KR20050084889A - 다능성 줄기 세포 배양용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

다능성 줄기 세포 배양용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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도꾸리쯔교세이호징 리가가쿠 겐큐소
히토시 니와
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Abstract

본 발명은 다능성 줄기 세포를, 혈청이나 지지 세포를 사용하지 않는 배지에서 배양하여 분화능을 유지한 미분화 다능성 줄기 세포를 증식 또는 수립시키는 것을 과제로 한다. 본 과제는 다능성 줄기 세포를 배양하는 배지를, 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 보충한 분명한 성분만으로 구성함으로써 해결된다.

Description

다능성 줄기 세포 배양용 조성물 및 이의 용도{COMPOSITION FOR CULTURING MULTIPOTENT STEM CELLS AND UTILIZATION OF THE SAME}
본 발명은 다능성 줄기 세포 배양용 조성물 및 이의 용도, 특히 지지 세포나 혈청이 존재하지 않는 배지에서의 다능성 줄기 세포의 배양을 가능하게 하는 조성물 및 이를 함유하는 배지 및 이들의 용도에 관한 것이다.
다능성 줄기 세포는 적어도 각각 1종류씩의 외배엽, 중배엽, 내배엽에 속하는 분화 세포로 분화하는 능력을 갖는 자기 복제 가능한 줄기 세포로서, 배성 줄기 세포(embryonic stem cell: ES 세포), 배성 생식세포(embryonic germ cell: EG 세포), 배성 암 세포(embryonal carcinoma cell: EC 세포), 다능성 성체 전구 세포(multipotent adult progenitor cells: MAP 세포), 성체 다능성 줄기 세포(adult pluripotent stem cell: APS 세포) 등을 포함한다. 이하, 이들 중 ES 세포를 예로 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다.
ES 세포는 초기배에 존재하는 다능성 줄기 세포 집단에서 유래된 세포주로서, 생식 세포를 포함한 다양한 세포로 분화하는 능력을 가지고 있고, 특정 배양 조건하에서 다능성을 유지한 채로 증식시킬 수 있다. 이러한 조건하에서 배양된 ES 세포를 배반포 또는 상실배에 주입하면, 키메라 동물(2종의 상이한 게놈을 갖는 동물)이 생성된다. 유전자 조작된 ES 세포에서 유래된 생식 세포를 갖는 키메라 동물을 교배함으로써, 조작된 유전자를 갖는 동물 개체를 작성할 수 있다. 이 때문에, ES 세포는 유전자 변형 마우스(특정 유전자의 기능이 개변된 마우스)를 포함한 형질전환 동물의 작성에 널리 사용되고 있다. 또한, 페트리 디쉬 내에서 ES 세포를 분화 유도하여 특정 분화 세포를 얻는 기술도 개발되어 있다. 이 기술을 인간 ES 세포에 적용함으로써 세포 이식 치료에 필요한 분화 세포가 수득되는 점에서, 장래적으로는 의료 분야에서의 ES 세포의 이용도 기대되고 있다.
이상과 같이, ES 세포를 분화시키지 않고, 다능성(분화능)을 유지한 채로 증식 또는 수립시키는 배양 기술은 이미 개발되어 있다. 즉, ES 세포를 배양하는 배지에는 보통 혈청(예컨대, 소 태아 혈청(fetal calf serum: FCS), 말 혈청, 염소 혈청)을 첨가한다. 혈청은 ES 세포의 분화를 억제하고, 증식 또는 수립을 촉진하는 다양한 액성 인자를 공급하는 것이지만, 이들 인자는 현재까지 동정되어 있지 않다. 또한, 혈청은 로트간의 변동이 크기 때문에, 막대한 노동력이 필요한 예비 스크리닝에 의해 적절한 것을 선별해야 한다.
또한, 다른 배양 기술로서, ES 세포는 불활성화시켜 증식을 정지시킨 태아성 초대 배양 섬유 아세포나 STO 세포 등을 지지 세포로서 사용하여 그 위에 접종하여 배양되고 있다. 이 때, 지지 세포는 ES 세포 부착을 위한 매트릭스를 제공하는 동시에, ES 세포의 분화를 억제하고, 증식을 촉진하는 다양한 액성 인자를 방출한다고 여겨지고 있다. 이와 같은 액성 인자의 하나로서 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor: LIF)가 알려져 있고(미국 특허 제5,187,077호), 이는 다양한 동물에서 유래된 ES 세포의 분화 억제능을 갖는 점에서, 많은 경우, 혈청, 지지 세포, LIF를 조합하여 사용하고 있다. 또한, 혈청 함유 배지에 대량의 재조합 LIF 단백질을 첨가함으로써 지지 세포 비의존성의 ES 세포를 젤라틴 코팅 플레이트 상에서 배양하는 것도 가능한 것으로 여겨지고 있다(미국 특허 제5,166,065호).
상기한 바와 같은 혈청이나 지지 세포의 사용은 인간 ES 세포에서 유래된 분화 세포를 세포 이식 치료에 응용하고자 할 때 큰 문제가 발생된다. 즉, 인간 ES 세포의 배양은 보통 소태아 혈청을 포함하는 배지를 사용하여, 불활성화된 마우스 태아성 초대 배양 섬유 아세포를 지지 세포로 하여 실시되어 왔지만, 이들 이종 동물 유래의 생체 성분은 항상 미지 병원체의 감염원이 될 수 있다. 또한, 미국 식품 의약국의 초안에서는 이종 세포와 공배양된 인간 세포의 이식은 이종 이식(xenotransplantation)으로 간주되어, 피이식자의 생활이 제한되게 된다.
따라서, ES 세포와 같은 다능성 줄기 세포의 세포 생물학적 특성의 해석이나 그 의학적 응용에 있어서, 그 단리, 배양은 이종 동물 유래의 감염원이나 이종 세포를 포함하지 않는 배지, 즉 지지 세포나 혈청을 포함하지 않는, 인위적 조제가 가능한 성분이 명확한 배지를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다는 것이 분명하다.
이와 같은 요망에 답하고자 다양한 연구가 이루어지고, 제안이 이루어져 왔다. 그 대표예로서, 혈청을 포함하는 배지에 대량의 재조합 LIF 단백질을 첨가함으로써 지지 세포 비의존성의 ES 세포를 젤라틴 코팅 플레이트 상에서 배양하는 방법이 있다(미국 특허 제5,166,065호). 또한, 혈청 대신에 특정 치환물을 포함하는 배성 줄기 세포 배양용 배지(일본 특허 공개 제2001-508302호 공보)가 제안되어, 지지 세포의 존재하에서 혈청을 포함하지 않는 배지에 의한 배양을 가능하게 하고 있다. 그러나, 대량의 재조합 LIF 단백질을 배지에 공급하더라도 혈청 대신에 특정 치환물을 포함하는, 성분이 명확한 배지로 지지 세포 비의존성의 ES 세포를 젤라틴 코팅 플레이트 상에서 안정하게 배양하는 것은 불가능하였다. 즉, 종래의 기술에서는 혈청 대신에 혈청 치환물을 사용하여 배양하면, 지지 세포 비의존성 다능성 줄기 세포라도 젤라틴 코팅 플레이트 상에서 저밀도 파종 조건으로 증식 또는 수립시키는 것은 불가능하였다.
