CN104812891A

CN104812891A - 细胞培养基

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Publication number: CN104812891A
Application number: CN201380058205.9A
Authority: CN
Inventors: J·冯哈根; M·A·布里宁; C·贾斯珀
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2033-11-14
Also published as: MX358095B; AR117697A2; CA3112061A1; JP6433429B2; BR112015010948A2; DK2920296T3; US20180230422A1; CA2891279A1; JP2019030334A; ES2827701T3; EP2920296A1; AR093460A1; US10030225B2; BR112015010948B1; CA3112061C; WO2014075807A1; CN104812891B; EP2920296B1; CA2891279C; MX2015006099A

Abstract

本发明涉及包含酪氨酸和/或半胱氨酸的无机酯衍生物的细胞培养基。细胞培养基中酪氨酸的差溶解性和半胱氨酸的时常稳定性不足可以通过将酪氨酸和半胱氨酸替代为无机酯衍生物而克服，所述无机酯衍生物例如磷酸化衍生物。

Description

细胞培养基

技术领域

本发明涉及包含酪氨酸和/或半胱氨酸的无机酯衍生物的细胞培养基。通过用无机酯衍生物，例如磷酸化的衍生物，置换酪氨酸和半胱氨酸，可以克服在细胞培养基中酪氨酸溶解性差而半胱氨酸时常稳定性不足的问题。

背景技术

细胞培养基支持和维持细胞在人工环境中的生长。

取决于应被支持生长的生物体类型，细胞培养基包含多种成分——有时一百种以上的不同成分——的复杂混合物。

哺乳动物、昆虫或植物细胞繁殖所需的细胞培养基通常比支持细菌和酵母生长的培养基要复杂得多。

最先开发的细胞培养基由不确定成分组成，如血浆、血清、胚胎提取物、或其他未确定成分的生物提取物或蛋白胨。因而开发化学成分确定的培养基成为了一个重要的进步。化学成分确定的培养基常包括但不仅限于氨基酸、维生素、金属盐、抗氧化剂、螯合剂、生长因子、缓冲剂、激素和本领域技术人员已知的许多其他物质。

一些细胞培养基作为无菌水性液体提供。液体细胞培养基的缺点是其减少的保质期以及运输和储存困难。因此，目前许多细胞培养基以细磨干粉混合物提供。这些培养基出于在水和/或水溶液中溶解的目的而生产，并且被设计为在溶解状态下(常常与其它补充剂一起)为细胞供应实质的营养基质以便所述细胞可以生长和/或生产生物药。

大多数生物药生产平台基于补料分批细胞培养方案。目的通常在于，开发高滴度细胞培养方法以满足渐增的市场需求和降低制造成本。除使用高性能重组细胞系外，也需要改良细胞培养基和方法参数以实现最大的生产潜力。

在补料分批方法中，基础培养基支持初始生长和生产，补料培养基防止养分耗竭并维持生产阶段。选择培养基以适应在不同生产阶段的不同代谢需求。方法参数设置-包括进料策略和控制参数-定义合适细胞生长和蛋白生产的化学和物理环境。

补料培养基的优化是优化补料分批方法的主要方面。

大多数情况下补料培养基是高度浓缩的，以避免生物反应器的稀释。营养物的受控加入直接影响培养物的生长速率。

从干粉制备细胞培养基的一个限制因素是某些成分的溶解性差或稳定性差，特别是氨基酸L-酪氨酸和L-半胱氨酸的溶解性或稳定性差。对于L-酪氨酸，溶解性差是主要问题，而对于L-半胱氨酸，稳定性问题占主导地位。

因此找到提高L-酪氨酸和L-半胱氨酸的溶解性和/或稳定性的方法将是有利的。

发明概述

已经发现，L-酪氨酸和L-半胱氨酸的无机酯衍生物具有改进的溶解性和/或稳定性，可分别代替L-酪氨酸和L-半胱氨酸用于细胞培养基中而没有任何负面影响，并且有时甚至对细胞生长有积极的影响。

也已发现，这种无机酯衍生物特别适于制备补料溶液，其中所述补料溶液具有不超过pH8.5的pH、并具有高浓度的以适于作为细胞营养物的形式存在的酪氨酸和半胱氨酸。

因此，本发明涉及包含酪氨酸和/或半胱氨酸的至少一种无机酯衍生物的细胞培养基。

在一个优选的实施方案中，无机酯衍生物是硫酸酯衍生物或磷酸酯衍生物。

在一个优选的实施方案中，细胞培养基包含式I和/或II的成分中的一种或多种：

在一个优选的实施方案中，酪氨酸的无机酯衍生物是(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸或其盐。

在另一个优选的实施方案中，半胱氨酸的衍生物是(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基丙酸(sulfosulfanylpropanoic acid)或其盐。

在一个优选的实施方案中，酪氨酸的磷酸化衍生物是(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸二钠盐。

在一个优选的实施方案中，半胱氨酸的磺化衍生物是(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基丙酸钠盐。

在一个优选的实施方案中，细胞培养基是干粉培养基。

在另一个优选的实施方案中，细胞培养基是补料培养基。

在另一个优选的实施方案中，细胞培养基是液体培养基，其具有8.5或更小的pH，并包含浓度为5和40mmol/l之间，优选10和30mmol/l之间的酪氨酸和/或半胱氨酸的至少一种无机酯衍生物。

