
［１４］式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物のＲ体の光学異性体である、［１］～［１２］のいずれかに記載の剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
［１５］Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［１］～［１２］のいずれかに記載の剤。
［１６］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
　ｎが０であり、
　Ａｒが、水酸基で置換されていてもよいフェニル基であり、
　Ｚが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、［１］～［１０］および［１５］のいずれかに記載の剤。
［１７］式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、［１］～［１０］、［１５］および［１６］のいずれかに記載の剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
［１８］式（Ｉ）で示される化合物が、以下の化合物のＲ体の光学異性体である、［１］～［１２］、［１５］および［１６］のいずれかに記載の剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
［１９］以下の工程を含む、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質のスクリーニング方法：
　（工程１）下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地において細胞を培養する工程:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝；
　（工程２）被検物質の存在下、(工程１)で得られた細胞においてＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量を測定する工程；
　（工程３）（工程２）で測定されたＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量が、前記被検物質の非存在下における存在量と比較して減少している場合に、前記被検物質をＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質と判断する工程。
［２０］下記、式（Ｉ）で示される化合物の光学活性体、またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である（ただし、Ｘが－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ２がエチル基であり、ｎが０であるとき、Ｒ１は、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ６Ｈ５ではない。）。｝。
［２１］Ｘが、－ＮＨＣＯ－である、［２０］に記載の光学活性体、またはその塩。
［２２］Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基であり、ｎが０である、［２０］または［２１］に記載の光学活性体、またはその塩。
［２３］Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、炭素数１～６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［２０］～［２２］のいずれかに記載の光学活性体またはその塩。
［２４］光学活性体がＲ体である、［２０］～［２３］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。
［２５］式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、［２０］～［２４］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
［２６］Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１～６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［２０］～［２２］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。
［２７］光学活性体がＲ体である、［２０］～［２２］、および［２６］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。
［２８］式（Ｉ）で示される化合物が、以下の化合物である、［２０］～［２２］、［２６］、および［２７］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　また、一態様において、本発明は以下の通りである。
［１’］下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む、キナーゼ阻害剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
｛式中、Ｘ０は、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１0は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、
Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝。
［２’］下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
｛式中、Ｘ０は、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１0は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、
Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝。
［３’］下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
｛式中、Ｘ０は、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１0は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、
Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝。
［４’］下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
｛式中、Ｘ０は、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１0は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、
Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝。
［５’］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
　ｎが０であり、
　Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
　Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、［１’］～［４’］のいずれか記載の剤。
［６’］化合物(Ｉ’)が、以下からなる群より選択される化合物である、［１’］～［５’］のいずれか記載の剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
および、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
［７’］化合物(Ｉ’)が、以下で示される化合物である、［１’］～［５’］のいずれかに記載の剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
および、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
［８’］キナーゼが、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３からなる群から選択される、［１’］、［５’］～［７’］のいずれか記載の剤。
［９’］キナーゼが、ＬＡＴＳ２である、［８’］記載の剤。
［１０’］細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の抑制を伴う疾患である、［３’］、［５’］～［７’］のいずれか記載の剤。
［１１’］細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、炎症性疾患、神経変性疾患、免疫性神経疾患、筋ジストロフィー、ミオパチー、外傷、火傷、脊髄損傷、筋肉損傷、肝不全、皮膚損傷、脳浮腫、心筋梗塞、脳出血、および脳梗塞からなる群から選択される、［３’］、［５’］～［７’］のいずれか記載の剤。
［１２’］以下の工程を含む、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質のスクリーニング方法：
　（工程１）下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む培地において細胞を培養する工程:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
｛式中、Ｘ０は、－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１0は、－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝；
　（工程２）被検物質の存在下、(工程１)で得られた細胞においてＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量を測定する工程；
　（工程３）（工程２）で測定されたＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量が、前記被検物質の非存在下における存在量と比較して減少している場合に、前記被検物質をＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質と判断する工程。
［１３’］［１’］、［２’］、［４’］～［７’］のいずれか記載の剤を含む、細胞培養培地。
　なお、化合物(Ｉ’)は、式（Ｉ）で示される化合物において、Ｘが－ＮＨＣＯ－であり、かつ、Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒ（式中、Ｙ、およびＺが、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗが、ＮＨであり、Ａｒが、置換基を有していてもよいアリール基である）である場合に相当する。
　本発明によれば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路における主要キナーゼであるＬＡＴＳを含む、複数のキナーゼの活性を阻害することができる。特にＬＡＴＳキナーゼの活性を阻害することにより、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を効率的に阻害することが可能となる。これにより、細胞内のＹＡＰタンパク質の核内移行が促進され、その結果としてＹＡＰまたはＴＡＺタンパク質の標的遺伝子群の発現を促進することが可能となる。細胞におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害は細胞増殖を亢進するため、細胞増殖の不全を伴う疾患（特に、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の活性化を伴う疾患等）または組織損傷の治療が可能となる。さらに、本発明によれば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が関与する細胞機能や疾病の研究を従来よりも迅速かつ効率的に実施することが可能となる。すなわち、これまではＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を選択的に阻害するために分子生物学的な手法を用いてＭＳＴ１やＬＡＴＳ２の遺伝子を欠損させたり（遺伝子ノックアウト）、その発現を抑制させたり（遺伝子ノックダウン）をすることが必要であった。これらの手法は、選択的な阻害という観点では優れているが、目的の遺伝子をノックダウン或いはノックアウトした細胞を得るためには煩雑な操作と時間が必要であり、また目的の細胞毎にこれらの遺伝子操作を加える必要がある。しかしながら、本発明の特定の化合物を用いれば、細胞培養時の培地に当該化合物を添加するだけで簡便にＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を選択的に阻害することができる。また、当該化合物を培地から除去すれば、阻害効果が無くなるため、一時的にＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害するという用途にも最適である。更に、本発明によれば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が関与する疾病の治療薬を見出すことができる。すなわち、本発明の特定の化合物を添加した培地にて細胞を培養すれば、細胞内のＹＡＰの核内移行が促進されるため、ＹＡＰが関与する疾病の表現型がより明確に表れる。この様な状況では、ＹＡＰの機能を阻害するような化合物や因子をこれまでよりも効率よく探索することができる。
図１は、本発明の特定化合物を添加した培地にて培養されたＳＫＯＶ３細胞中のＹＡＰ、リン酸化ＹＡＰ及びＴＡＺの量を、ウェスタンブロッティング法を用いて観察した図である。 図２は、本発明の特定化合物を投与したマウスにおける肝臓重量の変化を観察した図である。 図３は、本発明の特定化合物を投与したマウスにおける大腸の長さの変化を観察した図である。 図４は、本発明の特定化合物を投与したマウスにおける皮膚創傷の面積の変化を観察した図である。
　本明細書において使用する用語を以下に定義する。
　本明細書において、ｎ－はノルマル、ｉ－はイソ、ｓｅｃ－はセカンダリー及びｔｅｒｔ－はターシャリーを各々意味する。また、本明細書において、ｏ－はオルト、ｍ－はメタ及びｐ－はパラを各々意味する。
　「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子である。「ハロゲノ基」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである。
　「アルキル基」および「炭素数１～６のアルキル基」とは、直鎖または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル等の基が挙げられる。
　「アリール基」とは、少なくとも１つの環が芳香族であり、各環が５～８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基が挙げられ、具体的には、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。特に、アリール基は、Ｃ６－１０の芳香族のフェニル、インデニル、ナフチルであり得る。
　「アルキレン基」および「炭素数１～６のアルキレン基」とは、直鎖の炭素鎖を意味し、具体的には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の基が挙げられる。
　「アルキル基」、「アリール基」及び「アルキレン基」は、置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、例えば以下が挙げられる。尚、「アルキル基」の場合には下記（１）～（４０）が挙げられ、「アリール基」及び「アルキレン基」の場合には下記（１）～（４１）が挙げられる。
(1)ハロゲノ基、
(2)水酸基、
(3)シアノ基、
(4)ニトロ基、
(5)カルボキシル基、
(6)アルケニル基（Ｃ２－１０アルケニル基；例、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、ブタジエニル、ヘキサトリエニル、およびその各異性体）、
(7)アルキニル基（Ｃ２－１０アルキニル基；例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、および、その各異性体）、
(8)ハロゲノアルキル基（例、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、トリフルオロエチル、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、およびその各異性体）、
(9)環状アルキル基（環中にヘテロ原子を含んでもよい）（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル）、
(10)アリール基（例、フェニル、ナフチル）、
(11)ヘテロアリール基（例、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル（例、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル）、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，３－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例、１，２，３－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル）、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル）、
(12)アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｔｅｒｔ－ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、２－ペンチルオキシ、３－ペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキシ）、
(13)アルキルチオ基（例、メチルチオ、エチルチオ、ｎ－プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ－ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ－ブチルチオ、ｔｅｒｔ－ブチルチオ、ｎ－ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ｔｅｒｔ－ペンチルチオ、ネオペンチルチオ、２－ペンチルチオ、３－ペンチルチオ、ｎ－ヘキシルチオ、２－ヘキシルチオ）、
(14)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(15)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(16)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(17)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(18)環状アルキル（環中にヘテロ原子を含んでもよい）オキシ基（例、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、テトラヒドロフラニルオキシ、テトラヒドロピラニルオキシ、アジリジニルオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、モルホリニルオキシ）、
(19)アリールオキシ基（例、アリール基（上記(10)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(20)ヘテロアリールオキシ基（例、ヘテロアリール基（上記(11)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(21)ハロゲノアルコキシ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(22)ハロゲノアルキルチオ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が硫黄原子に結合した基）、
(23)水酸基で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(24)アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(25)アミノ基、
(26)アルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、
　ここで、「アルキル基」とは、Ｃ１－６アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル等が挙げられる。
(27)カルバモイル基、
(28)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたカルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル）、
(29)スルファモイル基、
(30)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたスルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、エチルメチルスルファモイル）、
(31)アルカノイル基（例、水素原子若しくはアルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(32)アロイル基（例、アリール基（上記（10）と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(33)アルキルスルホニルアミノ基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(34)アリールスルホニルアミノ基（例、アリール基（上記（10）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(35)へテロアリールスルホニルアミノ基（例、ヘテロアリール基（上記（11）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(36)アシルアミノ基（例、アシル基で置換されたアミノ基）、
　ここで、「アシル基」とは、Ｃ１－６アルキル基、またはＣ６－１０アリール基を有するアシル基である。ここで、「Ｃ１－６アルキル基」とは、上記「アルキル基」のうち、炭素数が１～６のものであり、「Ｃ6－１０アリール基」とは、上記「アリール基」のうち、炭素数が６～１０のものである。アシル基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、イソブチロイル基、バレロイル基、イソバレロイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる、
(37)アルコキシカルボニルアミノ基（例、アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換されたカルボニルアミノ基）、
(38)アルキルスルホニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニル基）、
(39)アルキルスルフィニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルフィニル基）、
(40)アルコキシカルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）、
(41)アルキル基（Ｃ1－６アルキル基；例、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル等）等が挙げられる。
　置換基が２以上存在する場合は、それらは同一でも異なっていてもよい。
　式（Ｉ）に示される化合物（以下、特定化合物ともいう）は、塩の形態であってもよい。前記式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば、塩酸及び臭化水素酸等の無機酸との塩ならびに酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸及び安息香酸等の有機酸との塩が挙げられる。
　式（Ｉ）に示される化合物は、置換基の種類によってはＥの立体配置を有するＥ体及びＺの立体配置を有するＺ体の幾何異性体が存在する場合がある。本発明はこれらＥ体、Ｚ体またはＥ体およびＺ体を任意の割合で含む混合物を包含するものである。
　また、式（Ｉ）で示される化合物は、１個又は２個以上の不斉炭素原子の存在に起因する光学活性体が存在する場合があるが、式（Ｉ）で示される化合物は全ての光学活性体又はラセミ体を包含する。
［式（Ｉ）に示される化合物の合成］
　式（Ｉ）に示される化合物は、下記式で表されるように、ケトン化合物とＨ２Ｎ－Ｘ－Ｒ１（式中、Ｘ及びＲ１は前記の意味を表し、例えば、ヒドラジド化合物、セミカルバジド化合物等）、それぞれを１当量ずつ用い、トルエン、１,４－ジオキサン、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、１００℃以上の温度範囲で、１時間から３日間反応を行なうのが好ましい。
［反応式１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　反応終了後の反応混合物は、蒸留水を加えて析出させる、又は析出しない場合は、有機溶媒抽出後濃縮といった通常の後処理を行ない、目的の特定化合物を得ることができる。また、精製の必要が生じたときには、再結晶、カラムクロマトグラフ、薄層クロマトグラフ、液体クロマトグラフ分取等の任意の精製方法によって分離、精製することができる。
[光学活性体の取得]
　上述の方法により合成される化合物のうち、光学異性体を有するものについては、光学活性体（ユートマー）が存在し得る。光学活性体の取得は、結晶化による方法、酵素反応を用いる方法、又はＨＰＬＣを用いる方法（例、光学活性担持法）等の自体公知の方法を用いて行うことができる。また、光学活性体を、不斉合成法等を用いて調製することもできる。尚、本明細書において「光学活性体」とは、少なくともＬＡＴＳ１または２のキナーゼ活性を阻害する活性において、より活性が強いと判断される光学異性体を意味する。
１．キナーゼ阻害剤
　本発明は、以下の特定化合物またはその塩を含む、キナーゼ阻害剤（以下、「本発明のキナーゼ阻害剤」と称することがある。）を提供する。
　本発明のキナーゼ阻害剤に含まれる化合物は、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝で表される化合物、またはその塩である（以下、式（I）で示される化合物またはその塩を総称して、単に「本発明に用いられる特定化合物」等と称する場合がある）。
　一態様において、式（I）中のＸが－ＮＨＣＯ－、かつ、Ｒ１が－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒ、かつ、Ｙが、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基（好ましくは、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基、より好ましくはメチル基もしくはエチル基で置換されていてもよいメチレン基）である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、式中Ｒ４が、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が、水素原子）であり、Ｚは、単結合であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基（好ましくは、置換基を有していてもよいフェニル基、より好ましくは、ハロゲノ基、水酸基、メチル基もしくはエトキシ基で置換されているフェニル基またはナフチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、ｎ＝０である。
　また、式（I）中のＸが－ＮＨＣＯ－、かつ、Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、かつ、Ｙが、単結合である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が、水素原子）であるか、酸素原子であり、Ｚは、単結合または置換基を有していてもよいアルキレン基（より好ましくは、置換基を有していてもよいアルキレン基、特に好ましくは、置換基を有していてもよいメチレン基）であり、Ａｒは置換基（ハロゲン原子、水酸基、メチル基、またはメトキシ基等）を有していてもよいアリール基（より好ましくは、水酸基を有するアリール基もしくは置換基を有していないアリール基、特に好ましくは、水酸基を有するフェニル基もしくはフェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、ｎ＝０である。
　好ましい一態様において、式(I)で示される化合物は、以下に示される化合物のいずれかであり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
　好ましい一態様において、式(I)で示される化合物は、以下に示される化合物の光学異性体のうち、Ｒ体のものであり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
　本発明のキナーゼ阻害剤に配合される本発明に用いられる特定化合物の量は、所望の効果を得られ得る限り特に限定されないが、通常０．０１～１００重量％、好ましくは０．１～１００重量％、より好ましくは１～１００重量％、さらに好ましくは５～１００重量％、特に好ましくは１０～１００重量％で有り得る。
　本発明のキナーゼ阻害剤は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の溶媒としては、水、生理食塩水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の各種アルコールなどの水性溶媒が挙げられる。製剤化される際の添加物としては、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。
　また、本発明のキナーゼ阻害剤は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある。）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、０．１μｍ～１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ～１μｍ、最も好ましくは、０．１μｍ～０．５μｍである。これらの滅菌処理は、特定化合物が固形でも溶液の状態でもよい。
