CN110945118A

CN110945118A - 培养基添加用组合物及培养基添加用化合物以及使用了它们的细胞或组织的培养方法

Info

Publication number: CN110945118A
Application number: CN201880049174.3A
Authority: CN
Inventors: 西野泰斗; 相原彩子; 大冢敬一朗; 猿桥康一郎; 三岛巧; 灶浦政宏
Original assignee: Nissan Chemical Corp
Current assignee: Nissan Chemical Corp
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2020-03-31
Also published as: CA3071363A1; RU2020108470A; AU2018307555A1; EP3656847A1; WO2019022222A1; TW201909890A; BR112020001680A2; JPWO2019022222A1; RU2020108470A3; JP7205473B2; EP3656847B1; EP3656847A4; US20200165194A1

Abstract

本发明提供培养基添加用组合物，其包含下述式(I)表示的化合物、或其盐。

Description

培养基添加用组合物及培养基添加用化合物以及使用了它们的细胞或组织的培养方法

技术领域

本发明涉及培养基添加用组合物等，详细而言，涉及用于促进细胞增殖的培养基添加用组合物等、以及特征在于使用该培养基添加用组合物等的细胞或组织的培养方法。

背景技术

近年来，以解释清楚生命现象的作用机理、确立疾病的治疗方法等为目的，在以生命科学领域为代表的许多领域中极其频繁地实施使用了细胞的实验。例如，作为创新药物领域中的一例，有使候选化合物作用于作为治疗靶标的癌细胞、筛选能抑制癌细胞增殖的化合物的方法。该筛选中，存在对数万种候选化合物进行筛选的情况，在这样的方式中需要准备大量均质的细胞。但是，就人等高等生物的细胞而言，即使是分裂较快的细胞也需要1天左右的时间，并且，癌细胞、干细胞中还存在1次细胞分裂所需要的时间达数月以上的细胞，这成为妨碍迅速筹备细胞的主要原因。基于上述背景，需求构建能对分裂慢的细胞的增殖进行促进的手段，例如，报道了具有特定结构的硫醇化合物促进造血前体细胞的增殖；聚戊二烯(Polyprenyl)类化合物促进肝细胞的增殖；等等(专利文献1、2)。

另一方面，创新药物筛选的领域中，近年来，细胞的三维培养受到瞩目。三维培养是介于体外与体内的中间的细胞培养技术。三维培养中，细胞能形成球体(sphere)(也称为球(spheroid))等立体结构，因此，较之通常的二维培养而言，能够进行更接近于生物体的分析。因此，三维培养有可能得以对使用了二维培养的创新药物筛选所无法确定的疾病治疗用化合物进行确定(非专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表平11-504000号公报

专利文献2：国际公开第2008/155920号

非专利文献

非专利文献1：SusanBreslin，DrugDiscoveryToday，2013年，第18卷，第5号，p.240-249

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的为提供能在细胞培养(尤其是三维细胞培养)中促进细胞增殖的新型化合物。

用于解决课题的手段

本申请发明人针对上述课题深入研究，结果发现，本次新合成的化合物能够极其良好地促进三维培养下的各种细胞的增殖，基于上述见解进一步进行研究，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。

[1]培养基添加用组合物，其包含下述式(I)表示的化合物、或其盐：

[化学式1]

{式中，X为单键、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar(式中，Y、及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，W为氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，Ar为可具有取代基的芳基。)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R₃为羟基，n为0、1或2。}

[2]如[1]所述的组合物，其中，X为-NHCO-。

[3]如[1]或[2]所述的组合物，其中，R₂为碳原子数1～6的烷基，n为0。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的组合物，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，W为N(R₄)，Z为单键，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

[5]如[4]所述的组合物，其中，芳基为苯基。

[6]如[1]～[3]中任一项所述的组合物，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为单键，W为N(R₄)，R₄为氢原子，Z为单键或可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

[7]如[6]所述的组合物，其中，芳基为苯基。

[8]如[6]或[7]所述的组合物，其中，Z为亚甲基。

[9]如[1]～[3]中任一项所述的组合物，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为单键，W为氧原子，Z为可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

[10]如[9]所述的组合物，其中，芳基为苯基，Z为亚甲基。

[11]如[1]～[5]中任一项所述的组合物，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

[化学式6]

[化学式7]

及

[化学式8]

[12]如[1]～[3]、[6]、及[7]中任一项所述的组合物，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，

[化学式9]

[化学式10]

[化学式11]

及

[化学式12]

[13]如[1]～[3]、[9]及[10]中任一项所述的组合物，其中，化合物为以下所示的化合物或其盐，

[化学式13]

[14]如[1]～[13]中任一项所述的组合物，其用于促进细胞增殖。

[15]如[14]所述的组合物，细胞选自由正常细胞株、癌细胞株及干细胞组成的组。

[16]如[15]所述的组合物，正常细胞株为来源于非洲绿猴肾上皮的细胞(Vero细胞)、狗肾小管上皮细胞(MDCK细胞)、来源于中国仓鼠卵巢的细胞(CHO-K1)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T1/2)。

[17]如[15]所述的组合物，癌细胞株为选自由来源于人卵巢癌的细胞株SKOV3、来源于人宫颈癌的细胞株HeLa、来源于人恶性黑色素瘤的细胞株A375、来源于人上皮样细胞癌的细胞株A431、来源于人胃腺癌的细胞株AGS、来源于人前列腺癌的细胞株LNCap cloneFGC、来源于人结肠腺癌的细胞株HCT116、来源于人肺泡基底上皮腺癌的细胞株A549、及来源于人前列腺癌的细胞DU145组成的组中的1种以上。

[18]如[15]所述的组合物，其中，干细胞为人人工多能干细胞(iPS细胞)或人间充质干细胞(MSC)。

[19]如[1]～[13]中任一项所述的组合物，其用于促进球体形成、类器官形成、或Cyst形成。

[20]如[19]所述的组合物，球体为癌细胞株、人人工多能干细胞(iPS细胞)或人间充质干细胞(MSC)。

[21]如[19]所述的组合物，类器官为来源于小肠的细胞。

[22]如[19]所述的组合物，Cyst为来源于肾脏的细胞。

[23]培养基，其包含[1]～[13]中任一项所述的培养基添加用组合物。

[24]如[23]所述的培养基，其用于促进细胞增殖。

[25]如[23]或[24]所述的培养基，其是三维细胞培养培养基。

[26]如[23]所述的培养基，其用于促进球体形成、类器官形成、或Cyst形成。

[27]促进细胞增殖的方法，其包括向培养基添加[1]～[13]中任一项所述的培养基添加用组合物。

[28]如[27]所述的方法，其中，细胞选自由正常细胞株、癌细胞株及干细胞组成的组。

[29]如[28]所述的方法，其中，正常细胞株为来源于非洲绿猴肾上皮的细胞(Vero细胞)、狗肾小管上皮细胞(MDCK细胞)、来源于中国仓鼠卵巢的细胞(CHO-K1)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T1/2)。

[30]如[28]所述的方法，其中，癌细胞株为选自由来源于人卵巢癌的细胞株SKOV3、来源于人宫颈癌的细胞株HeLa、来源于人恶性黑色素瘤的细胞株A375、来源于人上皮样细胞癌的细胞株A431、来源于人胃腺癌的细胞株AGS、来源于人前列腺癌的细胞株LNCap clone FGC、来源于人结肠腺癌的细胞株HCT116、来源于人肺泡基底上皮腺癌的细胞株A549、及来源于人前列腺癌的细胞DU 145组成的组中的1种以上。

[31]如[28]所述的方法，其中，干细胞为人人工多能干细胞(iPS细胞)或人间充质干细胞(MSC)。

[32]如[27]～[31]中任一项所述的方法，其中，培养基为三维细胞培养培养基。

[33]方法，其是促进球体形成、类器官形成或Cyst形成的方法，其包括向培养基添加[1]～[13]中任一项所述的培养基添加用组合物。

[34]如[33]所述的方法，其中，球体为癌细胞株、人人工多能干细胞(iPS细胞)或人间充质干细胞(MSC)。

[35]如[33]所述的方法，其中，类器官为来源于小肠的细胞。

[36]如[33]所述的方法，其中，Cyst为来源于肾脏的细胞。

[37]下述式(I)表示的化合物、或其盐：

[化学式14]

{式中，X为单键、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar(式中，Y、及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，W为氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，Ar为可具有取代基的芳基。)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R₃为羟基，n为0、1或2(其中，X为-NHCO-、R₂为乙基、n为0时，R₁不是-CH₂-NH-C₆H₅。)。}

[38]如[37]所述的化合物或其盐，其中，X为-NHCO-。

[39]如[37]或[38]所述的化合物或其盐，其中，R₂为碳原子数1～6的烷基，n为0。

[40]如[37]～[39]中任一项所述的化合物或其盐，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为亚甲基，W为N(R₄)，Z为单键，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

[41]如[40]所述的化合物或其盐，其中，芳基为苯基。

[42]如[37]～[39]中任一项所述的化合物或其盐，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为单键，W为N(R₄)，R₄为氢原子，Z为单键或可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

[43]如[42]所述的化合物或其盐，其中，芳基为苯基。

[44]如[42]或[43]所述的化合物或其盐，其中，Z为亚甲基。

[45]如[37]～[39]中任一项所述的化合物或其盐，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为单键，W为氧原子，Z为可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

[46]如[45]所述的化合物或其盐，其中，芳基为苯基，Z为亚甲基。

[47]如[37]～[41]中任一项所述的化合物或其盐，其选自由以下组成的组，

[化学式15]

[化学式16]

[化学式17]

[化学式18]

[化学式19]

及

[化学式20]

[48]如[37]～[39]、[42]及[43]中任一项所述的化合物或其盐，其选自由以下组成的组，

[化学式21]

[化学式22]

[化学式23]

及

[化学式24]

[49]如[37]～[39]、[45]及[46]中任一项所述的化合物，其是以下所示的化合物或其盐，

[化学式25]

其他方式中，本发明如下所述。

[50]培养基添加用组合物，其包含下述通式(I-a)表示的化合物、或其盐，

[化学式26]

{式中，X为单键、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R_1a为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-NH-Z-Ar(式中，Y、及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，Ar为可具有取代基的芳基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R_3a为氢原子或羟基。}。

[51]培养基，其包含[50]所述的培养基添加用组合物。

[52]促进细胞增殖的方法，其包括向培养基添加[50]所述的培养基添加用组合物。

[53]方法，其是促进球体形成、类器官形成或Cyst形成的方法，其包括向培养基添加[50]所述的培养基添加用组合物。

[54]下述通式(I-a)表示的化合物、或其盐：

[化学式27]

{式中，X为单键、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R_1a为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-NH-Z-Ar(式中，Y、及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，Ar为可具有取代基的芳基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R_3a为氢原子或羟基(其中，X为-NHCO-、R₂为乙基、R_3a为氢原子时，R_1a不是-CH₂-NH-C₆H₅)。}。

发明效果

式(I)表示的化合物或其盐具有促进三维培养下的细胞增殖的活性，因此，能够显著地促进细胞的增殖、球体形成、类器官形成、及/或Cyst形成。

附图说明

[图1]图1为使用共聚焦荧光显微镜对在添加有本发明组合物的培养基中培养后的MDCK细胞的Cyst形成进行观察而得到的图。

具体实施方式

本说明书中，使用的术语如下定义。

本说明书中，n-表示正，i-表示异，sec-表示仲，以及tert-表示叔。另外，本说明书中，o-表示邻位，m-表示间位，以及p-表示对位。

“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。“卤代基”是指氟、氯、溴、碘。

“烷基”及“碳原子数1～10的烷基”是指直链或支链状的烷基，具体而言，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等基团。“碳原子数1～6的烷基”是指直链或支链状的烷基，具体而言，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基等基团。

“芳基”可举出至少1个环为芳香族、各环具有5～8个环原子的单环式、二环式、三环式及四环式碳环式基团，具体而言，可举出苯基、茚基、萘基、芴基等。特别地，芳基可以是作为碳原子数6～10的环的苯基、茚基、萘基。

“亚烷基”及“碳原子数1～6的亚烷基”是指直链或支链状的亚烷基。具体而言，可举出亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基等基团。

“烷基”、“芳基”及“亚烷基”可具有取代基，作为这样的取代基，可举出例如以下。需要说明的是，“烷基”的情况下可举出下述(1)～(40)，“芳基”及“亚烷基”的情况下可举出下述(1)～(41)。

可举出：

(1)卤代基、

(2)羟基、

(3)氰基、

(4)硝基、

(5)羧基、

(6)链烯基(C_2-10链烯基；例如，乙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、丁二烯基、己三烯基、及其各异构体)、

(7)炔基(C_2-10炔基；例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、及其各异构体)、

(8)卤代烷基(例如，单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、单氟乙基、二氟乙基、三氟乙基、氯甲基、氯乙基、二氯乙基、及其各异构体)、

(9)环状烷基(环中可包含杂原子)(例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、吖丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基)、

(10)芳基(例如，苯基、萘基)、

(11)杂芳基(例如，吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基(例如，1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基)、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、噁二唑基(例如，1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基)、噻二唑基(例如，1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基)、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基(cinnolinyl)、酞嗪基(phthalazinyl)、喹唑啉基、喹喔啉基、蝶啶基、咪唑并噁唑基、咪唑并噻唑基、咪唑并咪唑基)、

(12)烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、叔戊氧基、新戊氧基、2-戊氧基、3-戊氧基、正己氧基、2-己氧基)、

(13)烷基硫基(例如，甲基硫基、乙基硫基、正丙基硫基、异丙基硫基、正丁基硫基、异丁基硫基、仲丁基硫基、叔丁基硫基、正戊基硫基、异戊基硫基、叔戊基硫基、新戊基硫基、2-戊基硫基、3-戊基硫基、正己基硫基、2-己基硫基)、

(14)经芳基(与上述(10)含义相同)取代的烷氧基(与上述(12)含义相同)、

(15)经芳基(与上述(10)含义相同)取代的烷基硫基(与上述(13)含义相同)、

(16)经杂芳基(与上述(11)含义相同)取代的烷氧基(与上述(12)含义相同)、

(17)经杂芳基(与上述(11)含义相同)取代的烷基硫基(与上述(13)含义相同)、

(18)环状烷基(环中可包含杂原子)氧基(例如，环丙基氧基、环丁基氧基、环戊基氧基、环己基氧基、四氢呋喃基氧基、四氢吡喃基氧基、吖丙啶基氧基、氮杂环丁烷基氧基、吡咯烷基氧基、哌啶基氧基、吗啉基氧基)、

(19)芳基氧基(例如，芳基(与上述(10)含义相同)与氧原子键合而成的基团)、

(20)杂芳基氧基(例如，杂芳基(与上述(11)含义相同)与氧原子键合而成的基团)、

(21)卤代烷氧基(例如，卤代烷基(与上述(8)含义相同)与氧原子键合而成的基团)、

(22)卤代烷基硫基(例如，卤代烷基(与上述(8)含义相同)与硫原子键合而成的基团)、

(23)经羟基取代的烷氧基(与上述(12)含义相同)、

(24)经烷氧基(与上述(12)含义相同)取代的烷氧基(与上述(12)含义相同)、

(25)氨基、

(26)经烷基单取代或二取代的氨基、

此处，“烷基”可举出C_1-6烷基，具体而言，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基等。

(27)氨基甲酰基、

(28)经烷基(与上述(26)中的“烷基”含义相同)单取代或二取代的氨基甲酰基(例如，甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、乙基甲基氨基甲酰基)

(29)氨基磺酰基(sulfamoyl)、

(30)经烷基(与上述(26)中的“烷基”含义相同)单取代或二取代的氨基磺酰基(例如，甲基氨基磺酰基、乙基氨基磺酰基、二甲基氨基磺酰基、二乙基氨基磺酰基、乙基甲基氨基磺酰基)、

(31)烷酰基(例如，在碳原子上键合有氢原子或烷基(与上述(26)中的“烷基”含义相同)的羰基)、

(32)芳酰基(例如，在碳原子上键合有芳基(与上述(10)含义相同)的羰基)、

(33)烷基磺酰基氨基(例如，经烷基(与上述(26)中的“烷基”含义相同)取代的磺酰基氨基)

(34)芳基磺酰基氨基(例如，经芳基(与上述(10)含义相同)取代的磺酰基氨基)、

(35)杂芳基磺酰基氨基(例如，经杂芳基(与上述(11)含义相同)取代的磺酰基氨基)、

(36)酰基氨基(例如，经酰基取代的氨基)、

此处，“酰基”是指具有C_1-6烷基、或C_6-10芳基的酰基。此处，“C_1-6烷基”是指上述“烷基”之中、碳原子数为1～6的烷基，“C_6-10芳基”是指上述“芳基”之中、碳原子数为6～10的芳基。作为酰基，具体而言，可举出乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基、丙烯酰基、甲基丙烯酰基、巴豆酰基、异巴豆酰基、苯甲酰基、萘甲酰基等，

(37)烷氧基羰基氨基(例如，经烷氧基(与上述(12)含义相同)取代的羰基氨基)、

(38)烷基磺酰基(例如，经烷基(与上述(26)中“烷基”含义相同)取代的磺酰基)、

(39)烷基亚磺酰基(例如，经烷基(与上述(26)中“烷基”含义相同)取代的亚磺酰基)、

(40)烷氧基羰基(例如，甲氧基羰基、乙氧基羰基)、

(41)烷基(C_1-10烷基；例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基等)等。

在存在2个以上取代基的情况下，它们可相同也可不同。

式(I)所示的化合物可以是盐的形态。作为前述式(I)表示的化合物的盐，可举出例如与盐酸及氢溴酸等无机酸形成的盐、以及与乙酸、丙酸、酒石酸、富马酸、马来酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸及苯甲酸等有机酸形成的盐。

式(I)所示的化合物根据取代基的种类而有时存在具有E构型的E型及具有Z构型的Z型这样的几何异构体。本发明包含上述E型、Z型或以任意比例含有E型及Z型的混合物。

[合成方法1]式(I)所示的化合物的合成

[化学式28]

{式中，X为单键、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar(式中，Y、及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，W为氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，Ar为可具有取代基的芳基。)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R3为羟基，n为0、1或2。}

