CN102224239A - 高效价抗体生产 - Google Patents

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D·伦代罗
S·桑达迪
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Abstract

本发明部分地提供了用于以高水平重组表达蛋白质的方法以及用于该方法的细胞培养基。

Description

高效价抗体生产
本申请要求2008年9月26日提交的美国临时专利申请第61/100,450号的权益，其通过全文引用并入本文。
发明领域
本发明一般地涉及用于在细胞培养物中生产大量蛋白质例如抗体的方法；以及该细胞培养物自身。
发明背景
培养用于治疗性蛋白质商业生产的细胞是一个昂贵的过程。所需设备费用昂贵并且研发及生产成本高昂。开发使每升细胞培养物生产的治疗性蛋白质的量最大化的细胞培养方法将会使生产给定量蛋白质所需的资源最少化。因此，期望使用商业上可行的生产大量蛋白质的方法。
在标准的培养条件下，许多天然存在的细胞并不产生大量的期望蛋白质。相反地，必须进行广泛的会诱使培养中的细胞产生大量治疗性蛋白质的细胞培养方法的研发。通常，鉴定最佳的细胞培养条件是困难的并且需要大量的创造性投入。
发明概述
本发明一般地提供了用于通过利用各种培养添加物以及对培养条件的其它改变，从培养中的细胞产生大量蛋白质的方法和组合物。
本发明提供了用于生产蛋白质的方法，包括用表达该蛋白质的宿主细胞接种初始哺乳动物细胞生长培养基并加入任选地处于接近所示浓度(不包括来自其它来源例如来自初始哺乳动物细胞培养基的每种成分的量)的添加物，所述添加物包括如下所列的那些：
Figure BPA00001373562500011
Figure BPA00001373562500021
Figure BPA00001373562500031
在本发明的一个实施方案中，一些添加物是从包含以约如下浓度存在的氨基酸的氨基酸进料(feed)储液(例如50X储液)加入的：
Figure BPA00001373562500032
Figure BPA00001373562500041
在本发明的一个实施方案中，每升培养物加入约20ml氨基酸进料储液。在本发明的一个实施方案中，下列添加物是从包含以约如下浓度存在的氨基酸的氨基酸进料储液(例如100X储液)加入的：
Figure BPA00001373562500042
在本发明的一个实施方案中，以每升培养物加入约10ml氨基酸进料来加入氨基酸进料储液。在本发明的一个实施方案中，一些添加物是从包含以约如下浓度存在的添加物的营养物进料储液(例如50X储液)加入的：
在本发明的一个实施方案中，每升培养物加入约20ml营养物进料储液。在本发明的一个实施方案中，一些添加物是从包含以约如下浓度存在的添加物的维生素/盐进料储液(例如50X储液)加入的：
Figure BPA00001373562500052
Figure BPA00001373562500061
在本发明的一个实施方案中，每升培养物加入约20ml维生素/盐进料。在本发明的一个实施方案中，该方法进一步包括从细胞收获培养基；其中所述蛋白质由所述细胞分泌至培养基中。例如，在本发明的一个实施方案中，在细胞生存力低于约60％时，从细胞收获培养基。可例如通过对培养基进行离心和/或对培养基进行深层过滤(depth filtering)和/或经0.2微米过滤器对培养基进行过滤而从细胞收获培养基。使用本发明方法表达的蛋白质可以是任何蛋白质，例如，抗体或其抗原结合片段，例如特异性结合IGF1R的抗体或其抗原结合片段，例如其中该抗体或片段包含：含有示于选自SEQ ID NOs：1、3，-6、13、21和26的成员的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs；
和含有选自SEQ ID NOs：2、7-9、17和25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链，或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs；例如，其中该抗体或片段是完整抗体，其包含：含有SEQ ID NO：3、4、5或6的氨基酸20-128的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO：8或9的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白，例如其中轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于γ-1免疫球蛋白恒定链。在本发明的一个实施方案中，加入了添加物的初始哺乳动物细胞生长培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分。