또한, ES 세포의 수립이나 유전자 조작을 위해서는 저밀도 파종 조건하에서 조차도 ES 세포를 증식시킬 필요가 있지만, 상기 조건으로는 그 요구를 만족시키지 못한다.
발명의 요약
본 발명의 기술적 과제는 이와 같이 종래에는 불가능하게 여겨졌던 지지 세포나 혈청을 사용하지 않는, 인위적으로 조제할 수 있는 성분이 명확한 배지에 의한 다능성 줄기 세포의 배양을 가능하게 하는 데에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 다양한 연구를 거듭한 결과, 미분화 상태를 유지시키면서 다능성 줄기 세포를 증식 또는 수립시킴에 있어서, 상기 배양을 아데닐산 사이클라아제(adenylate cyclase) 활성을 억제하는 조건하에서 수행함으로써, 상기 과제를 해결할 수 있다는 사실을 발견하고, 이러한 사실을 근거로 하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
"아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건"을 작성하는 가장 전형적인 구체예는 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 다능성 줄기 세포의 배양 배지에 첨가 또는 배합하는 것이다. 이에 따라 상기 배지에 지지 세포나 혈청이 존재하지 않더라도 다능성 줄기 세포를 분화시키지 않고, 그 분화능을 유지한 채로 증식 또는 수립하는 것이 가능해진다.
따라서, 본 발명의 주요한 목적은 1종 이상의 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 함유하는, 다능성 줄기 세포 배양용 조성물을 제공하는 데에 있다. 다른 목적은 그와 같은 조성물을 포함하는, 다능성 줄기 세포 배양용 배지를 제공하는 데에 있다. 또 다른 목적은 이와 같은 배지를 사용하는, 다능성 줄기 세포의 배양 방법을 제공하는 데에 있다. 나아가 또 다른 목적은, 상기한 바와 같은 배지로 배양하여 증식 또는 수립된 미분화 다능성 줄기 세포를 제공하는 데에 있다. 이들 및 기타 목적은 당업자에게 있어서 하기에 기재되는 본 발명의 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.
본 발명의 하나의 양태에서는, 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질의 1종 이상을 함유하는, 다능성 줄기 세포 배양용 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물은 경우에 따라 배지 보충물이다. 본 발명의 조성물은 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지시키면서, 다능성 줄기 세포를 증식시키기 위한 것이다. 바람직하게는, 상기 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질은 SQ22536(9-(테트라하이드로-2-퓨란일)-아데닌), 2',5'-다이데옥시아데노신, 9-사이클로펜틸아데닌, 2',5'-다이데옥시아데노신 3'-다이포스페이트, 2',5'-다이데옥시아데노신 3'-모노포스페이트 및 MDL-12,330A(시스-N-(2-페닐사이클로펜틸)아자사이클로트라이데세-1-엔-2-아민)으로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 부신 피질 자극 호르몬(ACTH), 뇌 나트륨 이뇨 펩티드(BNP) 및 하수체 세포 아데닐산 사이클라아제 활성화 펩티드(PACAP) 및 이들과 실질적으로 동일한 생리 활성을 갖는 펩티드로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태에서는, 상기 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 다능성 줄기 세포 배양용 배지가 제공된다. 바람직하게는, 상기 배지는 지지 세포 및/또는 혈청을 포함하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 상기 배지는 지지 세포 및 혈청을 포함하지 않는다. 이들 배지는 세포 배양용 최소 배지일 수 있고, 또한, 추가로 분화 억제 인자, 혈청 치환물 및 항산화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지시키면서, 다능성 줄기 세포를 증식 또는 수립하기 위한 다능성 줄기 세포의 배양 방법으로서, 상기 배양을 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건은 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질의 사용을 수반하는 것이다. 또한, 본 배양 방법은 상기 배지 중에서 실시될 수 있다.
본 발명의 배양 방법에서는, 바람직하게는 다능성 줄기 세포는 ES 세포이다. 또한, 다능성 줄기 세포는 포유류에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 다능성 줄기 세포는 인간에서 유래된 것일 수 있다.
또한, 상기 방법에 의해 증식 또는 수립시킨, 다능성을 유지하는 미분화 다능성 줄기 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건하에 미분화 상태의 다능성 줄기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 미분화 상태의 다능성 줄기 세포 클론 집단의 조제 방법이 제공된다. 또한, 생체로부터 미분화 상태의 다능성 줄기 세포를 단리하여 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건하에 미분화 상태의 다능성 줄기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 미분화 상태의 다능성 줄기 세포 클론 집단의 조제 방법이 제공된다. 바람직하게는, 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건은 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질의 사용을 수반하는 것이다. 또한, 본 조제 방법에서의 배양은 상기 배지 중에서 수행될 수 있다.
바람직하게는, 본 조제 방법은 1개의 다능성 줄기 세포를 배양하여 그 클론세포 집단을 수득하는 것을 특징으로 한다. 또는, 본 조제 방법은 근접하는 다능성 줄기 세포끼리의 상호 작용에 의해 상기 다능성 줄기 세포의 미분화 증식이 유도되는 것보다 저밀도인 파종 조건에 있는 다능성 줄기 세포를, 상기 배지에서 배양하여 그 클론 집단을 수득하는 것, 또는 지지 세포 및/또는 혈청이 존재하지 않으면서, 상기 조성물이 존재하지 않는 조건하에서는 미분화 증식을 일으키지 않는 다능성 줄기 세포를, 상기 배지에서 배양하여 이의 클론 집단을 얻는 것을 특징으로 한다. 특히 바람직하게는, 1개의 다능성 줄기 세포를 상기 배지에서 배양하여 그 클론 집단을 수득하는 것을 특징으로 한다.
상기 조제 방법에서는, 바람직하게는 다능성 줄기 세포는 ES 세포이다. 또한, 다능성 줄기 세포는 포유류에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 다능성 줄기 세포는 인간에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 조제 방법으로 수득되는 미분화 다능성 줄기 세포 클론 집단을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지시키면서 배양하여 다능성 줄기 세포를 증식 또는 수립하기 위한, 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질 또는 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 함유하는 조성물의 용도이다.
본 발명에 의해, 다능성 줄기 세포를, 혈청이나 지지 세포를 사용하지 않고, 성분이 분명한 배지에서 배양하여, 다분화능을 유지한 미분화 다능성 줄기 세포를 증식 또는 수립시킬 수 있게 된다. 그 결과, 증식 또는 수립한 다능성 줄기 세포는 혈청이나 지지 세포에서 유래된 병원체에 의해 오염되지 않고, 또한 이종 세포와의 공배양에 기초한 특별한 제한을 회피할 수 있게 된다.
도 1은 특정 펩티드의 보충에 의한 혈청 및 지지 세포 비존재하에서의 미분화 ES 세포의 증식을 나타내는 도면(사진)이다.
본 명세서에 있어서, "다능성"이란 외배엽, 중배엽, 내배엽에 속하는 어떠한 분화 세포로도 분화될 수 있는 능력, 및 외배엽, 중배엽, 내배엽에 속하는 적어도 각각 1종의 분화 세포로 분화되는 능력을 의미하며, 생식 세포로의 분화능도 이 개념에 포함된다.