上述式(I)所示的化合物可以如下述反应式所示，通过使酮化合物(k)与H₂N-X-R₁(式中，X及R₁表示前述的含义，例如，酰肼化合物等)反应来合成。优选分别各使用1当量的前述原料，在甲苯、1，4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等溶剂中、于100℃以上的温度范围反应1小时至3天。

[反应式1]

[化学式29]

(式中，R₁、R₂、R₃、X及n表示前述的含义。)

上述k及100之中的一些可购买市售品，除此以外可按照已知的合成方法进行合成。

[合成方法2]由酮化合物及酰肼化合物的组合形成的化合物的合成

通过以前述合成方法1为基准的方法，使用H₂N-X-R₁之中X为-NHCO-、R₁为-Y-W-Z-Ar、W为N(R₄)、Y为可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基、R₂、R₃、R₄、Z、Ar及n表示前述含义的酰肼化合物，从而可合成式(I)所示的化合物之中、由酮化合物及酰肼化合物的组合形成的化合物。

上述酰肼化合物之中的一些可购买市售品，除此以外可按照已知的合成方法进行合成。

[合成方法3]由酮化合物及胺化合物的组合形成的化合物的合成

通过使用前述的酮化合物(k)[例如，2’，4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮(k-1)等]、和H₂N-X-R₁之中、X为单键或-CH₂COO-、R₁表示前述的含义的所期望的伯胺[例如，正辛胺(A-3)等]或其盐[例如，甘氨酸乙酯盐酸盐(A-1)等]，从而可合成式(I)所示的化合物之中、由酮化合物及胺化合物的组合形成的化合物。优选分别各使用1当量的前述原料，在甲苯、1，4-二氧杂环己烷、N,N--二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等溶剂中、于100℃以上的温度范围反应1小时至24小时。作为胺的盐，可使用盐酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐等。

上述伯胺之中的一些可购买市售品，除此以外可按照已知的合成方法进行合成。

[合成方法4]脲化合物的合成

按照已知的合成方法，使前述的酮化合物(k)[例如，2’，4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮(k-1)等]溶解于氨的甲醇溶液中，一边注入氨气一边搅拌，从而合成亚胺化合物(k-1’)，然后，使其与对应的异氰酸酯[例如，苯基异氰酸酯(A-5)]反应，从而可合成式(I)所示的化合物之中、X为-CONH-、R₁、R₂、R₃及n表示前述含义的脲化合物。

上述异氰酸酯之中的一些可购买市售品，除此以外可按照已知的合成方法进行合成。

合成方法1～合成方法4中，对于反应结束后的反应混合物而言，加入蒸馏水使其析出，或者在不进行析出的情况下，实施有机溶剂萃取后浓缩这样的常规后处理，可得到作为目标的本发明所使用的化合物。另外，在需要纯化时，可利用重结晶、柱色谱法、薄层色谱法、液相色谱分选等任意的纯化方法进行分离、纯化。

本说明书中的三维细胞培养(3D细胞培养)是指使用例如包埋培养法、微载体培养法、球体培养法等在三维环境中培养细胞。包埋培养是在Matrigel(注册商标)、Geltrex(注册商标)、琼脂、甲基纤维素、胶原蛋白、明胶、血纤维蛋白、琼脂糖、海藻酸盐等固态或半固体的凝胶基材中埋入细胞、将其固定来进行培养的方法。微载体培养法是下述这样的方法：在比水稍重的微粒(下文也称为微载体)的表面上使细胞进行单层增殖，在培养瓶等培养容器内搅拌该微粒，进行悬浮状态下的培养。球体培养是下述这样的培养方法：使目标细胞形成由数十～数百个细胞构成的凝集块(下文中也称为球体或球)，之后在培养基中使该凝集块静置或进行振荡来培养的方法。另外，作为本发明中的三维细胞培养(3D细胞培养)，也可使用下述方法：通过使透明质酸、脱酰基结冷胶、黄原酸胶等多糖类或它们的派生物在培养基中分散来形成不规则形态的三维网络，将其作为支架而使粘附细胞在培养基中维持悬浮的状态，从而在更接近于生物体内的三维状态下对细胞进行培养。此时，三维细胞培养中的细胞被该三维网络捕获而不会沉淀，因此能够在不需要振荡、旋转操作等的情况下进行培养。三维细胞培养可利用自身已知的方法来实施(例如，参见WO2014/017513)。

1.化合物

本发明的组合物、培养基、方法中使用的化合物为式(I)：

[化学式30]

{式中，X为单键、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar(式中，Y、及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，W为氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，Ar为可具有取代基的芳基。)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R₃为羟基，n为0、1或2。}(以下，有时将本发明的组合物、培养基、方法中使用的化合物或其盐总称为“本发明所使用的化合物”)。

一个方式中，前述式(I)中的X为单键的情况下，R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～10的烷基，特别优选为辛基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为乙基)，n＝0。

另外，X为-CH₂COO-的情况下，R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基(优选为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为乙基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为乙基)，R₃为氢原子，或者，R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基(更优选为具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为苄基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为乙基)，n＝0。

另外，X为-CONH-的情况下，R₁为可具有取代基的芳基(更优选为不具有取代基的芳基，特别优选为苯基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为乙基)，n＝0。

另外，X为-NHCO-的情况下，R₁为-Y-W-Z-Ar，此处，Y为单键的情况下，W为N(R₄)(更优选为N(R₄)、且R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，特别优选为N(R₄)且R₄为氢原子)、或氧原子，Z为单键或可具有取代基的亚烷基(更优选为单键或不具有取代基的亚烷基，特别优选为单键或亚甲基)，Ar为可具有取代基(更优选为卤素原子、羟基、甲基、或甲氧基)的芳基(更优选为具有羟基的芳基或不具有取代基的芳基，特别优选为具有羟基的苯基或不具有取代基的苯基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为乙基)，n＝0。

另外，X为-NHCO-、且R₁为-Y-W-Z-Ar、且Y为可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基(更优选为可具有碳原子数1～6的烷基的碳原子数1～6的亚烷基，特别优选为亚甲基、经甲基、或乙基取代的亚甲基)的情况下，W为N(R₄)(更优选为N(R₄)、且式中R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，特别优选为N(R₄)、且式中R₄为氢原子)，Z为单键，Ar为可具有取代基的芳基(更优选为具有取代基的芳基，特别优选为具有卤代基、羟基、甲基或乙氧基的苯基或者萘基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为甲基、乙基、或异丙基)，n＝0。

另外，本发明提供以下的新型化合物或其盐(以下有时称为“本发明的化合物”)。

本发明的化合物为以下式(I)表示的化合物或其盐：

[化学式31]

{式中，X为单键、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar(式中，Y、及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，W为氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，Ar为可具有取代基的芳基。)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基，R₃为羟基，n为0、1或2(其中，X为-NHCO-、R₂为乙基、n为0时，R₁不是-CH₂-NH-C₆H₅。)。}。

本发明的化合物的一个方式中，前述式(I)中的X为单键的情况下，R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～10的烷基，特别优选为辛基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为乙基)，n＝0。

另外，X为-NHCO-的情况下，R₁为-Y-W-Z-Ar，此处，Y为单键的情况下，W为N(R₄)(更优选为N(R₄)且R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，特别优选为N(R₄)且R₄为氢原子)、或氧原子，Z为单键或可具有取代基的亚烷基(更优选为单键或不具有取代基的亚烷基，特别优选为单键或亚甲基)，Ar为可具有取代基(更优选为卤素原子、羟基、甲基、或甲氧基)的芳基(更优选为具有羟基的芳基或不具有取代基的芳基，特别优选为具有羟基的苯基或不具有取代基的苯基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为乙基)，n＝0。

另外，X为-NHCO-、且R₁为-Y-W-Z-Ar、且Y为可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，特别优选为亚甲基)的情况下，W为N(R₄)(更优选为N(R₄)、且式中R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，特别优选为N(R₄)、且式中R₄为氢原子)，Z为单键，Ar为可具有取代基的芳基(更优选为具有取代基的芳基，特别优选为具有卤代基、羟基、甲基或乙氧基的苯基或者萘基)，R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基(更优选为不具有取代基的碳原子数1～6的烷基，特别优选为甲基、乙基、或异丙基)，n＝0。

一个优选方式中，本发明所使用的化合物如下。

[化学式32]

2.培养基添加用组合物

本发明提供包含本发明所使用的化合物作为有效成分的、培养基添加用组合物(以下有时称为“本发明的组合物”)。本发明的组合物通过添加至细胞培养基、尤其是三维细胞培养培养基中，从而能够达成细胞增殖的促进、球体形成的促进、类器官形成的促进、及Cyst形成的促进中的任一项或它们的任意的组合。

即，本发明的组合物的用途具体而言可列举如下：

(1)促进细胞增殖；

(2)促进球体形成；

(3)促进类器官形成；

(4)促进Cyst形成；

(5)促进细胞增殖及促进球体形成；

(6)促进细胞增殖及促进类器官形成；

(7)促进细胞增殖及促进Cyst形成；

(8)促进球体形成及促进类器官形成；

(9)促进球体形成及促进Cyst形成；

(10)促进类器官形成及促进Cyst形成；

(11)促进细胞增殖、促进球体形成及促进类器官形成；

(12)促进细胞增殖、促进球体形成及促进Cyst形成；

(13)促进细胞增殖、促进类器官形成及促进Cyst形成；

(14)促进球体形成、促进类器官形成及促进Cyst形成；或

(15)促进细胞增殖、促进球体形成、促进类器官形成及促进Cyst形成。

本发明的组合物可含有本发明所使用的化合物中的1种、或组合含有2种以上作为有效成分。

另外，本发明的组合物也可含有本发明所使用的化合物以外的其他成分。只要能得到本发明所期望的效果即可，没有特别限定，所述成分可包括例如水、生理盐水、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、丙二醇、丁二醇、及甲醇、乙醇、丁醇、丙醇等各种醇等。另外，本发明的组合物可根据需要施以灭菌处理。灭菌方法没有特别限定，可举出例如放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压釜灭菌、过滤器灭菌等。对于进行过滤器灭菌(以下也有时称为过滤灭菌)时的过滤器部分的材质没有特别限定，可举出例如玻璃纤维、尼龙、PES(聚醚砜)、亲水性PVDF(聚偏氟乙烯)、纤维素混合酯、纤维素乙酸酯、聚四氟乙烯等。过滤器的微孔的大小没有特殊限定，优选为0.1μm至10μm，更优选为0.1μm至1μm，最优选为0.1μm至0.5μm。就上述灭菌处理而言，该组合物可以是固态也可以是溶液的状态。

就本发明的组合物中的作为有效成分的本发明所使用的化合物的配合量而言，只要是在将本发明的组合物添加至培养基(尤其是三维细胞培养培养基)中时该培养基能发挥本发明所期望的效果的浓度即可，没有特别限定。需要说明的是，作为能发挥本发明所期望的效果的浓度，例如，本发明所使用的化合物在培养基(尤其是三维细胞培养培养基)中的浓度的下限值通常可为0.001μM以上，优选为0.01μM以上，更优选为0.1μM以上，进一步优选为1μM以上，特别优选为10μM以上。另外，该浓度的上限值通常可为100μM以下，优选为50μM以下，特别优选为10μM以下。

本发明的组合物在提供时或者保存时可以是任意的形状。该组合物可以是片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂这样的经制剂化的固体、溶解在适当的溶剂及溶解剂中的溶液或悬浮液这样的液体、或者结合于基板、载体上的状态。作为被制剂化时的添加物，可以举出：对羟基苯甲酸酯类等防腐剂；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋形剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等结合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂等。这些添加物不限于上述成分，只要本领域技术人员可以利用即可，可自由地进行选择。

作为通过将本发明的组合物添加至培养基(尤其是三维细胞培养培养基)从而实现促进细胞增殖等的细胞种类，只要能得到所期望的效果即可，没有特别限定，可举出精子、卵子等生殖细胞、构成生物体的体细胞、正常细胞株、癌细胞株、前体细胞、干细胞、被从生物体分离并经过人工基因改造的细胞、被从生物体分离并经过人工核更换的细胞等细胞种类。需要说明的是，这些细胞的来源也没有特别限定，优选来源于大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸、犬、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、大象、普通狨、松鼠猴、猕猴、黑猩猩、人等哺乳动物的细胞。另外，就作为细胞来源的组织或器官而言，只要能得到本发明所期望的效果即可，没有特别限定，作为前述组织，可举出皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、脾脏、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液、心脏、眼、脑或神经组织等组织，但不限于这些，另外，作为前述器官，可举出肝脏、肺、肾脏、心脏、胰脏、胃、脾脏、小肠、大肠、生殖器等器官，但不限于这些。需要说明的是，以促进类器官形成为目的的情况下，类器官有时优选为来源于小肠的细胞。另外，以促进Cyst形成为目的的情况下，Cyst有时优选为来源于肾脏的细胞。

需要说明的是，作为正常细胞株，可举出C3H10T1/2(小鼠胚胎成纤维细胞)、HEK293(人胎肾细胞)、MDBK(来源于牛肾脏的细胞)、MDCK(狗肾小管上皮细胞)、CHO-K1(来源于中国仓鼠卵巢的细胞)、Vero细胞(来源于非洲绿猴肾上皮的细胞)、NIH3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)、HepaRG(肝细胞，注册商标)、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)、人原代培养肝细胞等。其中，特别优选MDCK、HUVEC、CHO-K1及Vero细胞。另外，作为癌细胞株的例子，不限于以下，作为人乳腺癌细胞株可举出HBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADR RES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D，作为人宫颈癌细胞株可举出HeLa，作为人肺癌细胞株可举出A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、DMS273、DMS114，作为人大肠癌细胞株可举出Caco-2、COLO-205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr，作为人前列腺癌细胞株可举出DU-145、PC-3、LNCaP，作为人中枢神经系统癌细胞株可举出U251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19，作为人卵巢癌细胞株可举出OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SKOV3、IGROV-1，作为人肾癌细胞株可举出RXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10，作为人胃癌细胞株可举出MKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74，作为皮肤癌细胞株可举出LOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14，作为白血病细胞株可举出CCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TBRPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat等。其中，特别优选人卵巢癌细胞株SKOV3、人宫颈癌细胞株HeLa、来源于人恶性黑色素瘤的细胞株A375、来源于人上皮样细胞癌的细胞株A431、来源于人胃腺癌的细胞株AGS、来源于人前列腺癌的细胞株LNCap clone FGC、来源于人结肠腺癌的细胞株HCT116、来源于人肺泡基底上皮腺癌的细胞株A549、及来源于人前列腺癌的细胞DU145。此外，干细胞是指兼具自我复制能力和分化成其他多个系统的细胞的能力的细胞，作为其例子，不限于以下，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等。作为多能干细胞，可举出前述干细胞之中的ES细胞、胚胎生殖干细胞、iPS细胞。前体细胞是指处于从前述干细胞分化为特定的体细胞、生殖细胞的中途阶段的细胞。作为干细胞，特别优选iPS细胞及间充质干细胞(MSC)。

一个方式中，使用添加有本发明的组合物的三维细胞培养培养基对MSC等干细胞进行培养的情况下，能够在维持该细胞的特性(例如未分化性)的状态下促进该细胞的增殖。MSC的未分化性的维持可通过基于流式细胞术(FCM)分析细胞表面标志物的表达来进行确认(例如，参见WO2016/136986)，可举出作为MSC的细胞表面标志物的CD29、CD73、CD90及CD105等为阳性的情况。因此，本发明也适合用于MSC等干细胞的大量生产。

本说明书中的术语“本发明的组合物”可以与术语“本发明的制剂或“本发明的培养基添加用剂”互换。

3.培养基

本发明提供包含本发明所使用的化合物或本发明的组合物的培养基(以下有时称为“本发明的培养基”)。通过使用本发明的培养基，从而能够达成细胞增殖的促进、球体形成的促进、类器官形成的促进、及Cyst形成的促进中任一项或它们的任意组合。需要说明的是，本发明的培养基特别优选为三维细胞培养培养基。

就本发明的培养基中作为有效成分包含的本发明所使用的化合物的浓度而言，只要能得到本发明所期望的效果即可，没有特别限定，例如，该浓度的下限值通常可为0.001μM以上，优选为0.01μM以上，更优选为0.1μM以上，进一步优选为1μM以上，特别优选为10μM以上。另外，该浓度的上限值通常可为100μM以下，优选为50μM以下，特别优选为10μM以下。

就本发明的培养基而言，除了配合有本发明所使用的化合物或本发明的组合物以外，与已知的培养基的组成相同。

一个方式中，本发明的培养基可通过向市售的培养基(尤其是三维细胞培养培养基)中添加本发明所使用的化合物或组合物来进行制备。作为能通过添加本发明所使用的化合物或本发明的组合物来制成本发明的培养基的市售的培养基，只要能得到所期望的效果即可，没有特别限定，可举出例如杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium；DMEM)、Ham F12培养基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy5A培养基(McCoy’s 5A medium)、Eagle’s MEM(Eagle’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM(alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium；αMEM)、MEM(MinimumEssential Medium)、RPMI 1640培养基、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)、MCDB 131培养基、William培养基E、IPL41培养基、Fischer’s培养基、StemPro34(Invitrogen公司制)、X-VIVO 10(Cambrex公司制)、X-VIVO 15(Cambrex公司制)、HPGM(Cambrex公司制)、StemSpan H3000(STEMCELL Technologies公司制)、StemSpan SFEM(STEMCELL Technologies公司制)、StemlineII(Sigma Aldrich公司制)、QBSF-60(Qualitybiological公司制)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司制)、Essential8(注册商标)培养基(Gibco公司制)、mTeSR1培养基(STEMCELL Technologies公司制)、mTeSR2培养基(STEMCELL Technologies公司制)、ReproFF(ReproCELL Incorporated制)、ReproFF2(ReproCELL Incorporated制)、StemFit(注册商标)AK02N(味之素公司制)、StemFit(注册商标)AK03N(味之素公司制)、PSGrohESC/iPSC培养基(System Biosciences公司制)、NutriStem(注册商标)培养基(Biological Industries公司制)、CSTI-7培养基(株式会社细胞科学研究所制)、MesenPRO RS培养基(Gibco公司制)、MF-Medium(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(东洋纺株式会社制)、间充质干细胞用培养基(PromoCell GmbH制)、Sf-900II(Invitrogen公司制)、Opti-Pro(Invitrogen公司制)等培养基。另外，可使用向这些培养基中添加脱酰基结冷胶等多糖类制成三维细胞培养培养基而得到的培养基。作为这样的三维细胞培养培养基，可举出例如FCeM(注册商标)(和光纯药工业株式会社制)，但不限于此。