在一个优选的实施方案中，液体培养基的pH为6.5和8.5之间，最优选为6.8和7.8之间。

在一个实施方案中，细胞培养基包含至少一种或多种糖成分，一种或多种氨基酸，一种或多种维生素或维生素前体，一种或多种盐，一种或多种缓冲剂成分，一种或多种辅因子和一个或多种核酸成分。

本发明还涉及用于生产根据本发明的细胞培养基的方法，其通过如下实施:

a)将L-酪氨酸和/或L-半胱氨酸的一种或多种无机酯衍生物与细胞培养基的其它成分混合，

b)研磨步骤a)的混合物。

在一个优选的实施方案中，步骤b)在针棒式粉碎机(pin mill)、中碎机(Fitz mill)或喷射式粉碎机(jet mill)中进行。

在另一个优选的实施方案中，来自步骤a)的混合物在研磨之前冷却至0℃以下的温度。

本发明还涉及(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的二钠盐、二钾盐、一钾盐、2:1钙盐和镁盐。

本发明还涉及用于培养细胞的方法，其通过如下实施：

a)提供生物反应器，

b)将待培养的细胞与根据本发明的细胞培养基混合，

c)孵育步骤b)的混合物。

本发明还涉及用于在生物反应器中培养细胞的补料分批的方法，其通过如下实施：

-将细胞和水性细胞培养基进料到生物反应器中，

-在生物反应器中孵育细胞，

-在生物反应器中孵育细胞的整个期间中连续地向生物反应器加入细胞培养基，或在所述孵育期间内一次或几次地加入细胞培养基——在这种情况下所述细胞培养基是补料培养基，

其中补料培养基的pH小于8.5，并且包含酪氨酸和/或半胱氨酸的至少一种无机酯衍生物。

优选地，补料培养基包含浓度10至50mmol/l，优选15至30mmol/l的酪氨酸和/或半胱氨酸的至少一种无机酯衍生物。

附图简述

图1示出了用于生产(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的反应方案。进一步的细节可见于实施例1。

图2示出了用于生产(S)-2-氨基-3-(4-磺基氧基-苯基)-丙酸的反应方案。进一步的细节可见于实施例2。

图3和4示出了使用根据本发明的细胞培养基的分批细胞生长实验。进一步的细节可于见实施例5和6。

图5和6示出了补料分批细胞培养实验的结果，其中使用根据本发明的优化的补料分批和(S)-2-氨基-3-(4-磺基氧基-苯基)-丙酸盐。详细信息可见于实施例7。

图7和8示出了补料分批细胞培养实验的结果，其中使用根据本发明的优化的补料分批和(S)-2-氨基-3-(4-磺基氧基-苯基)-丙酸盐和(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基-丙酸钠盐。详细信息可见于实施例8。

发明内容

根据本发明的无机酯衍生物是一种产品，例如可获自无机含氧酸和酪氨酸或半胱氨酸的缩合。无机含氧酸的实例为，例如磷酸、硫酸、硝酸和硼酸。优选的是衍生自硫酸或磷酸的无机酯衍生物。因而，无机酯衍生物是无机含氧酸和半胱氨酸或酪氨酸的酯及它们的盐。合适的酪氨酸的无机酯衍生物的实例是(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸以及(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的一钠盐、二钠盐、一钾盐、二钾盐、钙盐和镁盐。

优选的无机酯衍生物也可以由下面的式I和II表示：

其中R是

或

且X和Y彼此独立地为H,Li,Na,K,1/2Ca,1/2Mg，优选H，Na，K。术语丙酸(propanoic acid)也可以用于代替术语丙酸(propionic acid)。

根据本发明的细胞培养基是维持和/或支持细胞在体外生长的成分的任何混合物。其可以是复杂培养基或化学成分确定的培养基。细胞培养基可包括维持和/或支持细胞在体外生长所必需的所有成分，或仅包括一些成分而其它成分可以分开加入。根据本发明的细胞培养基的实例为包含维持和/或支持细胞体外生长所必需的所有成分的完全培养基、以及培养基补充剂或补料。在一个优选的实施方案中，细胞培养基是完全培养基或补料培养基。完全培养基也被称为基础培养基，通常有6.8和7.8之间的pH。补料培养基优选具有低于8.5的pH。

典型地，根据本发明的细胞培养基用于维持和/或支持细胞在生物反应器中的生长。

补料或补料培养基是一种细胞培养基，其不是支持细胞培养的初始生长和生产的基础培养基，其是在后期加入以防止营养物耗竭和维持生产期的培养基。与基础培养基相比，补料培养基可具有更高浓度的一些成分。例如，一些成分，诸如营养物,包括氨基酸或碳水化合物，可以以基础培养基中浓度的约5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至约1000倍存在于补料培养基中。

哺乳动物细胞培养基是维持和/或支持哺乳动物细胞体外生长的成分的混合物。哺乳动物细胞的例子是人或动物细胞，优选CHO细胞、COS细胞、I VERO细胞、BHK细胞、Ak-1细胞、SP2/0细胞、L5.1细胞、杂交瘤细胞或人细胞。