"다능성 줄기 세포"란 외배엽, 중배엽, 내배엽에 속하는 어떠한 분화 세포로도 분화될 수 있는 능력, 또는 외배엽, 중배엽, 내배엽에 속하는 적어도 각각 1종류씩의 분화 세포로 분화되는 능력(다분화능)을 갖는 자기 복제 가능한 줄기 세포를 의미하며, ES 세포, EG 세포, EC 세포, MAP 세포, APS 세포 등이 포함된다. 그 대표예인 "배성 줄기 세포(ES 세포)"는 다분화능을 가지며, 다른 배반포 내에 주입되면, 생식 세포도 포함한 다양한 세포로 분화될 수 있다.
"지지 세포"란 그 자체로는 증식할 수 없지만 대사 활성을 가지고 있어, 다양한 대사 물질을 생산함으로써, 그 위에 접종된 다른 세포의 증식을 돕는 세포를 말한다(무라마쓰 마사미(村松　正實) 등: "분자 세포 생물학 사전" 367 페이지(1997년) (주)동경 화학 동인 발행 참조). 예컨대, ES 세포의 경우, 불활성화되어 증식을 정지시킨 태아성 초대 배양 섬유아세포 또는 STO 세포를 지지 세포로서 사용한다.
"지지 세포 비의존성 다능성 줄기 세포"란 혈청의 존재하, 지지 세포를 포함하지 않는 배양 조건에서 증식할 수 있는 다능성 줄기 세포를 의미한다. 다능성 줄기 세포는 원래 그와 같은 배양 조건에서는 미분화 증식 배양하기 어려운 것이지만, 계대배양을 계속함으로써, 지지 세포 비의존성을 취득하게 된다.
본 발명에 따라 제공되는 다능성 줄기 세포 배양용 조성물은 1종 이상의 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 함유하는 것을 특징으로 한다. 아데닐산 사이클라아제는 ATP로부터 cAMP(환형 AMP)를 생성시키는 효소로서, 세포의 신호 전달에 있어서 중심적인 효소이다. 이 효소의 활성은 주로 G 단백질 공액형 수용체를 통해 다양한 세포외 신호에 의해 조절되며, 생성된 cAMP는 세포내 제 2 전달체로서 작용한다. 포유 동물에서는 현재까지 인간, 마우스, 랫트, 소, 개, 토끼 등에서 총 10종류의 아데닐산 사이클라아제의 존재가 보고되었다(예컨대, Patel, TB et al., Molecular biological approaches to unravel adenylyl cyclase signaling and function, Gene, 269, 13-25, 2001). 인간에서는 이 중 9종류에 대하여, 마우스에서는 5종류에 대하여 유전자가 단리되어 있지만, 마우스에서 단리된 것은 모두 인간에서도 서열이 잘 보존되어 있는 점, 및 이들 분자가 세포 증식 제어 등의 기본적인 생명 현상에 불가결한 점에서, 다능성 줄기 세포에 있어서 아데닐산 사이클라아제의 기능도 이들 동물종에서 공유되어 있다고 생각된다.
본 발명의 다능성 줄기 세포 배양용 조성물로서 사용하는 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질은 세포내 및 세포외 신호 전달 경로 중 어떠한 단계에 작용하는 것이더라도, 결과적으로 아데닐산 사이클라아제의 활성을 억제하는 것이면 좋다. 따라서, 예컨대, 아데닐산 사이클라아제의 활성 억제에 이르는 세포외 신호를 수용체에 부여하는 물질이나, 아데닐산 사이클라아제를 직접 저해하는 물질을 사용할 수 있고, 수용체와 아데닐산 사이클라아제간의 신호 전달을 매개하는 분자에 작용하는 물질도 사용할 수 있다.
어느 물질이 다능성 줄기 세포의 아데닐산 사이클라아제의 활성을 억제하는지의 여부를 조사하기 위해서는 증식 또는 수립시키고자 하는 세포(예컨대 ES 세포)의 배양 배지에 상기 물질을 첨가하고, cAMP 생성의 억제 정도를 관찰하는 것이 바람직하다.
아데닐산 사이클라아제를 직접 저해하는 물질의 예로는, SQ22536(9-(테트라하이드로-2-퓨란일)-아데닌), 2',5'-다이데옥시아데노신, 9-사이클로펜틸아데닌, 2',5'-다이데옥시아데노신 3'-다이포스페이트, 2',5'-다이데옥시아데노신 3'-모노포스페이트, MDL-12,330A(시스-N-(2-페닐사이클로펜틸)아자사이클로트라이데세-1-엔-2-아민) 등의 화합물을 들 수 있고, 이들은 칼바이오켐-노바바이오켐 코포레이션(CALBIOCHEM-NOVABIOCHEM CORPORATION, 미국 캘리포니아 소재) 등에서 시판되고 있어, 용이하게 입수할 수 있다. 이들 물질의 사용량은 그 종류에 따라 적절히 결정될 수 있다. 예컨대, SQ22536를 사용하는 경우, 그 배지 중의 최종 농도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 보통 1μM 내지 10mM, 바람직하게는 10μM 내지 1mM의 최종 농도가 되는 양으로 사용한다.
다능성 줄기 세포에 있어서 아데닐산 사이클라아제의 활성을 억제하는 물질의 다른 예로서는 다음과 같은 펩티드를 들 수 있다: 부신 피질 자극 호르몬(corticotropin, adrenocorticotropic hormone: ACTH), 뇌 나트륨 이뇨 펩티드(brain natriuretic peptide: BNP), 하수체 세포 아데닐산 사이클라아제 활성화 펩티드(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide: PACAP) 등.
또한, 이들 펩티드와 실질적으로 동일한 생리 활성을 갖는 펩티드, 즉 상기 ACTH, BNP, PACAP 등의 펩티드를 구성하는 아미노산 서열에 대하여 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가되어 있고, 대응하는 전장 펩티드와 동일한 생리 활성을 갖는 것도 사용할 수 있다. 예컨대, ACTH는 39개의 아미노산으로 이루어진 펩티드(ACTH(1-39))로서, N말단 1 내지 24의 아미노산은 각 동물에게 공통되며, 25 내지 33의 아미노산은 종에 따라 다르고, N말단 1 내지 18에 부신 피질 자극 작용이 있는 것이 알려져 있지만, 본 발명에서는 ACTH(1-39) 뿐 아니라 그 단편인 ACTH(1-24), ACTH(11-24) 등도 사용할 수 있다. 이들 펩티드는 보통 1nM 내지 100μM, 바람직하게는 1 내지 10μM의 최종 농도가 되는 양으로 사용한다.
상기한 ACTH, BNP, PACAP 등 및 이들의 단편 자체는 모두 문헌에 기재되어 있거나(예컨대, 미국 특허 공보 제4,415,546호; 이마호리 가즈토모(今堀 和友) 등: 생화학 사전(제3판) 1178 내지 1179 페이지, 721 페이지 및 286 내지 287 페이지(1998) (주)동경 화학 동인), 또는 시약으로 시판되고 있거나, 또는 문헌에 기재된 방법에 준하여 제조하는 것이 가능한 것이다. 예컨대, 이들 펩티드는 원하는 아미노산 서열을 구축하기 위한 당업자에게 있어서 주지된 합성법으로 작성할 수 있다. 또한, 이들 펩티드를 인코딩하는 유전자를 대장균 등의 숙주 세포에 도입하여 펩티드를 발현시키고, 이를 단리, 정제하는 유전자 조작에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 단일의 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 포함할 수도 있고, 복수의 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 어떠한 조합으로 포함할 수도 있다. 따라서, 복수의 화합물을 포함하는 조성물, 복수의 펩티드를 포함하는 조성물, 및 화합물과 펩티드 모두를 포함하는 조성물 등을 사용할 수 있다. 또는, 본 발명의 조성물은 단일의 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질만으로 구성될 수도 있다.