本发明在其范围中包括用于生产抗体(例如单克隆、重组和/或全人抗体)的方法，包括用表达抗体轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的CHO DXB11宿主细胞接种预热至约37℃的初始哺乳动物细胞生长培养基至约2.5-5X 105个细胞/ml的细胞密度；该培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且其不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分；并且，在所述接种前、同时或之后立即在培养基中加入下列添加物：
大豆水解物至约10g/L的终浓度；
以及，任选地，加入氨基酸至约下列终浓度(不包括来自其它来源例如初始哺乳动物细胞生长培养基的所述氨基酸的量)：
Figure BPA00001373562500071
Figure BPA00001373562500081
；并且，在活细胞密度达到超过约1.2X 106个细胞/ml时，加入添加物进料，其中来自所述添加物进料的成分(不包括来自其它进料的每种成分的量)达到大约如下所列的最终培养物浓度：
Figure BPA00001373562500091
；并且，在细胞生长期间，在葡萄糖水平降至低于约1.5g/L时在培养基中加入葡萄糖并且在L-谷氨酰胺水平降至低于约150mg/L时加入L-谷氨酰胺；并且在细胞生长期间，维持O2浓度处于约60％；pH处于约6.8±0.02且温度处于约36.5℃±0.5℃。在本发明的一个实施方案中，抗体包含：含有示于选自SEQ ID NOs：1、3，-6、13、21和26的成员的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs；
和含有选自SEQ ID NOs：2、7-9、17和25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链，或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs，例如其中抗体包含：含有SEQ ID NO：3、4、5或6的氨基酸20-128的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO：8或9的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白。例如，在本发明的一个实施方案中，轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于γ-1免疫球蛋白恒定链。该方法任选地进一步包括通过对培养基进行叠盘(disk-stack)离心、对培养基进行深层过滤和经具有0.2微米孔径的过滤器对培养基进行过滤而从细胞回收培养基，以及，任选地，通过柱色谱分离而从培养基纯化免疫球蛋白链的进一步的步骤。
本发明还提供了含水液体细胞培养基，包含：
约10g/L大豆水解物，
约1.5g/L葡萄糖，
约150mg/L L-谷氨酰胺，
约6.8±0.02的pH，
HEPES，
碳酸氢钠缓冲剂，
无机盐，
非必需氨基酸，
重组人胰岛素，
痕量元素，
表面活性剂，
氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure BPA00001373562500101
Figure BPA00001373562500111
；其中该培养基不包含抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分。此外，本发明提供了细胞培养物，其中表达感兴趣的免疫球蛋白的细胞业已得到生长。