　本発明のキナーゼ阻害剤において「キナーゼを阻害する」とは、キナーゼのリン酸化機能を阻害してその活性を消失又は減弱することを意味する。本発明のキナーゼ阻害剤により阻害されるキナーゼの種類としては、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３が挙げられるが、これらに限定されない。尚、本明細書において「キナーゼの活性を減弱する」とは、例えば、対照となる所定のキナーゼのリン酸化活性レベルと比較して、少なくとも５％以上、少なくとも１０％以上、少なくとも１５％以上、少なくとも２０％以上、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、または、少なくとも９９％以上、キナーゼの活性が減弱することを意味する。キナーゼ活性の測定は、以下の実施例において説明されるように、ＭＳＡ法などの自体公知の方法を用いることができる。或いは、キナーゼがＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の上流に位置するＬＡＴＳ２等の場合は、その下流エフェクターであり、リン酸化の標的となるＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞内の局在を、自体公知の分子生物学的手法を用いて確認することにより間接的にキナーゼ活性の減弱の程度を評価することもできる。
　本発明の一態様において、キナーゼがＬＡＴＳ２である場合、「ＬＡＴＳ２を阻害する」とは、ＬＡＴＳ２のキナーゼとしての機能を阻害してその活性を消失又は減弱することを意味する。ＬＡＴＳ２は酵母からヒトまで広範な種で進化的に保存されている。従って、本発明のキナーゼ阻害剤によりその活性が阻害されるＬＡＴＳ２は、あらゆる生物におけるＬＡＴＳ２であり得、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物のＬＡＴＳであり得る。本発明のキナーゼ阻害剤により阻害されるＬＡＴＳ２は、好ましくはヒトＬＡＴＳであり得る。尚、本明細書において単に「ＬＡＴＳ」と記載する場合、「ＬＡＴＳ１」および「ＬＡＴＳ２」の両方、並びにＬＡＴＳ１とＬＡＴＳ２の複合体を包含する概念とする。
　本発明のキナーゼ阻害剤の使用態様の例としては、分子生物学的な試験や研究目的での使用等が含まれるが、これらに限定されない。分子生物学的な試験や研究目的での使用の一態様としては、本発明のキナーゼ阻害剤をＬＡＴＳ２等の特定のキナーゼを発現する細胞に投与することで、特定のキナーゼの活性が抑制された細胞を容易に調製し得る。かくして得られた細胞は特定のキナーゼの機能解析や該特定のキナーゼの機能を調節し得る候補物質のスクリーニング等に有用であり得る。
　一態様において、特定のキナーゼを発現する細胞は、哺乳動物由来の細胞であり得る。かかる細胞の例としては、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。なお、これらの細胞の由来も特に限定されず、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。また、かかる細胞が由来する組織または臓器も、特に限定されず、組織の例としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられ、また、臓器の例としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられる。尚、本明細書において「幹細胞」とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞を意味し、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
　本発明のキナーゼ阻害剤の特定のキナーゼを発現する細胞への投与は、当該細胞を培養する培地に本発明のキナーゼ阻害剤を添加することにより達成される。本発明のキナーゼ阻害剤の添加量は、本発明の所望の効果を得られる量であれば特に限定されないが、例えば、本発明に用いられる特定化合物の培地中の濃度が、通常０．００１～１００μＭ、好ましくは０．０１Ｍ～５０μＭ、より好ましくは０．１～３０μＭ、さらに好ましくは１～２０μＭ、特に好ましくは５～１０μＭとすることができる。
　また、本発明のキナーゼ阻害剤を用いるに際して、細胞を培養するための培地は特に限定されず、市販の培地を用いることもできる。好適な市販培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ＭｉｘｔｕｒｅＦ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’s ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）培地（味の素社製）、ＣＳＴＩ－７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、間葉系幹細胞用培地（プロモセル社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、ケラチノサイト基礎培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、ケラチノサイト増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（クラボウ社製）、正常ヒト表皮角化細胞基礎培地（クラボウ社製）、ヒトＥｐｉＶｉｔａ増殖培地（東洋紡株式会社製）、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、角膜上皮細胞基礎培地（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＰＣＳ－７００－０３０（登録商標））等の培地が挙げられるが、これらに限定されない。
　また、上記の培地に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、細胞外マトリックス、生理活性物質等の更なる物質を、試験・研究の目的に応じて、適宜添加することができる。具体的な例としては、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子－α、トランスフォーミング増殖因子－β、上皮成長因子、インスリン様成長因子、Ｗｎｔ蛋白質、アンフィレグリン、インターフェロン類、インターロイキン類、血管内皮細胞増殖因子、血小板由来成長因子、肝細胞増殖因子、アルブミン、インスリン、β－メルカプトエタノール、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸、亜セレン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞培養条件（例えば、温度、二酸化炭素濃度、培養期間等）は自体公知の条件を用いればよく、あるいは、目的に応じて、適宜改変してもよい。例えば、細胞を培養する際の温度は、通常２５～３９℃、好ましくは３３～３９℃（例、３７℃）である。二酸化炭素濃度は、通常、培養の雰囲気中、４～１０体積％であり、４～６体積％が好ましい。培養期間は、通常１～３５日間であるが、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
２．Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤
　本発明はまた、本発明に用いられる特定化合物を含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤（以下、「本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤」と称することがある。）を提供する。
　Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は、細胞増殖、細胞死、器官サイズ、自己複製、幹細胞および前駆細胞の分化、創傷治癒、組織再生に関与するシグナル伝達経路である。この経路は多種の生物において進化的に保存されており、特に哺乳動物において高度に保存されている。哺乳動物におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の主要な因子には、ＬＡＴＳ１およびＬＡＴＳ２が挙げられる。ＬＡＴＳは、足場タンパク質Ｍｏｂ１Ａ／Ｂとの会合によって活性化される。ＬＡＴＳはまた、ＳＴＥ２０ファミリープロテインキナーゼＭｓｔ１およびＭｓｔ２によるリン酸化によっても活性化される。ＬＡＴＳは、転写共役因子である下流エフェクターのＹＡＰおよびＴＡＺをリン酸化する。ＬＡＴＳによるＹＡＰおよびＴＡＺのリン酸化は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路における非常に重要な事象である。リン酸化されたＹＡＰおよびＴＡＺは、細胞核から細胞質へと移行し、ユビキチンプロテアソーム系により分解される。従って、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が活性化された状態にある場合は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺはＬＡＴＳによりリン酸化され、細胞質中に移行し、分解される。一方、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が不活性の状態にある場合は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺはリン酸化されておらず、細胞核中に局在する。
　上述した通り、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺは転写共役因子であり、細胞核中に局在する場合、様々な遺伝子の発現を誘導することが知られている。ＹＡＰおよび／またはＴＡＺによって発現が誘導される遺伝子の多くは、細胞の生存や増殖を媒介することが知られている。かかる遺伝子の例としては、例えば、ＣＣＮＤ１、ＣＴＧＦ、ＢＩＲＣ２、ＣＹＲ６１、ＡＭＯＴＬ２、ＴＧＦＢ２、ＡＮＫＲＤ１等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。尚、ＣＣＮＤ１遺伝子（ＣＹＣＬＩＮ　Ｄ１、「ＰＲＡＤ１」等とも称される。）は、ヒトにおいては１１番染色体に存在する。該遺伝子によりコードされるタンパク質（２９５アミノ酸、分子量：約３６ｋＤａ）は、細胞周期の促進に関する。ＣＴＧＦ遺伝子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、「ＣＣＮ２」等とも称される。）は、ヒトにおいては第６番染色体に存在し、細胞増殖促進等を誘導するポリペプチド（３４９アミノ酸、分子量：約３５ｋＤａ）をコードする。ＢＩＲＣ２遺伝子（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ＩＡＰ　ｒｅｐｅａｔ　ｋｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２、「ＡＰＩ１」等とも称される。）は、ヒトにおいては第１１番染色体に存在し、カスパーゼ分解活性によりアポトーシスを阻害するタンパク質（６１８アミノ酸、分子量：約７０ｋＤａ）をコードする遺伝子である。ＣＹＲ６１遺伝子（ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｒｉｃｈ　ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ　ｉｎｄｕｃｅｒ　６１、「ＣＣＮ１」等とも称される。）は、ヒトにおいては第１番染色体に存在する。該遺伝子によりコードされるタンパク質（３８１アミノ酸、分子量：約３９ｋＤａ）は、血管形成、ＶＥＧＦの亢進、骨形成において重要な役割を担う。ＡＭＯＴＬ２遺伝子（ａｎｇｉｏｍｏｔｉｎ　ｌｉｋｅ　２、「ＬＣＣＰ」とも称される。）は、ヒトにおいては第３番染色体（３ｑ２２．２）に存在する。該遺伝子によりコードされるタンパク質（８３７アミノ酸、分子量：約９２ｋＤａ）は、血管新生を阻害するアンジオモチンに関連し、モチンタンパク質ファミリーに属する。ＡＮＫＲＤ１遺伝子（Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、Ｃａｒｄｉａｃ　ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ、「ＣＡＲＰ」とも称される。）は、ヒトにおいては第１０番染色体に存在する。該遺伝子によりコードされるタンパク質（３１９アミノ酸、分子量：約３６ｋＤａ）は、心筋や骨格筋において高発現しており、転写因子として機能している。
　本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＡＴＳ（特にＬＡＴＳ２）のキナーゼ活性を阻害し、ＬＡＴＳによるＹＡＰおよび／またはＴＡＺのリン酸化を阻害する。ＹＡＰおよび／またはＴＡＺがリン酸化されないため、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行が促進される。結果として、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺにより発現が誘導される遺伝子の遺伝子発現が亢進する。従って、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤は、「ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行促進剤」、もしくは、「ＹＡＰおよび／またはＴＡＺにより誘導される遺伝子の発現促進剤」とも言い換えることができる。
　なお、本明細書において「ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行を促進する」とは、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺのリン酸化と蛋白質分解を阻害することにより、細胞質よりも核でのＹＡＰおよび／またはＴＡＺの存在量を高めることを意味する。尚、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの存在量を高めるとは、例えば、対照となるＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核内の存在量と比較して、少なくとも１．３倍以上、少なくとも１．５倍以上、少なくとも２倍以上、少なくとも３倍以上、少なくとも４倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも６倍以上、少なくとも７倍以上、少なくとも８倍以上、少なくとも９倍以上、少なくとも１０倍以上、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核内の存在量が上昇することを意味する。尚、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核の存在量の測定は、後述する実施例において用いられているような、蛍光ラベルを結合させた抗ＹＡＰ（またはＴＡＺ）抗体を用いたイメージング解析等の自体公知の方法により実施することができる。また、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核の存在量は、ウェスタンブロッティング法等を用いてＹＡＰおよび／またはＴＡＺのリン酸化状態を観察することにより、間接的に測定することができる。
　また、本明細書において「ＹＡＰおよび／またはＴＡＺにより誘導される遺伝子の発現促進」とは、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核への移行が促進される結果、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺにより誘導される遺伝子（例えば、ＣＣＮＤ１、ＣＴＧＦ、ＢＩＲＣ２、ＣＹＲ６１、ＡＭＯＴＬ２、ＴＧＦＢ２、ＡＮＫＲＤ１の少なくとも１つ以上）の発現量が亢進することを意味する。尚、遺伝子発現が亢進するとは、例えば、所定の対照レベルの発現量（例えば、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を無添加の細胞群）と比較して、少なくとも１．３倍以上、少なくとも１．５倍以上、少なくとも２倍以上、少なくとも３倍以上、少なくとも４倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも６倍以上、少なくとも７倍以上、少なくとも８倍以上、少なくとも９倍以上、少なくとも１０倍以上、上記した遺伝子の少なくとも１つ以上の遺伝子の発現量が上昇することを意味する。尚、遺伝子発現の亢進の評価は、マイクロアレイ法、リアルタイムＰＣＲ法等を用いて転写レベルで評価してもよく、或いは、ウェスタンブロッティング法等を用いてタンパク質翻訳レベルで評価することもできる。
　本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤における、本発明に用いられる特定化合物の量、剤形、滅菌処理等に関しては、１．本発明のキナーゼ阻害剤において説明したものと同様である。
　本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤の使用態様の例としては、分子生物学的な試験や研究目的での使用等が含まれるが、これらに限定されない。分子生物学的な試験や研究目的での使用の具体例としては、例えば、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を有する細胞に投与することで、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が阻害された状態の細胞を容易に調製することができる。上述した通り、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核への移行を促進するため、該細胞においてはＹＡＰおよび／またはＴＡＺが関与する疾病の表現型がより明確に表れ得る。従って、かかる特性を有する細胞を用いることにより、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの機能を調節し得る物質の探索を効率よく行い得る。
　一態様において、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を有する細胞は、哺乳動物由来の細胞であり得る。かかる細胞の例としては、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。なお、これらの細胞の由来も特に限定されず、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。また、かかる細胞が由来する組織または臓器も、特に限定されず、組織の例としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられ、また、臓器の例としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられる。
　本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤の、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を有する細胞への投与は、当該細胞を培養する培地に本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を添加することにより達成される。本発明のキナーゼ阻害剤の添加量は、本発明の所望の効果を得られる量であれば特に限定されないが、例えば、本発明に用いられる特定化合物の培地中の濃度が、通常０．００１～１００μＭ、好ましくは０．０１～５０μＭ、より好ましくは０．１～３０μＭ、さらに好ましくは１～２０μＭ、特に好ましくは５～１０μＭとすることができる。
　また、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を用いるに際して、細胞を培養するための培地は特に限定されず、市販の培地を用いることもできる。本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤の使用に際して用い得る市販培地は、本発明のキナーゼ阻害剤の使用に際して用い得る市販培地と同様である。また、細胞培養条件等も本発明のキナーゼ阻害剤で説明したものと同様である。
３．細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤
　本発明はまた、本発明に用いられる特定化合物を含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤（以下、「本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤」と称することがある。）を提供する。
　Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は、細胞増殖、細胞死、器官サイズ、自己複製、幹細胞および前駆細胞の分化、創傷治癒、組織再生に関与するシグナル伝達経路であり、特に、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害することにより、細胞増殖、創傷治癒、および組織再生が亢進される。従って、一態様において、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤は、細胞増殖の不全を伴う疾患または損傷組織の再生にも用いることもできる。
　本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤における、本発明に用いられる特定化合物の量、滅菌処理等に関しては、１．本発明のキナーゼ阻害剤において説明したものと同様である。
　本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、単独で、又は他の少なくとも１種類の治療薬と組み合わせて使用されてもよい。その際、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、当該治療薬と共に同時に投与されてもよく、あるいは、当該治療薬の投与に先立って、又はその後に投与されてもよい。本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、当該治療薬と同じか、又は異なった投与経路により投与されてもよい。当該治療薬としては、化学療法薬、支持治療薬、又はその組み合わせが挙げられる。
　本明細書中において「治療する」とは、疾患の程度を部分的又は完全に軽減すること、疾患に関連する臨床的症状又は指標が改善するか又は向上すること、疾患の進行を遅らせるか、抑制するか、又は予防すること、或いは疾患の発症又は進行を部分的又は完全に遅らせるか、抑制するか、又は予防すること、の1つ以上を部分的又は実質的に達成することが含まれる。
　本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤の適用対象となる動物は、通常哺乳動物であり、好ましくはヒトであるが、ペット（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、リス等）或いは家畜（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）であってもよい。
　また、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、通常錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤などの経口投与剤、直腸投与剤、経皮吸収剤あるいは注射剤として投与できる。本剤は１個の治療薬として、あるいはほかの治療薬との混合物として投与できる。それらは単体で投与してもよいが、一般的には医薬組成物の形態で投与する。それらの製剤は、薬理的、製剤学的に許容しうる添加物を加え、常法により製造することができる。すなわち、経口剤には通常の賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、可塑剤、コーティング剤などの添加物を使用することができる。経口用液剤は、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、エリキシルなどの形態であってもよく、あるいは使用前に水またはほかの適当な溶媒で調製するドライシロップとして供されてもよい。前記の液剤は、懸濁化剤、香料、希釈剤あるいは乳化剤のような通常の添加剤を含むことができる。直腸内投与する場合は座剤として投与することができる。坐剤はカカオ脂、ラウリン脂、マクロゴール、グリセロゼラチン、ウィテップゾール、ステアリン酸ナトリウムまたはそれらの混合物など、適当な物質を基剤として用い、必要に応じて乳化剤、懸濁化剤、保存剤などを加えることができる。注射剤は、水性剤形あるいは用時溶解型剤形を形成するために、注射用蒸留水、生理食塩水、５％ブドウ糖溶液、プロピレングリコールなどの溶解剤ないし溶解補助剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、安定化剤などの製剤成分が使用される。局所投与剤としては、例えば、スプレー、エアロゾル、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、ゲル剤が挙げられ、好ましくはスプレー、クリーム剤、軟膏剤、又はゲル剤である。これらの製剤には必要により、吸収促進剤、ｐＨ調整剤、保存剤、着香料、分散剤、湿潤剤、安定剤、防腐剤、懸濁剤、界面活性剤、抗菌剤等の添加剤を配合することができる。また、本発明の治療剤は、被覆材と共に用いることができる。その例としては、ガーゼ、ポリウレタンフィルム、ハイドロコロイド、ポリウレタンフォーム、アルギン酸塩被覆材、ハイドロジェル、ハイドロファイバー、ハイドロポリマー等を挙げることができる。以下に、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤の製剤例およびその調製方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
製剤例１
以下の成分を含有する顆粒剤を製造する。
成分
　　式（Ｉ）で表される化合物　１０ｍｇ
　　乳糖 　　　　　　　　　 ７００ｍｇ
　　コーンスターチ　　　 　 ２７４ｍｇ
　　ＨＰＣ－Ｌ 　　　　　　　 １６ｍｇ　　　　　　　　　　　
　　計 　　　　　　　　　 １０００ｍｇ
　式（Ｉ）で表される化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらをＶ型混合機にて混合する。混合末に低粘度ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ－Ｌ）水溶液を添加し、練合、造粒（押し出し造粒 孔径０．５～１ｍｍ）した後、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい（12/60メッシュ）で篩過し顆粒剤を得る。
製剤例２
以下の成分を含有するカプセル充填用散剤を製造する。
成分
　　式（Ｉ）で表される化合物　１０ｍｇ
　　乳糖 　　　　　　　　　 　７９ｍｇ
　　コーンスターチ　　　　　　１０ｍｇ
　　ステアリン酸マグネシウム　　１ｍｇ　　　　　　　　　　　
　　計 　　　　　　　　　　 １００ｍｇ
　式（Ｉ）で表される化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらとステアリン酸マグネシウムをＶ型混合機にて混合する。１０倍散１００ｍｇを5号硬ゼラチンカプセルに充填する。
製剤例３
以下の成分を含有するカプセル充填用顆粒剤を製造する。
成分
　　式（Ｉ）で表される化合物　１５ｍｇ
　　乳糖 　　　　　　　　　　 ９０ｍｇ
　　コーンスターチ 　　　　　 ４２ｍｇ
　　ＨＰＣ－Ｌ 　　　　　　　　 ３ｍｇ　　　　　　　　　　　
　　計 　　　　　　　　　　 １５０ｍｇ
　式（Ｉ）で表される化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらをＶ型混合機にて混合する。混合末に低粘度ヒドロキシプロピルセルロース（HPC-L）水溶液を添加し、練合、造粒した後、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい（12/60メッシュ）で篩過し整粒し、その１５０ｍｇを４号硬ゼラチンカプセルに充填する。
製剤例４
以下の成分を含有する錠剤を製造する。
成分
　　式（Ｉ）で表される化合物　１０ｍｇ
　　乳糖 　　　　　　　　　　 ９０ｍｇ
　　微結晶セルロース 　　　　 ３０ｍｇ
　　ステアリン酸マグネシウム 　 ５ｍｇ
　　CMC-Na 　　　　　　　　　 １５ｍｇ　　　　　　　　　　　
　　計　　　　　　　　　　　１５０ｍｇ
　式（Ｉ）で表される化合物と乳糖と微結晶セルロース、CMC-Na(カルボキシメチルセルロース ナトリウム塩)を６０メッシュのふるいに通し、混合する。混合末にステアリン酸マグネシウムを添加し、製剤用混合末を得る。本混合末を直打し１５０ｍｇの錠剤を得る。
製剤例５
静脈用製剤は次のように製造する。
　　式（Ｉ）で表される化合物　１００ｍｇ
　　飽和脂肪酸グリセリド　　１０００ｍＬ
　上記成分の溶液は通常、1分間に１ｍＬの速度で患者に静脈内投与される。
製剤例６
液剤は次のように製造する。
　　式（Ｉ）で表される化合物　１０ｍｇ
　　エタノール　　　　　　　　　１ｍＬ
　　水　　　　　　　　　　　　９９ｍＬ
　上記成分を混合する。
製剤例７
液剤は次のように製造する。
　　式（Ｉ）で表される化合物　　　　　　　　１ｇ
　　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８　　　　　　１０ｇ
　　プロピレングリコール　　　　　　　　２０ｍＬ
　　トリスヒドロキシメチルアミノメタン　２．４ｇ
　　水　　　　　　　　　　　　　　　　９７０ｍＬ
　上記成分を混合する。
　本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤をヒトに投与する場合は、その投与量を患者の年齢、状態により決定するが通常成人の場合、経口剤あるいは直腸内投与では、本発明に用いられる特定化合物の投与量として、０．１～１０００ｍｇ/ヒト/日程度、注射剤で０．０５ｍｇ～５００ｍｇ/ヒト/日程度である。局所投与剤では、投与量は通常成人１回当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇであり、投与回数は通常１日１回から６回である。これらの数値はあくまでも例示であり、投与量は患者の症状にあわせて決定されるものである。
　プロドラッグとして利用できる本発明に用いられる特定化合物は、加溶媒分解によりまたは生理的条件下のインビボにおいて本発明の薬理学的に活性な化合物を生成する、化学的または代謝的に分解できる基を有する本発明の誘導体である。適当なプロドラッグを選択する方法および製造する方法は、例えばＤｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９８５）に記載されている。本発明において、水酸基を有する化合物である場合は、該化合物と適当なアシルハライドまたは適当な酸無水物とを反応させることによって得られるアシルオキシ誘導体がプロドラッグとして例示される。プロドラッグとして特に好ましいアシルオキシとしては－ＯＣＯＣ２Ｈ５、－ＯＣＯ（ｔ－Ｂｕ）、－ＯＣＯＣ１５Ｈ３１、－ＯＣＯ（ｍ－ＣＯ２Ｎａ－Ｐｈ）、－ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａ、－ＯＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３、－ＯＣＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２などが挙げられる。本発明を形成する化合物がアミノ基を有する場合は、アミノ基を有する化合物と適当な酸ハロゲン化物または適当な混合酸無水物とを反応させることにより製造されるアミド誘導体がプロドラッグとして例示される。プロドラッグとして特に好ましいアミドとしては、－ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２０ＯＣＨ３、－ＮＨＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３等が挙げられる。