본 발명에 따라, 상기 조성물을 첨가한 다능성 줄기 세포 배양용의 배양 배지가 제공된다. 상기 조성물은 지지 세포나 혈청에서 유래된 액성 인자의 대체물이기 때문에, 배양 배지에 지지 세포나 혈청이 존재하더라도 다능성 줄기 세포의 배양에 지장을 초래하는 것은 아니지만, 지지 세포나 혈청이 존재하면 그들에게서 유래된 병원체에 의한 오염이나 이종 이식으로서 특별한 제한을 회피할 수 없다. 따라서, 바람직하게는 배양 배지로서 지지 세포 및/또는 혈청을 포함하지 않는 것이 사용되고, 보다 바람직하게는, 배양 배지로서 지지 세포도 혈청도 포함하지 않는 것이 사용된다.
즉, 본 발명의 배양 배지는 바람직하게는 세포 배양용 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)를 기초 배지로 하여, 여기에 분화 억제 인자, 혈청 치환물, 항산화제(예컨대, 2-머캅토에탄올(2-ME), 다이티오트레이톨, 아스코르브산) 및 상기한 본 발명의 조성물(즉, 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질)을 함유시킨 것으로서, 지지 세포나 혈청을 함유하지 않는 것이다. 이들 CCMM, 분화 억제 인자, 혈청 치환물, 항산화제 및 본 발명의 조성물은 이하에 설명하는 바와 같이 모두 인위적으로 조제하는 것이 가능한 기지 물질이기 때문에, 이들에 의해 구성되는 본 발명의 배양 배지는 생체 성분의 사용에 기인하는 미지 병원체에 의한 오염을 회피할 수 있는 것이다.
기초 배지로서 사용하는 "세포 배양용 최소 배지(CCMM)"는 여기에 분화 억제 인자, 혈청 치환물, 항산화제 및 본 발명의 조성물을 함유시킨 경우, 다능성 줄기 세포의 미분화 증식을 가능하게 하는 임의의 배지를 의미한다.
CCMM에는 보통 표준 무기염(아연, 철, 마그네슘, 칼슘, 칼륨 등), 바이타민, 글루코스, 완충계, 필수 아미노산 등을 첨가한다. 그 구체예로서는, 둘베코 개질된 이글스 배지(Dulbecco' s Modified Eagle's Medium, DMEM), 최소 필수 배지(Minimal essential Medium, MEM), 기저 배지 이글(Basal Medium Eagle, BME), RPMI1640, F-10, F-12, α최소 필수 배지(αMinimal essential Medium, αMEM), 글라스고우 최소 필수 배지(Glasgow's Minimal essential Medium, GMEM), 이스코브 개질된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco' s Medium) 등을 들 수 있고, 시판되는 것을 사용할 수도 있다.
가장 바람직한 CCMM은 하기 표 1의 조성의 GMEM이다.
바람직하게는, CCMM에는 0.1mM 비필수 아미노산 및 1mM 피루브산 나트륨을 가한다. 비필수 아미노산은 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민산, 글라이신, L-프롤린, L-세린의 혼합물로, 예컨대 MEM 비필수 아미노산 용액 10mM 액체(인비트로젠(Invitrogen))로서 시판되고 있는 것을 사용한다. 피루브산 나트륨은, 예컨대 MEM 피루브산나트륨 용액 100mM 액체(인비트로젠)로서 시판되고 있는 것을 사용한다.
분화 억제 인자는 지지 세포 및 다능성 줄기 세포 자체가 방출하는 액성 인자로서, 미분화 세포의 분화를 억제한다. 대표적인 분화 억제 인자로서는 백혈병 저해 인자(LIF)를 들 수 있다. 분화 억제 인자는 원래 생체에 존재하는 물질이기 때문에, 생체로부터의 채취도 불가능하지는 않지만, 병원체의 오염을 피하기 위해서나, 또한 경제적인 면에서도 인위적으로 합성되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대, LIF와 같은 단백질성의 분화 억제 인자의 경우, 유전자 조작에 의해 제조되는 재조합 분화 억제 인자 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.
항산화제로서는 2-머캅토에탄올, 다이티오트레이톨, 아스코르브산 등을 사용할 수 있지만, 통상적으로는 2-머캅토에탄올을 사용한다. 이들 물질은 시판되고 있어 용이하게 입수할 수 있다.
혈청 치환물은 이것을 무혈청 배양 배지에 첨가함으로써 다능성 줄기 세포의 증식을 지지할 수 있는 물질을 의미한다. 혈청 치환물은 단일 물질이거나 혼합물일 수 있고, 구체적으로는 알부민(예컨대, 소혈청 알부민) 또는 알부민 치환물(예컨대, 소 하수체 추출물, 쌀 가수분해물, 소태아 알부민, 난 알부민, 인간 혈청 알부민, 소 배 추출물, 알부맥스 I(AlbuMAX I, 등록상표), 아미노산(예컨대, 글라이신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-시스테인, L-아스파르트산, L-글루타민산, L-페알라닌, L-히스티딘, L-아이소루신, L-라이신, L-루신, L-글루타민, L-알기닌, L-메티오닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린), 바이타민, 트랜스페린 또는 트랜스페린 치환물(예컨대, 에틸렌다이아민테트라아세트산, 에틸렌글라이콜-비스(β-아미노에틸에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산, 데페록사민메실레이트, 다이머캅토프로판올, 다이에틸렌트리아민펜타아세트산, 트랜스-1,2-다이아미노사이클로헥세인-N,N,N',N'-테트라아세트산과 같은 철 킬레이트물, 시트르산 제2철 킬레이트물, 황산 제1철 킬레이트물 등의 철 킬레이트 화합물), 항산화제(예컨대, 환원형 글루타치온, 아스코르브산-2-인산염), 인슐린 또는 인슐린 치환물(예컨대, 염화 아연, 질산 아연, 브롬화 아연, 황산 아연 등의 아연 함유 화합물), 콜라겐 전구체(예컨대, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, 아스코르브산) 및 미량 원소(예컨대, Ag＋, Al3＋, Ba2＋, Cd2＋, Co2＋, Cr3＋, Ge4＋, Se4＋, Br－, I－, Mn2＋, F－, Si4＋, V5＋, Mo6＋, Ni2＋, Rb＋, Sn2＋, Zr4＋)에서 선택되는 1종 또는 그 이상의 성분을 함유하는 것이다.
한편, 혈청 치환물의 일례는 일본 PCT 국제출원 공개 제2001-508302호 공보에 "무혈청 진핵 생물 세포 배양 배지 보충물"로 기재되어 있고, 상기 공보의 기재를 참작하여 혈청 치환물의 조성을 적당히 결정하면 바람직하다. 대표적인 혈청 치환물은 배성 줄기 세포 혈청 치환(KSR)으로서 인비트로젠사에서 판매되고 있어 용이하게 입수 가능하다.