另外，可根据目的而向上述的培养基中添加钠、钾、钙、镁、磷、氯、各种氨基酸、各种维生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖、细胞生长因子、分化诱导因子、细胞粘附因子、抗体、酶、细胞因子、激素、凝集素、细胞外基质、生理活性物质等。

本发明的培养基中的细胞的培养(尤其是三维细胞培养)可使用通常用于细胞培养的培养皿、培养瓶、塑料袋、Teflon(注册商标)袋、皿、陪替氏培养皿(Petri Dish)、组织培养用皿、多皿、微孔培养板、微孔板、多片板、多孔板、腔室载玻片(chamber slide)、管、盘、培养袋、滚瓶等培养容器实施。期望这些培养容器为细胞低粘附性，从而使所培养的(粘附性的)细胞不会粘附于培养容器。作为细胞非粘附性的培养容器，可使用培养容器的表面未基于提高与细胞的粘合性的目的进行人工处理(例如，利用细胞外基质等的包被处理)、或者培养容器的表面基于减弱与细胞的粘合性的目的而经过人工处理的培养容器。作为这样的容器的例子，可举出Sumilon细胞紧密板(SUMITOMO BAKELITE株式会社制)、PrimeSurface(注册商标)板(SUMITOMO BAKELITE株式会社制)、超低粘附表面板(Corning公司制)、Nunclon Sphera板(Thermo Fisher Scientific公司制)等，但不限于此。

4.细胞增殖促进方法、球体形成促进方法、类器官形成促进方法、及Cyst形成促进方法

本发明提供包括向培养基添加本发明所使用的化合物或本发明的组合物的、促进细胞增殖的方法、促进球体形成的方法、促进类器官形成的方法、或促进Cyst形成的方法(以下将其一并称为“本发明的方法”)。

就本发明的方法中使用的培养基而言，只要能得到所期望的效果即可，没有特别限定。优选为三维细胞培养培养基。另外，本发明的方法中的细胞培养条件(例如，温度、二氧化碳浓度、培养时间等)使用自身已知的方法即可，或者可根据目的而适当改变。例如，就培养细胞时的温度而言，若为动物细胞则通常为25℃～39℃，优选为33℃～39℃(例如37℃)。就二氧化碳浓度而言，通常，培养的气氛中为4体积％～10体积％，优选为4体积％～6体积％。就培养时间而言，通常为1至35天，根据培养的目的适当设定即可。

形成细胞凝集块(球体)的方法没有特别限定，本领域技术人员可以适当地选择。作为其例子可举出：使用具有细胞非粘附表面的容器的方法、悬滴法、旋转培养法、三维支架法、离心法、采用利用电场、磁场形成的凝集的方法等。例如，对于使用具有细胞非粘附表面的容器的方法，可以在实施了阻碍细胞粘附的表面处理的培养容器中培养目标细胞，使其形成球体。使用该细胞非粘附性培养容器时，首先，在采集目标细胞后配制其细胞悬浮液，接种于该培养容器中进行培养。持续培养约一周时，细胞自发地形成球体。作为此时使用的细胞非粘附性表面，可以使用在通常所用的培养皿等培养容器的表面涂布了阻碍细胞粘附的物质而得到的细胞非粘附性表面等。作为这样的物质，可举出琼脂糖、琼脂、聚-HEMA(聚-(甲基丙烯酸2-羟基乙酯))2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)与其他单体(例如，甲基丙烯酸丁基酯等)形成的共聚物、聚(丙烯酸2-甲氧基甲酯)、聚-N-异丙基丙烯酰胺、MebiolGel(注册商标)等，只要没有细胞毒性即可，不限于这些。

另外，作为形成细胞凝集块(球体)的方法，可使用NATURE BIOTECHNOLOGY，VOL.28，NO.4，APRIL2010，361-366、NATURE PROTOCOLS，VOL.6，NO.5，2011，689-700、NATUREPROTOCOLS，VOL.6，NO.5，2011，572-579、Stem Cell Research，7，2011，97-111、Stem CellRev and Rep，6，2010，248-259等中记载的方法。

另外，在使球体形成的培养时所使用的培养基中，也可含有加速球体形成、或对其维持进行促进的成分。作为具有上述效果的成分的例子，可举出二甲基亚砜、超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白、过氧化氢酶、过氧化物酶、L-抗坏血酸、L-抗坏血酸磷酸酯、生育酚、类黄酮、尿酸、胆红素、含硒化合物、转铁蛋白、不饱和脂肪酸、白蛋白、茶碱、毛喉素、胰高血糖素、二丁酰cAMP等。作为含硒化合物，可举出亚硒酸钠、硒酸钠、二甲基硒、硒化氢、硒代蛋氨酸、硒-甲基硒代半胱氨酸、丙氨酸丁氨酸硒醚、硒代半胱氨酸、硒高半胱氨酸、腺苷-5’-磷酰硒酸、硒-腺苷硒代蛋氨酸、Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152、Wf-536等ROCK抑制剂。另外，为了得到作为目标的尺寸均匀的细胞凝集块，也可在所使用的细胞非粘附性培养容器上导入与目标细胞凝集块具有相同直径的多个凹部。如果这些凹部彼此接触、或在目标细胞凝集块的直径的范围内，则在接种细胞时，所接种的细胞不在凹部与凹部之间形成细胞凝集块，而是确实地在凹部中形成与其容积相应的大小的细胞凝集块，能够得到尺寸均匀的细胞凝集块群。作为此时的凹部的形状，优选半球或圆锥状。

或者，也可基于具有细胞粘附性的支持体而形成球体。作为这样的支持体的例子，可举出胶原蛋白、聚轮烷、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、水凝胶等。

另外，也可通过与饲养细胞共同培养来形成球体。作为用于促进球体形成的饲养细胞，可使用任何粘附性细胞，但优选与各种细胞相应的饲养细胞。虽然没有限定，但例如在形成来源于肝脏、软骨的细胞的球体时，作为其饲养细胞的例子，可举出COS-1细胞、血管内皮细胞作为优选的细胞种类。

另外，作为使球体形成的方法，可选择悬滴法。作为悬滴法，可举出下述方法：例如，将细胞悬浮液的液滴(就容量而言为10～50μL左右)滴加于培养容器的盖等的顶板侧，以所载置的液滴垂下的方式在颠倒状态下进行培养。通过如此进行培养，细胞因与平面的接触而受到的影响为最小限度，在液滴的下部形成球体。上述液滴可使用GravityPLUSPlate(PerkinElmer公司制)这样的特殊培养容器进行制备。具体而言，可使用含有100～100000个、优选200～10000个、更优选500～10000个细胞的液滴来制备球体。为了使球体形成，优选培养6～48小时。

球体的大小根据细胞种类及培养时间的不同而不同，没有特别限定，为球形状或椭圆球形状时，具有20μm至1000μm、优选40μm至500μm，更优选50μm至300μm、最优选80μm至200μm的直径。

对于上述球体而言，即使以此状态继续静置培养，也能在10天以上、优选13天以上、进一步优选30天以上的时间内保持增殖能力，通过进一步在静置培养中定期地进行机械分割，或进一步地进行单细胞化处理和凝集，由此能够实质性地无期限地保持增殖能力。

、关于球体培养中所用的培养容器，只要是通常可以进行动物细胞培养的容器即可，没有特别限定，可举出例如培养瓶、皿、陪替氏培养皿、组织培养用皿、多皿、微孔培养板、微孔板、多片板、多孔板、腔室载玻片、细胞培养瓶、旋转瓶、培养皿、管、盘、培养袋、滚瓶、EZSPHERE(AGC Techno Glass公司制)、Sumilon细胞紧密板(SUMITOMO BAKELITE株式会社制)等。

这些培养容器之中，在实施许多抗癌剂的评价、医药品候选化合物或医药品的评价时，优选使用微孔培养板、微孔板、多片板、多孔板。这些板的孔底形状没有特别限定，可使用平底、U字型、V字型的底，优选使用U字型的孔底。这些培养器材的材质没有特别限定，可举出例如玻璃、聚氯乙烯、纤维素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯等塑料等。

进行包埋培养时所使用的培养基可以含有细胞粘附因子，作为其例子，可举出Matrigel(注册商标)、Geltrex(注册商标)、胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、腱生蛋白、选择素、透明质酸、血纤维蛋白等。上述细胞粘附因子也可组合添加2种以上。另外，还可针对包埋培养所使用的培养基进一步混合琼脂、瓜尔胶、罗望子胶、藻酸丙二醇酯、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、刺云实胶、罗望子胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂糖、罗望子种子胶、普鲁兰多糖等增稠剂。上述增稠剂也可组合添加2种以上。

使类器官(将干细胞或前体细胞在三维环境下于生物体外进行培养、形成的微器官)或Cyst(由上皮细胞形成的管腔结构)形成的方法没有特别限定，本领域技术人员可以适当地选择。作为其例子，可举出使用了上述的包埋培养的方法。具体而言，在含有上述的细胞粘附因子的包埋培养用培养基中对于作为目标的细胞或组织进行培养，可使类器官或Cyst形成。例如，在采集作为目标的细胞或组织后制备其悬浮液，接种于用于包埋培养的培养基中，进行培养。持续培养3至14天后，细胞自发地形成类器官或Cyst。

本发明的方法中使用的培养基(尤其是三维细胞培养的培养基)使用本发明的培养基即可。

本发明的方法中的、培养基中的本发明所使用的化合物或本发明的组合物的浓度及细胞种类等与“2.培养基添加用组合物”中所说明的相同。

以下，通过实施例来更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。没有特别注明的情况下，所使用的试剂等可进行购买。

实施例

以下，示出本发明所使用的化合物的合成方法及结构式。需要说明的是，¹H-NMR表示质子核磁共振光谱，以270MHz或400MHz在氘代二甲基亚砜中进行测定。关于化学位移值，将氘代二甲基亚砜的值记载为2.49ppm。另外，s的记载表示单峰，以下同样地，brs表示宽单峰，d表示二重峰，dd表示双二重峰，t表示三重峰，q表示四重峰，m表示多重峰。

[合成例1]以酮及酰肼作为原料的本发明化合物的合成

(材料和方法)

利用下图所示的4种酮[1-(2，4-二羟基-3-甲基苯基)-1-丙酮(以下简称为k-1)、1-(2，4-二羟基-3-甲基苯基)-1-乙酮(以下简称为k-2)、1-(2，4，6-三羟基-3-甲基苯基)-1-丙酮(以下简称为k-3)、1-(2，4-二羟基-3-甲基苯基)-3-甲基-1-丁酮(以下简称为k-5)]及10种酰肼[2-(苯基氨基)乙酰肼(以下简称为H-1)、2-(邻甲苯基氨基)乙酰肼(以下简称为H-2)、2-(间甲苯基氨基)乙酰肼(以下简称为H-3)、2-(对甲苯基氨基)乙酰肼(以下简称为H-4)、2-[(4-氟苯基)氨基]乙酰肼(以下简称为H-5)、2-(萘-1-基氨基)乙酰肼(以下简称为H-6)、2-(苯基氨基)丁烷酰肼(以下简称为H-7)、2-[(4-乙氧基苯基)氨基]乙酰肼(以下简称为H-9)、2-[(4-羟基苯基)氨基]乙酰肼(以下简称为D-2)、2-[(2-羟基苯基)氨基]乙酰肼(以下简称为D-4)]合成了化合物。

[化学式33]

合成的34化合物记载于第1表。表中，Me的记载表示甲基，以下同样地，Et的记载表示乙基，n-Pr表示正丙基，i-Bu表示异丁基，Ph表示苯基，Naph表示萘基。(R₃)_n中的“-”的记载表示无取代，结构式中记载的编号表示(R₃)_n的取代位置。

[第1表]

[化学式34]

[表1]

化合物编号	R<sub>2</sub>	(R<sub>3</sub>)<sub>n</sub>	R<sub>1</sub>’	Ar
					k-1：H-1	Et	-	H	Ph
k-1：H-2	Et	-	H	2-Me-Ph
					k-1：H-3	Et	-	H	3-Me-Ph
k-1：H-4	Et	-	H	4-Me-Ph
					k-1：H-5	Et	-	H	4-F-Ph
k-1：H-6	Et	-	H	1-Naph
					k-1：H-7	Et	-	Et	Ph
k-1：H-9	Et	-	H	4-EtO-Ph
					k-1：D-2	Et	-	H	4-OH-Ph
k-1：D-4	Et	-	H	2-OH-Ph
					k-2：H-1	Me	-	H	Ph
k-2：H-2	Me	-	H	2-Me-Ph
					k-2：H-3	Me	-	H	3-Me-Ph
k-2：H-4	Me	-	H	4-Me-Ph
					k-2：H-5	Me	-	H	4-F-Ph
k-2：H-6	Me	-	H	1-Naph
					k-2：H-7	Me	-	Et	Ph
k-2：H-9	Me	-	H	4-EtO-Ph
					k-3：H-1	Et	6-OH	H	Ph
k-3：H-2	Et	6-OH	H	2-Me-Ph
					k-3：H-3	Et	6-OH	H	3-Me-Ph
k-3：H-4	Et	6-OH	H	4-Me-Ph
					k-3：H-5	Et	6-OH	H	4-F-Ph
k-3：H-6	Et	6-OH	H	1-Naph
					k-3：H-7	Et	6-OH	Et	Ph
k-3：H-9	Et	6-OH	H	4-EtO-Ph
					k-5：H-1	i-Bu	-	H	Ph
k-5：H-2	i-Bu	-	H	2-Me-Ph
					k-5：H-3	i-Bu	-	H	3-Me-Ph
k-5：H-4	i-Bu	-	H	4-Me-Ph
					k-5：H-5	i-Bu	-	H	4-F-Ph
k-5：H-6	i-Bu	-	H	1-Naph
					k-5：H-7	i-Bu	-	Et	Ph
k-5：H-9	i-Bu	-	H	4-EtO-Ph

第1表中记载的化合物的¹H-NMR的测定结果记载于第2表。

[第2表]

[表2-1]

[表2-2]

[表2-3]

[表2-4]

以下，记载本发明所使用的化合物及合成中间体的化合物的合成方法。

4种酮之中，关于k-1、k-2及k-5可利用已知的方法进行合成(Sum TH等人，Tetrahedron.2015 Jul 1；71(26-27)：4557-4564.)。另外，10种酰肼之中，H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-6、H-9、D-2及D-4可利用已知的方法进行合成(Samal RP etal.，Chem Biol DrugDes.2013 Jun；81(6)：715-29.等)。因此，以下，对k-3及H-7的合成方法进行详细说明。

[k-3的合成]

使2,4,6-三羟基苯甲醛(2.22g、14.4mmol)溶解于THF(40mL)中，在冰冷下加入NaBH₃CN(2.7g、43mmol)、乙酸(8mL)，于室温搅拌2小时。将反应溶液用乙酸乙酯(50mL)稀释，用水(50mL×2)、饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)、浓盐水(brine)(50mL)依次洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶50g、乙酸乙酯/己烷＝20/80～50/50)纯化，得到白色固体形式的中间化合物(1.20g、8.56mmol、收率为59％)。

使如上述那样得到的中间化合物(1.04g，7.42mmol)悬浮于丙酸(7mL)中，加入丙酸酐(1.15mL，8.90mmol)、BF₃-Et₂O(1.12mL、8.90mmol)，于130℃加热回流1小时。放冷后，将反应溶液用乙酸乙酯(100mL)稀释，用水(100mL×3)、饱和碳酸氢钠水溶液(100mL×2)、浓盐水(100mL)依次洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶100g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～45/55)纯化，将得到的固体用己烷洗涤，得到淡橙色固体形式的k-3(0.41g)。将滤液在减压下浓缩，将得到的残余物再次通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～50/50)纯化，得到淡橙色固体形式的k-3(0.70g)。综上，得到淡橙色固体形式的k-3(1.11g、5.66mmol、收率为76％)。

[H-7的合成]

使2-溴丁酸甲酯(8.0g、44mmol)、苯胺(8.0mL、88mmol)溶解于甲苯(10mL)中，加热回流5小时。放冷后，将反应溶液用水(30mL)、2M盐酸(25mL)、水(30mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)、浓盐水(30mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶100g、乙酸乙酯/己烷＝1/99～10/90)纯化，得到黄色液体形式的中间化合物(5.11g、26.4mmol、收率为60％)。

使如上述那样得到的中间化合物(5.11g、26.4mmol)溶解于甲醇(26mL)使，加入肼·一水合物(12.8mL、264mmol)，于室温搅拌4.5小时。加入水(150mL)，用二氯甲烷(30mL×5)萃取。将有机层用饱和食盐水(100mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥、过滤，在减压下浓缩，将得到的固体用IPE洗涤，得到白色固体形式的H-7(4.60g、23.8mmol、收率为90％)。

[k-1：H-1的合成]

使k-1(100mg、0.555mmol)、H-1(110mg、0.666mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌14小时。放冷后，加入蒸馏水(11mL)，再次于100℃搅拌后，趁热过滤，得到淡黄色固体形式的k-1：H-1(70.1mg、0.214mmol、收率为39％)。

[k-1：H-2的合成]

使k-1(50mg、0.28mmol)、H-2(69mg、0.33mmol)溶解于DMSO(0.55mL)中，于100℃搅拌18小时。放冷后，加入蒸馏水(6mL)倾析，将残留的固体用二氯甲烷、乙酸乙酯依次洗涤。使得到的残余物溶解于DMSO(0.2mL)中，加入水，将析出的固体用甲醇洗涤，得到淡橙色固体形式的k-1：H-2(19.6mg、0.0574mmol、收率为21％)。

[k-1：H-3的合成]

使k-1(100mg、0.555mmol)、H-3(119mg、0.666mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌14小时。于相同温度加入蒸馏水(11mL)，放冷后，滤取析出的固体，用甲醇洗涤，得到白色固体形式的k-1：H-3(98.9mg、0.290mmol、收率为52％)。