　本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤が適用され得る疾患としては、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害による細胞増殖促進、創傷治癒、組織再生の結果として治療され得る疾患または組織損傷であれば特に限定されない。一態様において、細胞増殖の不全を伴う疾患には、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患が含まれる。また別の一態様において、細胞増殖の不全を伴う疾患は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の抑制を伴う疾患が含まれる。かかる細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の例としては、例えば、炎症性疾患（例えば、炎症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、肝炎、腎炎、糸球体腎炎、膵炎、乾癬、痛風、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、膠原線維性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット症候群、感染性大腸炎（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｌｉｔｉｓ）、および分類不能大腸炎など）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症など）、免疫性神経疾患（例えば、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、多発性筋炎など）、筋ジストロフィー、ミオパチー、外傷、火傷、薬傷、皮膚潰瘍、外傷性潰瘍、下肢潰瘍、凍傷潰瘍、免疫性潰瘍、帯状疱疹後潰瘍、放射線潰瘍、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、巨大色素性母斑、瘢痕、刺青による障害、尋常性白斑、白皮症、脊髄損傷、筋肉損傷、肝不全、薬剤性肝障害、アルコール性肝障害、虚血性肝障害、ウイルス性肝障害、自己免疫性肝障害、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、皮膚損傷、脳浮腫、心筋梗塞、脳出血、および脳梗塞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、一態様において、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、細胞、組織、臓器等を哺乳動物に移植した際の生着及び回復を促進する際に有効であり得る。移植される細胞の例としては、幹細胞（造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞等）、β細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。移植される組織の例としては、血液、赤血球、血小板、リンパ球、骨髄、臍帯血、血管、角膜、網膜、眼球、皮膚等が挙げられるが、これらに限定されない。移植される臓器の例としては、膵臓、肺、腎臓、肝臓、心臓、小腸等が挙げられるが、これらに限定されない。本態様において、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または損傷組織の治療剤は、「細胞、組織、および／または臓器移植の生着促進剤」とも言い換えられる。
４．移植治療用細胞または組織の増殖促進剤
　本発明はまた、本発明に用いられる特定化合物を含む、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤（以下、「本発明の増殖促進剤」と称することがある。）を提供する。
　Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が抑制または阻害されている細胞は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内濃度が高まり、その結果、細胞増殖が促進される。加えて、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が抑制または阻害されている細胞は損傷治癒能や組織再生能に関する細胞機能も亢進している。従って、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を抑制または阻害されている細胞または該細胞を含む組織は移植治療に適し、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を抑制または阻害していない細胞または組織と比較して、対象への移植後、生着および／または回復に要する期間の短縮が期待される。
　本発明の増殖促進剤に配合される、本発明に用いられる特定化合物の量および滅菌処理等に関しては、１．本発明のキナーゼ阻害剤において説明したものと同様である。
　本発明の増殖促進剤を添加した培地において細胞を培養することにより、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が抑制または阻害されている細胞、またはこれを含む組織を生体外において調製することができる。一態様において、本発明の増殖促進剤を添加した培地において培養される細胞は、哺乳動物由来の細胞であり得る。かかる細胞の例としては、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。なお、これらの細胞の由来も特に限定されず、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。また、かかる細胞が由来する組織または臓器も、特に限定されず、組織の例としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられ、また、臓器の例としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられる。一態様において、培養する細胞としては幹細胞が好ましい。例えば、生体外でＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を本発明の増殖促進剤を添加した培地を用いて培養すれば、該細胞の増殖が促進され、大量のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を効率よく調製することができる。かくして得られたＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、自体公知の方法により目的の組織へと分化させることで、移植治療に好適に用いることができる。
　本発明の増殖促進剤の培地への添加量は、細胞におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達経路が阻害される限り特に限定されないが、例えば、本発明に用いられる特定化合物の培地中の濃度が、通常０．００１～１００μＭ、好ましくは０．０１Ｍ～５０μＭ、より好ましくは０．１～３０μＭ、さらに好ましくは１～２０μＭ、特に好ましくは５～１０μＭとすることができる。また、本発明の増殖促進剤の培地への添加タイミングは、細胞を培養し、増幅させている期間中であればいかなるタイミングで添加してもよいが、細胞増殖を促進する効果の観点からは、培養開始時から添加しておくことが好ましい。
　また、本発明の増殖促進剤を添加することができる培地は、細胞を維持または増殖できる培地である限り特に限定されず、市販の培地を用いることもできる。本発明の増殖促進剤の使用に際して用い得る市販培地は、本発明のキナーゼ阻害剤の使用に際して用い得る市販培地と同様である。
　本発明の増殖促進剤を添加した培地における培養条件としては、細胞を維持又は増幅し得る限り特に限定されないが、培養温度として、例えば３０～４０℃の範囲内、好ましくは３６～３８℃の範囲内、より好ましくは３７℃を好適に例示することができる。また、細胞をより好適に維持または増幅する観点から、培地交換や継代を適当な時期に行うことが好ましい。培地交換の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に限定されないが、例えば１～５日間経過毎、好ましくは３日間経過毎とすることができる。継代の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に限定されず、細胞の集団（好ましくはオルガノイド）が大きくなってきたタイミングで適宜行うことができ、例えば、４～１２日間経過毎、好ましくは６～１０日間経過毎とすることができる。
　細胞および／または組織の培養は、細胞培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。一態様において、培養容器として、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているものを用いてもよい。このような容器の例としては、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｉＭａｔｒｉｘ－４１１、ｉＭａｔｒｉｘ－２２１、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、セレクチン、ヒアルロン酸、フィブリン等をコーティングした容器が挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞及び／又は組織の培養器材に対する接着を阻害するためのコーティング材料を用いることもできる。このようなコーティング材料としては、ハイドロゲル、ｐｒｅｖｅｌｅｘ（登録商標）、シリコン、ポリ（２－ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等が挙げられるが、これらに限られるわけではない。また、培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものも使用できる。このような培養容器の例としては、スミロンセルタイトプレート（住友ベークライト株式会社製）、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート（住友ベークライト株式会社製）、超低接着表面プレート（コーニング社製）、ヌンクロンスフェラプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞および／または組織の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞および／または組織に供給する手法には、流加培養、連続培養、灌流培養が含まれるが、これらに限定されない。
５．スクリーニング方法
　上述した本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤によれば、所望の細胞のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害することができる。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が阻害された細胞は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患の細胞環境を模倣している。従って、かかる細胞を用いることにより、該疾患の治療または予防に適用し得る候補物質をスクリーニングすることができる。即ち、本発明は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と称することがある。）を提供する。
　本発明のスクリーニング方法においては、まず、本発明に用いられる特定化合物（または本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤でもよい）を添加した培地において細胞を培養する（工程１）。工程１に用い得る細胞、培地、特定化合物の培地への添加量等は、本発明のキナーゼ阻害剤において説明したものと同様である。
　次に、工程１において得られた細胞に対して被検物質を接触させる。被検物質の接触は被検物質を細胞培養培地に添加することにより行うことができる。被検物質を培養培地に添加後、通常１～５日間（好ましくは２～４日間）細胞を維持培養する。この維持培養期間中、細胞におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害が維持されるよう、維持培養用の培地に本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を添加しておくことが好ましい。所定期間の経過後、被検物質を接触させた細胞において、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量を測定する（工程２）。ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量が被検物質の非存在下における存在量と比較して減少している場合、被検物質はＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患の治療および／または予防剤と判断することができる（工程３）。尚、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの存在量が減少するとは、例えば、対照となるＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核内の存在量と比較して、少なくとも５％以上、少なくとも１０％以上、少なくとも１５％以上、少なくとも２０％以上、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、または、少なくとも９９％以上、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核の存在量が減少することを意味する。尚、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核の存在量の測定は、後述する実施例において用いられているような、蛍光ラベルを結合させた抗ＹＡＰ（またはＴＡＺ）抗体を用いたイメージング解析等の自体公知の方法により実施することができる。
　本発明のスクリーニング方法において、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患には癌が含まれ、具体的には、大腸癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、肝癌、乳癌、腎癌、前立腺癌、胃腸癌、メラノーマ、子宮頸部癌、膀胱癌、膠芽腫、および頭頸部癌等が挙げられるがこれらに限定されない。
６．キナーゼを阻害する方法
　本発明は、本発明に用いられる特定化合物を細胞に接触させることを含む、特定のキナーゼ活性を阻害する方法（以下、「本発明のキナーゼを阻害する方法」と称することがある。）を提供する。本発明のキナーゼを阻害する方法は、上記した本発明のキナーゼ阻害剤を用いて好適に実施することができるため、その実施形態が本方法にも適用され得る。一態様において、本発明のキナーゼを阻害する方法は、細胞におけるＬＡＴＳ２のリン酸化活性を阻害する。
７．Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する方法
　本発明は、本発明に用いられる特定化合物を細胞に接触させることを含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する方法（以下、「本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する方法」と称することがある。）を提供する。本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する方法は、上記した本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を用いて好適に実施することができるため、その実施形態が本方法にも適用され得る。
８．細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷を治療するための方法
　本発明は、本発明に用いられる特定化合物を対象に投与することを含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷を治療するための方法（以下、「本発明の治療方法」と称することがある。）を提供する。本発明の治療方法は、上記した本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤を用いて好適に実施することができるため、その実施形態が本方法にも適用され得る。尚、本発明の治療方法を、特に細胞、組織、臓器等を哺乳動物に移植した際の生着及び回復の促進を目的として実施する場合、本発明の治療方法は、「細胞、組織、および／または臓器移植の生着促進方法」とも言い換えられる。
９．移植治療用細胞または組織の増殖を促進するための方法
　本発明は、本発明に用いられる特定化合物を細胞に投与することを含む、移植治療用細胞または組織の増殖を促進するための方法（以下、「本発明の増殖促進方法」と称することがある。）を提供する。本発明の増殖促進方法は、上記した本発明の増殖促進剤を用いて好適に実施することができるため、その実施形態が本方法にも適用され得る。尚、本発明の増殖促進方法により、移植治療用細胞または組織を効率よく調製できることから、本発明の増殖促進方法は、「移植治療用細胞または組織を製造するための方法」とも言い換えられる。
１０．培地
　本発明はまた、本発明のキナーゼ阻害剤、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤、または、本発明の移植治療用細胞または組織の増殖促進剤のいずれかを含む細胞培養培地（以下、「本発明の培地」と称することがある。）を提供する。本発明の培地は、本発明のキナーゼ阻害剤、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤、および、本発明の移植治療用細胞または組織の増殖促進剤に記載した通り、これらの剤を細胞培養に適した培地に添加することにより調製される培地である。本発明の培地を用いて細胞を培養することにより、本発明のキナーゼ阻害剤、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤、および、本発明の移植治療用細胞または組織の増殖促進剤に記載した通りの効果を得ることができる。
　以下に、本発明の有用性について、以下の実施例において具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。なお、ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ２の体積％で示した。また、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水（シグマアルドリッチジャパン社製）を意味し、ＦＢＳは牛胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を意味する。また、（ｗ／ｖ）は、１体積あたりの重量を表わす。
　以下に、本発明に用いられる特定化合物の合成方法および構造式を示す。尚、１Ｈ－ＮＭＲはプロトン核磁気共鳴スペクトラムを表し、２７０ＭＨｚまたは４００ＭＨｚにて、重ジメチルスルホキシド中で測定した。ケミカルシフト値は、重ジメチルスルホキシドの値を２．４９ｐｐｍとして記載した。また、ｓとの記載はシングレットを表し、以下同様にｂｒｓはブロードシングレットを、ｄはダブレットを、ｄｄはダブルダブレットを、ｔはトリプレットを、ｑはカルテットを、ｍはマルチプレットをそれぞれ表す。
［合成例１］ケトンおよびヒドラジドを原料とした本発明化合物の合成
（材料と方法）
　以下に図示されるケトン４種［１－（２，４－ジヒドロキシ－３－メチルフェニル）プロパン－１－オン（以下、ｋ－１と略称する。）、１－（２，４－ジヒドロキシ－３－メチルフェニル）エタン－１－オン（以下、ｋ－２と略称する。）、１－（２，４，６－トリヒドロキシ－３－メチルフェニル）プロパン－１－オン（以下、ｋ－３と略称する。）、１－（２，４－ジヒドロキシ－３－メチルフェニル）－３－メチルブタン－１－オン（以下、ｋ－５と略称する。）］及びヒドラジド１０種［２－（フェニルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－１と略称する。）、２－（ｏ－トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－２と略称する。）、２－（ｍ－トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－３と略称する。）、２－（ｐ－トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－４と略称する。）、２－［（４－フルオロフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｈ－５と略称する。）、２－（ナフタレン－１－イルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－６と略称する。）、２－（フェニルアミノ）ブタンヒドラジド（以下、Ｈ－７と略称する。）、２－［（４－エトキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｈ－９と略称する。）、２－［（４－ヒドロキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｄ－２と略称する。）、２－［（２－ヒドロキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｄ－４と略称する。）］より化合物を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
　合成した３４化合物を第１表に記載する。表中、Ｍｅとの記載はメチルを表し、以下同様に、Ｅｔとの記載はエチルを、ｎ－Ｐｒはノルマルプロピルを、ｉ－Ｂｕはイソブチルを、Ｐｈはフェニルを、Ｎａｐｈはナフチルをそれぞれ表す。（Ｒ３）ｎにおける「－」との記載は無置換を表し、構造式に記載された番号は、（Ｒ３）ｎの置換位置を表す。
［第１表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
　第１表に記載した化合物の１Ｈ－ＮＭＲの測定結果を第２表に記す。
［第２表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
　以下に本発明に用いられる特定化合物及び合成中間体の化合物の合成法を記載する。
　４種のケトンのうち、ｋ－１、ｋ－２およびｋ－５については公知の方法により合成が可能である（Sum TH et al., Tetrahedron. 2015 Jul 1;71(26-27): 4557-4564.）。また、１０種のヒドラジドのうち、Ｈ－１、Ｈ－２、Ｈ－３、Ｈ－４、Ｈ－５、Ｈ－６、Ｈ－９、Ｄ－２及びＤ－４は公知の方法により合成が可能である（Samal RP et al., Chem Biol Drug Des. 2013 Jun;81(6):715-29.等）。従って、以下、ｋ－３およびＨ－７の合成法につき詳述する。
［ｋ－３の合成］
　２，４，６－トリヒドロキシベンズアルデヒド(２．２２ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ＮａＢＨ３ＣＮ（２．７ｇ、４３ｍｍｏｌ）、酢酸（８ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬｘ２）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０～５０／５０）で精製し、中間化合物（１．２０ｇ、８．５６ｍｍｏｌ、収率５９％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた中間化合物（１．０４ｇ，７．４２ｍｍｏｌ）を、プロピオン酸（７ｍＬ）に懸濁させ、プロピオン酸無水物（１．１５ｍＬ，８．９０ｍｍｏｌ）、ＢＦ３－Ｅｔ２Ｏ（１．１２ｍＬ、８．９０ｍｍｏｌ）を加えて１３０℃で１時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、水(１００ｍＬｘ３）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(１００ｍＬｘ２）、ブライン（１００ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～４５／５５）で精製し、得られた固体をヘキサンで洗浄してｋ－３（０．４１ｇ）を薄橙色固体として得た。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を再度中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）で精製し、ｋ－３（０．７０ｇ）を薄橙色固体として得た。以上まとめて、ｋ－３（１．１１ｇ、５．６６ｍｍｏｌ、収率７６％）を薄橙色固体として得た。
［Ｈ－７の合成］
　２－ブロモ酪酸メチル（８．０ｇ、４４ｍｍｏｌ）、アニリン(８．０ｍＬ、８８ｍｍｏｌ）をトルエン(１０ｍＬ）に溶解させ、５時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を水(３０ｍＬ）、２Ｍ塩酸（２５ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で順次洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９～１０／９０）で精製し、中間化合物（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ、収率６０％）を黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた中間化合物（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ）をメタノール(２６ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン・１水和物（１２．８ｍＬ、２６４ｍｍｏｌ）を加えて室温で４．５時間撹拌した。水（１５０ｍＬ）を加えて、塩化メチレン（３０ｍＬｘ５）で抽出した。有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をＩＰＥで洗浄し、Ｈ－７（４．６０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ、収率９０％）を白色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－１の合成］
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ－１（１１０ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加え、再度１００℃で撹拌後、熱時ろ過してｋ－１：Ｈ－１（７０．１ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ、収率３９％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－２の合成］
　ｋ－１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ－２（６９ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残った固体を塩化メチレン、酢酸エチルで順次洗浄した。得られた残渣をＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）に溶解させ、水を加えて析出した固体をメタノールで洗浄し、ｋ－１：Ｈ－２（１９．６ｍｇ、０．０５７４ｍｍｏｌ、収率２１％）を薄橙色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－３の合成］
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ－３（１１９ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。同温で蒸留水（１１ｍＬ）を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してｋ－１：Ｈ－３（９８．９ｍｇ、０．２９０ｍｍｏｌ、収率５２％）を白色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－４の合成］
　ｋ－１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ－４（６５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、酢酸エチルで洗浄してｋ－１：Ｈ－４（２８．６ｍｇ、０．０８３８ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－５の合成］
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ－５（１２２ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。同温で蒸留水（１１ｍＬ）を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してｋ－１：Ｈ－５（５５．６ｍｇ、０．１６１ｍｍｏｌ、収率２９％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－６の合成］
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ－６（１４３ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してｋ－１：Ｈ－６（８６．５ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ、収率４１％）を茶色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－７の合成］
　ｋ－１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ－７（５４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン（０．５ｍＬ）に溶解させた。ヘキサン（０．５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取してｋ－１：Ｈ－７（５６．８ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ、収率５７％）を白色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－９の合成］
