CN110799639A - 含有核黄素衍生物的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供一种用于对iPS细胞、ES细胞等多能干细胞进行增殖培养的培养基，特别是，提供一种不会发生完全培养基的保存导致的劣化的细胞增殖用培养基，并且提供制造该培养基的方法。本发明提供一种含有核黄素衍生物的干细胞增殖用培养基等。

Description

含有核黄素衍生物的培养基
技术领域
本发明涉及保存稳定性、尤其是作为完全培养基以液体形式保存时的稳定性优异的干细胞、特别是多能干细胞增殖用的培养基及其制造方法等。
发明背景
使用iPS细胞、ES细胞等干细胞的再生医疗中，设想有效地使这些细胞增殖、其后分化成目标组织、进行移植。以细胞的增殖为目的，报告或市售有各种培养基(非专利文献1～3)。其大多是由放入了各种成分的多种瓶子构成，混合后使用。混合而得的物质通常被称为“完全培养基”。
多种瓶子包括例如由氨基酸、维生素、矿物质、缓冲剂等构成的基础培养基、由蛋白质等构成的补充剂，补充剂根据种类进一步分别容纳在2个至2个以上瓶子中。它们作为冷藏品或冷冻品供应。
一般，干细胞增殖用的培养基是在使用时将基础培养基和补充剂(一种或多种补充剂)混合制成完全培养基后以液体形式保存。完全培养基通常可以保存2周左右。然而，实际上，使用保存了2周的完全培养基时，存在细胞不生长的情况，而且，其原因还不清楚。
再生医疗中，能够稳定地培养、供应细胞的系统是不可或缺的，需要开发对应的培养基和该培养基的制造方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Nakagawa M.,等,Sci Rep.2014；4:3594
非专利文献2:Ludwig T.E.,等,Nat.Biotechnol.,2006；24:185
非专利文献3:Chen,G.,等,Nat Methods,2011；8:424
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种用于对细胞、特别是iPS细胞、ES细胞等多能干细胞进行增殖培养的培养基，特别是，目的在于提供一种在液体状态下稳定性高的细胞增殖用培养基和制造该培养基的方法等。
用于解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明人等对培养基组成进行了各种变更，详细地对何种成分是培养基保存稳定性劣化的原因进行了研究。其结果是，确定了虽然核黄素(RFV)对于细胞的生长而言是必需的，但也是液体保存时培养基的劣化的原因。因此对RFV的替代成分进行了深入研究，结果发现，通过在培养基组成中不使用RFV、而是使用黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)、核黄素四丁酸酯(RTB)等核黄素衍生物(RFV衍生物)，能够不使培养基劣化地保存，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
[1]一种干细胞增殖用培养基，其含有核黄素衍生物。
[2]上述[1]所述的培养基，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
[3]上述[1]或[2]所述的培养基，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物(优选为黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物)。
[4]上述[1]～[3]中任一项所述的培养基，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
[5]上述[1]～[4]中任一项所述的培养基，其不含核黄素。
[6]一种干细胞增殖用培养基，其特征在于，其为将含有氨基酸、维生素、矿物质和缓冲剂的基础培养基以及一种或多种补充剂混合而成的培养基，核黄素衍生物包含在基础培养基中。
[7]上述[6]所述的培养基，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
[8]上述[6]或[7]所述的培养基，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物(优选为黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物)。
[9]上述[6]～[8]中任一项所述的培养基，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
[10]上述[6]～[9]中任一项所述的培养基，其不含核黄素。
[11]一种干细胞增殖用培养基的稳定剂，其含有核黄素衍生物。
[12]上述[11]所述的稳定剂，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
[13]上述[11]或[12]所述的稳定剂，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物(优选为黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物)。
[14]上述[11]～[13]中任一项所述的稳定剂，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
[15]一种使干细胞增殖用培养基稳定的方法，其特征在于，添加核黄素衍生物。
[16]上述[15]所述的方法，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