[k-1：H-4的合成]

使k-1(50mg、0.28mmol)、H-4(65mg、0.36mmol)溶解于DMSO(0.55mL)中，于100℃搅拌19小时。放冷后，加入蒸馏水(6mL)，滤取析出的固体，用乙酸乙酯洗涤，得到淡黄色固体形式的k-1：H-4(28.6mg、0.0838mmol、收率为30％)。

[k-1：H-5的合成]

使k-1(100mg、0.555mmol)、H-5(122mg、0.666mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌14小时。于相同温度加入蒸馏水(11mL)，放冷后，滤取析出的固体，用甲醇洗涤，得到淡黄色固体形式的k-1：H-5(55.6mg、0.161mmol、收率为29％)。

[k-1：H-6的合成]

使k-1(100mg、0.555mmol)、H-6(143mg、0.666mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌14小时。放冷后，加入蒸馏水(11mL)，滤取析出的固体，用二氯甲烷洗涤，得到棕色固体形式的k-1：H-6(86.5mg、0.229mmol、收率为41％)。

[k-1：H-7的合成]

使k-1(50mg、0.28mmol)、H-7(54mg、0.28mmol)溶解于DMSO(0.55mL)中，于100℃搅拌17小时。放冷后，加入蒸馏水(6mL)倾析，使残余物溶解于二氯甲烷(0.5mL)中。加入己烷(0.5mL)，滤取析出的固体，得到白色固体形式的k-1：H-7(56.8mg、0.160mmol、收率为57％)。

[k-1：H-9的合成]

使k-1(150mg、0.83mmol)、H-9(226mg、1.08mmol)悬浮于DMSO(0.55mL)中，于100℃搅拌17小时。放冷后，加入蒸馏水(20mL)倾析，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～60/40)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到白色固体形式的k-1：H-9(40.2mg、0.108mmol、收率为13％)。

[k-2：H-1的合成]

使k-2(80mg、0.48mmol)、H-1(95.4mg、0.578mmol)溶解于DMSO(1.0mL)中，于100℃搅拌15小时。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，滤取析出的固体，用二氯甲烷洗涤，得到黄色固体形式的k-2：H-1(80.4mg、0.257mmol、收率为53％)。

[k-2：H-2的合成]

使k-2(80mg，0.48mmol)、H-2(112mg、0.625mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌19小时。放冷后，加入蒸馏水(30mL)、乙酸乙酯(30mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～80/20)纯化，得到淡黄色固体形式的k-2：H-2(34mg、0.10mmol、收率为21％)。

[k-2：H-3的合成]

使k-2(80mg、0.48mmol)、H-3(104mg、0.578mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌15小时。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，倾析，使得到的残余物溶解于二氯甲烷(3mL)中，加入己烷(3mL)，滤取析出的固体。将得到的固体通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝50/50～80/20)纯化，得到淡黄色固体形式的k-2：H-3(46.9mg、0.143mmol、收率为30％)。

[k-2：H-4的合成]

使k-2(80mg、0.48mmol)、H-4(112mg、0.625mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌19小时。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，倾析，将残余物用二氯甲烷洗涤，得到淡黄色固体形式的k-2：H-4(58.7mg、0.179mmol、收率为37％)。

[k-2：H-5的合成]

使k-2(80mg、0.48mmol)、H-5(106mg、0.578mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌15小时。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，倾析，使得到的残余物溶解于二氯甲烷(3mL)中，加入己烷(1mL)，滤取析出的固体。将得到的固体通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝50/50～80/20)纯化，得到白色固体形式的k-2：H-5(36.6mg、0.110mmol、收率为23％)。

[k-2：H-6的合成]

使k-2(100mg、0.602mmol)、H-6(155mg、0.722mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌15小时。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，倾析，将得到的残余物用二氯甲烷洗涤，得到淡棕色固体形式的k-2：H-6(59.3mg、0.163mmol、收率为27％)。

[k-2：H-7的合成]

使k-2(80mg、0.48mmol)、H-7(121mg、0.626mmol)溶解于DMSO(0.55mL)中，于100℃搅拌17小时。放冷后，加入蒸馏水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝5/95～50/50)纯化，得到淡黄色固体形式的k-2：H-7(109mg、0.319mmol、收率为66％)。

[k-2：H-9的合成]

使k-2(100mg、0.60mmol)、H-9(164mg，0.784mmol)悬浮于DMSO(1.2mL)中，于100℃搅拌18小时。放冷后，加入蒸馏水(12mL)、乙酸乙酯(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～60/40)纯化，将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到淡黄色固体形式的k-2：H-9(63.1mg、0.177mmol、收率为30％)。

[k-3：H-1的合成]

使k-3(200mg、1.02mmol)、H-1(253mg、1.53mmol)溶解于DMSO(2.0mL)中，于100℃搅拌3天。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，倾析，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝40/60～70/30)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到淡棕色固体形式的k-3：H-1(25.0mg，0.0728mmol、收率为7.1％)。

[k-3：H-2的合成]

使k-3(200mg、1.02mmol)、H-2(237mg、1.33mmol)溶解于DMSO(2mL)中，于100℃搅拌4天。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，滤取析出的固体，用甲醇洗涤。将得到的固体通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝40/60～70/30)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到淡棕色固体形式的k-3：H-2(10.3mg、0.0288mmol、收率为2.8％)。

[k-3：H-3的合成]

使k-3(200mg、1.02mmol)、H-3(219mg、1.22mmol)溶解于DMSO(2mL)中，于100℃搅拌5天。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，滤取析出的固体，通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝40/60～70/30)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到淡棕色固体形式的k-3：H-3(17.9mg、0.0501mmol、收率为4.9％)。

[k-3：H-4的合成]

使k-3(200mg、1.02mmol)、H-4(237mg、1.33mmol)溶解于DMSO(2mL)中，于100℃搅拌4天。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，滤取析出的固体，通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝40/60～70/30)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到淡棕色固体形式的k-3：H-4(17.9mg、0.0501mmol、收率为4.9％)。

[k-3：H-5的合成]

使k-3(200mg、1.02mmol)、H-5(224mg、1.22mmol)溶解于DMSO(2mL)中，于100℃搅拌6天。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，倾析，使得到的残余物溶解于二氯甲烷(3mL)中，加入己烷(1mL)，滤取析出的固体，通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝40/60～70/30)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到淡棕色固体形式的k-3：H-5(13.7mg、0.0379mmol、收率为3.7％)。

[k-3：H-6的合成]

使k-3(100mg、0.510mmol)、H-6(121mg、0.561mmol)溶解于DMSO(2mL)中，于100℃搅拌4天。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，倾析，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝40/60～70/30)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到橙色固体形式的k-3：H-6(17.0mg、0.0432mmol、收率为8.5％)。

[k-3：H-7的合成]

使k-3(200mg、1.02mmol)、H-7(256mg、1.33mmol)溶解于DMSO(2mL)中，于100℃搅拌3天。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，倾析，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝40/60～70/30)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到白色固体形式的k-3：H-7(28.3mg、0.762mmol、收率为7.5％)。

[k-3：H-9的合成]

使k-3(200mg，1.02mmol)、H-9(277mg、1.33mmol)溶解于DMSO(2mL)中，于100℃搅拌4天。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，过滤析出的固体，通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝40/60～70/30)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤，得到淡棕色固体形式的k-3：H-9(11.2mg、0.0289mmol、收率为2.8％)。

[k-5：H-1的合成]

使k-5(100mg、0.48mmol)、H-1(95.2mg、0.576mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌4天。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，滤取析出的固体，用二氯甲烷、甲醇依次洗涤，得到黄色固体形式的k-5：H-1(38.1mg、0.107mmol、收率为22％)。

[k-5：H-2的合成]

使k-5(100mg、0.48mmol)、H-2(112mg、0.625mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌3天。加入蒸馏水(10mL)，倾析，使残余物溶解于二氯甲烷(2mL)中，用芒硝干燥。过滤，在减压下浓缩，向得到的残余物中加入二氯甲烷(1mL)，暴露于超声波，滤取析出的固体，得到黄色固体形式的k-5：H-2(18.6mg、0.0503mmol、收率为10％)。

[k-5：H-3的合成]

使k-5(100mg、0.480mmol)、H-3(103mg、0.576mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌4天。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，滤取析出的固体，用二氯甲烷洗涤，得到黄色固体形式的k-5：H-3(44.6mg、0.121mmol、收率为25％)。

[k-5：H-4的合成]

使k-5(100mg，0.480mmol)、H-4(112mg，0.625mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌3天。加入蒸馏水(10mL)，滤取析出的固体，用二氯甲烷洗涤，得到黄色固体形式的k-5：H-4(44.4mg、0.120mmol、收率为25％)。

[k-5：H-5的合成]

使k-5(100mg、0.480mmol)、H-5(106mg、0.576mmol)溶解于DMSO(2mL)中，于100℃搅拌4天。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，滤取析出的固体，得到黄色固体形式的k-5：H-5(37.4mg、0.100mmol、收率为21％)。

[k-5：H-6的合成]

使k-5(100mg、0.480mmol)、H-6(124mg、0.576mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌5天。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，滤取析出的固体，通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝20/80～50/50)纯化。将得到的固体用甲醇洗涤，得到淡黄色固体形式的k-5：H-6(28.1mg、0.0693mmol、收率为14％)。

[k-5：H-7的合成]

使k-5(100mg、0.480mmol)、H-7(121mg、0.626mmol)溶解于DMSO(1mL)中，于100℃搅拌4天。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，滤取析出的固体，用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇依次洗涤，得到白色固体形式的k-5：H-7(43.6mg、0.114mmol、收率为24％)。

[k-5：H-9的合成]

使k-5(150mg、0.72mmol)、H-9(196mg、0.937mmol)悬浮于DMSO(1.4mL)中，于100℃搅拌3天。放冷后，加入蒸馏水(12mL)、二氯甲烷(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)依次洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～50/50)纯化，得到淡黄色固体形式的k-5：H-9(72.0mg、0.180mmol、收率为25％)。

另外，关于化合物编号k-1：D-2及k-1：D-4，可利用以上述的合成方法为基准的方法进行合成。

[合成例2]k-1：A-1的合成

[化学式35]

使k-1(100mg、0.55mmol)、甘氨酸乙酯盐酸盐(A-1)(100mg、0.72mmol)、乙酸钠(64mg、0.78mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌2小时。放冷后，加入水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～50/50)纯化。将得到的固体用IPE洗涤，得到黄色固体形式的k-1：A-1(21.9mg、0.0825mmol、收率为15％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ9.69(s，1H)，7.32(d，J＝8.1Hz，1H)，6.30(d，J＝10.8Hz，1H)，5.76(s，1H)，4.48(s，2H)，4.19(q，J＝8.1Hz，2H)，2.67(q，J＝8.1Hz，2H)，1.94(s，3H)，1.24(t，J＝8.1Hz，3H)，1.08(t，J＝8.1Hz，3H).

[合成例3]k-1：A-2的合成

[化学式36]

使k-1(100mg、0.55mmol)、甘氨酸苄酯对甲苯磺酸盐(A-2)(243mg、0.721mmol)、乙酸钠(64mg、0.78mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌2小时。放冷后，加入水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝5/95～50/50)纯化。将得到的固体用IPE洗涤，得到黄色固体形式的k-1：A-2(25.0mg、0.0764mmol、收率为14％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ9.69(s，1H)，7.45-7.35(m，6H)，7.32(d，J＝10.8Hz，1H)，6.31(d，J＝10.8Hz，1H)，5.23(s，2H)，4.56(s，2H)，2.70(q，J＝8.1Hz，2H)，1.94(s，3H)，1.08(t，J＝8.1Hz，3H).

[合成例4]k-1：A-3的合成

[化学式37]

使k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，加入正辛胺(A-3)(120mL、0.72mmol)，于室温搅拌2小时，于100℃搅拌17小时。放冷后，加入水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝0/100～20/80)纯化。将得到的固体用IPE洗涤，得到黄色固体形式的k-1：A-3(60.1mg、0.206mmol、收率为37％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ9.52(s，1H)，7.25(d，J＝8.1Hz，1H)，6.20(d，J＝8.1Hz，1H)，5.31(t，J＝8.1Hz,2H)，2.73(q，J＝8.1Hz，2H)，1.90(s，3H)，1.64(m，2H)，1.30-1.05(m，10H)，1.11(t，J＝8.1Hz,3H)，0.86(t，J＝8.1Hz,3H).

[合成例5]k-1：A-5的合成

[化学式38]

使k-1(300mg、1.7mmol)溶解于2M氨/甲醇溶液(17mL、33mmol)中，于室温搅拌1周。这期间，每天鼓泡氨气15分钟。将反应溶液在减压下浓缩，得到土黄色固体形式的4-(1-亚氨基丙基)-2-甲基苯-1，3-二醇(k-1’)与k-1的混合物(292mg、k-1’：k-1＝1∶0.2)。使如上述那样得到的k-1’与k-1的混合物(292mg)溶解于THF(6.5mL)中，在冰冷下，加入异氰酸苯酯(A-5)(158mL、1.46mmol)。于相同温度搅拌30分钟后，加入水(30mL)、乙酸乙酯(30mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝5/95～45/55)纯化。将得到的固体用IPE洗涤，得到淡黄色固体形式的k-1：A-5(160mg、0.536mmol、2工序收率32％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.74(s，1H)，10.22(s，1H)，10.11(s，1H)，7.63(d，J＝8.1Hz，2H)，7.53(d，J＝8.1Hz，1H)，7.32(t，J＝8.1Hz，2H)，7.06(t，J＝8.1Hz，1H)，6.49(d，J＝8.1Hz，1H)，2.84(q，J＝8.1Hz，2H)，2.00(s，3H)，1.24(t，J＝8.1Hz，3H).

[合成例6]k-1：H-10的合成

[化学式39]

使k-1(100mg，0.55mmol)、4-苯基氨基脲(H-10)(109mg，0.721mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌3.5小时。放冷后，加入水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～50/50)纯化。将得到的固体用IPE洗涤，得到白色固体形式的k-1：H-10(19.1mg、0.0610mmol、收率为11％)。

¹H-NMR(270MHz)：δ13.50(s，1H)，9.75(s，1H)，9.59(s，1H)，8.82(s，1H)，7.49(d，J＝8.1Hz，2H)，7.30(t，J＝8.1Hz，2H)，7.21(d，J＝8.0Hz，1H)，6.99(t，J＝8.1Hz，1H)，6.39(d，J＝8.1Hz，1H)，2.70(q，J＝8.1Hz，2H)，1.99(s，3H)，1.14(t，J＝8.1Hz，3H).

[合成例7]k-1：I-1的合成

[化学式40]

使肼一水合物(0.26mL、5.3mmol)溶解于二氯甲烷(5.3mL)中，在冰冷下缓缓加入异氰酸苄酯(101)(0.324mL、2.63mmol)。于室温搅拌3小时，将析出的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的102(352mg、2.13mmol、收率为82％)。

使如上述那样得到的102(155mg、0.938mmol)、k-1(130mg、0.72mmol)溶解于DMSO(1.4mL)中，于100℃搅拌3.5小时。放冷后，加入蒸馏水(10mL)，滤取析出的固体，通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～55/45)纯化。将得到的固体用二氯甲烷洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：I-1(55mg、0.17mmol、收率为24％)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.59(s，1H)，9.56(s，1H)，7.40-7.25(m，5H)，7.17(d，J＝12.0Hz，1H)，6.84(t，J＝8.0Hz，NH)，6.37(d，J＝12.0Hz，1H)，4.34(d，J＝8.0Hz，2H)，2.65(q，J＝8.0Hz,2H)，1.97(s，3H)，1.08(t，J＝8.0Hz，3H).(NH的一个信号未观测到。)

[合成例8]k-1：I-3的合成

[化学式41]

使肼一水合物(0.20mL、4.2mmol)溶解于二氯甲烷(4.2mL)中，在冰冷下缓缓加入异氰酸4-氯代苄酯(103)(0.278mL、2.09mmol)。于室温搅拌1.5小时，滤取析出的固体后，在减压下干燥，得到白色固体形式的104(315mg、1.58mmol、收率为75％)。

使如上述那样得到的104(187mg、0.937mmol)、k-1(130mg、0.72mmol)溶解于DMSO(1.4mL)中，于100℃搅拌22小时。将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～65/35纯化，使得到的纯化物溶解于乙酸乙酯中，加入己烷，滤取析出的固体后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：I-3(155mg、0.428mmol、收率为59％)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.63(s，1H)，9.56(s，1H)，7.41(d，J＝8.0Hz，2H)，7.34(d，J＝8.0Hz，2H)，7.17(d，J＝8.0Hz，1H)，6.89(t，J＝8.0Hz，NH)，6.36(d，J＝8.0Hz，1H)，4.31(d，J＝8.0Hz，2H)，2.65(q，J＝8.0Hz，2H)，1.97(s，3H)，1.08(t，J＝8.0Hz，3H).(NH的一个信号未观测到。)

[合成例9]k-1：I-6的合成

[化学式42]

使肼一水合物(0.23mL、4.8mmol)溶解于二氯甲烷(8mL)中，在冰冷下缓缓加入异氰酸4-甲基苄酯(105)(350mg、2.4mmol)。于室温搅拌2小时，滤取析出的固体后，在减压下干燥，得到白色固体形式的106(297mg、1.66mmol、收率为69％)。

使如上述那样得到的106(168mg、0.937mmol)、k-1(130mg、0.72mmol)悬浮于DMSO(2.8mL)中，于100℃搅拌22小时。将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～60/40)纯化，使得到的纯化物溶解于乙酸乙酯(30mL)中，用水(20mL)、饱和食盐水(30mL)依次洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的固体用二氯甲烷洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：I-6(118mg、0.346mmol、收率为48％)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.56(s，1H)，9.55(s，1H)，7.20(d，J＝8.0Hz，2H)，7.16(d，J＝8.0Hz，2H)，7.15(d，J＝8.0Hz，1H)，6.78(t，J＝8.0Hz，NH)，6.36(d，J＝8.0Hz，1H)，4.29(d，J＝8.0Hz，2H)，2.64(q，J＝8.0Hz，2H)，2.28(s，3H)，1.97(s，3H)，1.07(t，J＝8.0Hz，3H).(NH的一个信号未观测到。)