상기 LIF, 2-ME 및 KSR은 배양 배지중에 있어서 각각 보통 1 내지 10000 unit/ml, 1 내지 1000μM, 및 0.5 내지 90%(v/v)의 최종 농도, 바람직하게는 100 내지 1000unit/ml, 10 내지 100μM, 및 5 내지 20%의 최종 농도가 되는 양으로 사용한다. 본 발명의 조성물 및 이들 각 첨가 성분은 배지에 대하여 처음부터 원하는 최종 농도가 되는 양으로 첨가될 수 있고, 2회 이상의 회수로 나누어 첨가하고, 최종적으로 원하는 농도가 되는 양으로 사용될 수도 있다. 배양 배지는 통상적으로 pH를 중탄산염에 의해 7.0 내지 8.2, 바람직하게는 7.3 내지 7.9로 조절하여 사용된다.
본 발명의 조성물 및 배양 배지는 각각 용액 형태 또는 건조 형태로 조제될 수 있다. 용액 형태의 경우, 농축 조성물(예컨대 1x 내지 1000x)로서 제공될 수 있고, 사용시에 적당하게 희석될 수 있다. 용액 형태 또는 건조 형태의 조성물 또는 배양 배지를 희석 또는 용해하는 데 사용하는 액체의 종류는 물, 완충 수용액, 생리 식염수 용액 등이 있고, 필요에 따라 용이하게 선택될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물 또는 배양 배지를 멸균하여 오염을 방지한다. 멸균 방법에는 자외선 조사, 가열 멸균, 방사선 조사 및 여과 등이 있다.
본 발명에 따라, 다능성 줄기 세포를 배양하여 분화능을 유지한 채로 미분화 증식을 하기 위해서는 상기한 본 발명의 배양 배지, 바람직하게는 세포 배양용 최소 배지에 백혈병 저해 인자, 항산화제, 혈청 치환물 및 본 발명의 조성물을 함유시켜 이루어진 배지를 사용하여 다능성 줄기 세포를 이 분야에서 채용되고 있는 통상적인 배양 조건하에서 배양하면 바람직하다.
다능성 줄기 세포는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 몰모트, 소, 돼지, 개, 말, 고양이, 염소, 양을 포함하는 포유류, 조류, 파충류 등의 다양한 동물에서 유래된 것을 사용할 수 있지만, 통상적으로는 포유류에서 유래된 것이다. 다능성 줄기 세포의 구체예로서는 ES 세포, EG 세포, EC 세포, APS 세포, MAP 세포 등을 들 수 있다. 빈번히 사용되는 전형예는 마우스의 ES 세포이다. 배양하는 다능성 줄기 세포의 수에 특별히 한정은 없지만, 본 발명의 배양 방법은 특히 1개의 다능성 줄기 세포를 배양하여 증식시켜 클론 세포 집단을 형성시키는 것을 가능하게 하는 점에서 유리하다.
배양해야 할 다능성 줄기 세포는 그 자체가 지지 세포 의존성의 것일 수도 있지만, 지지 세포 비의존성인 것이 바람직하다. 지지 세포 의존성 다능성 줄기 세포를 지지 세포 비의존성으로 하기 위해서는 다음과 같이 처리하면 바람직하다. 즉, 지지 세포를 사용하지 않는 배양 조건에서 수회에 걸쳐 계대 조작을 하고, 이와 같은 조건에 적합한 세포를 선택한다.
본 발명에 따른 다능성 줄기 세포의 배양 방법에서의 구체적인 조작은 배양 조건을 포함하여 상기 기술 분야에서 통상적인 조작 및 조건에 따라 수행할 수 있다. 예컨대, 나카쯔지 노리오의 문헌[실험 의학 별책·포스트 게놈 시대의 실험 강좌 4 "줄기 세포·클론 연구 프로토콜", 요도사(2001년)], 호간 지(Hogan, G.) 등의 문헌[마우스 간의 조작: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY(1994)], 로버트손 이 제이(Robertson, E. J.)의 문헌[기형암 및 배성 줄기 세포, A Practical Approach, IRL Press Oxford, UK(1987)] 등의 기재를 참작하여 적절히 결정할 수 있다.
대표적인 계대 조작과 배양 조건을 들면 다음과 같다. 즉, ES 세포를 계대하기 위해서는, 우선 육성한 ES 세포의 콜로니를 인산 완충화 생리 식염수(phosphate buffered saline: PBS)로 1 내지 2회 헹구고, 그 후 충분한 양의 트립신-EDTA 용액(0.25% 트립신-1mM EDTA, PBS 중)을 세포층을 덮도록 첨가하여 5분간 방치한다. 그 후, 트립신 저해제를 포함하는 PBS 또는 혈청을 포함하는 ES 세포 배양용 기초 배양액(CCMM＋LIF＋2-ME)을 첨가하고, 피펫팅에 의해 세포괴를 분리한다. 이 세포 현탁액으로부터 보통 원심분리에 의해 세포를 침전시킨다. 상청을 제거한 후, 침전한 세포를 혈청 또는 혈청 치환물을 포함하는 ES 세포 배양용 기초 배양액에 재현탁하고, 이 일부를 지지 세포층 또는 젤라틴화한 플라스틱 플레이트 내에 파종하여 37℃, 5% CO2 하에서 배양한다.
본 발명 방법의 하나의 실시양태로서, 0.1%(w/v) 젤라틴 용액으로 처리하여 젤라틴화한 플라스틱 플레이트내에 37℃로 데운 본 발명의 배양 배지를 넣고, 여기에 플레이트 면적 1cm2당 10 내지 1000개의 다능성 줄기 세포를 파종한다. 플레이트를 CO2 인큐베이터내에 넣고, 37℃, 5% CO2 하에서 배양한다. 콜로니가 성장하면(예컨대, E14tg2a 세포에서는 7일 이내) 새로운 배지에 다시 파종하여 계대한다. 계대시에는 트립신 저해제를 포함하는 PBS를 사용하는 것이 바람직하다.
근접하는 다능성 줄기 세포끼리의 상호 작용에 의해 상기 다능성 줄기 세포의 미분화 증식이 유도되는 것보다 저밀도인 파종 조건이란, 구체적으로는 세포 1개/mm2 이하의 파종 조건 등이 적합한 것으로서 예시된다. 균일한 다능성 줄기 세포 계통의 수립이나, 유전자 조작을 한 다능성 줄기 세포의 증식시에 하나의 다능성 줄기 세포로부터 그 클론 세포 집단을 얻는 공정 등은 물론 이 조건에 해당한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는 지지 세포나 혈청이 사용되지 않기 때문에, 통상적인 배양 방법으로 수행되는 혈청 로트의 스크리닝, 지지 세포의 선택 및 배양을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 성분이 분명한 배양 배지를 사용했을 경우, 젤라틴 코팅 플레이트 상에서 저밀도 파종 조건하에 단일의 지지 세포 비의존성 다능성 세포를 미분화 상태로 증식시키는 것이 가능하다.
한편, 본 발명은 지지 세포와 혈청을 사용하지 않는 세포 배양 배지에 첨가함으로써 다능성 줄기 세포의 미분화 증식을 가능하게 하는 물질의 스크리닝 방법도 제공한다. 즉, 세포 배양용 최소 배지에 백혈병 저해 인자, 혈청 치환물, 항산화제 및 후보 물질을 첨가하여 이루어진 배양 배지를 사용하여, 지지 세포 비의존성의 다능성 줄기 세포(예컨대 마우스의 ES 세포)를 배양하고, 상기 다능성 줄기 세포의 미분화 콜로니의 생성 유무를 확인하여 현저한 양성을 나타내는 것을 본 발명에 의해 선택하는 것이다.