　ｋ－１（１５０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、Ｈ－９（２２６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に懸濁させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（２０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６０／４０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－１：Ｈ－９（４０．２ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ、収率１３％）を白色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－１の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－１（９５．４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してｋ－２：Ｈ－１（８０．４ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ、収率５３％）を黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－２の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－２（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（３０ｍＬ）、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）で精製してｋ－２：Ｈ－２（３４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、収率２１％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－３の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－３（１０４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（３ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０～８０／２０）で精製してｋ－２：Ｈ－３（４６．９ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－４の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－４（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレンで洗浄してｋ－２：Ｈ－４（５８．７ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ、収率３７％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－５の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－５（１０６ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０～８０／２０）で精製してｋ－２：Ｈ－５（３６．６ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、収率２３％）を白色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－６の合成］
　ｋ－２（１００ｍｇ、０．６０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－６（１５５ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレンで洗浄してｋ－２：Ｈ－６（５９．３ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、収率２７％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－７の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－７（１２１ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～５０／５０）で精製してｋ－２：Ｈ－７（１０９ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ、収率６６％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－９の合成］
　ｋ－２（１００ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、Ｈ－９（１６４ｍｇ，０．７８４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．２ｍＬ）に懸濁させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１２ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６０／４０）で精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－２：Ｈ－９（６３．１ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－１の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－１（２５３ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－１（２５．０ｍｇ，０．０７２８ｍｍｏｌ、収率７．１％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－２の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－２（２３７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、メタノールで洗浄した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－２（１０．３ｍｇ、０．０２８８ｍｍｏｌ、収率２．８％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－３の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－３（２１９ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で５日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－３（１７．９ｍｇ、０．０５０１ｍｍｏｌ、収率４．９％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－４の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－４（２３７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－４（１７．９ｍｇ、０．０５０１ｍｍｏｌ、収率４．９％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－５の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－５（２２４ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で６日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－５（１３．７ｍｇ、０．０３７９ｍｍｏｌ、収率３．７％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－６の合成］
　ｋ－３（１００ｍｇ、０．５１０ｍｍｏｌ）、Ｈ－６（１２１ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－６（１７．０ｍｇ、０．０４３２ｍｍｏｌ、収率８．５％）を橙色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－７の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－７（２５６ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄しｋ－３：Ｈ－７（２８．３ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ、収率７．５％）を白色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－９の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－９（２７７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ別し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－９（１１．２ｍｇ、０．０２８９ｍｍｏｌ、収率２．８％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－１の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－１（９５．２ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してｋ－５：Ｈ－１（３８．１ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ、収率２２％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－２の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－２（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン（２ｍＬ）に溶解させ、芒硝乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣に塩化メチレン（１ｍＬ）を加え、超音波に晒して析出した固体をろ取してｋ－５：Ｈ－２（１８．６ｍｇ、０．０５０３ｍｍｏｌ、収率１０％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－３の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－３（１０３ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してｋ－５：Ｈ－３（４４．６ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－４の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ，０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－４（１１２ｍｇ，０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してｋ－５：Ｈ－４（４４．４ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－５の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－５（１０６ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取してｋ－５：Ｈ－５（３７．４ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－６の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－６（１２４ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で５日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０～５０／５０）で精製した。得られた固体をメタノールで洗浄してｋ－５：Ｈ－６（２８．１ｍｇ、０．０６９３ｍｍｏｌ、収率１４％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－７の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－７（１２１ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、酢酸エチル、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してｋ－５：Ｈ－７（４３．６ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ、収率２４％）を白色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－９の合成］
　ｋ－５（１５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、Ｈ－９（１９６ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に懸濁させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１２ｍＬ）、塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）で精製しｋ－５：Ｈ－９（７２．０ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ、収率２５％）を薄黄色固体として得た。
　また、化合物番号ｋ－１：Ｄ－２及びｋ－１：Ｄ－４ついても、上記の合成法に準じた方法により合成することができる。
［合成例２］ｋ－１：Ａ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、グリシンエチル塩酸塩(Ａ－１）（１００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ａ－１（２１．９ｍｇ、０．０８２５ｍｍｏｌ、収率１５％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ9.69(s, 1H), 7.32(d, J=8.1Hz, 1H), 6.30(d, J=10.8Hz, 1H), 5.76(s, 1H), 4.48(s, 2H), 4.19(q, J=8.1Hz, 2H), 2.67(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.24(t, J=8.1Hz, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例３］ｋ－１：Ａ－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、グリシンベンジルｐ－トルエンスルホナート(Ａ－２）（２４３ｍｇ、０．７２１ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ａ－２（２５．０ｍｇ、０．０７６４ｍｍｏｌ、収率１４％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ9.69(s, 1H), 7.45-7.35 (m, 6H), 7.32(d, J=10.8Hz, 1H), 6.31(d, J=10.8Hz, 1H), 5.23(s, 2H), 4.56(s, 2H), 2.70(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例４］ｋ－１：Ａ－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、ｎ－オクチルアミン(Ａ－３）（１２０ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間、１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～２０／８０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ａ－３（６０．１ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ、収率３７％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ9.52(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20(d, J=8.1Hz, 1H), 5.31 (t, J=8.1Hz, 2H), 2.73(q, J=8.1Hz, 2H), 1.90(s, 3H), 1.64(m, 2H), 1.30-1.05(m, 10H), 1.11(t, J=8.1Hz, 3H), 0.86(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例５］ｋ－１：Ａ－５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
　ｋ－１（３００ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を２Ｍアンモニア／メタノール溶液（１７ｍＬ、３３ｍｍｏｌ）に溶解させ、室温で１週間撹拌した。その間、毎日アンモニアガスを１５分バブリングした。反応溶液を減圧下濃縮し、４－（１－イミノプロピル）－２－メチルベンゼン－１，３－ジオール（ｋ－１’）とｋ－１の混合物（２９２ｍｇ、ｋ－１’:ｋ－１＝１:０．２）を黄土色固体として得た。上記のようにして得られたｋ－１’とｋ－１の混合物（２９２ｍｇ）をＴＨＦ（６．５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、フェニルイソシアネート（Ａ－５）（１５８ｍＬ、１．４６ｍｍｏｌ）を加えた。同温で３０分撹拌後、水（３０ｍＬ）、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～４５／５５）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ａ－５（１６０ｍｇ、０．５３６ｍｍｏｌ、２工程収率３２％）を薄黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ13.74(s, 1H), 10.22(s, 1H), 10.11(s, 1H), 7.63(d, J=8.1Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.1Hz, 1H), 7.32 (t, J=8.1Hz, 2H), 7.06 (t, J=8.1Hz, 1H), 6.49 (d, J=8.1Hz, 1H), 2.84(q, J=8.1Hz, 2H), 2.00(s, 3H), 1.24(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例６］ｋ－１：Ｈ－１０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
　ｋ－１（１００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）、４－フェニルセミカルバジド(Ｈ－１０）（１０９ｍｇ，０．７２１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ｈ－１０（１９．１ｍｇ、０．０６１０ｍｍｏｌ、収率１１％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz):δ13.50(s, 1H), 9.75(s, 1H), 9.59(s, 1H), 8.82(s, 1H), 7.49(d, J=8.1Hz, 2H), 7.30(t, J=8.1Hz, 2H), 7.21(d, J=8.0Hz, 1H), 6.99(t, J=8.1Hz, 1H), 6.39(d, J=8.1Hz, 1H), 2.70(q, J=8.1Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.14(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例７］ｋ－１：Ｉ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
　ヒドラジン一水和物（０．２６ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ベンジルイソシアネート（１０１）（０．３２４　ｍＬ、２．６３　ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３時間撹拌し、析出した固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１０２（３５２ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ、収率８２％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１０２（１５５ｍｇ、０．９３８ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５５／４５）にて精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｉ－１（５５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、収率２４％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ9.59(s, 1H), 9.56(s, 1H), 7.40-7.25(m, 5H), 7.17(d, J=12.0Hz, 1H), 6.84(t, J=8.0Hz, NH), 6.37(d, J=12.0Hz, 1H), 4.34(d, J=8.0Hz, 2H), 2.65(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
［合成例８］ｋ－１：Ｉ－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
　ヒドラジン一水和物（０．２０ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．２ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４－クロロベンジルイソシアネート（１０３）（０．２７８ｍＬ、２．０９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で１．５時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０４（３１５ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、収率７５％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１０４（１８７ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６５／３５）にて精製し、得られた精製物を酢酸エチルに溶解させ、ヘキサンを加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｉ－３（１５５ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ、収率５９％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ9.63(s, 1H), 9.56(s, 1H), 7.41(d, J=8.0Hz, 2H), 7.34(d, J=8.0Hz, 2H), 7.17(d, J=8.0Hz, 1H), 6.89(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.31(d, J=8.0Hz, 2H), 2.65(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
［合成例９］ｋ－１：Ｉ－６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
　ヒドラジン一水和物（０．２３ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（８ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４－メチルベンジルイソシアネート（１０５）（３５０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で２時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０６（２９７ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ、収率６９％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１０６（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ―１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．８ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２２時間撹拌した。反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６０／４０）にて精製し、得られた精製物を酢酸エチル（３０ｍＬ）に溶解させ、水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｉ－６（１１８ｍｇ、０．３４６ｍｍｏｌ、収率４８％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ9.56(s, 1H), 9.55(s, 1H), 7.20(d, J=8.0Hz, 2H), 7.16(d, J=8.0Hz, 2H), 7.15(d, J=8.0Hz, 1H), 6.78(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.29(d, J=8.0Hz, 2H), 2.64(q, J=8.0Hz, 2H), 2.28(s, 3H), 1.97(s, 3H), 1.07(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
［合成例１０］ｋ－１：Ｉ－７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
　ヒドラジン一水和物（０．２１ｍＬ、４．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４－メトキシベンジルイソシアネート（１０７）（３５０ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で２時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０８（３８１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ、収率９３％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１０８（１８３ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．８ｍＬ）に懸濁させ１００℃で５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５～６５／３５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｉ－７（５５．０ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、収率２１％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ9.55(s, 2H), 7.25(d, J=8.0Hz, 2H), 7.16(d, J=8.0Hz, 1H), 6.91(d, J=8.0Hz, 2H), 6.75(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.26(d, J=8.0Hz, 2H), 3.73(s, 3H), 2.63(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.07(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
　上記の合成法に準じた方法により合成した化合物を第３表に記載する。
［第３表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000106
　また、第３表に記載した化合物の１Ｈ－ＮＭＲの測定結果を第４表に記す。
［第４表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000107
［合成例１１］ｋ－１：Ｂ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
　２－ブロモプロピオン酸メチル（１０９）（５００ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．３６ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．５４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～１５／８５）で精製し、１１０（３４３ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ、収率６４％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１１０（３４０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）をメタノール（３．８ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２４時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．３６ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００～２０／８０）で精製し、１１１（３２１ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ、収率９４％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１１１（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、乾燥して得られた黄色固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｂ－１（１７３ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ、収率７０％）を薄黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ10.82(s, 1H), 9.71(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.07(t, J=8.0Hz, 2H), 6.63(d, J=8.0Hz, 2H), 6.56(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.93(d, J=12Hz, NH), 4.28(m, 1H), 2.80(q, J=8.0Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.40(d, J=8.0Hz, 3H), 1.03(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１２］化合物ＧＡ－００２Ａ及び化合物ＧＡ－００２Ｂの合成