化学成分确定的细胞培养基是不包含任何化学成分不明确的物质的细胞培养基。这意味着，用于培养基中的所有化学品的化学组成是已知的。化学成分确定的培养基不包含任何酵母、动物或植物组织；它们不包含饲养细胞、血清、提取物或消化物、或可向培养基提供化学成分不甚明确的蛋白质的其它成分。化学成分不明确或不甚明确的化学成分是化学组成和结构未知的那些成分，其可以以不同的组成存在、或只有通过巨大的实验努力——相当于评估蛋白质(如白蛋白或酪蛋白)的化学组成和结构的巨大努力——才能明确。

粉末细胞培养基或干粉培养基通常是由研磨方法或冷冻干燥方法所得的细胞培养基。这意味着，粉末细胞培养基是粒状的、颗粒培养基–而不是液体培养基。术语“干粉”可以与术语“粉末”互换使用；然而，本文中“干粉”仅指该颗粒物的总体外观，除非另有说明，并不意在表示该物质完全不含复合的或聚结的溶剂。

使用根据本发明的培养基培养的细胞可以是原核细胞如细菌细胞、或真核细胞如植物或动物细胞。细胞可以是正常细胞、永生化细胞、患病细胞、转化的细胞、突变细胞、体细胞、生殖细胞、干细胞、前体细胞或胚胎细胞，其中任何一种都可以是建立的或转化的细胞系或可以从天然来源获得。

颗粒尺寸是指颗粒的平均直径。颗粒直径可以通过在硅油中的激光散射而确定。

惰性气氛可以通过将惰性气体充入相应的容器或装置产生。合适的惰性气体是稀有气体如氩气或优选氮气。这些惰性气体是不反应的，并可以防止不希望的化学反应发生。在根据本发明的方法中，产生惰性气氛指，如通过引入液氮或氮气，使氧浓度降低到10％(体积/体积)绝对值以下。

不同类型的粉碎机是本领域技术人员所熟知的。

针棒式粉碎机，也称为离心冲击式粉碎机，其通过高速旋转盘上突出的销棒提供破碎能量以粉碎固体。针棒式粉碎机由例如Munson Machinery(USA),Premium Pulman(India)或Sturtevant(USA)出售。

喷射式粉碎机使用压缩气体来加速颗粒，造成它们在工艺室中互相碰撞。喷射式粉碎机由例如Sturtevant(USA)或PMT(Austria)出售。

由Fitzpatrick(USA)销售的中碎机使用带刀片的旋转器进行粉碎。

持续运行的方法是非分批运行的方法。如果研磨方法持续运行，则意味着培养基成分在一定期间中被不停地稳定地补加入粉碎机中。

根据本发明的细胞培养基，特别是完全培养基，典型地包括至少一种或多种糖成分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲成分、一种或多种辅因子和一种或多种核酸成分。

培养基还可包括丙酮酸钠、胰岛素、植物蛋白、脂肪酸和/或脂肪酸衍生物、和/或普流尼克酸(pluronic acid)、和/或表面活性成分，如化学制备的非离子表面活性剂。合适的非离子表面活性剂的一个例子是以伯羟基团封端的双官能嵌段共聚物表面活性剂，也称为泊洛沙姆(poloxamer)，例如可从BASF,Germany以商品名普流尼克购得。

糖成分均是单或二糖，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(单糖的例子)，或蔗糖、乳糖或麦芽糖(二糖的例子)。

根据本发明的氨基酸的实例是酪氨酸，蛋白质性氨基酸(proteinogenicamino acids)，特别是必需氨基酸，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸，以及非蛋白质性氨基酸如D-氨基酸。

酪氨酸指L-或D-酪氨酸，优选L-酪氨酸。

半胱氨酸指L-或D-半胱氨酸，优选L-半胱氨酸。

维生素的实例是维生素A(视黄醇、视黄醛、各种类视黄醇、和四种类胡萝卜素)、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸，烟酰胺)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸、甲酰四氢叶酸)、维生素B12(氰钴胺素、羟钴胺素、甲基钴胺素)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D(麦角钙化醇、胆钙化醇)、维生素E(生育酚、生育三烯酚)和维生素K(叶绿醌、甲萘醌类)。维生素的前体也包括在内。

盐的实例是含有无机离子如碳酸氢根、钙、氯、镁、磷酸根、钾和钠或微量元素如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V和Zn的成分。实例是硫酸铜(II)五水合物(CuSO₄.5H₂O)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl₂.2H₂O)、氯化钾(KCl)、硫酸亚铁(Ⅱ)、无水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、无水硫酸镁(MgSO₄)、无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、氯化镁六水合物(MgCl₂.6H₂O)、七水硫酸锌。

缓冲剂的实例是CO₂/HCO₃(碳酸)、磷酸、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS和TRIS。

辅因子的实例是硫胺素衍生物、生物素、维生素C、NAD/NADP、钴胺素、黄素单核苷酸及其衍生物、谷胱甘肽、血红素核苷酸磷酸盐和衍生物。

根据本发明的核酸组分是核碱基如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，核苷如胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和胸苷，和核苷酸如单磷酸腺苷或二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。

补料培养基与完全培养基相比可具有不同的组成。它们典型地包括氨基酸、微量元素和维生素。它们还可以包括糖成分，但有时由于生产的原因，糖成分在分开的补料中加入。

合适的补料培养基可以例如包括以下化合物的一种或多种：

L-天冬酰胺一水合物

L-异亮氨酸

L-苯丙氨酸

L-谷氨酸钠一水合物

L-亮氨酸

L-苏氨酸

L-赖氨酸一盐酸盐

L-脯氨酸

L-丝氨酸

L-精氨酸一盐酸盐

L-组氨酸一盐酸盐一水合物

L-甲硫氨酸

L-缬氨酸

L-天门冬氨酸单钠一水合物

L-色氨酸

氯化胆碱

肌醇

烟酰胺

D(+)泛酸钙

盐酸吡哆醇

氯化硫胺素盐酸盐

微粉化的维生素B12(氰钴胺素)