[合成例10]k-1：I-7的合成

[化学式43]

使肼一水合物(0.21mL、4.3mmol)溶解于二氯甲烷(4.3mL)中，在冰冷下缓缓加入异氰酸4-甲氧基苄酯(107)(350mg、2.15mmol)。于室温搅拌2小时，滤取析出的固体后，在减压下干燥，得到白色固体形式的108(381mg、1.95mmol、收率为93％)。

使如上述那样得到的108(183mg、0.937mmol)、k-1(130mg、0.72mmol)悬浮于DMSO(2.8mL)中，于100℃搅拌5小时。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，滤取析出的固体，通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝15/85～65/35)纯化，将得到的固体用二氯甲烷洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：I-7(55.0mg、0.154mmol、收率为21％)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.55(s，2H)，7.25(d，J＝8.0Hz，2H)，7.16(d，J＝8.0Hz，1H)，6.91(d，J＝8.0Hz，2H)，6.75(t，J＝8.0Hz，NH)，6.36(d，J＝8.0Hz，1H)，4.26(d，J＝8.0Hz，2H)，3.73(s，3H)，2.63(q，J＝8.0Hz，2H)，1.97(s，3H)，1.07(t，J＝8.0Hz，3H).(NH的一个信号未观测到。)

利用以上述的合成方法为基准的方法合成的化合物记载于第3表。

[第3表]

[化学式44]

[表3]

化合物编号	R<sub>2</sub>	R<sub>1</sub>’	t	Ar
					k-1：I-8	Et	H	1	2-OH-Ph
k-1：I-9	Et	H	1	4-OH-Ph
					k-1：I-10	Et	Me	1	3-OH-Ph
k-1：I-11	Et	H	2	3-OH-Ph
					k-1：I-12	Et	H	1	3，5-di-OH-Ph

另外，第3表中记载的化合物的¹H-NMR的测定结果记载于第4表。

[第4表]

[表4]

[合成例11]k-1：B-1的合成

[化学式45]

使2-溴代丙酸甲酯(109)(500mg、3.0mmol)溶解于DMSO(6mL)中，加入苯胺(0.36mL、3.9mmol)、碳酸钾(0.54g、3.9mmol)，于室温搅拌21小时。加入乙酸乙酯(30mL)、水(50mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝2/98～15/85)纯化，得到淡黄色液体形式的110(343mg、1.91mmol、收率为64％)。

使如上述那样得到的110(340mg、1.9mmol)溶解于甲醇(3.8mL)中，加入肼一水合物(0.18mL、3.8mmol)，于60℃搅拌24小时。添加肼一水合物(0.36mL、7.4mmol)，于60℃进一步搅拌17小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(胺硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝0/100～20/80)纯化，得到白色固体形式的111(321mg、1.79mmol、收率为94％)。

使如上述那样得到的111(168mg、0.937mmol)、k-1(130mg、0.72mmol)溶解于DMSO(1.4mL)中，于100℃搅拌19小时。放冷后，加入蒸馏水(15mL)，滤取析出的固体，干燥，将得到的黄色固体用二氯甲烷洗涤后，在减压下干燥，得到淡黄色固体形式的k-1：B-1(173mg、0.507mmol、收率为70％)。

¹H-NMR(400MHz)：δ10.82(s，1H)，9.71(s，1H)，7.25(d，J＝8.0Hz，1H)，7.07(t，J＝8.0Hz，2H)，6.63(d，J＝8.0Hz,2H)，6.56(t，J＝8.0Hz,1H)，6.39(d，J＝8.0Hz，1H)，5.93(d，J＝12Hz，NH)，4.28(m，1H)，2.80(q，J＝8.0Hz,2H)，1.95(s，3H)，1.40(d，J＝8.0Hz,3H)，1.03(t，J＝8.0Hz,3H).(NH的一个信号未观测到。)

[合成例12]k-1：B-2的合成

[化学式46]

使2-溴代异戊酸乙酯(112)(700mg、3.3mmol)溶解于DMSO(7mL)中，加入苯胺(0.40mL、4.4mmol)、碳酸钾(0.60g、4.4mmol)，于室温搅拌21小时，于80℃搅拌6小时，于120℃搅拌20小时。加入乙酸乙酯(30mL)、水(50mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝0/100～5/95)纯化，得到黄色液体形式的113(110mg、0.497mmol、收率为15％)。

使如上述那样得到的113(96mg、0.43mmol)溶解于甲醇(1mL)中，加入肼一水合物(0.042mL、0.87mmol)，于50℃搅拌4小时，添加肼一水合物(0.2mL、4.1mmol)，搅拌20小时，添加肼一水合物(0.1mL、2.1mmol)，进一步搅拌23小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(胺硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝0/100～5/95)纯化，得到白色固体形式的114(80.7mg、0.389mmol、收率为90％)。

使如上述那样得到的114(75mg、0.36mmol)、k-1(50mg、0.28mmol)溶解于DMSO(0.6mL)中，于100℃搅拌18小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～75/25)纯化，将得到的固体用二氯甲烷/IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：B-2(37.6mg、0.102mmol、收率为36％)。

¹H-NMR(400MHz)：δ10.83(s，1H)，9.72(s，1H)，7.26(d，J＝8.0Hz，1H)，7.05(t，J＝8.0Hz,2H)，6.71(d，J＝8.0Hz，2H)，6.53(t，J＝8.0Hz，1H)，6.39(d，J＝8.0Hz，1H)，5.78(d，J＝12Hz，NH)，3.97(m，1H)，2.82(q，J＝8.0Hz，2H)，2.03(m，1H)，1.95(s，3H)，1.06(t，J＝8.0Hz，3H)，0.97(d，J＝8.0Hz，6H).(NH的一个信号未观测到。)

[合成例13]k-1：B-3的合成

[化学式47]

使2-溴代正辛酸(115)(600mg、2.7mmol)溶解于甲醇(5.5mL)中，加入浓盐酸(3滴)，于50℃搅拌18小时。放冷后，加入乙醚(30mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤，在减压下浓缩，得到黄色液体形式的116(588mg、2.48mmol、收率为92％)。

使如上述那样得到的116(585mg、2.47mmol)溶解于DMSO(5mL)中，加入苯胺(0.29mL、3.2mmol)、碳酸钾(0.44g、3.2mmol)，于室温搅拌21小时，于60℃搅拌16小时。加入乙酸乙酯(30mL)、水(50mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝1/99～5/95)纯化，得到黄色液体形式的117(277mg、1.11mmol、收率为45％)。

使如上述那样得到的117(256mg、1.08mmo1)溶解于甲醇(2.2mL)中，加入肼一水合物(0.10mL、2.2mmol)于50℃搅拌4小时，添加肼一水合物(0.50mL、10.3mmol)，搅拌20小时，添加肼一水合物(0.25mL、5.2mmol)，进一步搅拌23小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(胺硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝0/100～5/95)纯化，得到淡黄色固体形式的118(268mg、1.07mmol、收率为99％)。

使如上述那样得到的118(144mg、0.58mmol)、k-1(80mg、0.44mmol)溶解于DMSO(0.9mL)中，于100℃搅拌18小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝5/95～75/25)、继而通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝1/99～5/95)纯化，将得到的固体用二氯甲烷/IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：B-3(88.7mg、0.216mmol、收率为49％)。

¹H-NMR(400MHz)：δ10.82(s，1H)，9.72(s，1H)，7.25(d，J＝8.0Hz，1H)，7.06(t,J＝8.0Hz,2H)，6.65(d，J＝8.0Hz,2H)，6.54(t，J＝8.0Hz，1H)，6.39(d，J＝8.0Hz，1H)，5.87(d，J＝8.0Hz,NH)，4.19(m，1H)，2.81(q，J＝8.0Hz,2H)，1.95(s，3H)，1.73(q，J＝8.0Hz,2H)，1.33(m,4H)，1.27(m,4H)，1.03(t，J＝8.0Hz，3H)，0.86(t，J＝8.0Hz，3H).(NH的一个信号未观测到。)

[合成例14]k-1：B-5的合成

[化学式48]

使苯丙酮酸(119)(1.0g、6.1mmol)溶解于DMF(5mL)中，在冰冷下加入DBU(1.0mL、6.7mmol)、碘甲烷(0.42mL、6.7mmol)，于室温搅拌3小时。加入乙酸乙酯(30mL)、1M盐酸(50mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(50mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝0/100～13/87)纯化，得到白色固体形式的120a(298mg、1.67mmol、收率为27％)。

使如上述那样得到的120a(295mg、1.66mmol)溶解于甲醇(6.6mL)、乙酸(0.66mL)、2M乙胺THF溶液(0.87mL、1.7mmol)中，在冰冷下加入甲基吡啶硼烷(0.35g、3.3mmol)，于室温搅拌2.5小时。加入4M盐酸(3mL)，于50℃加热30分钟，放冷后，加入乙酸乙酯(20mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)，分液。将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝2/98～30/70)纯化，得到120b(48.9mg、0.236mmol、收率为14％)。

使如上述那样得到的120b(45mg、0.22mmol)溶解于甲醇(0.9mL)中，加入肼一水合物(0.021mL、0.43mmol)，于50℃搅拌3小时，添加甲醇(0.9mL)、肼一水合物(0.021mL、0.43mmol)，搅拌12小时，添加甲醇(0.9mL)、肼一水合物(0.021mL、0.43mmol)，进一步搅拌3小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(胺硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝0/100～20/80)纯化，得到淡黄色液体形式的120c(32mg、0.15mmol、收率为68％)。

使如上述那样得到的120c(30mg、0.14mmol)、k-1(25mg、0.14mmol)溶解于DMSO(0.3mL)中，于100℃搅拌18小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝10/90～60/40)纯化，将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：B-5(18.4mg、0.0498mmol、收率为36％)。

¹H-NMR(400MHz)：δ9.72(s，1H)，7.30-7.10(m，6H)，6.38(d，J＝8.0Hz,1H)，3.62(m,J＝8.0Hz，1H)，2.86(q，J＝8.0Hz,2H)，2.66(q，J＝8.0Hz，2H)，1.97(s，3H)，1.04(d，J＝8.0Hz，2H)，0.98(t，J＝8.0Hz,3H)，0.92(t，J＝8.0Hz，3H).(NH的两个信号和OH的一个信号未观测到。)

[合成例15]k-1：C-1的合成

[化学式49]

使Boc-Gly-OH(121)(0.70g、4.0mmol)溶解于二氯甲烷(13mL)中，加入WSC(0.84g、4.4mmol)、苯肼(122)(0.47mL、4.8mmol)，于室温搅拌4小时。加入水(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝15/85～65/35)纯化，得到无色非晶形式的123(853mg、3.22mmol、收率为81％)。

向如上述那样得到的123(0.64g、2.4mmol)中加入4M盐酸/二氧杂环己烷(6mL)，于室温搅拌3小时。滤取析出的固体，通过中压硅胶柱色谱(胺硅胶30g、甲醇/二氯甲烷＝0/100～8/92)纯化，得到淡黄色固体形式的124(290mg、1.76mmol、收率为73％)。

使如上述那样得到的124(120mg、0.72mmol)、k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌22小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝20/80～90/10)纯化，将得到的固体用二氯甲烷洗涤后，在减压下干燥，得到黄色固体形式的k-1：C-1(20.2mg、0.0617mmol、收率为11％)。

¹H-NMR(400MHz)：δ9.89(s，1H)，9.67(s，1H)，7.83(s，1H)，7.25(d，J＝8.0 Hz，1H)，7.14(t，J＝8.0Hz，2H)，6.77(d，J＝8.0Hz，2H)，6.71(t，J＝8.0Hz，1H)，6.29(d，J＝8.0Hz，1H)，4.35(s，2H)，2.74(q，J＝8.0Hz,2H)，1.92(s，3H)，1.13(t，J＝8.0H z，3H).(NH的一个信号未观测到。)

[合成例16]k-1：C-2的合成

[化学式50]

使Boc-Gly-OH(121)(0.70g、4.0mmol)溶解于二氯甲烷(13mL)中，加入WSC(0.84g、4.4mmol)、苄胺(125)(0.52mL、4.8mmol)，于室温搅拌3小时。加入水(20mL)、二氯甲烷(20mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～65/35)纯化，得到无色液体形式的126(937mg、3.54mmol、收率为89％)。

向如上述那样得到的126(0.93g、3.5mmol)中加入TFA(7mL)，于室温搅拌3.5小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(胺硅胶30g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝10/90～95/5)纯化，得到淡黄色液体形式的127(457mg、2.78mmol、收率为79％)。

使如上述那样得到的127(120mg、0.72mmol)、k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌22小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～80/20)纯化，将得到的固体用IPE、二氯甲烷洗涤后，在减压下干燥，得到黄色固体形式的k-1：C-2(29.9mg、0.0908mmol、收率为17％)。

¹H-NMR(400MHz)：δ9.63(s，1H)，8.55(m，NH)，7.40-7.20(m，6H)，6.25(d，J＝8.0Hz，1H)，4.32(d，J＝8.0Hz,2H)，4.29(s,2H)，2.70(q，J＝8.0Hz，2H)，1.91(s，3H)，1.09(t，J＝8.0Hz，3H).(OH的一个信号未观测到。)

[合成例17]k-1：D-1的合成

[化学式51]

使3-苄氧基苯胺(129)(2.44g、12.2mmol)溶解于DMF(24mL)中，加入乙酸钠(1.10g、13.5mmol)、溴代乙酸乙酯(128)(1.49mL、13.5mmol)，于室温搅拌4小时。加入水(300mL)、乙酸乙酯(150mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(100mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶50g、乙酸乙酯/己烷＝2/98～10/90)纯化，得到淡黄色固体形式的130(2.82g、9.88mmol、收率为81％)。

使如上述那样得到的130(1.0g、3.5mmol)悬浮于甲醇(18mL)中，加入10％Pd/C(0.1g)，在氢气氛下于室温搅拌5小时。硅藻土过滤反应溶液，将滤液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝3/97～35/65)纯化，得到淡黄色液体形式的131(295mg、1.51mmol、收率为43％)。

使如上述那样得到的131(0.29g、1.5mmol)溶解于乙醇(3.5mL)中，加入肼一水合物(0.32mL、6.5mmol)，于60℃搅拌18小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(胺硅胶10g、甲醇/二氯甲烷＝1/99～10/90)纯化。将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到淡黄色固体形式的132(239mg、1.32mmol、收率为88％)。

使如上述那样得到的132(130mg、0.72mmol)、k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌21小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝5/95～50/50)纯化。将得到的固体用水、及IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：D-1(95.9mg、0.279mmol、收率为51％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.66(s，1H)，10.76(s，1H)，9.70(s，1H)，8.98(s，1H)，7.25(d，J＝10.8Hz，1H)，6.86(t，J＝10.8Hz，1H)，6.40(d，J＝8.1Hz，1H)，6.20-5.95(m，3H)，5.87(t，J＝5.4Hz，NH)，3.88(d，J＝5.4Hz,2H)，2.78(q，J＝8.0Hz，2H)，1.97(s，3H)，1.05(t，J＝8.1Hz,3H).

[合成例18]k-1：D-3的合成

[化学式52]

使合成例17的工序中得到的130(1.2g、4.2mmol)溶解于DMF(12mL)中，加入碳酸钾(1.16g、8.4mmol)、碘乙烷(1.35mL、16.8mmol)，于100℃搅拌3小时，添加碘乙烷(0.7mL、8.7mmol)，搅拌1.5小时，于室温搅拌20小时。加入水(100mL)、乙酸乙酯(50mL)，分液，将有机层用饱和食盐水(50mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝2/98～10/90)纯化，得到无色液体形式的133(1.21g、3.86mmol、收率为92％)。

使如上述那样得到的化合物133(1.2g、3.9mmol)溶解于甲醇(19mL)中，加入10％Pd/C(0.1g)，在氢气氛下于室温搅拌15小时。硅藻土过滤反应溶液，将滤液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝5/95～25/75)纯化，得到134(194mg、0.869mmol、收率为22％)。

使如上述那样得到的134(0.20g、0.90mmol)溶解于乙醇(2.2mL)中，加入肼一水合物(0.22mL、4.5mmol)，于50℃搅拌18小时，添加肼一水合物(0.22mL、4.5mmol)，进而于60℃搅拌24小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(胺硅胶10g、甲醇/二氯甲烷＝1/99～6/94)纯化。将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到淡黄色固体形式的135(151mg、0.722mmol、收率为80％)。

使如上述那样得到的135(150mg、0.72mmol)、k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌23小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝15/85～80/20)纯化。将得到的固体用IPE/二氯甲烷(1/1)的混合溶剂洗涤后，在减压下干燥，得到黄色固体形式的k-1：D-3(118mg、0.318mmol、收率为58％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.68(s，1H)，10.78(s，1H)，9.69(s，1H)，9.00(s，1H)，7.26(d，J＝8.1Hz，1H)，6.91(t，J＝8.1Hz，1H)，6.40(d，J＝8.1Hz，1H)，6.11(d，J＝8.1Hz，1H)，6.10-6.05(m,2H)，4.12(s,2H)，3.42(q，J＝8.1Hz,2H)，2.79(q，J＝8.1Hz，2H)，1.96(s，3H)，1.13(t，J＝8.1Hz,3H)，1.05(t，J＝8.1Hz，3H).

[合成例19]k-1：E-1的合成

[化学式53]

使氨基苯酚(137)(500mg、4.6mmol)溶解于THF(5mL)、水(5mL)中，加入碳酸氢钠(0.77g、9.2mmol)，在冰冷下缓缓滴入氯代甲酸苯酯(136)(0.61mL、4.8mmol)。于相同温度搅拌2小时，加入乙酸乙酯(20mL)、2M盐酸(20mL)，分液。将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的138(0.94g、4.1mmol、收率为89％)。

使如上述那样得到的138(0.94g、4.1mmol)溶解于乙腈(4mL)中，加入肼一水合物(1.0mL、21mmol)，于60℃搅拌23小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶色谱(胺硅胶30g、甲醇/二氯甲烷＝0/100～12/88)纯化，得到淡黄色固体形式的139(664mg、3.97mmol、收率为97％)。

使如上述那样得到的139(120mg、0.72mmol)、k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌16小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～80/20)、继而通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、甲醇/二氯甲烷＝1/99～5/95)纯化。将得到的固体用IPE洗涤，得到白色固体形式的k-1：E-1(19.7mg、0.0598mmol、收率为11％)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.70(s，1H)，9.60(s，1H)，9.38(s，1H)，8.73(s，1H)，7.21(d，J＝8.0Hz,1H)，7.06(t，J＝8.0Hz,1H)，7.05(s，1H)，6.82(d，J＝8.0Hz,1H)，6.39(d，J＝8.0Hz,2H)，5.76(s，1H)，2.69(q，J＝8.0Hz,2H)，1.99(s,3H)，1.13(t，J＝8.0Hz,3H).