[17]上述[15]或[16]所述的方法，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物(优选为黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物)。
[18]上述[15]～[17]中任一项所述的方法，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
[19]一种干细胞增殖用培养基的制造方法，其特征在于，添加核黄素衍生物。
[20]上述[19]所述的方法，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
[21]上述[19]或[20]所述的方法，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物(优选为黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物)。
[22]上述[19]～[21]中任一项所述的方法，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
[23]一种干细胞增殖用培养基的制造方法，其特征在于，将含有核黄素衍生物、氨基酸、维生素、矿物质和缓冲剂的基础培养基以及一种或多种补充剂混合。
[24]上述[23]所述的方法，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
[25]上述[23]或[24]所述的方法，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物(优选为黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物)。
[26]上述[23]～[25]中任一项所述的方法，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
[27]一种干细胞的培养方法，其特征在于，在上述[1]～[10]中任一项所述的培养基中培养。
[28]一种干细胞的制造方法，其特征在于，在上述[1]～[10]中任一项所述的培养基中培养。
[29]一种干细胞增殖用培养基，其含有核黄素衍生物、氨基酸、维生素、矿物质、缓冲剂和一种或多种补充剂。
[30]上述[29]所述的培养基，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
[31]上述[29]或[30]所述的培养基，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物(优选为黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物)。
[32]上述[29]～[31]中任一项所述的培养基，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
[33]上述[29]～[32]中任一项所述的培养基，其不含核黄素。
发明的效果
根据本发明，能够提供一种即使将完全培养基以液体形式保存，在细胞增殖中的性能也不会降低的细胞增殖用培养基。因此，能够高效地获得更多的细胞、特别是ES细胞、iPS细胞等多能干细胞，能够为了用于研究、医疗等而大量供应该细胞。
附图说明
图1为显示对培养iPS细胞时RFV的有效性进行研究的结果的柱状图(Fe2+含有率、Zn2+含有率均为基础培养基的25mol％的情况)。纵轴表示细胞覆盖率(％)，横轴表示RFV浓度。
图2为显示对培养iPS细胞时RFV的有效性进行研究的结果的柱状图(Fe2+含有率、Zn2+含有率均为基础培养基的100mol％的情况)。纵轴表示细胞覆盖率(％)，横轴表示RFV浓度。
图3为显示使用经冷藏保存(2～8℃、2周或5周)的各种培养基培养iPS细胞时的细胞增殖能力(细胞覆盖率)的测定结果的柱状图。上部显示的是冷藏保存2周的培养基的结果，下部显示的是冷藏保存5周的培养基的结果。各培养基使用作为基础培养基(A液)含有RFV的DMEM/F-12或代替RFV含有FMN的Modified DMEM/F-12，作为补充剂(B液和C液)，使用Essential8补充剂(仅B液)或TeSR-E8补充剂(B液和C液)。
图4为显示对Fe2+、Zn2+和核黄素在何种程度上影响培养基的保存稳定性进行研究的结果的柱状图。研究了使用冷藏保存2周的各培养基培养iPS细胞时的细胞增殖能力(细胞覆盖率)。
图5为显示用市售的L-15培养基(含有FMN的培养基)培养iPS细胞时的细胞增殖能力的研究结果的柱状图。制备使用L-15作为基础培养基(A液)、使用Essential8补充剂作为补充剂(B液)的完全培养基，制备当天研究iPS细胞的增殖能力(细胞覆盖率)。上部显示的是使用基质胶作为支撑材料时的结果，下部显示的是使用iMatrix-511作为支撑材料时的结果。作为阳性对照，基础培养基(A液)使用DMEM/F-12。
具体实施方式
以下对本发明进行说明。如无特殊指明，则本说明书中使用的术语均具有本领域通常使用的意思。
本说明书中，“干细胞”的意思是具有自我复制能力和分化/增殖能力的未成熟细胞。干细胞中，根据分化能力，包括多能干细胞(pluripotent stem cell)、多潜能干细胞(multipotent stem cell)、单能干细胞(unipotent stem cell)等亚组。多能干细胞的意思是具有能够分化成构成生物体的全部组织、细胞的能力的细胞。多潜能干细胞的意思是具有能够分化成多种组织、细胞的能力的细胞，但不是全部种类。单能干细胞的意思是具有能够分化成特定的组织、细胞的能力的细胞。