生物素

叶酸

核黄素

无水硫酸镁

硫酸铜(II)五水合物

七水硫酸锌

1,4-二氨基丁烷二盐酸盐

七钼酸铵四水合物

硫酸镉水合物

氯化锰(Ⅱ)四水合物

氯化镍(II)六水合物

偏硅酸钠

偏钒酸钠

氯化锡(II)二水合物

亚硒酸钠(约45％SE)

磷酸二氢钠一水合物

柠檬酸铁(Ⅲ)铵(约18％，FE)

根据本发明，冷冻指冷却到0℃以下的温度。

本发明的一个要点在于提供可容易地溶解在合适溶剂中的粉末细胞培养基，其中仅通过将粉末和溶剂混合就可以使所述粉末溶解，并产生具有期望的均匀浓度的培养基成分的液体细胞培养基，如完全培养基、培养基补充剂、培养基亚组(medium subgroup)、或补料。

粉末细胞培养基的简单溶解常因在水性溶剂中具有差的溶解性和/或稳定性的物质如酪氨酸或半胱氨酸而变得复杂。例如，L-酪氨酸在25℃温度的水中的溶解度是0.4g/l。这意味着约0.4g L-酪氨酸可溶于1升水中。但在细胞培养基中所需的酪氨酸浓度往往更高。半胱氨酸在有氧条件下趋向于形成二聚体。这些二聚体被称作胱氨酸。此外，已知半胱氨酸可以与常存在于细胞培养基中的金属如铜或铁形成有毒副产物。存在于细胞培养基中的半胱氨酸或胱氨酸可由根据本发明的无机酯衍生物替代，这些无机酯衍生物不形成二聚体或有毒的副产物。

业已发现，一方面酪氨酸和/或半胱氨酸的磷酸化和/或磺化衍生物典型地在水溶液中具有较高的溶解度，而另一方面其可作为酪氨酸和/或半胱氨酸/胱氨酸的替代物，并与天然氨基酸酪氨酸和半胱氨酸同样合适作为细胞培养基成分。这意味着，例如，其中L-酪氨酸被替代为L-酪氨酸的一种或多种无机酯衍生物的细胞培养基，与仅包含L-酪氨酸的培养基，显示出相当的细胞培养性能。

酪氨酸和半胱氨酸的一些无机酯衍生物是本领域已知的。在肽和蛋白质中，酪氨酸的磷酸化在多种细胞过程中具有显著作用，其导致许多蛋白酶的开启和关闭从而改变它们的功能和活性。

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸一钠盐具有CAS号146900-49-4。R.H.Plimmer Biochemical Journal(1941),35,461-469页，公开了(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的合成以及其1:1钙盐的合成。

在本文中公开了(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的其它新衍生物的合成和特性，如(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的二钠盐、二钾盐、一钾盐、2:1钙盐和镁盐。

根据本发明的合适酪氨酸磷酸化衍生物是已经在酚OH基团被磷酸化的那些，如(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸或其盐。在一个特别优选的实施方案中，酪氨酸的磷酸化衍生物是(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的盐。

根据本发明的合适酪氨酸磺化衍生物是已经在酚OH基团被磺化的那些，如(S)-2-氨基-3-(4-磺基氧基-苯基)-丙酸或其盐。在一个特别优选的实施方案中，酪氨酸的磺化衍生物是(S)-2-氨基-3-(4-磺基氧基-苯基)-丙酸的盐。

根据本发明合适的半胱氨酸磷酸化衍生物是已经在半胱氨酸的SH基团被磷酸化的那些，如(S)-2-氨基-3-膦酰基硫烷基-丙酸或其盐。

根据本发明合适的半胱氨酸磺化衍生物是已经在半胱氨酸的SH-基团被磺化的那些，如(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基-丙酸或其盐。2-氨基-3-磺基硫烷基-丙酸(propanoic acid)(也称为(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基丙酸(propanoic acid)、S-磺基半胱氨酸或半胱氨酸-S-硫酸)和其盐的合成被公开在例如I.H.Segel和M.J.Johnson,Analytical Biochemistry 5,330-337和J.S.Church,D.J.Evans,Spectrochimica Acta Part A 69(2008)256-262。钠盐进一步地可从Bachem,Switzerland购得。

合适的盐是碱金属或碱土金属盐，例如锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，优选的是钠、钾盐和游离酸，最优选的是钠盐。

在酪氨酸的无机酯衍生物的情况下，(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸-二钠盐显示出非常良好的溶解性。

可通过任何方法生成酪氨酸和半胱氨酸的无机酯衍生物，例如，酶促或化学合成。优选酪氨酸的磷酸化衍生物通过如下方式制备：在五氧化二磷存在下使酪氨酸与磷酸反应。然后所得的(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸可以与合适的碱反应得到相关盐，所述合适的碱如氢氧化钠、乙醇钠、氢氧化钾等。此合成的反应方案示于图1。