例如，本发明提供了通过如下方法生产的液体培养基，该方法包括用表达抗体轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的CHO DXB11宿主细胞接种预热至约37℃的初始哺乳动物细胞生长培养基至约2.5-5X 105个细胞/ml的细胞密度；该培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且其不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分；并且在所述接种前、同时或之后立即在培养基中加入下列添加物：
大豆水解物至约10g/L的终浓度；
以及，任选地，加入氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure BPA00001373562500121
；并且，在活细胞密度达到超过约1.2X 106个细胞/ml时，加入添加物进料，其中通过所述添加物进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure BPA00001373562500122
Figure BPA00001373562500131
Figure BPA00001373562500141
；并且，在细胞生长期间，在葡萄糖水平降至低于约1.5g/L时在培养基中加入葡萄糖并在L-谷氨酰胺水平降至低于约150mg/L时加入L-谷氨酰胺；并且在细胞生长期间，维持O2浓度处于约60％；pH处于约6.8±0.02并且温度处于约36.5℃±0.5℃；其中细胞生存力为约60％或更低。在本发明的一个实施方案中，培养基包括宿主细胞，所述宿主细胞包含编码抗体或其抗原结合片段的载体；任选地，其中宿主细胞分泌的抗体或片段处于培养基中。例如，在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白形成特异性结合IGF1R的抗体或其抗原结合片段，例如其中抗体或片段包含：含有示于选自SEQ ID NOs：1、3，-6、13、21和26的成员的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs；和/或含有选自SEQ ID NOs：2、7-9、17和25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链，或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs，例如其中抗体或片段包含：含有SEQ ID NO：3、4、5或6的氨基酸20-128的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO：8或9的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白。在本发明的一个实施方案中，轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于γ-1免疫球蛋白恒定链。例如，其中宿主细胞包含编码抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白的载体，其中该抗体或片段分泌入培养基中。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞生存力为约60％或更低和/或其中细胞生长已进行约14-24天(例如约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天或约24天)，例如通过对培养基和细胞进行离心并从培养基除去细胞，例如其中培养基还被深层过滤和/或经0.2微米过滤器进行过滤，例如，在离心后。与实际上制备培养基的方法无关，任何包含如上所列产生的培养基的特性的培养基均构成了本发明的一部分。
本发明还提供了包含本发明的任意培养基的容器(例如烧瓶、生物反应器、罐式生物反应器、袋式生物反应器或一次性生物反应器、搅拌罐式生物反应器、泡罩塔生物反应器、气升式生物反应器、流化床生物反应器或填充床生物反应器)。
发明详述