미분화 콜로니의 형성은, 예컨대 라이슈만(Leischman) 염색을 포함하는 단백질 염색을 사용하여 형태적으로 확인할 수 있다. 또한, 알칼리 포스파타아제, SSEA-1, 3, 4 항원 등의 미분화 세포 마커 1의 존재를 항체로 확인하는 것도 가능하다. 또한, Oct-3/4 유전자나 Rex-1 유전자의 발현도 미분화 세포에 특징적이기 때문에 확인 수단으로 채용될 수도 있다. 통상적으로는 이들 방법을 여러개 조합하여 미분화된 것을 확인한다.
상기 스크리닝법을 실시하는 경우의 표준 배양 배지의 조성과 배양 조건은 다음과 같다:
표준 배양 배지의 조성:
GMEM, 10% KSR, 10μM2-ME, 1000U/ml LIF, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨
배지에 파종하는 다능성 줄기 세포의 수: 배양 면적 1cm2당 배양액 1ml를 사용하고, 100개를 파종한다.
배양 조건: 37℃, 5% CO2
확인 및 관찰 수단:
7일 후에 배지를 관찰하여 다능성 줄기 세포의 미분화 콜로니의 수(/1cm2)에 의해 하기 표 2와 같이 판정한다:
본 발명의 배양 방법에 의해, 1개의 다능성 줄기 세포를 배양하여 증식시켜 클론 세포 집단을 형성시킬 수 있다. 이는 게놈을 개변한 다능성 줄기 세포의 집단이 필요한 경우, 예컨대 형질전환 동물을 작성하는 경우에 유리하다.
다능성 줄기 세포의 대표예인 ES 세포를 배양하기 위한 배지로서는, 종래에는 세포 배양용 최소 배지에 (1) 백혈병 저해 인자, (2) 혈청, (3) 2-머캅토에탄올, (4) 지지 세포를 첨가한 것이 사용되어 왔다. 단, (1) 내지 (3)이 함유되어 있는 경우에는 (4)의 존재는 필수가 아니며, 젤라틴으로 코팅한 플레이트 상에 지지 세포 비의존성 ES 세포를 직접 부착시켜 배양하는 것도 가능하다. 또한, (4)의 존재를 전제로 한 경우, (2)를 (5) 혈청 치환물로 치환할 수 있어, 혈청 자체를 사용하지 않는 ES 세포의 배양이 가능해진다. 본 발명은 이러한 혈청이 사용되지 않는 배지에 대하여, 추가로 (6) 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 첨가함으로써 (4) 지지 세포의 비존재하에 ES 세포를 배양하는 것을 가능하게 하였다.
이상, 본 발명은 "아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건"이 배지에 대하여 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 첨가 또는 배합하는 경우를 예로 들어 설명되었지만, 그와 같은 조건을 다른 적절한 방법으로 만들어내는 것도 가능하다. 예컨대, 다능성 줄기 세포에 있어서의 아데닐산 사이클라아제 유전자의 발현을 억제하는 방법(예컨대 mRNA나 RNAi를 사용)이나, 유전자 조작으로 아데닐산 사이클라아제 활성을 저해하는 분자를 발현시키는 방법(예컨대 길항형 변이체를 사용)이 채용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는, 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질의 1종 이상을 함유하는, 다능성 줄기 세포 배양용의 배지 보충물이 제공된다. 바람직하게는, 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질은 SQ22536(9-(테트라하이드로-2-퓨란일)-아데닌), 2',5'-다이데옥시아데노신, 9-사이클로펜틸아데닌, 2',5'-다이데옥시아데노신 3'-다이포스페이트, 2',5'-다이데옥시아데노신 3'-모노포스페이트 및 MDL-12,330A(시스-N-(2-페닐사이클로펜틸)아자사이클로트라이데세-1-엔-2-아민)으로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 부신 피질 자극 호르몬(ACTH), 뇌 나트륨 이뇨 펩티드(BNP) 및 하수체 세포 아데닐산 사이클라아제 활성화 펩티드(PACAP) 및 이들과 실질적으로 동일한 생리 활성을 갖는 펩티드로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 배지 보충물을 포함하는 다능성 줄기 세포 배양용 배지가 제공된다. 바람직하게는, 상기 배지는 지지 세포 및/또는 혈청을 포함하지 않고, 보다 바람직하게는, 상기 배지는 지지 세포 및 혈청을 포함하지 않는다. 상기 배지는 세포 배양용 최소 배지를 기초 배지로 할 수 있다. 상기 배지는 추가로 분화 억제 인자, 혈청 치환물 및 항산화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는, 다능성 줄기 세포를 배양하여 미분화 다능성 줄기 세포를 증식시킴에 있어서, 상기 배양을 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건하에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 다능성 줄기 세포의 배양 방법이 제공된다. 본 방법에서는 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건이 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질의 사용을 수반하는 것일 수 있다. 또한, 상기 배양을 상기 배지로 수행할 수 있다. 본 방법에서는 1개의 다능성 줄기 세포를 배양하여 그 클론 세포 집단을 수득할 수 있고, 또한, 지지 세포 및/또는 혈청이 존재하지 않으면서 상기 배지 보충물이 존재하지 않는 조건하에서는 미분화 증식을 일으키지 않는 다능성 줄기 세포를, 상기 배지에서 배양하여 그 클론 집단을 수득할 수 있다. 바람직하게는, 본 방법에서는 1개의 다능성 줄기 세포를 상기 배지에서 배양하여 그 클론 집단을 수득한다. 본 방법에서는 다능성 줄기 세포는 ES 세포일 수 있고, 또한, 다능성 줄기 세포는 포유류에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 다능성 줄기 세포는 인간에서 유래된 것일 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 배양 방법으로 증식시킨 다능성을 유지하는 미분화 다능성 줄기 세포가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서는, 다능성 줄기 세포를 배양하여 미분화 다능성 줄기 세포를 수립시킴에 있어서, 상기 배양을 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건하에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 다능성 줄기 세포의 배양 방법이 제공된다. 본 방법에서는, 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건이 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질의 사용을 수반하는 것일 수 있다. 또한, 상기 배양을 상기 배지에서 수행할 수 있다. 본 방법에서는 다능성 줄기 세포는 ES 세포일 수 있고, 또한, 다능성 줄기 세포는 포유류에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 다능성 줄기 세포는 인간에서 유래된 것일 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 배양 방법으로 수립시킨 다능성을 유지하는 미분화 다능성 줄기 세포가 제공된다.
이하의 실시예는 그와 같은 혈청이나 지지 배지도 사용하지 않는, 모두 분명한 성분으로 조제된 배지에 의해 ES 세포를 배양하는 것이 가능함을 증명하는 것이다. 본 발명은 이들 실시예에 의해 아무런 한정도 되지 않는다.