[合成例20]k-1：F-1的合成

[化学式54]

使肼一水合物(0.58mL、12mmol)溶解于二氯甲烷(6mL)中，在冰冷下加入己二异氰酸酯(140)(0.48mL、3.0mmol)，于室温搅拌1.5小时，添加肼一水合物(0.29mL、6.0mmol)，搅拌2小时。滤取生成的固体，在减压下干燥，得到白色固体形式的141(0.60g、2.6mmol、收率为87％)。

使如上述那样得到的141(100mg、0.43mmol)、k-1(233mg、1.29mmol)悬浮于DMSO(1.4mL)中，于100℃搅拌20小时。放冷后，加入二氯甲烷，过滤不溶物，将滤液在减压下浓缩。将得到的固体用二氯甲烷及水洗涤后，在减压下干燥，得到淡黄色固体形式的k-1：F-1(88.6mg、0.159mmol、收率为37％)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.44(s，4H)，7.15(d，J＝8.0Hz，2H)，6.40-6.30(m，2H)，3.13(q，J＝8.0Hz,4H)，2.63(q，J＝8.0Hz,4H)，1.97(s，6H)，1.47(m,4H)，1.38(m,4H)，1.07(t，J＝8.0Hz，6H).

[合成例21]k-1：G-1的合成

[化学式55]

使N-甲基-苯胺(142)(0.50g、4.7mmol)溶解于乙醇(9mL)中，加入碳酸钾(0.97g、7.0mmol)、溴代乙酸乙酯(128)(0.57mL、5.1mmol)，于60℃搅拌21小时。过滤不溶物，将滤液在减压下浓缩，向得到的残余物中加入乙酸乙酯(30mL)、水(30mL)，分液。将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝0/100～5/95)纯化，得到淡黄色液体形式的143(496mg、2.57mmol、收率为55％)。

使如上述那样得到的143(0.49g、2.6mmol)溶解于甲醇(5mL)中，加入肼一水合物(0.25mL、5.1mmol)，于55℃搅拌15小时。添加肼一水合物(0.50mL、10mmol)，于60℃进一步搅拌18小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的144(389mg、2.17mmol、收率为83％)。

使如上述那样得到的144(130mg、0.72mmol)、k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌17小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～80/20)纯化。将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：G-1(92mg、0.27mmol、收率为49％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.64(s，1H)，10.86(s，1H)，9.67(s，1H)，7.24(d，J＝10.8Hz,1H)，7.15(t，J＝10.8Hz,2H)，6.71(d，J＝8.1Hz,2H)，6.62(t，J＝8.1Hz,1H)，6.38(d，J＝8.1Hz，1H),4.23(s,2H)，3.04(s，3H)，2.89(q，J＝8.1Hz,2H)，1.93(s，3H)，1.05(t，J＝8.1Hz，3H).

[合成例22]k-1：L-1的合成

[化学式56]

利用以上述的合成例21为基准的方法，以间苯二酚作为起始原料，合成k-1：L-1(65mg、白色固体)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.63(s，1H)，10.99(s，1H)，9.74(s，1H)，9.46(s，1H)，7.28(d，J＝8.1Hz，1H)，7.07(t，J＝8.1Hz，1H)，6.45-6.35(m，4H)，4.72(s，2H)，2.81(q，J＝8.1Hz，2H)，1.97(s，3H)，1.08(t，J＝8.1Hz，3H).

[合成例23]k-1：M-1的合成

[化学式57]

利用以上述的合成例21为基准的方法，以3-巯基苯酚作为起始原料，合成k-1：M-1(119mg、白色固体)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.64(s，1H)，10.96(s，1H)，9.72(s，1H)，9.57(s，1H)，7.26(d，J＝8.1Hz，1H)，7.11(t，J＝8.1Hz，1H)，6.82(d，J＝8.1Hz，1H)，6.80(s，1H)，6.62(d，J＝8.1Hz，1H)，6.40(d，J＝8.1Hz，1H)，3.88(s，2H)，2.78(q，J＝8.1Hz，2H)，1.97(s，3H)，1.06(t，J＝8.1Hz，3H).

[合成例24]k-1：G-2的合成

[化学式58]

使N-乙基-苯胺(145)(0.50g、4.1mmol)溶解于乙醇(8mL)中，加入碳酸钾(0.86g、6.2mmol)、溴代乙酸乙酯(128)(0.50mL、4.1mmol)，于60℃搅拌21小时。过滤不溶物，将滤液在减压下浓缩，向得到的残余物中加入乙酸乙酯(30mL)、水(30mL)，分液。将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤、在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝0/100～5/95)纯化，得到淡黄色液体形式的146(473mg、2.28mmol、收率为56％)。

使如上述那样得到的146(0.47g、2.3mmol)溶解于甲醇(4.5mL)中，加入肼一水合物(0.22mL、4.5mmol)，于55℃搅拌15小时。添加肼一水合物(0.44mL、9.1mmol)，于60℃进一步搅拌18小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的147(309mg、1.60mmol、收率为70％)。

使如上述那样得到的147(140mg、0.72mmol)、k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌17小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～80/20)纯化。将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：G-2(96mg、0.27mmol、收率为49％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.66(s，1H)，10.82(s，1H)，9.68(s，1H)，7.25(d，J＝8.1Hz，1H)，7.13(t，J＝8.1Hz,2H)，6.65(d，J＝8.1Hz,2H)，6.59(t，J＝8.1Hz，1H)，6.38(d，J＝10.8Hz，1H)，4.17(s，2H)，3.46(q，J＝8.1Hz,2H)，2.79(q，J＝8.1Hz,2H)，1.94(s，3H)，1.13(t，J＝8.1Hz,3H)，1.03(t，J＝8.1Hz,3H).

[合成例25]k-1：J-1的合成

[化学式59]

向冰冷后的THF(10mL)中依次加入氢化铝(1.0g、26mmol)、3-氰基苯酚(148)(0.63g、5.3mmol)，于室温搅拌1.5小时，于60℃搅拌3.5小时。放冷后，添加氢化铝(1.0g、26mmol)、THF(10mL)，于60℃进一步搅拌16小时。对反应溶液进行冰冷却，依次加入水(1.5mL)、15％氢氧化钠水溶液(1.5mL)、水(4.5mL)，于室温搅拌3小时。硅藻土过滤悬浮溶液，将滤液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(胺硅胶10g、甲醇/二氯甲烷＝0/100～8/92)纯化。将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的149(477mg、3.87mmol、收率为73％)。

使如上述那样得到的149(200mg、1.6mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)、水(2mL)中，加入碳酸氢钠(0.27g、3.2mmol)，在冰冷下缓缓滴入氯代甲酸苯酯(136)(0.22mL、1.7mmol)。于室温搅拌20小时，加入乙酸乙酯(20mL)、水(20mL)，分液。将有机层用饱和食盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥、过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝5/95～35/65)纯化，得到无色液体形式的150(369mg、1.52mmol、收率为95％)。

使如上述那样得到的150(365mg、1.50mmol)悬浮于乙腈(3.8mL)中，加入肼一水合物(0.18mL、3.8mmol)，于室温搅拌2.5小时，添加肼一水合物(0.18mL、3.8mmol)，于55℃进一步搅拌20小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的固体用IPE/二氯甲烷(3/1)洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的151(233mg、1.29mmol、收率为86％)。

使如上述那样得到的151(130mg、0.72mmol)、k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌15小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝10/90～55/45)纯化。向得到的纯化物中加入水，滤取析出的固体后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：J-1(102mg、0.297mmol、收率为54％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.45(brs，1H)，9.57(s，1H)，9.53(s，1H)，9.36(s，1H)，7.17(d，J＝8.1Hz，1H)，7.11(d，J＝8.1Hz,1H)，6.80-6.60(m,4H)，6.37(d，J＝8.1Hz，1H)，4.25(d，J＝5.4Hz,2H)，2.65(q，J＝8.1Hz,2H)，1.97(s,3H)，1.08(t，J＝8.1Hz,3H).

[合成例26]k-1：J-5的合成

[化学式60]

使4-苄基-3-氨基硫脲(155)(130mg、0.72mmol)、k-1)(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌17小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝5/95～80/20)、继而通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～50/50)纯化。将得到的固体用IPE洗涤后，在减压下干燥，得到白色固体形式的k-1：J-5(49.9mg、0.145mmol、收率为26％)。

¹H-NMR(400MHz)；δ10.61(brs，1H)，9.69(s，1H)，8.43(brs，1H)，7.40-7.20(m,6H)，6.40(d，J＝8.0Hz,1H)，4.78(d，J＝8.0Hz,2H)，2.74(q，J＝8.1Hz,2H)，1.99(s，3H)，1.09(t，J＝8.1Hz，3H).(NH的一个信号未观测到。)

[合成例27]k-1：J-6的合成

[化学式61]

使氨基硫脲(152)(0.50g、5.5mmol)悬浮于甲醇(5.5mL)中，加入碘甲烷(0.41mL、6.6mmol)，于60℃搅拌1.5小时，打开反应容器的盖并于70℃搅拌50分钟。放冷后，加入苄胺(0.61mL、5.5mmol)，于55℃搅拌17小时。将反应溶液在减压下浓缩，将得到的残余物用IPE/二氯甲烷(1/4)的混合溶剂洗涤。将得到的粗纯化物通过中压硅胶柱色谱(胺硅胶30g、甲醇/二氯甲烷＝0/100～15/85)纯化，将得到的固体用二氯甲烷洗涤后，在减压下干燥，得到橙色固体形式的156(626mg、3.81mmol、收率为69％)。

使如上述那样得到的156(120mg、0.72mmol)、k-1(100mg、0.55mmol)溶解于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌27小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝10/90～80/20纯化，向得到的粗纯化物中加入二氯甲烷、水，分液。将有机层用无水硫酸镁干燥、过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/己烷＝10/90～60/40)纯化，得到黄色非晶形式的k-1：J-6(29.9mg、0.0916mmol、收率为17％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ14.51(brs，1H)，9.39(s，1H)，7.36-7.05(m，6H)，6.32(d，J＝8.1Hz,1H)，6.20(m,NH)，5.30(brs，NH)，4.34(d，J＝5.4Hz，2H)，2.84(q，J＝8.1Hz,2H)，1.96(s，3H)，0.96(t，J＝8.1Hz,3H).

[合成例28]k-1：N-1的合成

使2-羟基苯甲醇(1.0g、8.1mmol)悬浮于二氯甲烷(10mL)、水(10mL)中，加入碳酸氢钠(2.0g、24mmol)，在冰冷下缓缓滴入氯代甲酸苯酯(2.0mL、16mmol)。缓缓升温置室温，搅拌5.5小时，加入二氯甲烷(20mL)、水(20mL)，分液。将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥、过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝2/98～35/65)纯化，得到白色固体形式的3-(羟基甲基)苯基苯基碳酸酯(1.45g、5.94mmol、收率为73％)。

使如上述那样得到的3-(羟基甲基)苯基苯基碳酸酯溶解于二氯甲烷(7mL)中，加入吡啶(0.72mL、8.9mmol)、少量DMAP，在冰冷下缓缓滴入氯代甲酸苯酯(0.90mL、7.1mmol)。于室温搅拌2小时，加入二氯甲烷(10mL)、水(30mL)，分液。将有机层用饱和食盐水(30mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥、过滤，在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、乙酸乙酯/己烷＝3/97～25/75)纯化，得到无色液体形式的3-[(苯氧基羰基)氧基]苄基苯基碳酸酯(2.20g、6.04mmol、收率为102％)。

使如上述那样得到的3-[(苯氧基羰基)氧基]苄基苯基碳酸酯(2.2g、6.0mmol)悬浮于乙醇(10mL)中，加入肼一水合物(2.9mL、60mmol)，于60℃搅拌21小时。过滤不溶物，将滤液在减压下浓缩，将得到的残余物通过中压硅胶柱色谱(硅胶30g、甲醇/二氯甲烷＝0/100～10/90)纯化，将得到的固体用二氯甲烷悬浮洗涤，得到白色固体形式的肼甲酸3-羟基苄酯(808mg、4.44mmol、收率为74％)。

使如上述那样得到的肼甲酸3-羟基苄酯(130mg、0.72mmol)、2’，4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮(100)(100mg、0.55mmol)悬浮于DMSO(1.1mL)中，于100℃搅拌22小时。放冷后，将反应溶液直接通过中压硅胶柱色谱(硅胶10g、乙酸乙酯/二氯甲烷＝2/98～30/70纯化，向得到的纯化物中加入水，滤取析出的固体，得到白色固体形式的k-1：N-1(85.5mg、0.248mmol、收率为45％)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.45(brs，1H)，10.78(brs，1H)，9.63(s，1H)，9.49(s，1H)，7.21(d，J＝8.1Hz，1H)，7.18(t，J＝8.1Hz，1H)，6.84(d，J＝8.1Hz,1H)，6.83(s，1H)，6.73(d，J＝8.1Hz,1H)，6.38(d，J＝8.1Hz，1H)，5.14(s,2H)，2.75(q，J＝8.1Hz,2H)，1.97(s，3H)，1.03(t，J＝8.1Hz，3H).

以下，记载使用本发明所使用的化合物实施的作用试验的结果。

[试验例1]各化合物的细胞增殖活性的研究

研究了将本发明所使用的化合物添加至三维培养基中时的促进细胞增殖的效果。具体而言，对经前培养(粘附培养)的SKOV3细胞(来源于人卵巢癌的细胞株)进行回收，悬浮于三维细胞培养培养基(“FCeM(注册商标)”(日产化学株式会社))中，制备细胞悬浮液。将该细胞悬浮液以每1孔为1000个细胞/40μL/孔的方式接种于384孔平底超低粘附表面微孔培养板(Corning公司制，#3827)的孔。将接种于板中的细胞悬浮液在37℃、5％CO₂下静置一晚。然后，以最终浓度成为5μM(或者是，5μM和10μM这2个阶段)的方式添加4.44μL本发明所使用的化合物的DMSO稀释溶液(添加后不搅拌)。添加各化合物后，在37℃、5％CO₂下静置培养4天。针对第5天的培养液添加ATP试剂44.4μL(CellTiter-Glo(注册商标)LuminescentCell Viability Assay，Promega公司制)使其悬浮，于室温静置15分钟。使用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，评价细胞增殖。

结果示于第5表及第6表。需要说明的是，增殖率以对照(添加了不含有本发明所使用的化合物的DMSO的细胞)作为基准(100％)算出。另外，表中所示的值为2个试验的结果的平均值。

[第5表]

[表5]

化合物	增殖率(％)	化合物	增殖率(％)
				k-1：H-1	233.26	k-3：H-1	133.76
k-1：H-2	147.27	k-3：H-2	117.84
				k-1：H-3	168.98	k-3：H-3	134.65
k-1：H-4	105.07	k-3：H-4	135.5
				k-1：H-5	154.19	k-3：H-5	141.82
k-1：H-6	125.68	k-3：H-6	134.6
				k-1：H-7	236.46	k-3：H-7	126.34
k-1：H-9	95.96	k-3：H-9	129.93
				k-2：H-1	184.61	k-5：H-1	148.88
k-2：H-2	131.13	k-5：H-2	133.96
				k-2：H-3	139.33	k-5：H-3	146.44
k-2：H-4	128.2	k-5：H-4	114.76
				k-2：H-5	158.56	k-5：H-5	145.4
k-2：H-6	116.79	k-5：H-6	115.2
				k-2：H-7	201.93	k-5：H-7	130.63
k-2：H-9	131.36	k-5：H-9	38.38

[第6表]

[表6]

增殖率的值表示2个试验的平均值。

[试验例2]本发明所使用的化合物针对SKOV3细胞的作用的研究1

按照专利文献1(WO2014/017513)的方法，使用均质混合器制备含有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三昌株式会社制)及15％(v/v)FBS、100ng/mL人HB-EGF(PEPROTECH公司制)的McCoy's 5a培养基(Sigma Aldrich公司制)的组合物。另外，作为对照，制备不含有脱酰基结冷胶的未添加培养基组合物。然后，将人卵巢癌细胞株SKOV3(DSPharma Biomedical公司制)悬浮于上述的添加了脱酰基结冷胶的培养基组合物中后，以每1孔为1000个细胞/40μL/孔的方式分注至384孔平底超低粘附表面微孔培养板(Corning公司制，#3827)的孔中(三维培养(3D))。就单层培养(2D)而言，将人卵巢癌细胞株SKOV3悬浮于上述的不含有脱酰基结冷胶的培养基组合物中后，以每1孔为400个/40μL的方式分注至384孔平底微孔培养板(Corning公司制，#3712)的孔中。各板在CO₂温箱(37℃、5％CO₂)内在静置状态下培养。在培养第1天，以最终浓度成为0、0.5、1、5、10、20μM的方式，分别各添加4.4μL溶解于二甲基亚砜(DMSO)中的本发明所使用的化合物，继而持续培养4天。针对第5天的培养液添加ATP试剂44.4μL(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell ViabilityAssay，Promega公司制)使其悬浮，于室温静置15分钟后，使用FlexStation3(MolecularDevices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测得活细胞的数量。以未添加化合物的RLU值(ATP测定、发光强度)作为100％时的、添加各化合物时的相对值示于第7表。本试验的结果是，对SKOV3细胞进行三维培养(3D)的条件中，k-1：H-7及k-1：H-10以宽泛的浓度显示出促进细胞增殖的作用，并且SKOV3细胞在培养基内形成了球体。另一方面，在单层培养(2D)下对SKOV3细胞进行培养的情况下，即使将k-1：H-7及k-1：H-10添加至培养基中，也未观察到良好的促进细胞增殖的效果。