本申请包括用于由哺乳动物细胞例如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞生产抗体(例如抗-IGF1R)的方法。该方法在多种生物反应器培养系统中运转，所述系统包括搅拌罐式生物反应器、袋式和一次性生物反应器以及摇瓶。该“3级”生产方法平均产生约1.2g/L抗体的效价和约22pg/细胞/天的培养物比生产力。该“增强的”方法平均产生约2.3g/L抗体的效价，具有约30pg/细胞/天的比生产力。这两种方法都包括在接种前或作为过程中的(in-progress)进料，加入特定添加物到生产生物反应器培养物中以增加培养物比生产力、效价、生物量和培养物生存力。对于3级方法，加入三种添加物-加入小麦和/或大豆水解物(水解物进料)(例如作为200g/L(含水)溶液)以增加培养物比生产力。通常将这两种水解物或单独将大豆水解物进料加入培养物。加入两种浓缩的氨基酸进料溶液(氨基酸进料)以提升培养物生物量并增加方法效价。加入浓缩的维生素和盐溶液(维生素/盐进料)以稳定培养物生存力并增加生物量。维生素进料溶液包含例如生物素、孕酮、肌醇、核酸、瓜氨酸、次黄嘌呤、硫辛酸、核黄素、硫胺素、胆碱、乙醇胺、叶酸、黄素和维生素B12。
对于增强的方法，加入进料溶液以及额外的浓缩的营养物溶液(营养物进料)。“营养物进料”包括例如氨基酸、硫酸锌、硫酸铜、钒酸铵、氯化钴、二氯化镍、氯化锡和氯化锰。其可在接种前或作为过程中的进料加入以提高方法效价并增加生存力。
此外，通过加入浓缩的盐溶液、大豆水解物溶液或二氧化碳以及氢氧化钠(作为对生物反应器pH控制的一部分)任选地采用过程中的重量摩尔渗透压浓度改变(至400-500mOsm)。进行重量摩尔渗透压浓度改变以便增加培养物比生产力并提高收获物生存力。此外，过程中的温度下调(从约36℃-37℃至33-35℃)，被任选地用于在高活细胞计数下稳定培养物生存力。
对本发明的目的来说，术语“过程中的”指在初始细胞接种(例如扩增的细胞的接种，例如，用于主细胞库或工作细胞库)后在生产细胞培养物生长期间发生的事件。
“生产细胞培养物”指要分离出最终产物例如抗体(例如抗-IGF1R抗体)的细胞培养物。
“扩增细胞培养物”指要被用于生产细胞培养物的初始接种的细胞或细胞培养物。
添加物的“nX”储液(其中n是数字，例如50)表示在加入到培养物时该储液被稀释到1/n。例如，在加入到培养物时50X储液通常稀释到1/50。
进料
本发明的方法包括将各种进料加入到初始哺乳动物细胞生长培养基中的步骤。这些进料包括水解物进料、维生素/盐进料、氨基酸进料和营养物进料。取决于正使用的细胞培养方法的类型，即3级方法或增强的方法，进料可在不同的时间点加入。
“初始哺乳动物细胞生长培养基”可以是本领域已知的数种类型的含水培养基中的任一种；并且该术语的含义能为任何本领域普通技术人员所容易地获知。实例包括EX-CELL ACF CHO培养基(Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)；以下进一步讨论)、DMEM、DMEM/F-12、F-10营养物混合物(Nutrient Mixture)、RPMI培养基1640、F-12营养物混合物、培养基199、Eagle’s MEM、RPMI、293培养基和Iscove培养基。例如，Eagle基本必需培养基(MEM)包含L-精氨酸盐酸盐(126mg/l)、L-胱氨酸二盐酸盐(31mg/l)、L-组氨酸盐酸盐-H2O(42mg/l)、L-异亮氨酸(52mg/l)、L-亮氨酸(52mg/l)、L-赖氨酸盐酸盐(73mg/l)、L-甲硫氨酸(15mg/l)、L-苯丙氨酸(32mg/l)、L-苏氨酸(48mg/l)、L-色氨酸(10mg/l)、无水L-酪氨酸二钠盐(52mg/l)、L-缬氨酸(46mg/l)、氯化胆碱(1mg/l)、D-泛酸钙(1mg/l)、叶酸(1mg/l)、烟酰胺(1mg/l)、盐酸吡哆醛(1mg/l)、核黄素(0.1mg/l)、盐酸硫胺素(1mg/l)、i-肌醇(2mg/l)、氯化钙(CaCl2)(无水)(200mg/l)、硫酸镁(MgSO4)(无水)(97.67mg/l)、氯化钾(KCl)(400mg/l)、碳酸氢钠(NaHCO3)(2200mg/l)、氯化钠(NaCl)(6800mlg/)、磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)(140mg/l)、D-葡萄糖(右旋糖)(1000mg/l)和酚红(10mg/l)。