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的溶解度比酪氨酸高(见实施例3中的表1)。为了使酪氨酸或半胱氨酸衍生物的溶解度增加得甚至更多，可通过使衍生物与如上所述合适的碱反应而形成盐。例如(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的钠盐具有更高的溶解度(参见实施例3中的表1)。

根据本发明的细胞培养基可含有酪氨酸和/或半胱氨酸的一种或多种无机酯衍生物，例如，(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的一钠盐和二钠盐的混合物。

已经发现，在完全培养基中使用酪氨酸的无机酯衍生物的情况下，有利的是向培养基组合物中加入少量酪氨酸。这可能是由于这样的事实，即，一些细胞显示不摄取酪氨酸的无机酯衍生物。酪氨酸的无机酯衍生物需要在细胞外由磷酸酶转化为游离酪氨酸。典型地，足量的磷酸酶可以在细胞培养开始2至5天后获得。

在新添加的补料培养基中使用酪氨酸的无机酯衍生物时，这意味着，对于细胞已经在含有酪氨酸的培养基中生长2-5天以上的细胞培养物，没有必要向该新添加的补料培养基中添加酪氨酸。

因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的完全培养基包含酪氨酸的至少一种无机酯衍生物和另外地5％至40％(w/w)酪氨酸。

使用半胱氨酸的无机酯衍生物时，没有发现这种效果。对于使用半胱氨酸的无机酯衍生物，加入半胱氨酸是没有必要的。半胱氨酸的无机酯衍生物可在任何情况下被用作半胱氨酸或胱氨酸的充分替代物。

此外，出乎意料的是，半胱氨酸的无机酯衍生物显示对细胞的生长和生产力具有积极作用。典型地，用含有半胱氨酸的无机酯衍生物的培养基和补料培养的细胞显示延长的生长。当使用半胱氨酸的无机酯衍生物时，细胞随时间的存活率比使用半胱氨酸的细胞培养物更高。

另外，与使用半胱氨酸的细胞培养相比，使用半胱氨酸的无机酯衍生物时重组蛋白质的生产增加。

半胱氨酸无机酯衍生物的积极效果可以通过使用与通常用于细胞培养基的半胱氨酸和/或胱氨酸的量相当的量得到。

本发明的粉末细胞培养基优选通过混合所有成分和研磨它们而生产。成分的混合是通过研磨制备干粉细胞培养基领域中的技术人员已知的。优选地，所有成分彻底混合以使混合物的所有部分具有几乎相同的组成。组合物的均匀性越高，所得到的培养基在导致均质细胞生长方面将具有越好的质量。

研磨可使用任何类型的适合于生产粉末细胞培养基的粉碎机进行。典型的例子有球磨机、针棒式粉碎机、中碎机或喷射式粉碎机。优选的是针棒式粉碎机、中碎机或喷射式粉碎机，非常优选的是针棒式粉碎机。

本领域技术人员知道如何使用这些粉碎机。

一个具有圆盘直径约40cm的大型设备粉碎机，例如在针棒式粉碎机的情况下，典型地每分钟运行1-6500转，优选每分钟1-3000转。

可在标准研磨条件下进行研磨，得到颗粒大小为10至300μm，最优选25至100μm之间的粉末。

优选，进行研磨的混合物的所有成分都是干燥的。这意味着，如果其包含水，其仅包括结晶水，但不超过10％、优选不超过5％、最优选不超过2％重量的未结合或未配位的水分子。

在一个优选的实施方案中，研磨是在惰性气氛中进行。优选的惰性保护气体是氮气。

在另一个优选的实施方案中，混合物的所有成分在研磨之前冷冻。研磨之前各成分的冷冻可通过确保成分冷却至0℃以下，最优选-20℃以下温度的任何方法完成。在一个优选的实施方案中，冷冻用液氮完成。这意味着用液氮处理成分，例如在将成分加入到粉碎机之前将液氮倾入存储成分的容器中。在一个优选的实施方案中，容器是进料器。如果容器是进料器，优选在所述进料器的引入成分的一侧或接近该侧引入液氮。

典型地用液氮处理成分2至20秒。

优选，对成分进行冷却，以便进入粉碎机的所有成分都在0℃以下、最优选-20℃以下的温度。

在一个优选的实施方案中，将所有成分放在一个容器中，从该容器将混合物转移到进料器，最优选转移到计量螺旋进料器。在进料器中有时成分可以进一步混合——取决于进料器的类型——和额外的冷却。然后将冷冻的混合物从进料器转移到粉碎机，从而使在粉碎机中被研磨的混合物优选地仍然具有低于0℃的温度，更优选低于-20℃。

混合时间(指成分的混合物在进料器中停留的时间)通常为1分钟以上，优选15至60分钟。

计量螺旋进料器，也被称为“dosage snail”，通常以每分钟10至200转的速度运行，优选以每分钟40至60转运行。

粉碎机的温度通常保持在-50至+30℃之间。在一个优选的实施方案中，温度保持在约10℃。

研磨期间优选氧水平低于10％(v/v)。

该方法例如可分批或连续运行。在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法连续地进行，其中在一定时间内不停地向进料器中装入成分的混合物以冷却、并不停地将冷却的混合物从进料器送入粉碎机中。