[第7表]

[表7]

[试验例3]本发明所使用的化合物针对SKOV3细胞的作用的研究2

按照专利文献1(WO2014/017513)的方法，使用FCeM-series Preparation Kit(和光纯药工业株式会社制)制备含有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGELCG-LA、三昌株式会社制)及15％(v/v)FBS、30ng/mL人EGF(PEPROTECH公司制)的McCoy’s 5a培养基(SigmaAldrich公司制)的组合物。另外，作为单层培养，制备不含有脱酰基结冷胶的未添加培养基组合物。然后，将人卵巢癌细胞株SKOV3(DS Pharma Biomedical公司制)悬浮于上述的添加了脱酰基结冷胶的培养基组合物中后，以每1孔为1000个细胞/36μL/孔的方式分注至384孔平底超低粘附表面微孔培养板(Corning公司制，#3827)的孔中(三维培养(3D))。就单层培养(2D)而言，将人卵巢癌细胞株SKOV3悬浮于上述的不含有脱酰基结冷胶的培养基组合物中后，以每1孔为400个细胞/36μL的方式分注至384孔平底微孔培养板(Corning公司制，#3712)的孔中。在分注后，以最终浓度成为0、1、5、10、20μM的方式，分别各添加4μL溶解于二甲基亚砜(DMSO)中的本发明所使用的化合物。各板在CO₂温箱(37℃、5％CO₂)内在静置状态下培养4天。针对第4天的培养液添加ATP试剂40μL(CellTiter-Glo(注册商标)LuminescentCell Viability Assay、Promega公司制)，使用板振荡器(AS ONE Corporation.制，Microplate mixer NS-P)于室温搅拌15分钟后，使用EnSpire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测得活细胞的数量。以未添加化合物的RLU值(ATP测定、发光强度)作为100％时的、添加各化合物时的相对值示于第8表。

[第8表]

[表8]

本试验的结果是，对SKOV3细胞进行三维培养(3D)的条件中，k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1、k-1：D-2、k-1：I-10、及k-1：N-1以宽泛的浓度显示出促进细胞增殖的作用，并且SKOV3细胞在培养基内形成了球体。另一方面，在单层培养(2D)下对SKOV3细胞进行培养的情况下，即使将k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1、k-1：D-2、k-1：I-10、及k-1：N-1添加至培养基中，也未观察到良好的促进细胞增殖的效果。

[试验例4]本发明所使用的化合物针对小肠类器官的作用的研究

摘出小鼠小肠约20cm，在冰上除去脂肪组织及血管组织后，用PBS充分清洗内容物，用剪刀切开，制成2mm左右的片段。用15mL的PBS洗涤20次，除去上清液后，添加25mL的Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL公司制)，一边以20rpm搅拌，一边于室温孵育15分钟。除去上清液后，向沉淀物添加10mL的冷0.1％BSA/PBS，吹吸3次，使用70μm细胞筛网(cell strainer)(BD Bioscience公司制)过滤上清液，回收滤液。针对残留的沉淀物，同样地将0.1％BSA/PBS的添加和吹吸、过滤重复3次，制备4个阶段的量的滤液。将各滤液于4℃、290g离心5分钟，除去上清液后，用10mL的冷0.1％BSA/PBS再次悬浮，于4℃、200g离心3分钟。除去上清液后，添加10mL的DMEM/F12(和光纯药株式会社制)进行悬浮，分取1mL在显微镜下观察，选择存在足够小肠片段(隐窝、Crypt)的滤液，使用血球计数板对Crypt数进行计数。添加与细胞悬浮液等量的冷Matrigel(注册商标)Matrix GFR(Corning公司制)并进行混合，迅速以成为500crypts/50μL/孔的方式分注至预先加热至37℃的24孔板中。将板于37℃静置10分钟，使凝胶化完成，向各孔中添加750μL的IntestiCult(注册商标)OrganoidGrowth Medium(STEMCELL TECHNOLOGIES公司制)，然后以最终浓度成为5μM的方式添加溶解于DMSO中的本发明所使用的化合物。作为对照，制备未添加化合物的孔。培养7天后，在显微镜下对形成的小肠类器官的数量和直径进行计测，与未添加(对照)进行比较的结果示于第9表。本试验的结果是，明确了k-1：H-7在小鼠的小肠类器官培养中促进类器官形成。此时，在类器官的直径没有显著变化的情况下，通过添加k-1：H-7提高了来自Crypt的类器官形成率。

[第9表]

[表9]

	对照	k-1：H-7
			类器官数量(相对值)	1	2.5
类器官直径(μm)	130±18	153±21

[试验例5]本发明所使用的化合物针对各种人癌细胞的作用1

使用如下所述的各种培养基对各种人源癌细胞进行前培养(单层培养)。来源于人宫颈癌的细胞株HeLa(American Type Culture Collection(以下记载为ATCC)公司制，含有10％胎牛血清(FBS、Corning公司制)的杜氏改良Eagle培养基(以下简称为DMEM)(和光纯药工业株式会社制))、来源于人恶性黑色素瘤的细胞株A375(ATCC公司制，含有10％FBS的DMEM)、来源于人上皮样细胞癌的细胞株A431(ATCC公司制，含有10％FBS及1％MEM非必需氨基酸溶液(MEM Non-Essential Amino Acids solution(以下简称为NEAA)(和光纯药工业株式会社制))的Eagle’s Minimum Essential Medium(以下简称为EMEM)(和光纯药工业株式会社制))、来源于人胃腺癌的细胞株AGS(DS Pharma Biomedical公司制，含有10％FBS的Ham’s F-12(和光纯药工业株式会社制))、来源于人前列腺癌的细胞株LNCaP clone FGC(ATCC公司制，含有10％FBS的RPMI1640(和光纯药工业株式会社制))、来源于人结肠腺癌的细胞株HCT116(DS Pharma Biomedical公司制，含有10％FBS的McCoy's5A培养基(SigmaAldrich公司制))、来源于人肺泡基底上皮腺癌的细胞株A549(DS Pharma Biomedical公司制，含有10％FBS的DMEM)、来源于人前列腺癌的细胞DU145(ATCC公司制，含有10％FBS的EMEM)。将处于对数增殖期的上述细胞用PBS洗涤后，对于粘附细胞而言，添加0.25w/v％胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(和光纯药工业株式会社制)于37℃孵育1～5分钟进行剥离，添加各种培养基，离心并用同种培养基再次悬浮后，各自以单细胞形式回收。

将前述的各种细胞悬浮于含有或不含有脱酰基结冷胶的各培养基中(脱酰基结冷胶浓度为0.015w/v％，但仅RPMI1640为0.020w/v％)以1000～12000个细胞/135μL/孔的细胞浓度接种于96孔低粘附U型底板(Corning公司制，不含有脱酰基结冷胶的培养基)、或低粘附平底板(Coming公司制，含有脱酰基结冷胶的培养基)(均为3D培养)。在37℃、5％CO₂温箱中静置培养一晚后，将本发明所使用的化合物的DMSO溶液以最终浓度成为5μM或10μM的方式添加至各培养基中。各化合物溶液的添加量为15μL/孔。作为对照，添加了溶解于培养基中的DMSO溶液(DMSO最终浓度0.1％)。继续在37℃、5％CO₂温箱中培养4天后，以15μL/孔添加WST-8溶液(同仁化学研究所社制)，在同一温箱中反应1～2小时后，使用分光光度计(Molecular Devices公司制，SPECTRA MAX190)测定450nm的吸光度，减去仅培养基的吸光度，由此测得活细胞的数量。然后，算出以未添加化合物(对照)的吸光度作为100％时的、添加各化合物时的相对值。与未添加化合物(对照)进行比较时，将显示119％以下的值的情况表示为-，将显示120％以上的值的情况表示为o，将显示150％以上的值的情况表示为◎，示于第10表。

[第10表]

[表10]

本试验的结果是，明确了在多个癌细胞株中，k-1：H-7及k-1：H-10在三维条件下使增殖活性亢进。此时，无论使用低粘附U型底板、低粘附平底板中的哪一种，癌细胞株均形成了球体。

[试验例6]本发明所使用的化合物针对各种人癌细胞的作用2

使用如下所述的各种培养基对各种人源癌细胞进行前培养(单层培养)。人卵巢癌细胞株SKOV3(DS Pharma Biomedical公司制，含有15％胎牛血清(FBS、Corning公司制)的McCoy's 5a培养基(Sigma Aldrich公司制))、来源于人肺泡基底上皮腺癌的细胞株A549(DS Pharma Biomedical公司制，含有10％FBS的DMEM(和光纯药工业株式会社制))、来源于人宫颈癌的细胞株HeLa(ATCC公司制，含有10％FBS的DMEM)、来源于人恶性黑色素瘤的细胞株A375(ATCC公司制，含有10％FBS的DMEM)、来源于人上皮样细胞癌的细胞株A431(ATCC公司制，含有10％FBS及1％MEM非必需氨基酸溶液(MEM NEAA、和光纯药工业株式会社制)的EMEM(和光纯药工业株式会社制))、来源于人胃腺癌的细胞株AGS(DS Pharma Biomedical公司制，含有10％FBS的Ham's F-12(和光纯药工业株式会社制))、来源于人前列腺癌的细胞DU145(ATCC公司制，含有10％FBS的EMEM)。将处于对数增殖期的上述细胞用PBS洗涤后，就粘附细胞而言，添加0.25w/v％胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(和光纯药工业株式会社制)于37℃孵育1～5分钟进行剥离，添加各种培养基，离心并用同种培养基再次悬浮后，各自以单细胞形式回收。

将前述的各种细胞悬浮于含有或不含有脱酰基结冷胶的各培养基中(脱酰基结冷胶浓度为0.015w/v％)，以700～2000个细胞/90μL/孔的细胞浓度接种于96孔低粘附U型底板(Corning公司制，#4520、不含有脱酰基结冷胶的培养基)、或低粘附平底板(Corning公司制，#3474，含有脱酰基结冷胶的培养基)(均为3D培养)。然后，将溶解于DMSO中的本发明所使用的化合物以最终浓度成为5μM或10μM的方式添加至各培养基中。各化合物溶液的添加量为10μL/孔。作为对照，添加了溶解于培养基中的DMSO溶液(DMSO最终浓度0.1％)。在37℃、5％CO₂温箱中培养4天后，向第4天的培养液中添加ATP试剂40μL(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司制)，使用板振荡器(AS ONECorporation.制，Micro plate mixer NS-P)于室温搅拌15分钟后，使用EnSpire(PerkinElmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测得活细胞的数量。算出以未添加化合物的RLU值(ATP测定、发光强度)作为100％时的、添加各化合物时的相对值。与未添加化合物(对照)进行比较时，将显示119％以下的值的情况表示为-，将显示120％以上的值的情况表示为○，将显示150％以上的值的情况表示为◎，示于第11表及第12表。未实施试验为空栏。

[第11表]

[表11]

[第12表]

[表12]

本试验的结果是，明确了在多个癌细胞株中，k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、及k-1：J-1在三维条件下使增殖活性亢进。此时，无论使用低粘附U型底板、低粘附平底板中的哪一种，癌细胞株均形成了球体。

[试验例7]本发明所使用的化合物针对MDCK细胞的作用1

使用含有10％FBS及1％NEAA的EMEM培养基对狗肾小管上皮细胞(MDCK细胞、DSPharma Biomedical公司制)进行前培养。将冷Matrigel(注册商标)Matrix GFR(Corning公司制)以各50μL涂布于24孔板，于37℃孵育15分钟使其固化。将前述的MDCK细胞以20000个细胞/mL的浓度悬浮于培养基中，然后加入20μL/mL冷Matrigel(注册商标)Matrix GFR，以1mL/孔接种。以最终浓度成为10μM的方式添加溶解于培养基中的本发明所使用的化合物，在37℃、5％CO₂的条件下，在温箱中培养7天。作为对照(未添加化合物)，以最终浓度成为0.1％的方式添加DMSO。7天后，用PBS洗涤后(1mL/孔)，添加4％多聚甲醛/PBS(和光纯药株式会社制)(1mL/孔)，于室温固定20分钟。然后，除去上清液，以1mL/孔添加IF缓冲液(含有0.2％TritonX-100(Sigma Aldrich公司制)、0.05％吐温20(Sigma Aldrich公司制)的PBS)，静置30分钟，除去。以1mL/孔添加透化缓冲液(0.5％TritonX-100(Sigma Aldrich公司制)/PBS)，于室温孵育30分钟。除去上清液，使用IF缓冲液以5分钟间隔洗涤3次，以0.5mL/孔添加封闭缓冲液(1％BSA(Sigma Aldrich公司制)/IF缓冲液)孵育30分钟。除去上清液，在封闭缓冲液中将抗β连环蛋白抗体(BD Bioscience公司制)稀释100倍，以250μL/孔添加，于4℃、遮光孵育一晚。翌日，使用IF缓冲液以5分钟间隔洗涤3次，在封闭缓冲液中将二抗(Alexa Fluor555、Thermo Fisher Scientific公司制)和鬼笔环肽(Alexa Fluor488、Thermo Fisher Scientific公司制)各自稀释250倍，以250μL/孔添加，于室温、遮光下孵育60分钟。使用IF缓冲液以5分钟间隔洗涤3次，然后滴入VECTASHIELD Mounting Mediumwith DAPI(Vector Laboratories公司制)，使用荧光显微镜(ArrayScan、Thermo FisherScientific公司制)进行观察及分析。

本试验的结果是，明确了在MDCK细胞于Matrigel上形成具有内腔的Cyst时，在化合物k-1：H-7存在下，每1Cyst的面积在以对照对象为100时增大20％以上。其结果示于第13表。

[第13表]

[表13]

	对照	k-1：H-7
			Cyst面积(相对值)	100	124

[试验例8]本发明所使用的化合物针对MDCK细胞的作用2

使用含有10％FBS及1％NEAA的EMEM培养基对狗肾小管上皮细胞(MDCK细胞、DSPharma Biomedical公司制)进行前培养。将冷Matrigel(注册商标)Matrix GFR(Corning公司制)以各50μL涂布于24孔板，于37℃孵育15分钟使其固化。将前述的MDCK细胞以10000个细胞/mL悬浮于培养基中，然后加入20μL/mL冷Matrigel(注册商标)Matrix GFR，以1mL/孔接种。以最终浓度成为5μM及10μM的方式添加溶解于培养基中的本发明所使用的化合物，在37℃、5％CO₂的条件下，在温箱中培养6天。作为对照(未添加化合物)，以最终浓度成为0.1％的方式添加DMSO。6天后，使用Cell³iMager(SCREEN Holdings Co.，Ltd.制)对形成的Cyst的大小及个数进行测定。总体的Cyst之中70μm以上的Cyst的比例示于第14表。

[第14表]

[表14]

另外，用PBS洗涤后(1mL/孔)，添加4％多聚甲醛/PBS(和光纯药株式会社制)(1mL/孔)，于室温固定20分钟。然后，除去上清液，以1mL/孔添加IF缓冲液(含有0.2％TritonX-100(Sigma Aldrich公司制)、0.05％吐温20(Sigma Aldrich公司制)的PBS)，静置30分钟，除去。以1mL/孔添加透化缓冲液(0.5％TritonX-100(Sigma Aldrich公司制)/PBS)，于室温孵育30分钟。除去上清液，使用IF缓冲液以5分钟间隔洗涤3次，以0.5mL/孔添加封闭缓冲液(1％BSA(Sigma Aldrich公司制)/IF缓冲液)孵育30分钟。除去上清液，在封闭缓冲液中将抗β连环蛋白抗体(BD Bioscience公司制)稀释100倍，以250μL/孔添加，于室温孵育60分钟。使用IF缓冲液以5分钟间隔洗涤3次，在封闭缓冲液中将二抗(Alexa Fluor555、ThermoFisher Scientific公司制)和鬼笔环肽(Alexa Fluor488、Thermo Fisher Scientific公司制)各自稀释250倍，以250μL/孔添加，于室温、遮光下孵育60分钟。使用IF缓冲液以5分钟间隔洗涤3次，然后滴入VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories公司制)，使用共聚焦荧光显微镜(FV1200I X83、奥林巴斯公司制)进行观察。

本试验的结果是，明确了在MDCK细胞于Matrigel上形成具有内腔的Cyst时，在化合物k-1：I-1、k-1：B-1存在下，总体的Cyst之中70μm以上的Cyst的比例增大(表13)。另外，使用共聚焦荧光显微镜的观察的结果是，确认了在化合物k-1：I-1、或k-1：B-1存在下，形成了正常的Cyst(图1)。

[试验例9]本发明组合物针对人间充质干细胞的作用1

通过使用了MF-medium间充质干细胞增殖培养基(东洋纺公司制)的单层培养法(2D)对人间充质干细胞(hMSC、东洋纺公司制)进行前培养。三维培养法(3D)中，将hMSC悬浮于添加了脱酰基结冷胶的培养基组合物中后，以成为1.2×10⁵个细胞/2mL/孔的方式接种于6孔平底超低粘附表面板(Corning公司制，#3471)。2D中，将hMSC悬浮于不含有脱酰基结冷胶的培养基组合物中后，以成为4.0×10⁴个细胞/2mL/孔的方式接种于6孔平底板(Corning公司制，#3516)。然后，以最终浓度成为10μM的方式添加溶解于培养基中的本发明所使用的化合物的溶液，在37℃、5％CO₂温箱中培养7天。作为对照，以最终浓度成为0.1％的方式添加DMSO。7天后，三维培养法中，从孔回收细胞，用PBS洗涤，除去上清液后，添加胰蛋白酶0.25w/v％胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(和光纯药工业株式会社制)，于37℃孵育2～5分钟，使球体分散为单细胞，添加培养基，离心并除去上清液。然后，使用同种培养基再次悬浮后，将一部分悬浮于台盼蓝(和光纯药工业株式会社制)中，使用全自动细胞计数盘TC20(BIO-RAD公司制)对活细胞数量进行计数。

单层培养法中，将细胞用PBS洗涤后，添加0.25w/v％胰蛋白酶-1mmol/L EDTA溶液，于37℃孵育2～5分钟进行剥离，添加培养基，离心并除去上清液。然后，使用同种培养基再次悬浮后，将一部分悬浮于台盼蓝(和光纯药工业株式会社制)中，使用TC-20(BIO-RAD公司制)对活细胞数量进行计数。