실시예 1
최소 배양 최소 배지로서, 글라스고우 최소 필수 배지(Glasgow minimum essential medium: GMEM; Sigma사)를 사용하여, 여기에 (1) 1x103 U/ml LIF(ESGRO, 인비트로젠사), (3) 0.1μM 2-머캅토에탄올(나카라이테스크사), (5) 10%(v/v) KSR(인비트로젠사)를 첨가한 배양액 1ml로, 100개의 지지 세포 비의존성 ES 세포(E14tg2a, 문헌[Hooper, M. et al., Nature, 325, 292(1987)], CGR8, 문헌[Mountford, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 4303(1994)] 및 이로부터 파생한 ES 세포)를 0.1%(w/v) 젤라틴 용액으로 처리하여 젤라틴화된 12웰 플레이트의 1웰내에서 37℃, 5% CO2 하에서 배양하였다.
배양 5일째 이후에, 배양액을 흡인 제거한 후, 플레이트면을 덮는 양의 라이슈만(Leischman) 염색액(1.5g Leischman Staining: 시그마(Sigma)사/L 메탄올)을 가하고, 실온에서 10분간 유지하고, 수세하였다(라이슈만 염색). 청색 염색한 콜로니를 육안 또는 광학 현미경으로 관찰한 결과, 형태적으로 미분화 상태를 유지한 콜로니의 형성은 전혀 보이지 않았다(도 1g). 이 조성의 배양액에 추가로 (2) 0.3%(v/v) FCS를 첨가하여 배양하면, 평균 17개의 미분화 콜로니 형성이 보였다(도 1d). 이 점에서, (1)＋(3)＋(5)의 조성에서는 (2) FCS에 포함되는 미분화 콜로니 형성에 필수적인 성분이 결여되어 있는 것으로 생각되었다. 또한, 동일 배양액 조성((1)＋(3)＋(5))으로 웰당 1000개 이상의 ES 세포를 배양하면, 미분화 콜로니의 형성이 보였다. 이 고밀도 배양 상청(조절된 배지(conditioned medium): CM)을 최종 농도 10%(v/v)로 배양액에 첨가하여 웰당 100개의 ES 세포를 배양하면, 평균 7개의 미분화 콜로니의 형성이 보였다(도 1f). 이것은 ES 세포 자신이 미분화 콜로니 형성에 필수적인 성분을 분비하고 있음을 나타낸다.
이에, 다양한 이미 알려진 성장 인자, 사이토카인, 펩티드 호르몬 등에서 선택된 후보 펩티드를 (1)＋(3)＋(5)을 포함하는 배지에 첨가하고, ES 세포를 37℃, 5% CO2 하에서 배양하여 그 미분화 콜로니 형성능을 관찰하였다. 그 결과, 1μM 부신 피질 자극 호르몬, 1μM 뇌 나트륨 이뇨 펩티드 및 1μM 하수체 세포 아데닐산 사이클라아제 활성화 펩티드를 첨가한 배지에 있어서, 형태적으로 분명한 ES 세포의 미분화 콜로니의 형성이 보였다(도 1e; 펩티드로서 ACTH를 사용). 한편, 도 1a 내지 도 1c는 GMEM과 LIF와 2-ME로 이루어진 배지에 각각 FCS＋지지 세포, KSR 10지지 세포 및 FCS를 첨가한 경우를 나타낸다.
이들의 펩티드 호르몬의 보충에 의해 미분화 콜로니를 형성한 ES 세포에서는 미분화 상태의 마커인 알칼리 포스파타아제 활성 염색 시험에서 양성이며(도 1), 미분화 세포 특이적으로 발현하는 전사 인자 Oct-3/4의 발현도 상동 유전자 재조합 법으로 도입한 리포터 유전자의 활성에 의해 확인되었다. 따라서, 이들의 펩티드는 FCS나 CM과 같이 미분화 콜로니 형성 지지능을 갖는 것으로 이해된다.
실시예 2
상기 실시예 1에 있어서, 시험한 후보 펩티드 중에 가장 저농도에서 활성을 보인 ACTH 및 그 단편을 이용하여 그 유의성을 검토하였다. 상기와 마찬가지로, 세포 배양 최소 배지에 (1) LIF, (3) 2-ME 및 (5) KSR를 첨가한 배양 배지에, ACTH 또는 그 단편을 최종 농도 1μM로 첨가했을 때, ACTH(1-39), ACTH(1-24), ACTH(11-24)는 활성을 나타내었지만, ACTH(18-39)는 활성을 나타내지 않았다. 또한, 활성을 나타낸 것 중에서는 ACTH(1-24)가 가장 강한 활성을 나타내었고, 최종 농도 0.1μM에서도 미분화 콜로니 형성을 지지하였다. 또한, 10μM ACTH(1-24)를 첨가한 조건에서의 미분화 콜로니 형성율 및 세포 증식 속도는 0.3% FCS 또는 10% CM 첨가시와 동등하였다.
이상의 결과로부터, 기초 배지로서의 세포 배양 최소 배지에 (1) LIF, (3) 2-ME, (5) KSR＋, (6) ACTH 등의 펩티드 호르몬을 첨가한 것은 혈청이나 지지 세포가 없더라도 다능성을 유지한 미분화 상태에서 ES 세포를 증식시키는 것이 가능함을 이해할 수 있다.
실시예 3
ACTH가 세포내에 어떠한 신호를 전달한 결과, 혈청이나 지지 세포의 비존재하에서 다능성을 유지한 미분화 상태에서 ES 세포를 증식시키는 것인지를 해명하기 위해, 각종 신호 전달 저해 물질을 배지에 첨가하여 ES 세포의 증식을 관찰하였다.
ACTH는 G 단백질 공액 수용체 패밀리에 속하는 ACTH 수용체를 활성화하고, ACTH 수용체는 Gαs 아단위를 포함하는 3량체 G 단백질의 활성화를 통해 아데닐산 사이클라아제를 활성화한다고 알려져 있다. 이에, (1) 1x103 U/ml LIF, (3) 0.1μM 2-ME, (5) 10%(v/v) KSR, 및 (6) 10μM ACTH를 첨가한 세포 배양 최소 배지에 추가로 아데닐산 사이클라아제 저해제인 (7) SQ22536(9-(테트라하이드로-2-퓨란일)-아데닌)(시그마) 100μM을 첨가하고, 그 배지를 사용하여 실시예 1과 동일하게 ES 세포를 배양하였다. 그 결과, 예상에 반하여 배양 7일째의 미분화 콜로니의 형성은 전혀 저해되지 않았고, 오히려 개개의 콜로니가 현저히 커졌다.
SQ22536 단독의 효과를 조사하기 위해, (1) 1x103 U/ml LIF, (3) 0.1μM 2-ME, (5) 10%(v/v) KSR, 및 (7) SQ22536 100μM을 첨가한 세포 배양 최소 배지를 사용하여 실시예 1과 동일하게 ES 세포를 배양하였다. 그 결과, ACTH를 첨가한 경우와 마찬가지로, 평균 9개의 미분화 콜로니의 형성이 보였다. 또한, SQ22536 대신에, 다른 아데닐산 사이클라아제 저해제인 2',5'-다이데옥시아데노신(시그마) 500μM를 첨가한 배지를 사용하더라도 평균 8개의 미분화 콜로니의 형성이 보였다. 이들 결과로부터 아데닐산 사이클라아제 활성의 억제가 미분화 콜로니 형성을 유도한다는 것이 밝혀졌다.