对于经研磨的粉末培养基的使用，将溶剂，优选水(最尤其是蒸馏水和/或去离子水或纯化水或注射用水)或水性缓冲液，加入到培养基，混合成分，直到培养基完全溶解于溶剂。

溶剂也可包含盐水、提供合适的pH范围(通常pH 1.0至pH 10.0之间的范围)的可溶性酸或碱离子、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、和醇或其它极性有机溶剂。

另外，也可以向细胞培养基和溶剂的混合物中添加其它物质，如调节pH的缓冲剂物质、胎牛血清、糖等。然后将得到的液体细胞培养基与待生长或维持的细胞接触。

尽管pH低于8.5且含有较高浓度酪氨酸的培养基组合物(例如10g/l L-酪氨酸)当与溶剂混合时由于未溶解的酪氨酸而会呈现浑浊，但使用相同浓度的酪氨酸无机酯衍生物的根据本发明的细胞培养基给出澄清的溶液。

本发明还进一步涉及用于培养细胞的方法，所述方法通过如下实施

a)提供生物反应器，

b)将待培养的细胞与根据本发明的细胞培养基混合，

c)孵育步骤b)的混合物。

生物反应器可以是可进行细胞培养的任何容器或罐。孵育通常是在合适的条件完成，如合适的温度等。本领域技术人员将明了用于支持或维持细胞生长/培养的合适孵育条件。

已发现，本发明也非常适用于制备补料培养基。由于L-酪氨酸和L-半胱氨酸利用度的限制——特别是在补料培养基所需的浓度时——这两种分子通常在碱性pH 11.0-11.5制备为原液。该pH对总体生物药的生物生产方法产生负面影响。在大规模生物反应器中的混合时间以及该碱性pH值一起对细胞的营养供给造成负面影响，并在一定程度上通过暴露于极端碱性pH值而加速细胞死亡。

这导致细胞内的蛋白质释放到上清液中。这些释放的蛋白质粘附到完整细胞上，然后完整细胞彼此粘附并形成聚集体。这些聚集体由于增大的的质量惯性而被破坏，总体的生物生产工艺开始跳漏。降低端速(tip speed)不是选项，因为无论如何这些方法都被调节到接近供氧限。

因此，需要一种补料培养基，其在一次补料中以高浓度包含所有需要的成分。此外，补料的pH值不应该负面影响细胞培养。

已发现，L-酪氨酸和L-半胱氨酸的无机酯衍生物具有改进的溶解性和/或稳定性，可分别代替L-酪氨酸和L-半胱氨酸用于高浓缩的补料培养基中，且没有任何负面影响，有时甚至对pH低于8.5下的细胞生长和/或生产力有积极作用。

本发明因此还涉及一种补料培养基，其是粉末培养基的形式、或者在溶解后是液体培养基的形式。

得到的液体培养基包含酪氨酸和/或半胱氨酸的无机酯衍生物，浓度在5至40mmol/l之间，优选为10至30mmol/l之间，优选pH值为8.5或更低。在一个优选的实施方案中，pH为6.8和8.4之间。

本发明还涉及用于在生物反应器中培养细胞的补料分批方法，其通过如下实施：

-向生物反应器中加入细胞和水性细胞培养基，

-在生物反应器中孵育细胞，

-在生物反应器中孵育细胞的整个期间中连续地向生物反应器中加入细胞培养基，或在所述孵育期间内一次或多次加入细胞培养基，在这种情况下所述培养基是补料培养基，

其中优选该补料培养基具有小于8.5的pH，并且包含酪氨酸和/或半胱氨酸的至少一种无机酯衍生物。补料培养基典型地包含溶解在溶剂中的100至150g/l固体成分。

已发现，通过使用酪氨酸和/或半胱氨酸的无机酯衍生物，可获得包含高浓度(总浓度100至150g/l之间)的所有必需补料成分的补料培养基。与需要将两种或更多种不同补料培养基进料到生物反应器中的已知方法不同，本发明提供了一种培养基和方法，其使得能够使用包含高浓度的所有成分的一种补料培养基。另外，根据本发明的补料培养基的pH通常低于8.5。由于L-酪氨酸和L-半胱氨酸在细胞培养基和补料中的利用度限制，在本领域中，这两种分子通常被制备为在碱性pH 11.0-11.5下的原液。该pH对总体生物药生物生产方法产生负面影响。在大规模生物反应器中的混合时间以及该碱性pH值一起地对细胞的营养供给造成负面影响，并在一定程度上通过暴露于极端碱性pH值而加速细胞死亡。当使用根据本发明的酪氨酸和/或半胱氨酸的无机酯衍生物时，补料培养基的pH可保持在低于8.5，而同时补料培养基中可以存在10至13mM酪氨酸和/或半胱氨酸的无机酯衍生物，总浓度介于100至150克/升之间。

因此，在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中，在孵育期间连续地或在所述期间内一次或几次地向生物反应器加入的补料培养基可以总是具有相同的组成。

进一步通过以下附图和实施例举例说明本发明，但本发明不限于此。

以上和以下引用的所有申请、专利、和出版物以及2012年11月14日提交的对应EP申请EP 12007711.0，以其全部公开特此并入作为参考。

实施例

下列实施例代表本发明的实际应用。

实施例1

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸和其盐的合成

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸根据文献(P.F.Alewood,R.B.Johns,R.M.Valerio,Synthesis 1983,30)从L-酪氨酸开始合成，随后转化为其盐。图1显示了二钠盐的合成反应方案。