向上述细胞悬浮液中添加CD34抗体(APC、BD Bioscience公司制)、CD73(BV421、BDBioscience公司制)、CD29(BB515、BD Bioscience公司制)，在冰上孵育30分钟。用2％SM缓冲液(2％FBS/PBS)洗涤2次后，添加含有1μg/mL碘化丙啶(PI)的SM，使用FACSAria(Becton，Dickinson and Company制)进行分析。第15表中，算出了以未添加化合物(对照)的细胞数作为1时的、添加各化合物时的相对值。第16表中示出了在未添加以及添加化合物的条件下进行了三维培养(3D)的细胞的CD34、CD73、及CD29的阳性率或阴性率。

[第15表]

[表15]

细胞增殖率(相对值)	k-1：H-7	k-1：H-10
			2D	1.9	1.3
3D	4	1.7

[第16表]

[表16]

分化标志物	未添加	k-1：H-7	k-1：H-10
				CD34+(阴性率)	0.9％	3％	0.7％
CD29+(阳性率)	94.6％	94.6％	87.6％
				CD73+(阳性率)	99.9％	100％	99.1％

本试验的结果是，k-1：H-7及k-1：H-10在二维及三维细胞培养条件下确认到使hMSC的细胞数量增加的效果。三维细胞培养条件中，hMSC形成了球体。此时，作为细胞表面标志物的CD34的阴性率、CD73、及CD29的阳性率并未由于添加化合物而变化(第16表)。由以上的结果表明，k-1：H-7及k-1：H-10在维持hMSC的未分化性的情况下使细胞增殖亢进。

[试验例10]本发明所使用的化合物针对人间充质干细胞的作用2

通过使用了间充质干细胞增殖培养基(PromoCell GmbH制)的单层培养法(2D)对来源于骨髓的人间充质干细胞(BM-hMSC、PromoCell GmbH制)进行前培养。三维培养法(3D)中，将hMSC悬浮于添加了脱酰基结冷胶的培养基组合物中后，以成为6000个细胞/90μL/孔的方式接种于96孔平底超低粘附表面板(Corning公司制，#3474)。另外，使用了EZSPHERE的三维培养法(EZSPHERE)中，将hMSC悬浮于不含有脱酰基结冷胶的培养基组合物中后，以成为2000个细胞/90μL/孔的方式接种于96孔EZSPHERE板(AGC TECHNO GLASS公司制，#4860-900)。2D中，将hMSC悬浮于不含有脱酰基结冷胶的培养基组合物中后，以成为2000个细胞/90μL/孔的方式接种于96孔平底板(Corning公司制，#3585)。然后，以最终浓度成为1μM、5μM、10μM及20μM的方式，以10μL/孔添加溶解于培养基中的本发明所使用的化合物，在37℃、5％CO₂温箱中培养4天。作为对照，以最终浓度成为0.1％的方式添加DMSO。4天后，针对培养液添加ATP试剂100μL(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司制)，使用板振荡器(AS ONE Corporation.制，Micro plate mixer NS-P)于室温搅拌2分钟，于室温静置10分钟后，使用Enspire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测得活细胞的数量。算出以未添加化合物的RLU值(ATP测定、发光强度)作为100％时的、添加各化合物时的相对值，其结果示于第17表。

[第17表]

[表17]

本试验的结果是，明确了k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、及k-1：J-1在三维细胞培养条件下使BM-hMSC的增殖活性亢进。三维细胞培养条件中，BM-hMSC形成了球体。另外，明确了k-1：B-1及k-1：J-1即使在二维细胞培养条件下也使hMSC的增殖活性亢进。

[试验例11]本发明所使用的化合物针对成纤维细胞株C3H10T1/2的作用

使用含有10(v/v)％FBS(Corning公司制)和L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素稳定化溶液(Sigma-Aldrich公司制)的BME培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)，对小鼠胚胎成纤维细胞C3H10T1/2(DS Pharma Biomedical公司制)进行了培养。将处于对数增殖期的上述细胞用PBS洗涤后，添加0.25w/v％胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(和光纯药工业株式会社制)，于37℃孵育3分钟进行剥离，添加培养基，离心并除去上清液。

将前述的各种细胞悬浮于含有或不含有脱酰基结冷胶的各培养基中(脱酰基结冷胶浓度为0.015w/v％)，以700～2000个细胞/90μL/孔的细胞浓度接种至96孔低粘附U型底板(Corning公司制，#4520、不含有脱酰基结冷胶的培养基)(3D培养)。接种后，以最终浓度成为1μM或5μM的方式，将溶解于DMSO的本发明所使用的化合物添加至各培养基中。各化合物溶液的添加量为10μL/孔。作为对照，添加了溶解于培养基中的DMSO溶液(DMSO最终浓度0.1％)。在37℃、5％CO₂温箱中培养4天后，针对培养液添加ATP试剂100μL(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司制)，使用板振荡器(AS ONECorporation.制，Micro plate mixer NS-P)于室温搅拌15分钟后，使用EnSpire(PerkinElmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测得活细胞的数量。以未添加化合物时的RLU值(ATP测定、发光强度)作为100％，算出添加各化合物时的相对值。与未添加化合物(对照)进行比较时，将显示119％以下的值的情况表示为-，将显示120％以上的值的情况表示为○，将显示150％以上的值的情况表示为◎，示于第18表。试验未实施为空栏。

[第18表]

[表18]

本试验的结果是，明确了成纤维细胞中，k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、及k-1：J-1在三维条件下使增殖活性亢进。此时，使用低粘附U型底板时，成纤维细胞形成了球体。

[试验例12]本发明所使用的化合物针对使用悬滴法培养的细胞的作用

使用含有10％FBS及1％MEM非必需氨基酸溶液(MEM NEAA、和光纯药工业株式会社制)的EMEM(和光纯药工业株式会社制))，对来源于人上皮样细胞癌的细胞株A431(ATCC公司制)进行培养。另外，使用间充质干细胞增殖培养基(PromoCell GmbH制)对来源于骨髓的人间充质干细胞(BM-hMSC、PromoCell GmbH制)进行培养。将处于对数增殖期的上述各种细胞用PBS洗涤后，添加0.25w/v％胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(和光纯药工业株式会社制)于37℃孵育3分钟进行剥离，添加培养基，离心并除去上清液。

然后，将各种细胞以成为100000个细胞/2mL的方式悬浮于上述培养基中，然后将溶解于DMSO中的本发明所使用的化合物以最终浓度成为5μM的方式添加至培养基中。在3.5cm皿(FALCON公司制，#351008)的盖的内表面上，以各10μL的方式接种15滴本细胞悬浮液，制备液滴。此时，作为对照，以各10μL的方式接种15滴添加了DMSO的培养基(DMSO最终浓度0.05％)。将该盖移回添加了2mL的PBS的3.5em皿，在37℃、5％CO₂温箱中培养2天。将培养后的液滴回收至1.5mL的管中，以最终容量成为150μL的方式添加培养基。然后添加ATP试剂150μL(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司制)使其悬浮，于室温静置10分钟后，使用Enspire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测得活细胞的数量。以未添加化合物的RLU值(ATP测定、发光强度)作为100％时的、添加各化合物时的相对值示于第19表及第20表。

[第19表]

[表19]

[第20表]

[表20]

本试验的结果是，k-1：H-1、k-1：H-7、及k-1：B-1在使用悬滴法进行三维细胞培养的条件下也确认到使A431细胞株及来源于骨髓的人间充质干细胞的细胞数量增加的效果。此时，A431细胞株及来源于骨髓的人间充质干细胞通过悬滴法在液滴中形成了球体。

[试验例13]本发明化合物针对人多能干细胞(hiPS细胞)的作用

在包被有玻连蛋白VTN-N(Thermo Fisher Scientific公司制)的皿上，使用mTeSR1(注册商标)培养基(STEMCELL Technologies公司制)对hiPS细胞株253G1(由理化学研究所出售)进行培养。将处于增殖期的上述细胞用PBS(FUJIFILM Wako HoldingsU.S.A.Corporation制)洗涤后，添加TrypLE Select(注册商标)(Thermo FisherScientific公司制)，于37℃孵育3分钟，除去剥离液后，添加培养基，通过吹吸进行剥离。然后，离心并除去上清液。

将前述的细胞悬浮于含有10μM的Y-27632(FUJIFILM Wako HoldingsU.S.A.Corporation制)的培养基中，以10000个细胞/200μμL/孔的细胞浓度接种至96孔EZSPHERE板(AGC TECHNO GLASS公司制，#4860-900)。接种后，将经稀释的溶解于DMSO中的本发明所使用的化合物以最终浓度成为5μM的方式添加至各培养基中。各化合物溶液的添加量为2μL/孔。作为对照，添加了溶解于培养基中的DMSO溶液(DMSO最终浓度0.05％)。每天更换一半量的培养基，相应地，以化合物浓度成为恒定的方式，添加各化合物溶液。在37℃、5％CO₂温箱中培养3天后，除去培养上清液100μL，然后针对残留的培养液添加ATP试剂100μL(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司制)，使用板振荡器(AS ONE Corporation.制，Micro plate mixer NS-P)于室温搅拌15分钟后，将150μL移至96孔板平底白色/透明(Falcon公司制)，使用EnSpire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测得活细胞的数量。以DMSO添加的RLU值(ATP测定、发光强度)作为100％时的、添加各化合物时的相对值示于第21表。

[第21表]

[表21]

化合物	相对值(％)
		k-1：H-1	166％
k-1：H-7	194％
		k-1：B-1	193％
k-1：D-1	207％
		k-1：J-1	227％
k-1：I-10	194％

本试验的结果是，明确了人多能干细胞中，k-1：H-1、k-1：H-7、k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1、及k-1：I-10在三维条件下使增殖活性亢进。

[试验例14]本发明化合物针对血管内皮细胞的作用

使用Endothelial Cell Growth Medium(PromoCELL公司制)培养基，对人脐静脉内皮细胞(PromoCELL公司制)进行前培养(单层培养)。将处于对数增殖期的上述细胞用PBS洗涤后，就粘附细胞而言，添加DetachKit(PromoCELL公司制)，于37℃孵育3分钟进行剥离，添加培养基，离心，使用相同培养基再次悬浮。

将前述的细胞悬浮于含有或不含有脱酰基结冷胶的各培养基中(脱酰基结冷胶浓度为0.015w/v％)，以700～2000个细胞/90μL/孔的细胞浓度接种于96孔低粘附U型底板(Corning公司制，#4520、不含有脱酰基结冷胶的培养基)、或低粘附平底板(Corning公司制，#3474、含有脱酰基结冷胶的培养基)(均为3D培养)。然后，将溶解于DMSO中的本发明所使用的化合物以最终浓度成为5μM或10μM的方式添加至各培养基中。各化合物溶液的添加量为10μL/孔。作为对照，添加了溶解于培养基中的DMSO溶液(DMSO最终浓度0.1％)。在37℃、5％CO₂温箱中培养4天后，针对第4天的培养液添加ATP试剂100μL(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司制)，使用板振荡器(AS ONECorporation.制，Micro plate mixer NS-P)于室温搅拌15分钟后，使用EnSpire(PerkinElmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测得活细胞的数量。以未添加化合物的RLU值(ATP测定、发光强度)作为100％时的、添加各化合物时的相对值示于[第22表]。

[第22表]

[表22]

本试验的结果是，明确了在人脐静脉内皮细胞中，k-1：H-1、k-1：H-7、k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、及k-1：J-1在三维条件下使增殖活性亢进。此时，无论使用低粘附U型底板、低粘附平底板中的哪一种，人脐静脉内皮细胞均形成了球体。

[试验例15]本发明化合物针对动物细胞株的作用

使用如下所述的各种培养基对各种动物细胞株进行前培养(单层培养)。来源于中国仓鼠卵巢的细胞株CHO-K1(DS Pharma Biomedical公司制，含有10％胎牛血清(FBS、Corning公司制)的Ham’s F-12培养基(FUJIFILM Wako Holdings U.S.A.Corporation制))、来源于非洲绿猴肾上皮的细胞株Vero(由JCRB细胞库出售，含有5％FBS的Medium199培养基(Life Technologies公司制))。将处于对数增殖期的上述细胞用PBS洗涤后，就粘附细胞而言，添加0.25w/v％胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(FUJIFILM WakoHoldings U.S.A.Corporation制)，于37℃孵育3分钟进行剥离，添加各种培养基，离心，使用同种培养基再次悬浮。

将前述的各种动物细胞悬浮于含有或不含有脱酰基结冷胶的各培养基中(关于脱酰基结冷胶浓度，Ham’sF-12培养基中为0.02w/v％，Medium199培养基中为0.015w/v％)，以700～2000个细胞/90μL/孔的细胞浓度接种于96孔低粘附U型底板(Corning公司制，#4520、不含有脱酰基结冷胶的培养基)、或低粘附平底板(Corning公司制，#3474、含有脱酰基结冷胶的培养基)(均为3D培养)。然后，将溶解于DMSO中的本发明所使用的化合物以最终浓度成为5μM或10μM的方式添加至各培养基中。各化合物溶液的添加量为10μL/孔。作为对照，添加了溶解于培养基中的DMSO溶液(DMSO最终浓度0.1％)。在37℃、5％CO₂温箱中培养4天后，针对第4天的培养液添加ATP试剂100μL(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent CellViability Assay、Promega公司制)，使用板振荡器(AS ONE Corporation.制，Micro platemixer NS-P)于室温搅拌15分钟后，使用EnSpire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测得活细胞的数量。以未添加化合物的RLU值(ATP测定、发光强度)作为100％时，算出添加各化合物时的相对值。与未添加化合物(对照)进行比较时，将显示119％以下的值的情况表示为-，将显示120％以上的值的情况表示为○，将显示150％以上的值的情况表示为◎，示于第23表及第24表。

[第23表]

[表23]

[第24表]

[表24]

本试验的结果是，明确了多个动物细胞株中，k-1：H-1、k-1：H-7、k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、及k-1：J-1在三维条件下使增殖活性亢进。此时，无论使用低粘附U型底板、低粘附平底板中的哪一种，动物细胞株均形成了球体。

产业上的可利用性

通过本发明，能够达成细胞增殖的促进、球体形成的促进、类器官形成的促进、及Cyst形成的促进中任一项或它们的任意的组合。通过本发明制备的细胞等在例如创新药物的领域中非常有用。

本申请以在日本提出申请的日本特愿2017-147071(申请日：2017年7月28日)及日本特愿2017-239102(申请日：2017年12月13日)为基础，上述申请的内容全部包括在本说明书中。

Claims

1.培养基添加用组合物，其含有下述式(I)表示的化合物、或其盐：

[化学式1]

式中，X为单键、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-；R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar，式中，Y、及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，W为氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，Ar为可具有取代基的芳基；R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基；R₃为羟基；n为0、1或2。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，X为-NHCO-。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，R₂为碳原子数1～6的烷基，n为0。

4.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，W为N(R₄)，Z为单键，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

5.如权利要求4所述的组合物，其中，芳基为苯基。

6.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为单键，W为N(R₄)，R₄为氢原子，Z为单键或可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

7.如权利要求6所述的组合物，其中，芳基为苯基。

8.如权利要求6或7所述的组合物，其中，Z为亚甲基。

9.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为单键，W为氧原子，Z为可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

10.如权利要求9所述的组合物，其中，芳基为苯基，Z为亚甲基。

11.如权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

[化学式6]

[化学式7]

及

[化学式8]

12.如权利要求1～3、6、及7中任一项所述的组合物，其中，化合物为选自由以下组成的组中的化合物或其盐，

[化学式9]

[化学式10]

[化学式11]

及

[化学式12]

13.如权利要求1～3、9及10中任一项所述的组合物，其中，化合物为以下所示的化合物或其盐，

[化学式13]

14.如权利要求1～13中任一项所述的组合物，其用于促进细胞增殖。

15.如权利要求14所述的组合物，细胞选自由正常细胞株、癌细胞株及干细胞组成的组。

16.如权利要求1～13中任一项所述的组合物，其用于促进球体形成、类器官形成、或Cyst形成。

17.培养基，其包含权利要求1～13中任一项所述的培养基添加用组合物。

18.促进细胞增殖的方法，其包括向培养基添加权利要求1～13中任一项所述的培养基添加用组合物。

19.如权利要求18所述的方法，其中，细胞选自由正常细胞株、癌细胞株及干细胞组成的组。

20.下述式(I)表示的化合物、或其盐：

[化学式14]

式中，X为单键、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-；R₁为可具有取代基的碳原子数1～10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar，式中，Y、及Z为单键、或可具有取代基的碳原子数1～6的亚烷基，W为氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄为氢原子或碳原子数1～6的烷基，Ar为可具有取代基的芳基；R₂为可具有取代基的碳原子数1～6的烷基；R₃为羟基；n为0、1或2，

其中，X为-NHCO-、R₂为乙基、n为0时，R₁不是-CH₂-NH-C₆H₅。

21.如权利要求20所述的化合物或其盐，其中，X为-NHCO-。

22.如权利要求20或21所述的化合物或其盐，其中，R₂为碳原子数1～6的烷基，n为0。

23.如权利要求20～22中任一项所述的化合物或其盐，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为亚甲基，W为N(R₄)，Z为单键，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

24.如权利要求23所述的化合物或其盐，其中，芳基为苯基。

25.如权利要求20～22中任一项所述的化合物或其盐，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为单键，W为N(R₄)，R₄为氢原子，Z为单键或可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

26.如权利要求25所述的化合物或其盐，其中，芳基为苯基。

27.如权利要求25或26所述的化合物或其盐，其中，Z为亚甲基。

28.如权利要求20～22中任一项所述的化合物或其盐，其中，R₁为-Y-W-Z-Ar，Y为单键，W为氧原子，Z为可具有碳原子数1～6的烷基的亚甲基，Ar为可具有卤素原子、羟基、碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的烷氧基的芳基。

29.如权利要求28所述的化合物或其盐，其中，芳基为苯基，Z为亚甲基。

30.如权利要求20～24中任一项所述的化合物或其盐，其选自由以下组成的组，

[化学式15]