作为多能干细胞，可以列举胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)、利用应力、细胞刺激诱导、筛选的多能干细胞等。通过培养对体细胞的核进行核移植而制作的初期胚而建立的干细胞作为多能干细胞也是优选的(Nature,385,810(1997)；Science,280,1256(1998)；Nature Biotechnology,17,456(1999)；Nature,394,369(1998)；Nature Genetics,22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999)；
Nature Genetics,24,109(2000))。
作为多潜能干细胞，可以列举间充质系干细胞、造血系干细胞、神经系干细胞、骨髓干细胞、生殖干细胞等体性干细胞等。多潜能干细胞优选为间充质系干细胞，更优选为骨髓间充质系干细胞。广义上，间充质系干细胞意思是能够分化成成骨细胞、软骨母细胞和脂肪母细胞等间充质系细胞中的全部或某几者的干细胞或其祖细胞的集合。
作为本发明对象的干细胞优选为多能干细胞，更优选为ES细胞和iPS细胞，特别优选为iPS细胞。
作为本发明对象的干细胞，任意动物来源的干细胞的增殖均可适当使用。可以使用本发明的培养基培养的干细胞例如为小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类、兔等兔目、猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄目、狗、猫等猫目、人、猴、恒河猴、猿、红毛猩猩、黑猩猩等灵长类等来源的干细胞，优选为人源干细胞。
1.干细胞增殖用培养基/干细胞增殖用培养基的制造方法
本发明提供一种含有核黄素衍生物的干细胞增殖用培养基(以下也称为本发明的培养基)及其制造方法。
本发明的干细胞增殖用培养基通常是通过在由氨基酸、维生素、矿物质、缓冲剂等构成的基础培养基中混合蛋白质等辅助成分(也称为补充剂)制成完全培养基而制备/制造的。作为本发明的一个实施方式，可列举通过在基础培养基中混合一种或多种补充剂而得到的完全培养基。使用多种补充剂的情况下，根据补充剂的种类，有时会相互产生不良影响，要求分别收纳(补充剂1和2等)。作为本发明的另一实施方式，可列举通过在基础培养基中混合补充剂1和2而得到的完全培养基。
本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)优选含有核黄素衍生物、氨基酸、维生素、矿物质、缓冲剂、一种或多种补充剂。
本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)也可以是：含有氨基酸、维生素、矿物质、缓冲剂的基础培养基与一种或多种补充剂被封入不同的瓶子等容器中，以它们组合而成的干细胞增殖用培养基试剂盒的形态提供，使用时进行混合制成完全培养基而使用。
本发明中使用的基础培养基的特征在于含有核黄素衍生物，除了以核黄素衍生物作为必需成分以外，与本身公知的能够培养干细胞增殖的培养基、例如DMEM、DMEM/F-12、EMEM、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、GMEM(Glasgow's MEM)、RPMI-1640、α-MEM、Ham's Medium F-12、Ham's Medium F-10、Ham's Medium F12K、Medium 199、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy's 5A、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth's MB752/1、CMRL-1066、Williams'mediumE和Brinster's BMOC-3Medium、Essential8(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)、ReproFF2(ReproCELL公司)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司)、TeSR2(STEMCELL Technologies公司)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司)、StemFit(注册商标)AK(味之素公司)等中使用的基础培养基的组成是同样的，可以基于其组成进行制备。作为优选的基础培养基，可列举通常添加RFV而使用的培养基。
作为本发明中使用的核黄素衍生物，例如含有黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、丁酸核黄素酯(例如核黄素四丁酸酯)、或者它们的盐、它们的水合物等，但不限于此。以下，如无特殊指明，则FMN用于表示包括黄素单核苷酸、其盐、其水合物的意思、FAD用于表示包括黄素腺嘌呤二核苷酸、其盐、其水合物的意思、RTB用于表示包括丁酸核黄素酯(核黄素四丁酸酯)、其盐、其水合物的意思。作为本发明中使用的核黄素衍生物，优选为FAD。盐的形态可以列举酸加成盐、与碱的盐等，优选为不表现细胞毒性、允许作为医疗用品的盐。作为形成那样的盐的酸，可列举例如氯化氢、溴化氢、硫酸、磷酸等无机酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲磺酸或硫酸单甲酯等有机酸，此外，作为形成那样的盐的碱，可列举例如钠、钾、钙等金属的氢氧化物或者碳酸化物、氨等无机碱、乙二胺、丙二胺、乙醇胺、单烷基乙醇胺、二烷基乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等有机碱。上述盐也可以为水合物(含水盐)。作为FAD，优选使用黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物。作为FMN，优选使用核黄素5’－一磷酸钠、核黄素5’－一磷酸钠二水合物(核黄素5’－磷酸酯钠二水合物)。