改变碱的化学计量和/或阳离子可分别产生一、二或三重带电荷的酪氨酸膦酸盐或不同的盐。

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸

结构:

合成：通过将100g(0.55mol)L-酪氨酸溶解于400g(3.48mol)正磷酸中，随后在冷却下分5份加入309g(2.13mol)五氧化二磷，进行反应。在80℃搅拌该粘稠溶液20小时，然后冷却至40℃，并通过加入400mL水而水解。将溶液在80℃再搅拌一小时，而后在60℃缓慢加入3.8L正丁醇。继续冷却到约3℃，将所得悬浮液过滤。将得到的无色晶体连续用水，乙醇和甲基叔丁基醚洗涤，然后在真空中于50℃干燥。

分析数据：1H-NMR(D₂O,400MHz):δ＝2.94(dd,1H),3.13(dd,1H),3.79(dd,1H),7.08-7.18(m,4H)。

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸一钠盐

结构:

分析数据:1H-NMR(D₂O,400MHz):δ＝3.03(dd,1H),3.21(dd,1H),3.91(dd,1H),7.11-7.16(m,2H),7.20-7.25(m,2H).ICP-OES(wt-％):测定值8.3％,计算值8.1％。

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸二钠盐

结构

合成:50g(191mmol)(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸溶解在146mL(402mmol)EtOH中的NaOEt溶液(21wt％)中，而后加入12.5mL水。无色浆液回流一小时，冷却至0℃，并过滤。用乙醇洗涤无色产物，然后在50℃真空干燥。

分析数据:1H-NMR(D₂O,400MHz):δ＝4.18(dd,1H),4.46(dd,1H),5.12(dd,1H),8.32-8.42(m,4H).ICP-OES(wt-％):测定值14.1％,计算值.15.1％。

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸一钾盐

结构：

分析数据:1H-NMR(D₂O,400MHz):δ＝3.08(dd,1H),3.29(dd,1H),3.97(dd,1H),7.16–7.22(m,2H),7.25–7.31(m,2H).ICP-OES(wt-％):测定值12.6％,计算值13.1％。

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸2:1钙盐

结构:

分析数据:1H-NMR(D₂O,400MHz):δ＝3.08(dd,1H),3.28(dd,1H),3.97(dd,1H),7.16–7.22(m,2H),7.25–7.31(m,2H).ICP-OES(wt-％):测定值7.2％,计算值7.2％。

(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸2:1镁盐

结构:

分析数据:1H-NMR(D₂O,400MHz):δ＝3.07(dd,1H),3.29(dd,1H),3.97(dd,1H),7.16–7.22(m,2H),7.25–7.31(m,2H).ICP-OES(wt-％):测定值4.3％,计算值4.5％。

由于在相同电荷但溶剂分离的酪氨酸磷酸盐之间在¹H-NMR谱上具有谱相似性，故使用ICP-OES光谱法明确地确定相应的阳离子。

实施例2

(S)-2-氨基-3-(4-磺基氧基-苯基)-丙酸和其盐的合成

(S)-2-氨基-3-(4-磺基氧基-苯基)-丙酸可以根据文献(*S.Futaki,T.Taike,T.Yagami,T.Ogawa,T.Akita,K.Kitagawa,J:Chem.Soc.Perkin Trans.I 1990,1739.)从L-酪氨酸合成,随后可以转化为其盐。图2示出钠盐的合成反应方案。

改变碱的化学计量和/或阳离子可分别产生一或二重带电荷的酪氨酸磺酸盐或不同的盐。

实施例3

在水中的溶解度

在20、25和30℃测试了L-酪氨酸(化合物D1)、(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸(化合物D2)、(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸钠盐(化合物D3)和(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸二钠盐(化合物D4)在水中的溶解度。表1示出了结果。

化合物	在20℃的溶解度	在25℃的溶解度	在30℃的溶解度
				D1	0.03％	0.04％	0.04％
D2	0.7％	1.0％	0.8％
				D3	5，5％	5，3％	11，4％
D4	9，8％	10，1％	9，2％

实施例4

在复杂细胞培养基中的溶解度

Dulbecco氏改进的Eagle培养基，也被称为DMEM，是常用于动物细胞生长的培养基。DMEM的成分是(ml/l)：

无机盐：

氨基酸：

维生素：

制备相同的培养基组合物，但L-酪氨酸2Na·2H₂O被等摩尔比的(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸二钠盐替代。

对于这两种培养基组合物，根据本发明的方法混合所有成分并研磨，包括“dosage snail”和针棒式粉碎机。

将所得粉末细胞培养基在25℃溶解于去离子水中。混合10分钟(在有搅拌器的烧瓶中)后测量溶解度。用磷酸化的酪氨酸衍生物制备的培养基组合物是澄清溶液，然而含有L-酪氨酸的组合物不清澈，显示浑浊。

细胞培养实验

实施例5

该实验的数据示于图3。在分批实验中，在化学成分确定的培养基中，酪氨酸被PTyr盐替代。pTyr指(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸盐。如果所用的PTyr浓度与培养基中酪氨酸的浓度相同，那么细胞不生长(未示出)。如果以4.5mM的浓度溶解在CDM中(相对于对照中的1mM)，细胞能够生长，显示出与对照相比甚至更高的最大活细胞密度和整体延长的生长(2天)。后期分析表明，初始生长可以通过来自PTyr衍生物合成的游离酪氨酸(合成杂质5％(w/w))而实现。延长的生长可能归因于在PTyr代谢裂解为游离酪氨酸和磷酸之后PTyr的直接作用。