　前述の合成例１１で合成したｋ－１：Ｂ－１（ラセミ体）を下記分取条件に従ってＷａｔｅｒｓ社製超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）にて光学分割を行い、以下の２つのエナンチオマーを取得した。両エナンチオマーの比旋光度は、旋光度計Ｐ－１０２０（日本分光社製）を用いて測定した。また、エナンチオマーの立体配置（Ｒ体、Ｓ体）は、Ｘ線結晶構造解析によって決定した。
化合物ＧＡ－００２Ａ（ｋ－１：Ｂ－１の左旋性エナンチオマー）；保持時間１１．９５分、分取量４７５．１ｍｇ、光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．０％、比旋光度[α]２２ Ｄ　－１０．５（ｃ＝０．１０１９、エタノール）、立体配置Ｒ体
化合物ＧＡ－００２Ｂ（ｋ－１：Ｂ－１の右旋性エナンチオマー）；保持時間１４．８５分、分取量４７４．０ｍｇ、光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．１％、比旋光度[α]２２ Ｄ　＋１２．６（ｃ＝０．１０１２、エタノール）、立体配置Ｓ体
＜分取条件＞
　カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＩＡ＜ダイセル社製、２０＊２５０ｍｍ、５μｍ＞、弱溶媒：ＣＯ２（７０％）、強溶媒：ＭｅＯＨ（３０％）、カラム温度：４０℃、総チャージ量：１ｇ、流速：１５ｍＬ／分
［合成例１３］ｋ－１：Ｂ－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000109
　２－ブロモイソ吉草酸エチル（１１２）（７００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（７ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．４０ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．６０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間、８０℃で６時間、１２０℃で２０時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～５／９５）で精製し、１１３（１１０ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ、収率１５％）を黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１１３（９６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．０４２ｍＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で４時間、ヒドラジン一水和物（０．２ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を追加して２０時間、ヒドラジン一水和物（０．１ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）を追加して更に２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００～５／９５）で精製し、１１４（８０．７ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ、収率９０％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１１４（７５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ｋ－１（５０ｍｇ、０．２８　ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．６ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～７５／２５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレン／ＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｂ－２（３７．６ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ、収率３６％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ10.83(s, 1H), 9.72(s, 1H), 7.26(d, J=8.0Hz, 1H), 7.05(t, J=8.0Hz, 2H), 6.71(d, J=8.0Hz, 2H), 6.53(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.78(d, J=12Hz, NH), 3.97(m, 1H), 2.82(q, J=8.0Hz, 2H), 2.03(m, 1H), 1.95(s, 3H), 1.06(t, J=8.0Hz, 3H), 0.97(d, J=8.0Hz, 6H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１４］ｋ－１：Ｂ－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000110
　２－ブロモ－ｎ－オクタン酸（１１５）（６００ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）をメタノール（５．５ｍＬ）に溶解させ、濃塩酸（３滴）を加えて５０℃で１８時間撹拌した。放冷後、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して１１６（５８８ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ、収率９２％）を黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１１６（５８５ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．２９ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．４４ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間、６０℃で１６時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９～５／９５）で精製し、１１７（２７７ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ、収率４５％）を黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１１７（２５６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をメタノール（２．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１０ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で４時間、ヒドラジン一水和物（０．５０ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）を追加して２０時間、ヒドラジン一水和物（０．２５ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を追加して更に２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００～５／９５）で精製し、１１８（２６８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ、収率９９％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１１８（１４４ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、ｋ－１（８０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．９ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～７５／２５）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１／９９～５／９５）、にて精製し、得られた固体を塩化メチレン／ＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１:Ｂ－３（８８．７ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。
　1H-NMR(400MHz):δ10.82(s, 1H), 9.72(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.06(t, J=8. 0Hz, 2H), 6.65(d, J=8.0Hz, 2H), 6.54(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.87(d, J=8.0Hz, NH), 4.19(m, 1H), 2.81(q, J=8.0Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.73(q, J=8.0Hz, 2H), 1.33(m, 4H), 1.27(m, 4H), 1.03(t, J=8.0Hz, 3H), 0.86(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１５］ｋ－１：Ｂ－５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000111
　フェニルプルビン酸（１１９）（１．０ｇ、６．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ＤＢＵ（１．０ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）、ヨウ化メチル（０．４２ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、１Ｍ塩酸（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～１３／８７）で精製し、１２０ａ（２９８ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、収率２７％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１２０ａ（２９５ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をメタノール（６．６ｍＬ）、酢酸（０．６６ｍＬ）、２ＭエチルアミンＴＨＦ溶液（０．８７ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）に溶解させ、氷冷下ピコリンボラン（０．３５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間撹拌した。４Ｍ塩酸（３ｍＬ）を加えて５０℃で３０分加熱し、放冷後、酢酸エチル（２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～３０／７０）で精製し、１２０ｂ（４８．９ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ、収率１４％）を得た。
　上記のようにして得られた１２０ｂ（４５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をメタノール（０．９ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で３時間、メタノール（０．９ｍＬ）、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加して１２時間、メタノール（０．９ｍＬ）、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加して更に３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００～２０／８０）で精製し、１２０ｃ（３２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、収率６８％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１２０ｃ（３０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ｋ－１（２５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．３ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０～６０／４０）にて精製し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｂ－５（１８．４ｍｇ、０．０４９８ｍｍｏｌ、収率３６％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ9.72(s, 1H), 7.30-7.10(m, 6H), 6.38(d, J=8.0Hz, 1H), 3.62(m, J=8.0Hz, 1H), 2.86(q, J=8.0Hz, 2H), 2.66(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.04(d, J=8.0Hz, 2H), 0.98(t, J=8.0Hz, 3H), 0.92(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの二つのシグナルとOHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１６］ｋ－１：Ｃ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000112
　Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１２１）（０．７０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１３ｍＬ）に溶解させ、ＷＳＣ（０．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、フェニルヒドラジン（１２２）（０．４７ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５～６５／３５）にて精製し、１２３（８５３ｍｇ、３．２２ｍｍｏｌ、収率８１％）を無色アモルファスとして得た。
　上記のようにして得られた１２３（０．６４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に４Ｍ塩酸／ジオキサン（６ｍＬ）を加えて室温で３時間撹拌した。析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～８／９２）にて精製し、１２４（２９０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、収率７３％）を、薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１２４（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０～９０／１０）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｃ－１（２０．２ｍｇ、０．０６１７ｍｍｏｌ、収率１１％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ9.89 (s, 1H), 9.67(s, 1H), 7.83(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.14(t, J=8.0Hz, 2H), 6.77(d, J=8.0Hz, 2H), 6.71(t, J=8.0Hz, 1H), 6.29(d, J=8.0Hz, 1H), 4.35(s, 2H), 2.74(q, J=8.0Hz, 2H), 1.92(s, 3H), 1.13(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１７］ｋ－１：Ｃ－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000113
　Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１２１）（０．７０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１３ｍＬ）に溶解させ、ＷＳＣ（０．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン（１２５）（０．５２ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。水（２０ｍＬ）、塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６５／３５）にて精製し、１２６（９３７ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌ、収率８９％）を無色液体として得た。
　上記のようにして得られた１２６（０．９３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（７ｍＬ）を加えて室温で３．５時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０～９５／５）にて精製し、１２７（４５７ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ、収率７９％）を、薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１２７（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）にて精製し、得られた固体をＩＰＥ、塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｃ－２（２９．９ｍｇ、０．０９０８ｍｍｏｌ、収率１７％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ9.63 (s, 1H), 8.55(m, NH), 7.40-7.20(m, 6H), 6.25(d, J=8.0Hz, 1H), 4.32(d, J=8.0Hz, 2H), 4.29(s, 2H), 2.70(q, J=8.0Hz, 2H), 1.91(s, 3H), 1.09(t, J=8.0Hz, 3H).(OHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１８］ｋ－１：Ｄ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000114
　３－ベンジルオキシアニリン（１２９）（２．４４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２４ｍＬ）に溶解させ、酢酸ナトリウム（１．１０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（１．４９ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（３００ｍＬ）、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～１０／９０）にて精製し、１３０（２．８２ｇ、９．８８ｍｍｏｌ、収率８１％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３０（１．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）をメタノール（１８ｍＬ）に懸濁させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７～３５／６５）にて精製し、１３１（２９５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、収率４３％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１３１（０．２９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をエタノール（３．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．３２ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～１０／９０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３２（２３９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、収率８８％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３２（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２１時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５～５０／５０）にて精製した。得られた固体を水、およびＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｄ－１（９５．９ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ、収率５１％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.66(s, 1H), 10.76(s, 1H), 9.70(s, 1H), 8.98(s, 1H), 7.25(d, J=10.8Hz, 1H), 6.86(t, J=10.8Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20-5.95(m, 3H), 5.87(t, J=5.4Hz, NH), 3.88(d, J=5.4Hz, 2H), 2.78(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例１９］ｋ－１：Ｄ－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000115
　合成例１８の工程中で得られた１３０（１．２ｇ、４．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（１．１６ｇ、８．４ｍｍｏｌ）、ヨードエタン（１．３５ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ）を加えて１００℃で３時間、ヨードエタン（０．７ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）を追加して１．５時間、室温で２０時間撹拌した。水（１００ｍＬ）、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～１０／９０）にて精製し、１３３（１．２１ｇ、３．８６ｍｍｏｌ、収率９２％）を無色液体として得た。
　上記のようにして得られた化合物１３３（１．２ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をメタノール（１９ｍＬ）に溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で１５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～２５／７５）にて精製し、１３４（１９４ｍｇ、０．８６９ｍｍｏｌ、収率２２％）を得た。
　上記のようにして得られた１３４（０．２０ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）をエタノール（２．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１８時間、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を追加して更に６０℃で２４時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～６／９４）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３５（１５１ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ、収率８０％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３５（１５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２３時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５～８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（１／１）の混合溶媒で洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｄ－３（１１８ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ、収率５８％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.68(s, 1H), 10.78(s, 1H), 9.69(s, 1H), 9.00(s, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 6.91(t, J=8.1Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.11(d, J=8.1Hz, 1H), 6.10-6.05(m, 2H), 4.12(s, 2H), 3.42(q, J=8.1Hz, 2H), 2.79(q, J=8.1Hz, 2H), 1.96(s, 3H), 1.13(t, J=8.1Hz, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２０］ｋ－１：Ｅ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000116
　アミノフェノール（１３７）（５００ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．７７ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．６１ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。同温で２時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、２Ｍ塩酸（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３８（０．９４ｇ、４．１ｍｍｏｌ、収率８９％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３８（０．９４ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～１２／８８）で精製して１３９（６６４ｍｇ、３．９７ｍｍｏｌ、収率９７％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３９（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１６時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～５／９５）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ｅ－１（１９．７ｍｇ、０．０５９８ｍｍｏｌ、収率１１％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ 9.70(s, 1H), 9.60(s, 1H), 9.38(s, 1H), 8.73(s, 1H), 7.21(d, J=8.0Hz, 1H), 7.06(t, J=8.0Hz, 1H), 7.05(s, 1H), 6.82(d, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 2H), 5.76(s, 1H), 2.69(q, J=8.0Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.13(t, J=8.0Hz, 3H).
［合成例２１］ｋ－１：Ｆ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000117
　ヒドラジン一水和物（０．５８ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（６ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ヘキサメチレンジイソシアネート（１４０）（０．４８ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１．５時間、ヒドラジン一水和物（０．２９ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を追加して２時間撹拌した。生じた固体をろ取、減圧下乾燥し、１４１（０．６０ｇ、２．６ｍｍｏｌ、収率８７％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１４１（１００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ｋ－１（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２０時間撹拌した。放冷後、塩化メチレンを加えて不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮した。得られた固体を塩化メチレンおよび水で洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｆ－１（８８．６ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ、収率３７％）を薄黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ 9.44(s,4H), 7.15(d, J=8.0Hz, 2H), 6.40-6.30(m, 2H), 3.13(q, J=8.0Hz, 4H), 2.63 (q, J=8.0Hz, 4H),1.97(s, 6H), 1.47(m, 4H), 1.38(m, 4H),1.07(t, J=8.0Hz, 6H).