核黄素衍生物(包括其盐、其水合物)可通过商业途径获得，此外，也可以按照已有文献进行制备。
本发明中，基础培养基中核黄素衍生物的浓度(盐和/或水合物的情况下是换算为无水游离体的浓度)只要抑制完全培养基的劣化即可，没有特别限定，通常，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中为5nM～500μM，优选为5nM～100μM，特别优选为5nM～20μM。
核黄素衍生物为FMN的情况下(盐和/或水合物的情况下换算成FMN的无水游离体)，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中优选为5nM～3μM；FAD的情况下(盐和/或水合物的情况下换算成FAD的无水游离体)，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中优选为5nM～20μM；RTB的情况下(盐和/或水合物的情况下换算成RTB的无水游离体)，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中优选为5nM～0.5μM。
本发明的培养基中，基础培养基中含有含铁(Fe2+)化合物(例如七水合硫酸亚铁)0.083～0.125mg/L(优选约为0.104mg/L)和含锌(Zn2+)化合物(例如七水合硫酸锌)0.086～0.13mg/L(优选约为0.108mg/L)时，核黄素衍生物为FMN的情况下(盐和/或水合物的情况下换算成FMN的无水游离体)，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中特别优选为5nM～2.57μM；FAD的情况下(盐和/或水合物的情况下换算成FAD的无水游离体)，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中特别优选为5nM～15.2μM；RTB的情况下(盐和/或水合物的情况下换算成RTB的无水游离体)，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中特别优选为5nM～0.47μM。
本发明的培养基中，基础培养基中含有含铁(Fe2+)化合物(例如七水合硫酸亚铁)0.332～0.5mg/L(优选约为0.417mg/L)和含锌(Zn2+)化合物(例如七水合硫酸锌)0.344～0.52mg/L(优选约为0.432mg/L)时，核黄素衍生物为FMN的情况下(盐和/或水合物的情况下换算成FMN的无水游离体)，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中特别优选为5nM～0.47μM；FAD的情况下(盐和/或水合物的情况下换算成FAD的无水游离体)，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中特别优选为5nM～2.57μM；RTB的情况下(盐和/或水合物的情况下换算成RTB的无水游离体)，本发明的干细胞增殖用培养基(完全培养基)中特别优选为5nM～0.47μM。
作为基础培养基所含的氨基酸，可以列举甘氨酸、L－丙氨酸、L－精氨酸、L－天冬酰胺(例如L－天冬酰胺(一水盐))、L－天冬酰胺酸、L－半胱氨酸、L－胱氨酸(例如L－胱氨酸二盐酸盐)、L－谷氨酸、L－谷氨酰胺、L－组氨酸、L－异亮氨酸、L－亮氨酸、L－赖氨酸(例如L－赖氨酸盐酸盐)、L－蛋氨酸、L－苯丙氨酸、L－脯氨酸、L－丝氨酸、L－苏氨酸、L－色氨酸、L－酪氨酸和L－缬氨酸。优选分别在本身公知的浓度范围内含有各种氨基酸。
例如，相对于1L基础培养基，基础培养基所含的氨基酸的含量为1mg～100g左右。
作为基础培养基所含的维生素，可以列举作为维生素类的肌醇(例如myo-肌醇)、胆碱(例如氯化胆碱)、维生素A、维生素B1(硫胺素(例如盐酸硫胺素))、维生素B3、维生素B4、维生素B5(泛酸(例如D－泛酸钙))、维生素B6(吡哆醇(例如吡哆醇盐酸盐))、维生素B7(生物素(例如D－生物素))、维生素B12、维生素B13、维生素B15、维生素B17、维生素Bh、维生素Bt、维生素Bx、维生素D、维生素E、维生素F、维生素K、维生素M(叶酸)、维生素P和烟酰胺。优选分别在本身公知的浓度范围内含有各种维生素，本发明中使用的基础培养基不含有核黄素，或者即使含有，通常其浓度在完全培养基中也为6μM以下、优选为0.6μM以下、更优选为0.6nM以下。即，基础培养基中核黄素的浓度为0～6μM，优选为0～0.6μM，更优选为0～0.6nM。特别优选本发明的基础培养基不含核黄素。
例如，相对于1L基础培养基，基础培养基所含的维生素的含量为0.0001～100mg左右。
作为基础培养基所含的矿物质，可以列举氯化钙(例如氯化钙(无水))、硫酸铜(例如五水合硫酸铜)、硝酸铁(III)(例如九水合硝酸铁)、硫酸铁(例如七水合硫酸亚铁)、氯化镁(例如六水合氯化镁)、硫酸镁(例如硫酸镁(无水))、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(例如磷酸二氢钠(无水))和硫酸锌(例如七水合硫酸锌)。可以分别在本身公知的浓度范围内含有各种矿物质。
例如，相对于1L基础培养基，基础培养基所含的矿物质的含量为0.0001～10000mg左右。
本发明的培养基(优选基础培养基中)优选至少含有铁和/或锌(例如硫酸铁或其水合物(例如七水合硫酸亚铁)、和/或硫酸锌或其水合物(例如七水合硫酸锌))。
相对于DMEM/F－12的硫酸铁或其水合物的含量，本发明的培养基中的硫酸铁或其水合物的含量优选为5～500mol％，更优选为10～150mol％，进一步优选为20～30mol％。