实施例6

该实验的数据示于图4。在分批实验中，在化学成分确定的培养基中，半胱氨酸被S-磺基半胱氨酸钠盐(相等浓度)替代。作为基础的CDM粉末被除去了半胱氨酸和胱氨酸，并在重构期间补充半胱氨酸作为对照条件(1.5和3mM)或补充S-磺基半胱氨酸钠盐作为测试条件(1.5和3mM)。当培养在含有半胱氨酸或S-磺基半胱氨酸钠盐的化学成分确定的培养基中时细胞表现出可比的生长，表明S-磺基半胱氨酸钠盐可被用作半胱氨酸的替代。

实施例7

图5和6示出在补料分批方法中随着时间的活细胞密度和IgG浓度。重组CHO细胞生长在完全化学成分明确的基本培养基中，在第3，5，7和9天添加pH 7.0的含有磷酸-Tyr盐的补料(加入的％v/v为3％；6％；6％；6％)。条件1对应PTyr二钠盐，条件2对应PTyr钾盐，条件3对应PTyr镁盐，其以30mM的浓度溶解在中性pH补料中。在这些情况下，再将半胱氨酸作为pH 11的单独补料加入。

该方法在30mL旋管中在37℃，5％CO2，320rpm搅拌进行。作为对照，根据本领域的现有技术，酪氨酸2Na+和半胱氨酸溶解在单独的pH11的补料中，并在第3；5；7；9天以0.3％，0.6％，0.6％和0.6％(v/v)加入。因此，主补料不包含任何半胱氨酸和酪氨酸，其如上所述加入。

每天测定葡萄糖浓度，并相应地调整以保持其浓度>2g/L。

可以看出，3种磷酸Tyr盐(钠，钾，镁)可以在高度浓缩的中性补料中用于补料分批方法中，对生长或滴度没有负面影响，从而简化了整个工艺。

实施例8

图7和8示出在补料分批方法中随着时间的活细胞密度和IgG浓度。重组CHO细胞生长在完全化学成分明确的基本培养基和含有S-磺基半胱氨酸和PTyr 2Na+的pH7.0补料中。在第3；5；7；9和14天添加补料(添加的％v/v是3％；6％；6％；6％；3％)。该方法在1.2L生物反应器中在37℃、pH 7.0，50％溶氧，140rpm搅拌进行。根据本领域技术状况，作为对照，酪氨酸2Na+和半胱氨酸溶解在单独的pH11的补料中，并在第3；5；7；9；14天以0.3％，0.6％，0.6％，0.6％，0.3％(v/v)加入。每天测定葡萄糖浓度，并相应地调整以保持其浓度>2g/L。

可以看出，主要补料中使用S-磺基半胱氨酸(在这里与PTyr 2Na+组合)诱导与对照相比延长的生长，并显示滴度显著增加。

Claims

1.细胞培养基，其包含酪氨酸和/或半胱氨酸的无机酯衍生物。

2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基包含酪氨酸和/或半胱氨酸的磷酸化和/或磺化衍生物。

3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基包含式I和II的成分中的一种或多种、或其盐:

其中R是膦酸酯或磺酸酯。

4.根据权利要求1至3的一项或多项所述的细胞培养基，其特征在于酪氨酸的无机酯衍生物是(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸或其盐。

5.根据权利要求1至4的一项或多项所述的细胞培养基，其特征在于酪氨酸的无机酯衍生物是(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸二钠盐。

6.根据权利要求1至5的一项或多项所述的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基是干粉培养基。

7.根据权利要求1至5的一项或多项所述的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基是补料培养基。

8.根据权利要求1至5的一项或多项所述的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基是液体培养基，其具有8.5或更小的pH，并包含酪氨酸和/或半胱氨酸的至少一种无机酯衍生物。

9.用于生产根据权利要求1-8的一项或多项的细胞培养基的方法，其通过如下实施:

b)对步骤a)的混合物进行研磨。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于步骤b)在针棒式粉碎机、中碎机或喷射式粉碎机中进行。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于来自步骤a)的混合物在研磨之前冷却至温度0℃以下。

12.(S)-2-氨基-3-(4-膦酰基氧基-苯基)-丙酸的二钠盐、二钾盐、一钾盐、2:1钙盐和镁盐。

13.用于培养细胞的方法，其通过如下实施：

a)提供生物反应器，

b)将待培养的细胞与根据权利要求1-8的一项或多项的细胞培养基混合，

c)孵育步骤b)的混合物。

14.用于在生物反应器中培养细胞的补料分批方法，其通过如下实施：

-将细胞和水性细胞培养基进料到生物反应器中，

-在生物反应器中孵育细胞，

-在生物反应器中孵育细胞的整个期间中连续地向生物反应器加入细胞培养基，或在所述孵育期间内一次或多次地加入细胞培养基，在这种情况下所述细胞培养基是补料培养基，

其中所述补料培养基具有小于8.5的pH，并且包含酪氨酸和/或半胱氨酸的至少一种无机酯衍生物。

15.根据权利要求14所述的补料分批方法，其特征在于补料培养基包含浓度为10至30mmol/l之间的酪氨酸和/或半胱氨酸的至少一种无机酯衍生物。