［合成例２２］ｋ－１：Ｇ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000118
　Ｎ－メチル－アニリン（１４２）（０．５０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）をエタノール（９ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（０．９７ｇ、７．０ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（０．５７ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～５／９５）にて精製し１４３（４９６ｍｇ、２．５７ｍｍｏｌ、収率５５％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１４３（０．４９ｇ、２．６ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２５ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１５時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．５０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４４（３８９ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ、収率８３％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１４４（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｇ－１（９２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.64(s, 1H), 10.86(s, 1H), 9.67(s, 1H), 7.24(d, J=10.8Hz, 1H), 7.15(t, J=10.8Hz, 2H), 6.71(d, J=8.1Hz, 2H), 6.62(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 4.23(s, 2H), 3.04(s, 3H), 2.89(q, J=8.1Hz, 2H), 1.93(s, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２３］ｋ－１：Ｌ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000119
　上記の合成例２２に準じた方法により、レゾルシノールを出発原料とし、ｋ－１：Ｌ－１（６５ｍｇ、白色固体）を合成した。
1H-NMR(270MHz);δ 13.63(s, 1H), 10.99(s, 1H), 9.74(s, 1H), 9.46(s, 1H), 7.28(d, J=8.1Hz, 1H), 7.07(t, J=8.1Hz, 1H), 6.45-6.35(m, 4H), 4.72(s, 2H), 2.81(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２４］ｋ－１：Ｍ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000120
　上記の合成例２２に準じた方法により、３－メルカプトフェノールを出発原料とし、ｋ－１：Ｍ－１（１１９ｍｇ、白色固体）を合成した。
1H-NMR(270MHz);δ13.64(s, 1H), 10.96(s, 1H), 9.72(s, 1H), 9.57(s, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11(t, J=8.1Hz, 1H), 6.82(d, J=8.1Hz, 1H), 6.80(s, 1H), 6.62(d, J=8.1Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 3.88(s, 2H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.06(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２５］ｋ－１：Ｇ－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000121
　Ｎ－エチル－アニリン（１４５）（０．５０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をエタノール（８ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（０．８６ｇ、６．２ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（０．５０ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～５／９５）にて精製し１４６（４７３ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ、収率５６％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１４６（０．４７ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をメタノール（４．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１５時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．４４ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４７（３０９ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、収率７０％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１４７（１４０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｇ－２（９６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.66(s, 1H), 10.82(s, 1H), 9.68(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 7.13(t, J=8.1Hz, 2H), 6.65(d, J=8.1Hz, 2H), 6.59(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=10.8Hz, 1H), 4.17(s, 2H),3.46(q, J=8.1Hz, 2H), 2.79(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.13(t, J=8.1Hz, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２６］ｋ－１：Ｊ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000122
　氷冷したＴＨＦ（１０ｍＬ）に水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、３－シアノフェノール（１４８）（０．６３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．５時間、６０℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）を追加して６０℃で更に１６時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、水（１．５ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）、水（４．５ｍＬ）を順次加えて室温で３時間撹拌した。懸濁溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～８／９２）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４９（４７７ｍｇ、３．８７ｍｍｏｌ、収率７３％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１４９（２００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２ｍＬ）、水（２ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．２７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．２２ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２０時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～３５／６５）にて精製し１５０（３６９ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、収率９５％）を無色液体として得た。
　上記のようにして得られた１５０（３６５ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．８ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を追加して５５℃で更に２０時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（３／１）で洗浄後、減圧下乾燥し、１５１（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ、収率８６％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１５１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０～５５／４５）にて精製した。得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｊ－１（１０２ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ、収率５４％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ13.45(brs, 1H), 9.57(s, 1H), 9.53(s, 1H), 9.36(s, 1H), 7.17(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11(d, J=8.1Hz, 1H), 6.80-6.60(m, 4H), 6.37(d, J=8.1Hz, 1H), 4.25(d, J=5.4Hz, 2H), 2.65(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２７］ｋ－１：Ｊ－５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000123
　４－ベンジル－３－チオセミカルバジド（１５５）（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～８０／２０）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：J－５（４９．９ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ、収率２６％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ10.61(brs, 1H), 9.69(s, 1H), 8.43(brs, 1H), 7.40-7.20(m, 6H), 6.40 (d, J=8.0Hz, 1H), 4.78(d, J=8.0Hz, 2H), 2.74(q, J=8.1Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.09(t, J=8.1Hz, 3H). (NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例２８］ｋ－１：Ｊ－６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000124
　チオセミカルバジド（１５２）（０．５０ｇ、５．５ｍｍｏｌ）をメタノール（５．５ｍＬ）に懸濁させ、ヨウ化メチル（０．４１ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１．５時間、反応容器のふたを開けて７０℃で５０分撹拌した。放冷後、ベンジルアミン（０．６１ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣をＩＰＥ／塩化メチレン（１／４）の混合溶媒で洗浄した。得られた粗精製物を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～１５／８５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、１５６（６２６ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ、収率６９％）を橙色固体として得た。
　上記のようにして得られた１５６（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０～８０／２０）にて精製し、得られた粗精製物に塩化メチレン、水を加えて分液した。有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６０／４０）にて精製しｋ－１：Ｊ－６（２９．９ｍｇ、０．０９１６ｍｍｏｌ、収率１７％）を黄色アモルファスとして得た。
1H-NMR(270MHz);δ14.51(brs, 1H), 9.39(s, 1H), 7.36-7.05 (m, 6H), 6.32(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20 (m, NH), 5.30(brs, NH), 4.34(d, J=5.4Hz, 2H), 2.84(q, J=8.1Hz, 2H), 1.96(s, 3H), 0.96(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２９］ｋ－１：Ｎ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000125
　２－ヒドロキシベンジルアルコール（１．０ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）に懸濁させ、炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（２．０ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。徐々に室温まで昇温して５．５時間撹拌し、塩化メチレン（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～３５／６５）にて精製し、３－（ヒドロキシメチル）フェニル　フェニル　カーボネート（１．４５ｇ、５．９４ｍｍｏｌ、収率７３％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた３－（ヒドロキシメチル）フェニル　フェニル　カーボネートを塩化メチレン（７ｍＬ）に溶解させ、ピリジン（０．７２ｍＬ、８．９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰを少量加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（０．９０ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２時間撹拌し、塩化メチレン（１０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７～２５／７５）にて精製し、３－［（フェノキシカルボニル）オキシ］ベンジル　フェニル　カーボネート（２．２０ｇ、６．０４ｍｍｏｌ、収率１０２％）を無色液体として得た。
　上記のようにして得られた３－［（フェノキシカルボニル）オキシ］ベンジル　フェニル　カーボネート（２．２ｇ、６．０ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（２．９ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～１０／９０）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで懸濁洗浄して３－ヒドロキシベンジル　ヒドラジンカルボキシレート（８０８ｍｇ、４．４４ｍｍｏｌ、収率７４％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた３－ヒドロキシベンジル　ヒドラジンカルボキシレート（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’－ジヒドロキシ－３’－メチルプロピオフェノン（１００）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝２／９８～３０／７０）にて精製し、得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取し、ｋ－１：Ｎ－１（８５．５ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ、収率４５％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ13.45(brs, 1H), 10.78(brs, 1H), 9.63 (s, 1H), 9.49 (s, 1H), 7.21(d, J=8.1Hz, 1H), 7.18(t, J=8.1Hz, 1H), 6.84(d, J=8.1Hz, 1H), 6.83(s, 1H), 6.73(d, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 5.14(s, 2H), 2.75(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例３０］ＧＡ－００５Ａの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000126
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
　Ｄ－アラニンメチル塩酸塩（１５７）（１．４０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、３－ベンジルオキシフェニルボロン酸（１５８）（３．４３ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）一水和物（３．００ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブ４Ａ（ＭＳ４Ａ；２０ｇ）を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（４．１７ｍＬ、３０．１ｍｍｏｌ）を加えて酸素雰囲気下室温で２３時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を半分まで減圧下濃縮、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９～１０／９０）にて精製し、１５９（５９５ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色液体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000127
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
　上記のようにして得られた１５９（５９５ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）をメタノール（２１ｍＬ）に溶解させ、パラジウム炭素エチレンジアミン複合体（２４１ｍｇ）を加えて水素雰囲気下、室温で３．５時間撹拌した。パラジウム炭素をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～３０／７０）にて精製し、１６０（４１３ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を黄色液体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000128
　上記のようにして得られた１６０（４１３ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（４．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で３．５時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮、トルエン共沸して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～１０／９０）にて精製し、１６１（３９１ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、収率９５％）を褐色アモルファスとして得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000129
　上記のようにして得られた１６１（７２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、２’，４’－ジヒドロキシ－３’－メチルプロピオフェノン（１００）（６０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．６７ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５～５０／５０）にて精製し、得られた精製物を蒸留水、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／ヘキサン、蒸留水で順次懸濁洗浄して、ＧＡ－００５Ａ（ＺＸ－０１－Ｒ（４０．５ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ、収率３４％））を薄茶色固体として得た。比旋光度は、旋光度計Ｐ－１０２０（日本分光社製）を用いて測定した。
1H-NMR(270MHz); ;δ13.65(s, 1H), 10.75(s, 1H), 9.70(s, 1H), 8.97(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 6.83(t, J=8.1Hz, 1H), 6.39(d, J=8.1Hz, 1H), 6.15-5.95(m, 3H), 5.81(d, J=8.1Hz, 1H), 4.18(m, 1H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.37(d, J=8.1Hz, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
化合物ＧＡ－００５Ａ；光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．２％、比旋光度[α]２２ Ｄ－１１．４（ｃ＝０．０２６４、エタノール）、立体配置Ｒ体
［合成例３１］ＧＡ－００５Ｂの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000130
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
　Ｌ－アラニンメチル塩酸塩（１６２）（７００ｍｇ、５．０２ｍｍｏｌ）、３－ベンジルオキシフェニルボロン酸（１５８）（１．７２ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）一水和物（１．５０ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）、ＭＳ４Ａ（１０ｇ）を塩化メチレン（１００ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（２．０９ｍＬ、１５．１ｍｍｏｌ）を加えて室温で１８時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下半分まで濃縮、塩化メチレン（２５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９～１０／９０）にて精製し、１６３（２５５ｍｇ、０．８９４ｍｍｏｌ、収率１８％）を薄黄色液体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000131
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
　上記のようにして得られた１６３(２５５ｍｇ、０．８９４ｍｍｏｌ)をメタノール(９ｍＬ)に溶解させ、５％パラジウム炭素(１９０ｍｇ)を加えて水素雰囲気下、室温で2時間撹拌した。パラジウム炭素をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～１００／０）にて精製し、１６４（９２．０ｍｇ、０．４７１ｍｍｏｌ、収率５３％）を薄褐色液体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000132
　上記のようにして得られた１６４（７５．５ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ）をエタノール（０．８ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１９ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮、トルエン共沸して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～４／９６）にて精製し１６５（６２．２ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ、収率８２％）を無色アモルファスとして得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000133
　上記のようにして得られた１６５（６０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、２’，４’－ジヒドロキシ－３’－メチルプロピオフェノン（１００）（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝３／９７～５０／５０）にて精製し、得られた固体をＩＰＡに溶解させ、ヘキサンを加えて析出した固体をろ取して、ＧＡ－００５Ｂ（ＺＸ－０１－Ｓ（３０．１ｍｇ、０．０８４２ｍｍｏｌ、収率３０％））を薄茶色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ13.64(s, 1H), 10.73(s, 1H), 9.69(s, 1H), 8.96(s, 1H), 7.24(d, J=8.1Hz, 1H), 6.82(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 6.15-5.95(m, 3H), 5.80(d, J=8.1Hz, 1H), 4.18(m, 1H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.36(d, J=8.1Hz, 3H), 1.01(t, J=8.1Hz, 3H).
化合物ＧＡ－００５Ｂ；光学純度９９．９ｅｅ％、純度９７．８％、比旋光度［α］２２ Ｄ　＋１１．３（ｃ＝０．０２３０、エタノール）、立体配置Ｓ体
［実施例１］キナーゼ阻害活性評価１
　化合物ｋ－１：Ｂ－１について、８種類のキナーゼ（ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３）に対する阻害活性評価（５０％阻害濃度（IC50）の算出）を行った。活性測定は、以下に記載したＯｆｆ―ｃｈｉｐ　Ｍｏｂｉｌｉｔｙ　Ｓｈｉｆｔ　Ａｓｓａｙ (ＭＳＡ法)を用いて行った。ｋ－１：Ｂ－１の試験濃度は最終濃度１０μＭから０．３ｎＭの１０段階になるように添加した。