相对于DMEM/F－12的硫酸锌或其水合物的含量，本发明的培养基中的硫酸锌或其水合物的含量优选为5～500mol％，更优选为10～150mol％，进一步优选为20～30mol％。
关于本发明的培养基中的硫酸铁或其水合物的含量，七水合硫酸亚铁的情况下，相对于1L基础培养基，优选为0.021～2.085mg，更优选为0.042～0.626mg，进一步优选为0.083～0.125mgL。
关于本发明的培养基中的硫酸锌或其水合物的含量，七水合硫酸锌的情况下，相对于1L基础培养基，优选为0.022～2.160mg，更优选为0.043～0.648mg，进一步优选为0.086～0.130mg。
作为基础培养基所含的缓冲剂，可以列举磷酸生理缓冲液(PBS)、柠檬酸缓冲液、HEPES等。
例如，相对于1L基础培养基，基础培养基所含的缓冲剂的含量为0.001～10000mg左右。
本发明中使用的基础培养基中可以含有本身公知的添加物。作为添加物，可列举糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸(例如丙酮酸钠)、乳酸等)、还原剂(例如2－巯基乙醇等)、类固醇(例如β－雌二醇、黄体酮等)、抗生素(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、嘌呤衍生物(例如次黄嘌呤)、硫辛酸(例如DL－硫辛酸)、脂肪酸(例如亚油酸)、pH指示剂(例如酚红)、多胺(例如1,4－丁二胺二盐酸盐)、嘧啶脱氧核苷酸(例如胸苷)等。此外，也可以适当含有以往干细胞的培养中使用的添加物。优选分别在本身公知的浓度范围内含有添加物。
作为本发明中使用的补充剂所含的成分，可列举胰岛素、bFGF、转铁蛋白、TGF－β等蛋白质、硒、碳酸氢钠等矿物质、L－抗坏血酸等维生素。不希望共存的补充剂彼此分开制备。即，本发明中，补充剂作为补充剂1、根据需要作为补充剂1和补充剂2提供。作为本发明中的补充剂，可以使用已经报道的以及市售的物质。例如可以使用Essential8(ThermoFisher SCIENTIFIC公司)补充剂液、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司)补充剂液。
本发明的培养基中，例如，相对于100重量份基础培养基，补充剂的量为1～50重量份左右。
本发明中使用的培养基中也可以含有血清。作为血清，如果是动物来源的血清，只要不阻碍干细胞的增殖即可，没有特别限定，优选为哺乳动物来源的血清(例如胎牛血清、人血清等)。血清的浓度可以在本身公知的浓度范围内。但已知血清成分中也含有人ES细胞的分化因子等，此外，还存在培养结果由于血清批次间的差异而产生波动的可能性，因而血清的含量越低越好，最优选不含血清。进一步，出于医疗目的使用培养后的干细胞时，存在异种来源成分成为血源性病原菌的感染源、异种抗原的可能性，因此优选不含血清。不含血清的情况下，可以使用血清的替代添加物(例如Knockout Serum Replacement(KSR)(Invitrogen)、Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco)、Glutamax(Gibco)、B-27补充剂等)。这些成分通常与基础培养基分开，作为补充剂提供。
2.干细胞增殖用培养基的稳定剂/使干细胞增殖用培养基稳定的方法
干细胞增殖用培养基通常由基础培养基和补充剂(一种或多种补充剂)构成，使用时混合，制备成液体的完全培养基。保存后的完全培养基在其细胞增殖中的性能劣化，但通过在该培养基中添加核黄素衍生物，能够防止该培养基保存后的劣化。本说明书中，保存后的完全培养基的“劣化”的意思是，与用保存前(例如刚制备之后)的培养基培养细胞时得到的细胞增殖的程度相比，其程度减少。在以添加核黄素衍生物为特征的使干细胞增殖用培养基稳定的方法(以下也称为本发明的稳定方法)中，作为添加的核黄素衍生物，可列举与上述1.干细胞增殖用培养基中使用的物质同样的物质。核黄素衍生物可以添加于完全培养基，也可以添加于基础培养基，优选添加于基础培养基。本发明的稳定方法中添加的核黄素衍生物的量只要能够抑制干细胞增殖用培养基的液体保存导致的劣化即可，没有特别限定，通常以相对于基础培养基为6nM～16μM、优选为6nM～3μM、更优选为6nM～0.6μM的方式添加。本发明的稳定方法中添加的核黄素衍生物的量按在干细胞增殖用培养基(完全培养基)中为5nM～500μM、优选为5nM～100μM、特别优选为5nM～20μM的量添加。为了更简便地进行在基础培养基或者完全培养基中的添加，也可以预先制备成以规定浓度含有核黄素衍生物的干细胞增殖用培养基的稳定剂(以下也称为本发明的稳定剂)。本发明的稳定剂只要含有核黄素衍生物作为有效成分即可，可以含有其他成分，也可以不含其他成分。从操作容易性、保存稳定性等观点出发，而且在添加至培养基中而使用这一点上，也是可以含有各种添加剂的。作为各种添加剂，可以使用本身公知的物质，也可以与1至2种以上培养基构成成分一起制剂。
本发明的稳定剂的剂型没有特别限定，可以为溶液状(包括悬浊液、乳液等剂型)、固态(包括粉末状等剂型)、半固态(包括凝胶状等剂型)。溶液状的本发明的稳定剂容易在液体培养基中添加，是优选的。固态、半固态的本发明的稳定剂从操作容易性、保存稳定性等观点出发是优选的。固态、半固态的本发明的稳定剂可以直接添加于培养基，也可以根据需要在添加至培养基前溶解后再使用。
本发明的基础培养基、补充剂的形态没有特别限定，可以为溶液状(包括悬浊液状、乳液状等)、固态(包括粉末状等)、半固态(包括凝胶状等)。溶液状的本发明的基础培养基是除了核黄素衍生物以外还添加期望的培养基构成成分而成的溶液状的培养基，补充剂为溶液的情况下，可以直接将它们混合制成完全培养基，用于干细胞的培养。补充剂为固态或者半固态的情况下，可以预先制备补充剂的溶液后将两者混合，也可以使补充剂直接溶解在溶液状的基础培养基中。本发明的基础培养基为固态或者半固态的情况下，除了核黄素衍生物以外，还含有期望的培养基构成成分(1至2种以上，优选全部)，使用时溶解于精制水等，然后，在补充剂为溶液时，可以直接将它们混合制成完全培养基，用于干细胞的培养。补充剂为固态或者半固态的情况下，可以在预先制备补充剂的溶液后将两者混合，也可以直接将补充剂溶解在制成溶液状的基础培养基中。可以根据需要进行pH调节，用于细胞的培养。任一方式均在本发明的干细胞增殖用培养基的范畴内。