改良的Eagle培养基(MEM)(2X)包含L-精氨酸盐酸盐(504mg/l)、L-胱氨酸(96mg/l)、L-谷氨酰胺(870mg/l)、L-组氨酸盐酸盐-H2O(168mg/l)、L-异亮氨酸(208mg/l)、L-亮氨酸(208mg/l)、L-赖氨酸盐酸盐(290mg/l)、L-甲硫氨酸(60mg/l)、L-苯丙氨酸(128mg/l)、L-苏氨酸(192mg/l)、L-色氨酸(40mg/l)、无水L-酪氨酸二钠盐(208mg/l)、L-缬氨酸(155mg/l)、氯化胆碱(4mg/l)、D-泛酸钙(4mg/l)、叶酸(4mg/l)、烟酰胺(4mg/l)、盐酸吡哆醛(4mg/l)、核黄素(0.4mg/l)、盐酸硫胺素(4mg/l)、i-肌醇(8mg/l)、氯化钙(CaCl2)(无水)(285mg/l)、硝酸铁(Fe(NO3)3″9H2O)(1mg/l)、硫酸镁(MgSO4)(无水)(195mg/l)、氯化钾(KCl)(800mg/l)、碳酸氢钠(NaHCO3)(8400mg/l)、氯化钠(NaCl)(12800mg/l)、磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)(250mg/l)和D-葡萄糖(右旋糖)(9000mg/l)。
RPMI培养基1640(1X)包含甘氨酸(10mg/l)、L-精氨酸(200mg/l)、L-天冬酰胺(50mg/l)、L-天冬氨酸(20mg/l)、L-胱氨酸2HCl(65mg/l)、L-谷氨酸(20mg/l)、L-谷氨酰胺(300mg/l)、L-组氨酸(15mg/l)、L-羟脯氨酸(20mg/l)、L-异亮氨酸(50mg/l)、L-亮氨酸(50mg/l)、L-赖氨酸盐酸盐(40mg/l)、L-甲硫氨酸(15mg/l)、L-苯丙氨酸(15mg/l)、L-脯氨酸(20mg/l)、L-丝氨酸(30mg/l)、L-苏氨酸(20mg/l)、L-色氨酸(5mg/l)、无水L-酪氨酸二钠盐(29mg/l)、L-缬氨酸(20)、生物素(0.2mg/l)、氯化胆碱(3mg/l)、D-泛酸钙(0.25mg/l)、叶酸(1mg/l)、烟酰胺(1mg/l)、对氨基苯甲酸(1mg/l)、盐酸吡哆素(1mg/l)、核黄素(0.2mg/l)、盐酸硫胺素(1mg/l)、维生素B12(0.005mg/l)、i-肌醇(35mg/l)、硝酸钙(Ca(NO3)24H2O)(100mg/l)、硫酸镁(MgSO4)(无水)(48.84mg/l)、氯化钾(KCl)(400mg/l)、碳酸氢钠(NaHCO3)(2000mg/l)、氯化钠(NaCl)(6000mg/l)、无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)(800mg/l)、D-葡萄糖(右旋糖)(2000mg/l)和谷胱甘肽(还原的)(1mg/l)。
通常，对本发明的目的来说，“水解物进料”包括小麦和/或大豆水解物。通常，大豆或小麦水解物是大豆或小麦的酶消化产物并可商购。通常，该水解物在细胞培养级水中且是无菌的。在本发明的一个实施方案中，水解物是200g/L的储液。在本发明的一个实施方案中，在培养基中加入水解物以达到约10g/L的终浓度。在本发明的一个实施方案中，在使用3级方法或增强的方法时，在最初、接种之前、同时或之后立即或在接种后约3天或在活细胞密度达到超过约1X 106个细胞/ml时，在培养基中加入该水解物。
“活细胞密度”指培养基中正在分析的细胞的浓度(例如细胞/ml)，该细胞是活的，例如能生长并复制(例如在用于接种液体培养物或固体培养基时)或能在染料排斥测定法中排斥染料例如台昐蓝、曙红或propidiumin。这样的测定法是本领域通常所知的。
通常，对本发明的目的来说，“维生素/盐进料”包括：
Figure BPA00001373562500181
Figure BPA00001373562500191
在本发明的一个实施方案中，维生素/盐进料是50X储液。在本发明的一个实施方案中，在培养基中加入维生素/盐进料以达到约20ml/L的终浓度。在使用3级方法时，在接种后第3天到第5天之间或在活细胞密度达到超过约1X 106个细胞/ml时，在培养物中加入维生素/盐进料。在本发明的一个实施方案中，在使用增强的方法时，在接种后第3天到第5天之间或在活细胞密度达到超过约1.2X 106个细胞/ml时，在培养物中加入维生素/盐进料。
通常，对本发明的目的来说，“氨基酸进料”包括：
在本发明的一个实施方案中，制备两种独立的氨基酸进料储液：包含以如上所列浓度存在的L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸的100X储液；
和包含以如上所列浓度存在的L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸的50X溶液。可制备这些储液并分开地加入培养基。在本发明的一个实施方案中，在第0天、细胞接种之前、同时或之后立即在初始培养基中加入氨基酸储液。