　データの解析方法としては全ての反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均シグナルを０％阻害、酵素非添加の平均シグナルを１００％阻害とし、各被検物質試験２ウェルの平均シグナルから阻害率を計算した。IC50値は被検物質濃度と阻害率によるプロットをExcel ソルバーアドインを用いて非線形最小二乗法により４パラメータのロジスティック曲線に近似させて求めた。
ＭＳＡ法：
　アッセイバッファー(20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH7.5)にて調製した５μＬの４倍濃度ｋ－１：Ｂ－１溶液、５μLの４倍濃度基質／ＡＴＰ／金属溶液および１０μLの２倍濃度キナーゼ溶液をポリプロピレン製３８４ウェルプレートのウェル内で混合し、室温にて１もしくは５時間反応させた。続いて７０μLのTermination Buffer (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences社)を添加して反応を停止させた。その後、反応溶液中の基質ペプチドとリン酸化ペプチドをLabChip system (Perkin Elmer社)にて分離、定量した。キナーゼ反応は基質ペプチドピーク高さ(S)とリン酸化ペプチドピーク高さ(P)から計算される生成物比（P/(P+S))にて評価した。
　本試験の結果として、ｋ－１：Ｂ－１のIC50値を表５に示す。ｋ－１：Ｂ－１は、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、及びＳＧＫ３キナーゼを阻害していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000134
[実施例２]キナーゼ阻害活性評価２
　化合物ｋ－１：Ｈ－７、ｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ｋ－１：Ｊ－１、及びｋ－１：Ｂ－１について、８種類のキナーゼ（CGK2、LATS2、MSK1、p70S6K、PKACα、PKACβ、SGK2、SGK3）に対する１００ｎＭでの阻害率の算出を行った。活性測定はＭＳＡ法を用いて行った。データの解析方法としては全ての反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均シグナルを0%阻害、酵素非添加の平均シグナルを１００％阻害とし、各被検物質試験２ウェルの平均シグナルから阻害率を計算した。
ＭＳＡ法：
　アッセイバッファー(20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH7.5)にて調製した５μＬの４倍濃度化合物溶液、５μＬの４倍濃度基質／ＡＴＰ／金属溶液および１０μＬの２倍濃度キナーゼ溶液をポリプロピレン製３８４ウェルプレートのウェル内で混合し、室温にて１もしくは５時間反応させた。続いて７０μＬのTermination Buffer (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences社)を添加して反応を停止させた。その後、反応溶液中の基質ペプチドとリン酸化ペプチドをLabChip system (Perkin Elmer社)にて分離、定量した。キナーゼ反応は基質ペプチドピーク高さ(S)とリン酸化ペプチドピーク高さ(P)から計算される生成物比（P/(P+S))にて評価した。
　本試験の結果、化合物ｋ－１：Ｈ－７、ｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ｋ－１：Ｊ－１、及びｋ－１：Ｂ－１は１００nMにおいて８種類のキナーゼ（CGK2、LATS2、MSK1、p70S6K、PKACα、PKACβ、SGK2、及びSGK3）に対して４０％以上の活性阻害率を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000135
[実施例３]キナーゼ阻害活性評価３
　化合物ｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－７、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－５：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－３、ｋ－１：Ｄ－４及びｋ－１：Ｉ－１０について、ＬＡＴＳ２に対する阻害活性評価（ＩＣ５０の算出）を行った。活性測定は、以下に記載したＯｆｆ―ｃｈｉｐ　Ｍｏｂｉｌｉｔｙ　Ｓｈｉｆｔ　Ａｓｓａｙ (ＭＳＡ法)を用いて行った。各化合物の試験濃度は最終濃度１０μＭから０．３ｎＭの１０段階になるように添加した。
　データの解析方法としては全ての反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均シグナルを０％阻害、酵素非添加の平均シグナルを１００％阻害とし、各被検物質試験２ウェルの平均シグナルから阻害率を計算した。ＩＣ５０値は被検物質濃度と阻害率によるプロットをExcel ソルバーアドインを用いて非線形最小二乗法により４パラメータのロジスティック曲線に近似させて求めた。
ＭＳＡ法：
　アッセイバッファー(20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH7.5)にて調製した５μLの４倍濃度ｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－７、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－５：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－３、ｋ－１：Ｄ－４及びｋ－１：Ｉ－１０溶液、５μLの４倍濃度基質／ＡＴＰ／金属溶液および１０μLの２倍濃度キナーゼ溶液をポリプロピレン製３８４ウェルプレートのウェル内で混合し、室温にて１もしくは５時間反応させた。続いて７０μLのTermination Buffer (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences社製)を添加して反応を停止させた。その後、反応溶液中の基質ペプチドとリン酸化ペプチドをLabChip system (Perkin Elmer社製)にて分離、定量した。キナーゼ反応は基質ペプチドピーク高さ(S)とリン酸化ペプチドピーク高さ(P)から計算される生成物比（P/(P+S))にて評価した。
　本試験の結果として、ｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－７、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－５：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－３、ｋ－１：Ｄ－４及びｋ－１：Ｄ－１０のＩＣ５０値を表７に示す。これらの化合物は、ＬＡＴＳ２に対するＩＣ５０が１００ｎＭ以下であり、ＬＡＴＳ２に対する阻害効果を有することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000136
[実施例４]ＹＡＰ蛋白質の核内移行に対する特定化合物の作用
　化合物ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、及びｋ－１：Ｊ－１について、ＹＡＰ蛋白質及びＴＡＺ蛋白質の核内移行に対する評価を行った。核内移行はヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて、以下に記載したＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いたイメージング解析によって行った。ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、及びｋ－１：Ｊ－１の試験濃度は最終濃度が１０μＭになるように添加した。
イメージング解析：
　ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、シクロオレフィン底面の９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－Ｕｌｔｒａ）へ１５，０００細胞／９０μＬ／ウェルとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１日培養した。培養後、ＤＭＳＯに溶解した１００μＭの濃度のｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、及びｋ－１：Ｊ－１溶液を１０μＬ添加した。更に３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間培養し、培地を４％パラホルムアルデヒドへ交換、室温で１０分間静置することによって、細胞を固定した。固定した細胞に対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）６４７標識ＹＡＰ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗マウスＴＡＺ（Ｄ－８）抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製の推奨プロトコルに従って免疫染色を行い、さらに１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液で細胞核を染色した。
　ＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳの２０倍対物レンズを用いて、１ウェルあたり９視野撮像した。得られた蛍光像から解析ソフトＨａｒｍｏｎｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、細胞核領域と細胞質領域をそれぞれ同定し、各領域内の単位面積あたりのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）６４７蛍光強度と単位面積あたりのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）５５５蛍光強度を抽出した。核内移行は、抽出した値から細胞質領域の蛍光強度に対する細胞核領域の蛍光強度の比を算出することによって評価した。ＹＡＰ蛋白質ならびにＴＡＺ蛋白質が細胞核へ移行するにつれて値は１より大きくなり、細胞質へ局在する場合は１未満となる。
　本試験の結果として、化合物無添加とｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、及びｋ－１：Ｊ－１を添加した際の核内移行率を表８に示す。表８に示される通り、化合物ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、及びｋ－１：Ｊ－１は、ＹＡＰ蛋白質及びＴＡＺ蛋白質の核内移行を促進する作用を有することが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000137
[実施例５]ＹＡＰ蛋白質の核内移行に対する特定化合物の作用
　化合物ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、及びｋ－１：Ｊ－１について、ＹＡＰ蛋白質及びＴＡＺ蛋白質の核内移行に対する評価を行った。核内移行はヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いて、実施例４に記載したＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いたイメージング解析によって行った。ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１とｋ－１：Ｊ－１の試験濃度は最終濃度が１０μＭになるように添加した。
サンプル調製：
　ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社推奨プロトコルによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、シクロオレフィン底面の９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－Ｕｌｔｒａ）へ２５，０００細胞／９０μＬ／ウェルとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１日培養した。培養後、１００μＭの濃度のｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、及びｋ－１：Ｊ－１溶液を添加した。３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間培養し、培地を４％パラホルムアルデヒド溶液へ交換、室温で１０分間静置することによって、細胞を固定した。固定した細胞に対して、実施例４に記載した方法で免疫染色を行った。
　本試験の結果として、化合物無添加群とｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、及びｋ－１：Ｊ－１を添加した際の核内移行率を表９に示す。表９に示される通り、化合物ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、及びｋ－１：Ｊ－１は、ＹＡＰ蛋白質及びＴＡＺ蛋白質の核内移行を促進する作用を有することが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000138
[実施例６]遺伝子発現に対する特定化合物の作用
　特許文献（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三昌株式会社製）、３０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）を調製した。ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、本培地に懸濁し６ウェルプレート（コーニング社製、＃３４７１）へ１，０００，０００細胞／３．３ｍＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、ＤＭＳＯに溶解したｋ－１：Ｂ－１を１０μＭの最終濃度となるように細胞懸濁液に添加した。更に３７℃のＣＯ２インキュベーターで６或いは２４時間培養した後、細胞培養液に対して１１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、シグマアルドリッチジャパン社製）を添加してから遠心処理（４００Ｇ、３分間）することにより、細胞を沈降させた。上清を除去後、ＰＢＳ１０ｍＬにて細胞を懸濁し、さらなる遠心処理（４００Ｇ、５分間）により細胞のペレットを得た。引き続き、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、得られた細胞から全ＲＮＡ（リボ核酸）を単離した。本ＲＮＡについて、ＨｕｍａｎＧｅｎｅ２．０ＳＴ Ａｒｒａｙ（アフィメトリックス社製）を用いたＤＮＡマイクロアレイを実施し、特定化合物の添加によるヒト遺伝子発現の変化を網羅的に解析した（倉敷紡績株式会社の遺伝子解析受託サービスを利用、製品番号；ＧＡ０３１２）。
　本解析の結果として、ｋ－１：Ｂ－１添加により発現が上昇した、ＹＡＰにより発現が制御される遺伝子を表１０に示す。表１０の数値は、化合物無添加時の遺伝子発現量を１としたときのｋ－１：Ｂ－１添加時の発現量の倍率を表す。表１０に示される通り、化合物ｋ－１：Ｂ－１は、ＹＡＰ蛋白質により発現が制御される遺伝子に関して、その発現量を上昇させる効果を有することが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000139
[実施例７]ＹＡＰ、リン酸化ＹＡＰ、ＴＡＺのタンパク質量に対する特定化合物の作用
　２Ｄ培養条件：ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）に懸濁し１００ｍｍディッシュ（コーニング社製、＃４３０１６７）へ１，０００，０００細胞／１０ｍＬとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。その後、ＤＭＳＯに溶解したｋ－１：Ｂ－１を１，５，１０μＭの最終濃度となるように培養液に添加した。対照として、未添加のもの及びＤＭＳＯを添加したものを培養した。１時間後に、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、和光純薬工業社製）で３回洗浄した後、プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ社製）を含むリパバッファー（和光純薬工業社製）を２５０μＬ添加し、スクレーパーを用いて細胞を溶解させた。溶解液をチューブに移し、超音波を４℃で４５秒間照射した後、４℃で１０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を分注し、タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定し、続いて溶解物に対してＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙl　ｓｕｌｆａｔｅ）ゲル電気泳動を行った。タンパク質をメンブレン（ＢｉｏＲａｄ社製）に転写し、ブロッキングバッファ中で保管した。その後、ＹＡＰ（ＣＳＴジャパン社製）、リン酸化ＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７，ＣＳＴジャパン社製）、ＴＡＺ（ＣＳＴジャパン社製）、及びＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社製）を認識する一次抗体でプローブした。抗ウサギＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）または抗マウスＨＲＰを連結した二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）でインキュベーション後、イムノスターゼータ（和光純薬工業社製）を用いて化学発光検出装置（ＢｉｏＲａｄ社製）にて検出した。
　３Ｄ培養条件：特許文献（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三昌株式会社製）、３０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）を調製した。ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、本培地に懸濁し低接着１００ｍｍディッシュ（コーニング社製、＃３２６２）へ２，０００，０００細胞／１０ｍＬとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。その後、ＤＭＳＯに溶解したｋ－１：Ｂ－１を１，５，１０μＭの最終濃度となるように培養液に添加した。対照として、未添加のもの及びＤＭＳＯを添加したものを培養した。１時間後に、培養液を５０ｍＬチューブに移し、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、和光純薬工業社製）を４０ｍＬ加えた。４℃で３分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を除去した。再度、氷冷したＰＢＳを５０ｍＬ加え、４℃で３分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を除去した。氷冷したＰＢＳを１ｍＬ加え、エッペンチューブに移した後、４℃で３分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を除去した。再度、氷冷したＰＢＳを１ｍＬ加え、４℃で３分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を除去した。この後、プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ社製）を含むリパバッファー（和光純薬工業社製）を２５０μＬ添加し、ピペッティングにより細胞を溶解させた。その後、超音波を４℃で４５秒間照射した後、４℃で１０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を分注し、タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定し、続いて溶解物に対してＳＤＳゲル電気泳動を行った。タンパク質をメンブレンに転写し、ブロッキングバッファ中で保管した。その後、ＹＡＰ（ＣＳＴジャパン社製）、リン酸化ＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７，ＣＳＴジャパン社製）、ＴＡＺ（ＣＳＴジャパン社製）、及びＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社製）を認識する一次抗体でプローブした。抗ウサギＨＲＰまたは抗マウスＨＲＰを連結した二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）でインキュベーション後、イムノスターゼータ（和光純薬工業社製）を用いて化学発光検出装置（ＢｉｏＲａｄ社製）にて検出した。本結果を図１に示す。
　本解析の結果として、ｋ－１：Ｂ－１添加により２Ｄ培養並びに３Ｄ培養の両条件においてＹＡＰのリン酸化が抑制されていることが明らかとなった。また、２Ｄ培養並びに３Ｄ培養の両条件においてｋ－１：Ｂ－１添加により細胞内の総ＹＡＰタンパク量並びに総ＴＡＺタンパク量が増加していることが明らかとなった。
[実施例８]マウス肝部分切除モデルにおける肝重量増加に対する特定化合物の作用
　マウス肝臓を一部切除した肝部分切除モデルを以下に記述するように作製し、切除直後の肝重量と切除３日後の肝重量を比較することで特定化合物の肝重量増加効果を評価した。
評価サンプル：
　０．５ｗ/ｖ％メチルセルロース水溶液（０．５％ＭＣ、富士フイルム和光純薬社製）及びｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｊ－１を評価した。ｋ－１：Ｂ－１及びｋ－１：Ｊ－１は０．５％ＭＣに懸濁し、最終濃度１ｍｇ/ｍＬとなるように調製した。
手順：
　マウスはＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ、５週齢、雄を日本チャールスリバー（株）より購入した。０．５％ＭＣ投与コントロール群は０．５％ＭＣ　１０ｍＬ/ｋｇを腹腔内へ単回投与し、２４時間後に肝臓を全て摘出して肝重量を測定した（ｎ＝５）。また、０．５％ＭＣ投与肝切除群は０．５％ＭＣ　１０ｍＬ/ｋｇを腹腔内へ２４時間ごとに計４回連続投与した。投与２回目の直後にイソフルラン（株式会社インターベット製）麻酔下で開腹し、肝臓の葉の根元を縫合糸を用いて結紮し、結紮した葉の先を切除することで最終的に肝臓の３０％程度を除去した。その後閉腹し、最終投与から２４時間後に肝臓を全て摘出し肝重量を測定した（ｎ＝４）。ｋ－１：Ｂ－１またはｋ－１：Ｊ－１投与－コントロール群はｋ－１：Ｂ－１またはｋ－１：Ｊ－１　１０ｍｇ/ｋｇ、１０ｍＬ/ｋｇを腹腔内へ単回投与し、２４時間後に肝臓を全て摘出して肝重量を測定した（ｎ＝５）。また、ｋ－１：Ｂ－１またはｋ－１：Ｊ－１－肝切除群はｋ－１：Ｂ－１またはｋ－１：Ｊ－１　１０ｍｇ/ｋｇ、１０ｍＬ/ｋｇを腹腔内へ２４時間ごとに計４回連続投与した。投与２回目の直後にイソフルラン麻酔下で開腹し、肝臓の葉の根元を縫合糸を用いて結紮し、結紮した葉の先を切除することで最終的に肝臓の３０％程度を除去した。その後閉腹し、最終投与から２４時間後に肝臓を全て摘出して肝重量を測定した（ｎ＝５）。
　本試験の結果として、０．５％ＭＣ、ｋ－１：Ｂ－１またはｋ－１：Ｊ－１を投与した肝部分切除マウスの肝体重比の変化を図２に示す。図２に示される通り、ｋ－１：Ｂ－１及びｋ－１：Ｊ－１は切除後の肝重量の回復を促進する作用を有することが明らかとなった。すなわち、ｋ－１：Ｂ－１及びｋ－１：Ｊ－１は組織損傷の治療効果を有することが明らかとなった。
[実施例９]光学異性体のキナーゼ阻害活性評価
　化合物ｋ－１：Ｂ－１（ラセミ体）、ＧＡ－００２Ａ、ＧＡ－００２Ｂ、ＧＡ－００５Ａ及びＧＡ－００５Ｂについて、ＬＡＴＳ１及びＬＡＴＳ２（カルナバイオサイエンス社製）に対する阻害活性評価（ＩＣ５０の算出）を行った。活性測定は、以下に記載したＫｉｎａｓｅ　Ａｓｓａｙ法を用いて行った。ｋ－１：Ｂ－１（ラセミ体）、ＧＡ－００２Ａ、ＧＡ－００２Ｂ、ＧＡ－００５Ａ及びＧＡ－００５Ｂの試験濃度は最終濃度１０μＭから０．３ｎＭの８段階（１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ）になるように添加した。
　データの解析方法としては評価化合物以外の反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均シグナルを０％阻害、酵素非添加の平均シグナルを１００％阻害とし、各被検物質試験２ウェルの平均シグナルから阻害率を計算した。ＩＣ５０値の算出は、ＥＸＳＵＳ（バージョン７．１．６、ＣＡＣエクシケア社製）を用いて行った。
Ｋｉｎａｓｅ　Ａｓｓａｙ法：
　アッセイバッファー(２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、２ｍＭ ＤＴＴ、５０ｕｇ/ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．５)にて調製した２μＬの２．５倍濃度本発明化合物溶液、１μＬの５倍濃度基質（ＳＧＫｔｉｄｅ：ＮＨ２－ＣＫＫＲＮＲＲＬＳＶＡ－ＣＯＯＨ、ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ社製）、ＡＴＰ（シグマアルドリッチ社製）、ＭｇＣｌ２（富士フイルム和光純薬社製）溶液（終濃度は１０μＭ、４００μＭ又は５ｍＭ）及び２μＬの２．５倍濃度キナーゼ溶液（ＬＡＴＳ１又はＬＡＴＳ２の終濃度５μｇ/ｍＬ）をポリプロピレン製３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製、♯７８４９００）のウェル内で混合し、室温にて５時間反応させた。続いて５μＬの検出溶液 (Ｆｌｕｏｒｏｓｐａｒｋ（登録商標）Ｋｉｎａｓｅ/ＡＤＰ　Ｍｕｌｔｉ-Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ；富士フイルム和光純薬社製)を添加し、室温にて３０分反応させた。続いて５μLの反応停止液 (Ｆｌｕｏｒｏｓｐａｒｋ（登録商標）Ｋｉｎａｓｅ/ＡＤＰ　Ｍｕｌｔｉ-Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ；富士フイルム和光純薬社製)を添加して反応を停止させた。その後、反応溶液中のＡＤＰ濃度をＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて定量し、キナーゼ反応を検出した。
　本試験の結果として、ｋ－１：Ｂ－１（ラセミ体）、ＧＡ－００２Ａ(左旋性ｋ－１：Ｂ－１、Ｒ体)、ＧＡ－００２Ｂ（右旋性ｋ－１：Ｂ－１、Ｓ体）、ＧＡ－００５Ａ（Ｒ体）及びＧＡ－００５Ｂ（Ｓ体）のＩＣ５０値を第１１表に、阻害率を第１２表に示す。
[第１１表]
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000140
[第１２表]
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000141
　第１１表及び第１２表に示される通り、ｋ－１：Ｂ－１（ラセミ体）、ＧＡ－００２Ａ及びＧＡ－００５Ａは、ＬＡＴＳ１及びＬＡＴＳ２に対する高い阻害効果を有することが示された。特に、ＧＡ－００２Ａは、ｋ－１：Ｂ－１（ラセミ体）と比較して、２倍以上ＩＣ５０が減少していた。
［実施例１０］ヒト表皮角化細胞を用いた細胞増殖に対する特定化合物の作用