本发明提供一种干细胞的培养方法(以下也称为本发明的培养方法)。
3.本发明的培养方法
本发明的培养方法包括将干细胞(优选为iPS细胞)用本发明的培养基培养的工序。
干细胞的培养中使用的培养器只要能够进行干细胞的培养即可，没有特别限定，可以列举培养瓶、组织培养用培养瓶、培养盘、培养皿、组织培养用培养盘、多孔培养盘、微量培养板、微孔板、多层板(Multi plate)、多孔板、微量玻片、腔室玻片、培养碗(Schale)、试管、培养池、培养袋和转瓶。
培养器可以是细胞黏附性的，也可以是细胞非黏附性的，根据目的适当选择。出于提高培养器表面与细胞的黏附性的目的，细胞黏附性的培养器可以是用细胞外基质(ECM)等任意细胞支撑用基质包被的器皿。细胞支撑用基质可以是以干细胞或饲细胞(有使用的情况下)的黏附为目的的任意物质。
其他培养条件可以适当设定。例如，培养温度没有特别限定，可以约为30～40℃，优选约为37℃。CO2浓度可以约为1～10％，优选约为2～5％。氧分压可以为1～10％。
通过在本发明的培养基中培养干细胞，能够高效地使干细胞增殖，因此，本发明能够提供高效的干细胞的制造方法。
以下给出实施例，更详细地对本发明进行说明，但这些实施例不限制本发明的范围。
实施例
(材料与方法)
本实施例中，使用人工多能干细胞(iPS细胞)对于改变了DMEM/F-12培养基中的成分的Modified DMEM/F-12培养基的保存稳定性进行了评价。
将Modified DMEM/F-12培养基的组成记载在表1中。其中，将从表1的组成去除了FMN的培养基作为Modified DMEM/F-12(FMN-)。将这些培养基组成的差异的摘抄示于表2。
[表1]
[表2]
Figure BDA0002337808360000162
DMEM/F-12的组成中的改变为以下4点。
(i)将RFV变更为作为核黄素衍生物的黄素单核苷酸(FMN)·Na盐(核黄素5’－一磷酸钠(东京化成工业株式会社，R0023，以下相同))，且使浓度降低至20mol％。
(ii)将Fe3+(九水合硝酸铁)设为0mol％。
(iii)使Fe2+(七水合硫酸亚铁)降低至25mol％。
(iv)使Zn2+(七水合硫酸锌)的含量降低至25mol％。
iPS细胞使用由iPSAcademia Japan公司购入的201B7株。细胞培养使用包被有作为细胞外基质的基质胶(日本Becton,Dickinson公司：354277)或者iMatrix-511(NIPPI公司：892002)的培养容器，在5％CO2/37℃的条件下进行。
将Modified DMEM/F-12与Essential8(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司:A1517001)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司:#05940)、TeSR2(STEMCELLTechnologies公司:#05860)各补充剂混合，制备完全培养基。将该培养基在玻璃门冰箱中在非遮光下(荧光灯照射时间10hr/天)保存后用于培养，从而研究培养基的保存稳定性。
在以下各实施例中，“Essential8补充剂”是Essential8(Thermo FisherSCIENTIFIC公司:A1517001)补充剂，“TeSR-E8补充剂”是TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司:#05940)补充剂，“TeSR2补充剂”是TeSR2(STEMCELL Technologies公司:#05860)补充剂。
实施例1：iPS细胞培养时RFV的有效性研究
对RFV是否为iPS细胞培养时的必需成分进行研究。在基础培养基(A液：ModifiedDMEM/F-12(FMN-))中混合Essential8补充剂(B液)，制备完全培养基。制备在完全培养基中以终浓度为0.00、0.0176、0.044、0.088、0.176mg/L的方式添加RFV的培养基(表3的No.1～No.5)。并且，为了了解降低的矿物质成分的影响，还实施了以成为100mol％的方式添加有Fe2+和Zn2+的培养基的制备(表3的No.6～No.10)。
制备培养基后，准备用基质胶包被的12孔板，以单细胞状态播种每孔10,000个细胞。细胞播种当天，使用上述制备的培养基进行评价。培养期间设为7天，在培养开始后第7天，使用IncuCyte Zoom(埃森生物科学公司)测量细胞覆盖率，作为细胞增殖的指标。播种时，使用添加有终浓度10μM的Y－27632(和光纯药工业公司：036-24023)的培养基，在次日以后的评价中，用未添加Y－27632的培养基培养。
将结果示于图1、2。任一Fe2+和Zn2+浓度下，RFV 0.00mg/L时细胞死亡。表明RFV对于细胞培养是必需的。
[表3]
实施例2：Modified DMEM/F-12培养基的效果研究
研究改变了DMEM/F-12的Modified DMEM/F-12的效果。如下将DMEM/F-12和Modified DMEM/F-12组合，制备由基础培养基(A液)和补充剂(Essential8补充剂(B液)或TeSR-E8补充剂(B液、C液))形成的完全培养基(表4)。将各培养基在非遮光下冷藏保存0、2、5周后，测定iPS细胞的增殖能力。
[表4]
Figure BDA0002337808360000182