G 단백질 공액형 수용체에 의한 아데닐산 사이클라아제의 억제는 보통 리간드 결합에 의한 Gαi 아단위를 포함하는 3량체 G 단백질의 활성화를 통해 일어난다. ACTH의 효과가 이 신호 전달 경로를 통하는 것인지의 여부를 확인하기 위해, (1) 1x103 U/ml LIF, (3) 0.1μM 2-ME, (5) 10%(v/v) KSR, 및 (6) 10μM ACTH를 포함하는 세포 배양 최소 배지에 Gαi의 저해제인 백일해 독소를 최종 농도 100ng/ml로 첨가하고, 그 배지를 사용하여 실시예 1와 마찬가지로 ES 세포를 배양하였다. 그 결과, ACTH의 효과가 억제되어 미분화 콜로니의 크기가 현저히 감소하였다. 이는 ACTH의 미분화 콜로니 형성 지지 효과가 Gαi의 활성화를 통하는 것임을 나타낸다. 또한, ACTH 수용체는 Gαs와 공액하기 때문에, ES 세포에 있어서는 ACTH는 그 특이적 수용체와는 다른 G 단백질 공액형 수용체와 결합하는 것이 시사된다.
이상의 결과로부터, ACTH에 의한 미분화 콜로니 형성 지지 작용은 이하의 신호 전달 경로를 통해 일어남이 밝혀졌다. ① Gαi와 공액하는 G 단백질 공액형 수용체에 ACTH가 결합하고, ② Gαi가 활성화되고, 그리고 ③ 아데닐산 사이클라아제의 활성이 억제된다. 따라서, 혈청 및 지지 세포를 포함하지 않는 배지중에서 ES 세포를 미분화된 채로 증식시키기 위해서는, 아데닐산 사이클라아제의 활성을 억제하는 방법이면 어떠한 방법을 채용할 수도 있음을 이해할 수 있다.
실시예 4
상기 실시예 1에 있어서, 1nM 부신 피질 자극 호르몬을 사용하여 배양하여 수득된 미분화 콜로니 유래의 ES 세포를, 추가로 2회 계대한 후, 이들을 마우스의 배반포에 주입하여 위임신 자성 마우스 자궁에 이식하였다. 그 결과, 100개의 이식간으로부터 33마리의 산자가 수득되었고, 30마리가 생후 3주 이후에도 생존했었지만, 이들 중 17마리는 털색으로 보아 70% 이상의 ES 세포 기여율을 나타내는 양호한 키메라 마우스였다. 또한 이 17 마리중 14 마리는 수컷으로, 소위 수컷 왜곡(male distortion)이 확인되었고, 이들 교배 실험에 의해 생식 세포 계열로의 ES 세포의 기여가 확인되었다. 이 점에서, 본 배양 조건이 ES 세포의 다능성을 유지하는 데 충분함이 증명되었다.
실시예 5
C57BL/6 순계 마우스로부터 수정후 3.5일의 배반포기배 30개를 채취하고, 이로부터 면역 수술법에 의해 단리한 내부 세포괴를, 각각 섬유결합소(fibronectin)로 코팅한 플레이트내에서 CCMM, (1) 1x103 U/ml LIF, (3) 0.1μM 2-ME, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨, (5) 10%(v/v) KSR 및 (6) 10μM ACTH로 이루어진 배양액으로 배양하였다. 그 결과, 적어도 2개의 내부 세포괴는 증식을 시작하여 최종적으로 ES 세포주로서 수립되기에 이르렀다. 이에 따라, 이 배양법이 이미 수립된 ES 세포의 배양 뿐만 아니라, 새로운 ES 세포주의 수립에도 유용함이 증명되었다.

Claims (29)

  1. 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질의 1종 이상을 함유하는 다능성 줄기 세포 배양용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    배지 보충물인 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지시키면서 다능성 줄기 세포를 증식시키기 위한 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질이 SQ22536(9-(테트라하이드로-2-퓨란일)-아데닌), 2',5'-다이데옥시아데노신, 9-사이클로펜틸아데닌, 2',5'-다이데옥시아데노신3'-다이포스페이트, 2',5'-다이데옥시아데노신 3'-모노포스페이트 및 MDL-12,330 A(시스-N-(2-페닐사이클로펜틸)아자사이클로트라이데세-1-엔-2-아민)으로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질이 부신 피질 자극 호르몬(ACTH), 뇌 나트륨 이뇨 펩티드(BNP) 및 하수체 세포 아데닐산 사이클라아제 활성화 펩티드(PACAP) 및 이들과 실질적으로 동일한 생리 활성을 갖는 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 다능성 줄기 세포 배양용 배지.
  7. 제 6 항에 있어서,
    지지 세포 및/또는 혈청을 포함하지 않는 배지.
  8. 제 6 항에 있어서,
    지지 세포 및 혈청을 포함하지 않는 배지.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 배양용 최소 배지인 배지.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 분화 억제 인자, 혈청 치환물 및 항산화제를 포함하는 배지.
  11. 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지시키면서, 다능성 줄기 세포를 증식 또는 수립하기 위한 다능성 줄기 세포의 배양 방법으로서, 상기 배양을 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건이 아데닐산 사이클라아제 활성 억제물질의 사용을 수반하는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    배양을 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포가 ES 세포인 것을 특징으로 하는 배양 방법.
  15. 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포가 포유류에서 유래된 것을 특징으로 하는 배양 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포가 인간에서 유래된 것을 특징으로 하는 배양 방법.
  17. 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건하에 미분화 상태의 다능성 줄기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 미분화 상태의 다능성 줄기 세포 클론 집단의 조제 방법.
  18. 생체로부터 미분화 상태의 다능성 줄기 세포를 단리하여, 아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건하에 미분화 상태의 다능성 줄기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 미분화 상태의 다능성 줄기 세포 클론 집단의 조제 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    아데닐산 사이클라아제 활성을 억제하는 조건이 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질의 사용을 수반하는 것을 특징으로 하는 조제 방법.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양을 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 조제 방법.
  21. 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1개의 다능성 줄기 세포를 배양하여 이의 클론 집단을 수득하는 것을 특징으로 하는 조제 방법.
  22. 제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    근접하는 다능성 줄기 세포끼리의 상호 작용에 의해 상기 다능성 줄기 세포의 미분화 증식이 유도되는 것 보다 저밀도인 파종 조건에 있는 다능성 줄기 세포를, 제 7 항 또는 제 8 항에 따른 배지에서 배양하여 이의 클론 집단을 수득하는 것을 특징으로 하는 조제 방법.
  23. 제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1개의 다능성 줄기 세포를 제 7 항 또는 제 8 항에 따른 배지에서 배양하여 이의 클론 집단을 수득하는 것을 특징으로 하는 조제 방법.
  24. 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포가 ES 세포인 것을 특징으로 하는 조제 방법.
  25. 제 17 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포가 포유류에서 유래된 것을 특징으로 하는 조제 방법.
  26. 제 17 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포가 인간에서 유래된 것을 특징으로 하는 조제 방법.
  27. 제 17 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 조제 방법으로 수득되는 미분화 다능성 줄기 세포 클론 집단.
  28. 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지시키면서 배양하여 다능성 줄기 세포를 증식 또는 수립하기 위한 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질의 용도.
  29. 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지시키면서 배양하여 다능성 줄기 세포를 증식 또는 수립하기 위한, 아데닐산 사이클라아제 활성 억제 물질을 함유하는 조성물의 용도.
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