　ヒト初代表皮角化細胞は、＃ＰＣＳ－２００－０１０（ＡＴＣＣ；Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、ケラチノサイト用添加物キット（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ－２００－０４０）を添加した表皮細胞系基礎培地（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ－２００－０３０）を用いて単層培養法にて前培養した。表皮角化細胞を同培地に懸濁した後、終濃度１０μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる特定化合物をそれぞれ添加し、９６ウェルＵ底細胞低接着プレート（コーニング社、＃４５２０）に１６００ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。３７℃、５％　ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。培養後、ＡＴＰ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ）を用いて生細胞数を計測した。平底プレートの培養液に対してＡＴＰ試薬を６４μＬ／ウェル添加し懸濁させ、懸濁液１００μＬ／ウェルをアッセイ用白色プレート（コーニング社、＃３９１２）へ移した。１０分間室温で静置した後、プレートリーダー（パーキンエルマー社、ＥｎＳｐｉｒｅ）を用いて発光量を測定した。
　測定した発光量について、対照群（ＤＭＳＯ）に対する相対値を算出したところ、下記の化合物を添加することで、発光量が４倍以上増加した。すなわち、下記の化合物の添加により細胞数が４倍以上に増加していた。このことから本発明の化合物は表皮角化細胞の増殖促進効果を有していることが示された。
細胞数が４倍以上に増加した化合物：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１
［実施例１１］ヒト初代表皮角化細胞およびヒト初代角膜上皮細胞の遺伝子発現に対する特定化合物の作用
　実施例１０と同様に、ヒト初代表皮角化細胞（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ－２００－０１０）を、ケラチノサイト用添加物キット（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ－２００－０４０）を添加した表皮細胞系基礎培地（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ－２００－０３０）を用いて単層培養法にて前培養した。また、ヒト初代角膜上皮細胞（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ－７００－０１０）を、角膜上皮細胞系添加物キット（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ－７００－０４０）を添加した角膜上皮細胞系基礎培地（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ－７００－０３０）を用いて単層培養法にて前培養した。角膜上皮細胞及び表皮角化細胞を２４ウェル平底プレート（コーニング社、＃３５２６）に１００，０００ｃｅｌｌｓ／３８０μＬ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％　ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。続いて、ＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる特定化合物を、終濃度１０μＭとなるように添加した培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養後、細胞培養液を除去し、Ｄ－ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬株式会社、＃０４９－２９７９３）を５００μＬ／ウェル添加し、除去した。引き続き、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、細胞から全ＲＮＡ（リボ核酸）を単離した。本ＲＮＡについて、ＴａｑｍａｎＡｓｓａｙ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いた遺伝子発現解析を実施し、特定化合物の添加によるＹＡＰおよびＴＡＺ蛋白質下流のヒト遺伝子発現の変化を解析した。解析した遺伝子名と使用したプローブのＡｓｓａｙＩＤを以下に示す。
遺伝子名             ＡｓｓａｙＩＤ　　　　　　
ＧＡＰＤＨ           Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１
ＣＹＲ６１           Ｈｓ００１５５４７９＿ｍ１
ＡＮＫＲＤ１         Ｈｓ００１７３３１７＿ｍ１
ＣＣＮＤ１           Ｈｓ００７６５５５３＿ｍ１
　得られた発現量について、ＧＡＰＤＨに対する相対値を算出した。その結果、対照群（ＤＭＳＯ）と比較して、特定化合物を添加することにより相対発現量が増加した。すなわち、本発明に用いられる特定化合物は、ＹＡＰ蛋白質により発現が制御される遺伝子に関して、その発現量を上昇させる効果を有することが明らかになった。
ＡＮＫＲＤ相対発現量が５倍以上増加した化合物（表皮角化細胞）：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１
ＡＮＫＲＤ相対発現量が３倍以上増加した化合物（角膜上皮細胞）：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１
ＡＮＫＲＤ相対発現量が５倍以上増加した化合物（角膜上皮細胞）：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１
ＣＣＮＤ１相対発現量が１．５倍以上増加した化合物（表皮角化細胞）：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１
ＣＣＮＤ１相対発現量が１．５倍以上増加した化合物（角膜上皮細胞）：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１
ＣＹＲ６１相対発現量が１．５倍以上増加した化合物（表皮角化細胞）：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１
ＣＹＲ６１相対発現量が２倍以上増加した化合物（角膜上皮細胞）：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１
［実施例１２］ＹＡＰ蛋白質およびＴＡＺ蛋白質の核内移行に対する特定化合物の作用
　本発明に用いられる特定化合物について、ＹＡＰ蛋白質およびＴＡＺ蛋白質の核内移行に対する評価を行った。核内移行はヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社）を用いて、以下に記載したＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いたイメージング解析によって行った。本発明に用いられる特定化合物の試験濃度は最終濃度が１０μＭになるように添加した。
イメージング解析：
　ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、シクロオレフィン底面の９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－Ｕｌｔｒａ）へ１５，０００細胞／９０μＬ／ウェルとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１日培養した。培養後、ＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる特定化合物の溶液をそれぞれ添加した。更に３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間培養し、培地を４％パラホルムアルデヒドへ交換、室温で１０分間静置することによって、細胞を固定した。固定した細胞に対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）６４７標識ＹＡＰ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗マウスＴＡＺ（Ｄ－８）抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の推奨プロトコルに従って免疫染色を行い、さらに１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液で細胞核を染色した。
　ＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳの２０倍対物レンズを用いて、１ウェルあたり９視野撮像した。得られた蛍光像から解析ソフトＨａｒｍｏｎｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて、細胞核領域と細胞質領域をそれぞれ同定し、各領域内のＹＡＰ蛋白質－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）６４７蛍光強度ならびにＴＡＺ蛋白質－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）５５５蛍光強度を抽出した。さらに抽出した値から細胞質領域の蛍光強度に対する細胞核領域の蛍光強度の比を算出した。今回、蛍光強度比が１．４以上となった場合を、ＹＡＰ蛋白質およびＴＡＺ蛋白質が核内へ移行した細胞集団と定義し、その割合を算出した。
　算出した細胞集団の割合について、対照群（ＤＭＳＯ）に対する相対値を算出したところ、下記の化合物を添加することで、ＹＡＰ蛋白質については６倍以上、ＴＡＺ蛋白質については１．５倍以上、細胞集団が増加した。このことから本発明に用いられる特定化合物は、ＹＡＰ蛋白質ならびにＴＡＺ蛋白質の核内移行を促進する作用を有することが明らかになった。
ＹＡＰ蛋白質が核内移行した細胞集団が６倍以上に増加した化合物：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１
ＴＡＺ蛋白質が核内移行した細胞集団が１．５倍以上に増加した化合物：
ｋ－１：Ｂ－１、ＧＡ－００２Ａ、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｈ－１
〔実施例１３〕本発明化合物のＹＡＰリン酸化阻害作用
　ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を１５％ＦＢＳ含有ＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）にて前培養（単層培養）を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄した。接着細胞は、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン－１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（富士フイルム和光純薬社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして、剥離した。上記培地を添加し、遠心して同培地で再懸濁した。
　特許文献（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三昌株式会社製）を含有する１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｐｈｅｎｏｌ－ｒｅｄ不含、富士フイルム和光純薬社製）の組成物をＦＣｅＭ－ｓｅｒｉｅｓ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（富士フイルム和光純薬社製）にて調製した。次いで、上記で調製した各種細胞を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物（３Ｄ条件）または非添加の培地（２Ｄ条件）に懸濁した後、１０００００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、５０μＬ／ウェル（コーニング社製、９６ウェル平底プレート、＃３５８５、２Ｄ条件）または２５μＬ／ウェル（コーニング社製、９６ウェル低接着平底プレート、＃３４７４）へ播種した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに静置し、播種から３時間後に終濃度の２倍または６倍濃度にて培地で希釈した本発明化合物、ＤＭＳＯ、または培地のみを５０μＬ／ウェル（２Ｄ条件）、５μＬ／ウェル（３Ｄ条件）でプレートに添加し、各化合物の終濃度を１０μＭとした。さらに１時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養後、２Ｄ条件では上清をアスピレートしてｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１倍濃度、シスバイオ社製、ＹＡＰ－ｔｏｔａｌキットまたはＹＡＰ　ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓ１２７キット）５０μＬを添加、３Ｄ条件ではｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　Ｌｙｓｙｓ　ｂｕｆｆｅｒ（４倍濃度）１０μＬを培養上清に添加し、プレートシェイカーで３０分間攪拌した。その後プレートを遠心して、上清１６μＬを３８４ウェル白色プレート（コーニング社、＃４５１２）に移し、キット付属の各抗体溶液（ｐＹＡＰ　ｄ２抗体またはＴｏｔａｌ－ＹＡＰ　ｄ２抗体と、ｐＹＡＰ　Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体またはＴｏｔａｌ－ＹＡＰ　Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体）を計４μＬ／ウェル添加し、室温にて一晩静置した。ブランクコントロールとして、化合物刺激を行わない細胞にｐＹＡＰ　Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体またはＴｏｔａｌ－ＹＡＰ　Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体のみを添加して同様に処理をした（Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。翌日、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）のＨＴＲＦモードにて６６５ｎｍ及び６１５ｎｍ波長を測定した。
　得られたシグナルを下記のように計算した。Ｒａｔｉｏ＝ｓｉｇｎａｌ（６６５ｎｍ）／ｓｉｇｎａｌ（６１５ｎｍ）×１００００、ΔＲ＝Ｓｉｇｎａｌ（Ｒａｔｉｏ）－Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、化合物非添加群（Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のΔＲを１００％とした相対値を算出し、各化合物のリン酸化ＹＡＰ量または総ＹＡＰ量を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000142
　表１３に示される通り、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ＧＡ－００２Ａ、およびＧＡ－００５Ａは２Ｄ、３Ｄの両培養条件でＹＡＰリン酸化阻害作用を有することが示された。
［実施例１４］大腸炎モデルマウスにおける炎症抑制効果
　デキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｓｏｄｉｕｍ（ＤＳＳ）、富士フイルム和光純薬製）を投与した大腸炎モデルを以下に記述するように作製した。また、大腸炎の評価は形態学的パラメータとして大腸の長さが利用されており、炎症の程度に応じて大腸が短小化する。このため大腸の長さを比較することで化合物の炎症抑制効果を評価した。
評価サンプル：
　化合物Ｋ－１：Ｊ－１を０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース水溶液（０．５％ＭＣ、富士フイルム和光純薬製）に５ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、１回あたり５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。陰性対照は０．５％ＭＣを投与した。
手順：
　マウスはＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ、６週齢、雄を日本チャールスリバー（株）より購入した。飲料水は蒸留水または２．５ｗ／ｖ％ＤＳＳ水溶液を自由飲水させた。ＤＳＳ飲水開始日を１日目とし、８日目まで飲水させた。化合物Ｋ－１：Ｊ－１は５０ｍｇ／ｋｇを１日目から２４時間おきに腹腔内投与した。８日目に解剖して大腸を摘出し、大腸の長さを測定した。各群４例で実施した。
　本試験の結果としてマウスの大腸の長さを図３に示す。図３に示される通り、ＤＳＳ飲水群は蒸留水飲水群と比較して大腸が短くなったが、ＤＳＳ飲水－化合物Ｋ－１：Ｊ－１投与群はＤＳＳ飲水－０．５％ＭＣ投与群より大腸の短小化が抑制された。以上のことから化合物Ｋ－１：Ｊ－１はＤＳＳ由来の大腸炎の発症を抑制する効果を有することが明らかとなった。
［実施例１５］マウス皮膚全層欠損創モデルにおける創傷治癒促進効果
　マウス背部の皮膚を一部除去した皮膚全層欠損創を以下に記述するように作製し、創面積の縮小率を比較することで化合物の創傷治癒促進効果を評価した。
評価サンプル：
　化合物Ｋ－１：Ｊ－１を１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶媒（１０％　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、２％　Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５））に溶解させ、創部に滴下投与（創傷部位１か所あたり０．０４ｍＬ）した。陰性対照は溶媒のみを滴下投与した。
手順：
　マウスはＢＫＳ．Ｃｇ－Ｄｏｃｋ７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ、７週齢、雄を日本チャールスリバー（株）より購入した。背部を除毛後、生検トレパン（貝印株式会社）を用いて８ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、被覆材（テガダームトランスペアレントドレッシング、スリーエム）で保護した。創作製日を１日目とし、１ｍｇ／ｍＬの化合物Ｋ－１：Ｊ－１を創傷部位１か所あたり０．０４ｍＬの投与量で、２４時間おきに１２日目まで滴下した。１、３、６、９、１３日目に創部の面積を測定した。１日目の創面積を１００％とし、測定した総面積を創作製日に対する１００分率（％）で算出した。各群６例で実施した。
　本試験の結果として、全創皮膚欠損創作製マウスの創面積の変化を図４に示す。また、創面積比の経時変化の結果から算出した創面積比下面積（Ａｒｅａ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）、％×日）は、陰性対照で８５４．２±１１９．２、Ｋ－１：Ｊ－１投与群で６５９．６±１６３．７となった。図４とＡＵＣの値に示される通り、化合物Ｋ－１：Ｊ－１は創傷治癒促進効果を有することが明らかとなった。
　本発明によれば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の主要キナーゼであるＬＡＴＳ（特にＬＡＴＳ２）を含む、複数のキナーゼを阻害することができる。また、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療することができる。従って、本発明は、例えば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が関与する細胞機能や疾病等の研究分野において有益である。さらに、かかる疾病等を治療する医療分野において有益である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１８－１１０７４８（出願日：２０１８年６月８日）及び特願２０１９－０１４８９８（出願日：２０１９年１月３０日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (28)

  1. 　下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、キナーゼ阻害剤：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     
    ｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
  2. 　キナーゼが、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３からなる群から選択される、請求項１に記載の剤。
  3. 　キナーゼが、ＬＡＴＳ２である、請求項２に記載の剤。
  4. 　下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     
    ｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
  5. 　下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     
    ｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
  6. 　細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の抑制を伴う疾患である、請求項５に記載の剤。
  7. 　細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、炎症性疾患、炎症性腸疾患、神経変性疾患、免疫性神経疾患、筋ジストロフィー、ミオパチー、外傷、火傷、薬傷、皮膚潰瘍、外傷性潰瘍、下肢潰瘍、凍傷潰瘍、免疫性潰瘍、帯状疱疹後潰瘍、放射線潰瘍、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、巨大色素性母斑、瘢痕、刺青による障害、尋常性白斑、白皮症、脊髄損傷、筋肉損傷、肝不全、薬剤性肝障害、アルコール性肝障害、虚血性肝障害、ウイルス性肝障害、自己免疫性肝障害、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、皮膚損傷、脳浮腫、心筋梗塞、脳出血、および脳梗塞からなる群から選択される、請求項５に記載の剤。
  8. 　下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     
    ｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
  9. 　Ｘが、－ＮＨＣＯ－である、請求項１～８のいずれか一項に記載の剤。
  10. 　Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基であり、ｎが０である、請求項１～９のいずれか一項に記載の剤。
  11. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の剤。
  12. 　Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
    　ｎが０であり、
    　Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
    　Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の剤。
  13. 　式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、請求項１～１２のいずれか一項記載の剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  14. 　式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物のＲ体の光学異性体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  15. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の剤。
  16. 　Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
    　ｎが０であり、
    　Ａｒが、水酸基で置換されていてもよいフェニル基であり、
    　Ｚが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、請求項１～１０および１５のいずれか一項に記載の剤。
  17. 　式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、請求項１～１０、１５および１６のいずれか一項に記載の剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  18. 　式（Ｉ）で示される化合物が、以下の化合物のＲ体の光学異性体である、請求項１～１２、１５および１６のいずれか一項に記載の剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
  19. 　以下の工程を含む、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質のスクリーニング方法：
    　（工程１）下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地において細胞を培養する工程:
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     
    ｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝；
    　（工程２）被検物質の存在下、(工程１)で得られた細胞においてＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量を測定する工程；
    　（工程３）（工程２）で測定されたＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量が、前記被検物質の非存在下における存在量と比較して減少している場合に、前記被検物質をＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質と判断する工程。
  20. 　下記、式（Ｉ）で示される化合物の光学活性体、またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     
    ｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である（ただし、Ｘが－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ２がエチル基であり、ｎが０であるとき、Ｒ１は、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ６Ｈ５ではない。）。｝。
  21. 　Ｘが、－ＮＨＣＯ－である、請求項２０に記載の光学活性体、またはその塩。
  22. 　Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基であり、ｎが０である、請求項２０または２１に記載の光学活性体、またはその塩。
  23. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、炭素数１～６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の光学活性体またはその塩。
  24. 　光学活性体がＲ体である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
  25. 　式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
  26. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１～６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
  27. 　光学活性体がＲ体である、請求項２０～２２、および２６のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
  28. 　式（Ｉ）で示される化合物が、以下の化合物である、請求項２０～２２、２６、および２７のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
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