就增殖能力而言，准备用基质胶包被的12孔板，以单细胞状态播种每孔10,000个细胞，进行评价。细胞播种当天，使用上述制备的培养基开始评价。培养期间设为7天，培养开始后第7天，利用IncuCyte Zoom测量细胞覆盖率。播种时，使用添加有终浓度10μM的Y－27632的培养基，在次日以后的评价中，用未添加Y－27632的培养基培养。
将保存2周(图3上部)或5周(图3下部)后的增殖能力研究结果示于图3。根据增殖能力研究结果，表明将基础培养基设为Modified DMEM/F-12时，在保存5周后也能够维持培养基的稳定性。
实施例3：Fe、Zn、RFV对保存稳定性影响的研究
对于Fe2+、Zn2+和RFV在何种程度上影响培养基的保存稳定性进行了研究。分别制备在Modified DMEM/F-12(FMN-)中添加各成分而得的完全培养基(表5)。将各培养基在非遮光下冷藏保存0、2周后，研究iPS细胞的增殖能力。
[表5]
研究的培养基的组成*1
Figure BDA0002337808360000191
*1上述No.2～5中，将RFV衍生物(FMN：核黄素5’－一磷酸钠)按分别为规定的浓度的方式添加于Modified DMEM/F-12(FMN-)。
*2No.3中，作为Fe2+，将七水合硫酸亚铁添加于Modified DMEM/F-12(FMN-)。mol％是相对于DMEM/F-12的相对摩尔浓度，七水合硫酸亚铁的100mol％为0.417mg/L(表2)。
*3No.4中，作为Zn2+，将七水合硫酸锌添加于Modified DMEM/F-12(FMN-)。mol％是相对于DMEM/F-12的相对摩尔浓度，七水合硫酸锌的100mol％为0.432mg/L(表2)。
*4No.5中，除了RFV衍生物以外，还将RFV添加于Modified DMEM/F-12(FMN-)。mol％是相对于DMEM/F-12的相对摩尔浓度，RFV的80mol％为0.176mg/L(0.58μM)(表2)。
准备用基质胶包被的12孔板，以单细胞状态播种每孔10,000个细胞。细胞播种当天，使用上述制备的培养基进行评价。培养期间设为7天，培养开始后第7天，利用IncuCyteZoom测量细胞覆盖率。播种时，使用添加有终浓度10μM的Y－27632的培养基，在次日以后的评价中，用未添加Y－27632的培养基培养。
将增殖能力研究结果示于图4。在含有RFV的培养基中，保存2周后，细胞无法生长，因而认为核黄素的存在是保存稳定性降低的重要原因。另一方面，本实验中确认到Fe2+、Zn2 +对培养基的保存稳定性降低没有影响。
实施例4：使用FMN的L-15培养基的iPS细胞培养评价
作为含有FMN来代替RFV的培养基，有L-15培养基，用于肿瘤细胞等增殖快的细胞的增殖而在市场上销售。对本培养基是否能用作干细胞用培养基进行研究。作为基础培养基，使用L-15(和光纯药工业(株)：128－06075)，作为补充剂，使用Essential8补充剂，制备完全培养基，制备后迅速研究iPS细胞的增殖能力。准备用基质胶或者iMatrix-511包被的6孔板，以单细胞的状态播种每孔13,000个细胞。细胞播种当天，使用上述制备的培养基进行评价。培养期间设为7天，培养开始后第7天，利用IncuCyte Zoom测量细胞覆盖率。播种时，使用添加有终浓度10μM的Y－27632的培养基，在次日以后的评价中，用未添加Y－27632的培养基培养。
将基质胶培养结果示于图5上部，将iMatrix-511培养结果示于图5下部。两种培养中，不管有无保存，均不能进行iPS细胞的培养。
实施例5：RFV衍生物FMN、FAD和RTB的有效浓度研究
研究作为RFV衍生物的FAD和RTB的有效性，并研究FMN、FAD和RTB的有效浓度范围。作为基础培养基，使用Modified DMEM/F-12(FMN-)，作为补充剂，使用Essential8或者TeSR2补充剂，制备完全培养基。在完全培养基中，将RFV、FMN(核黄素5’－一磷酸钠)、FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物(东京化成工业株式会社，F0014，以下相同))和RTB(核黄素四丁酸酯，和光纯药工业(株)，185-00861)分别按终浓度为0.47～15.2μM(盐和/或水合物的情况下是换算为无水游离体的浓度)的方式添加。还制备了以成为100mol％的方式添加有Fe2+和Zn2+的培养基。
将各培养基在非遮光下冷藏保存2周后，研究iPS细胞的增殖能力。准备用基质胶包被的12孔板，以单细胞状态播种每孔10,000个细胞。细胞播种当天，使用上述制备的培养基进行评价。培养期间设为7天，培养开始后第7天，利用IncuCyte Zoom测量细胞覆盖率。播种时，使用添加有终浓度10μM的Y－27632的培养基，在次日以后的评价中，用未添加Y－27632的培养基培养。
将使用Essential8补充剂的培养基的培养结果示于表6和表7，将使用TeSR2补充剂的培养基的培养结果示于表8和表9。任一培养基中，FMN、FAD和RTB均比RFV保存稳定性高。此外，与FMN和RTB相比，FAD能够培养的浓度也更高。Fe2+和Zn2+的浓度低则保存稳定性高。
[表6]
Figure BDA0002337808360000211
(×：不生长，○：细胞生长)
*Fe2+和Zn2+为25mol％
基础培养基：Modified DMEM/F-12(FMN-)，补充剂：Essential8补充剂
[表7]
(×：不生长，○：细胞生长)
*Fe2+和Zn2+为100mol％
基础培养基：Modified DMEM/F-12(FMN-)，补充剂：Essential8补充剂
[表8]
Figure BDA0002337808360000222
(×：不生长，○：细胞生长)
*Fe2+和Zn2+为25mol％
基础培养基：Modified DMEM/F-12(FMN-)，补充剂：TeSR2补充剂
[表9]
Figure BDA0002337808360000223
(×：不生长，○：细胞生长)
*Fe2+和Zn2+为100mol％
基础培养基：Modified DMEM/F-12(FMN-)，补充剂：TeSR2补充剂
实施例6：RFV衍生物FAD的有效浓度研究
为了研究作为RFV衍生物的FAD的有效浓度范围，对实施例5的未实施部分进行评价。作为基础培养基，使用Modified DMEM/F-12(FMN-)，作为补充剂，使用TeSR2补充剂，制备完全培养基。在完全培养基中按终浓度为0.47～15.2μM的方式添加FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物)。制备了以成为100mol％的方式添加有Fe2+和Zn2+的培养基。
将各培养基在非遮光下冷藏保存2周后，研究iPS细胞的增殖能力。准备用基质胶包被的12孔板，以单细胞状态播种每孔10,000个细胞。细胞播种当天，使用上述制备的培养基进行评价。培养时间设为7天，培养开始后第7天，利用IncuCyte Zoom测量细胞覆盖率。播种时，使用添加有终浓度10μM的Y－27632的培养基，在次日以后的评价中，用未添加Y－27632的培养基培养。
将培养结果示于表10。Fe2+和Zn2+为100mol％时，能够在0.47～2.57μM下培养。
[表10]
Figure BDA0002337808360000231
(×：不生长，○：细胞生长)
*Fe2+和Zn2+为100mol％
基础培养基：Modified DMEM/F-12(FMN-)，补充剂：TeSR2补充剂
产业可利用性
根据本发明，能够提供一种即使作为完全培养基进行液体保存、在细胞增殖中的性能也不会降低的细胞增殖用培养基。因此，能够高效地获得更多的细胞、尤其是ES细胞、iPS细胞等多能干细胞，能够为了用于研究、医疗等而大量供应该细胞。
本申请以在日本申请的日本特愿2017－125164为基础，其内容全部包含在本说明书中。

Claims (28)

1.一种干细胞增殖用培养基，其含有核黄素衍生物。
2.根据权利要求1所述的培养基，其中，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其中，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的培养基，其中，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的培养基，其不含核黄素。
6.一种干细胞增殖用培养基，其特征在于，其为将含有氨基酸、维生素、矿物质和缓冲剂的基础培养基以及一种或多种补充剂混合而成的培养基，基础培养基含有核黄素衍生物。
7.根据权利要求6所述的培养基，其中，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
8.根据权利要求6或7所述的培养基，其中，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的培养基，其中，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
10.根据权利要求6～9中任一项所述的培养基，其不含核黄素。
11.一种干细胞增殖用培养基的稳定剂，其含有核黄素衍生物。
12.根据权利要求11所述的稳定剂，其中，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
13.根据权利要求11或12所述的稳定剂，其中，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的稳定剂，其中，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
15.一种使干细胞增殖用培养基稳定的方法，其特征在于，添加核黄素衍生物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物。
18.根据权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
19.一种干细胞增殖用培养基的制造方法，其特征在于，添加核黄素衍生物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物。
22.根据权利要求19～21中任一项所述的方法，其中，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
23.一种干细胞增殖用培养基的制造方法，其特征在于，将含有核黄素衍生物、氨基酸、维生素、矿物质和缓冲剂的基础培养基以及一种或多种补充剂混合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，核黄素衍生物为选自由黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、核黄素四丁酸酯、它们的盐和它们的水合物组成的组的至少1种。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中，核黄素衍生物为黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐、或者其水合物。
26.根据权利要求23～25中任一项所述的方法，其中，干细胞为ES细胞或iPS细胞。
27.一种干细胞的培养方法，其特征在于，在权利要求1～10中任一项所述的培养基中培养。
28.一种干细胞的制造方法，其特征在于，在权利要求1～10中任一项所述的培养基中培养。
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