通常，对本发明的目的来说，“营养物进料”包括：
Figure BPA00001373562500211
在本发明的一个实施方案中，营养物进料是50X储液。在本发明的一个实施方案中，在培养基中加入营养物进料以达到约20ml/L的终浓度。在使用增强的方法时，在接种后第3天到第5天之间或在活细胞密度达到约1.2X 106个细胞/ml时，在培养物中加入营养物进料。
此外，在本发明的一个实施方案中，在使用3级或增强的方法时，在任意时间点在培养基中加入葡萄糖(来自2.5M储液)和L-谷氨酰胺(来自0.2M储液)，例如在营养物浓度降至低于1.5g/L葡萄糖和150mg/L L-谷氨酰胺时。
重量摩尔渗透压浓度和温度改变
本发明还包括其中培养物的重量摩尔渗透压浓度和/或温度任选地改变的方法。可在过程中的任何点进行重量摩尔渗透压浓度或温度改变。
已表明重量摩尔渗透压浓度改变增加了培养物的比生产力和细胞生存力。通常，初始哺乳动物细胞生长培养基具有约300mOsm的起始重量摩尔渗透压浓度。然而，本发明的“重量摩尔渗透压浓度改变”包括使培养物重量摩尔渗透压浓度从约400mOsM改变至约500mOsm。
重量摩尔渗透压浓度是溶质/公斤溶剂的渗透压摩尔的量度。可使用测量依数性，例如冰点降低、气压或沸点升高的渗透压计测量重量摩尔渗透压浓度。
可通过数种手段中的任一种改变细胞培养物的重量摩尔渗透压浓度。例如，可加入浓缩的盐溶液(例如包括5M NaCl盐储液，以8-12mL/L加入)、大豆水解物溶液(200g/L储液，以50-80mL/L加入)或二氧化碳。在本发明的一个实施方案中，在培养基中加入营养物进料，可改变重量摩尔渗透压浓度。
在本发明的一个实施方案中，培养物的温度被任选地改变，例如步进改变，从约36.5℃(+0.5℃)改变至约33℃-35℃。
蛋白质
本发明包括这样的实施方案：其包括用于重组生产蛋白质例如免疫球蛋白链的方法。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白包含抗-IGF1R抗体(例如人抗体、人源化抗体、嵌合抗体)或其抗原结合片段，例如包括免疫球蛋白轻链和/或重链可变区，其任选地连接有免疫球蛋白恒定区。
例如，本发明包括以下方法：其中要被表达的蛋白质(例如抗-IGF1R抗体轻链或重链免疫球蛋白)由质粒载体(例如其中多核苷酸可操作地连接于启动子例如CMV启动子)中的多核苷酸编码。在本发明的一个实施方案中，轻链和重链包括在单个质粒载体中。
在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白链编码任意如下所列的那些；例如，任意下列免疫球蛋白轻链和/或重链和/或任意其CDRs(例如来自单条轻链或重链的全部3个CDRs)。加点的、加下划线型编码信号肽。实线下划线型编码CDRs。无格式型编码构架区。在本发明的一个实施方案中，表达带有信号肽的链，所述信号肽一旦从宿主细胞分泌就被切除，以产生该链的成熟片段。
用于生产任意下列靶免疫球蛋白氨基酸序列或其成熟片段的组合物和方法均构成本发明的一部分。
19D12/15H12轻链(SEQ ID NO：1)
Figure BPA00001373562500221
EIVLTQVPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSLSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSRLPHTFGGGTKVEIKRT
19D12/15H12重链(SEQ ID NO：2)
Figure BPA00001373562500222
EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMHWVRQAPGKGLEWISVIDTRGATYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARLGNF
Figure BPA00001373562500223
19D12/15H12轻链-C(LCC)(SEQ ID NO：3)
Figure BPA00001373562500231
19D12/15H12轻链-D(LCD)(SEQ ID NO：4)
Figure BPA00001373562500232
19D12/15H12轻链-E(LCE)(SEQ ID NO：5)
Figure BPA00001373562500233
19D12/15H12轻链-F(LCF)(SEQ ID NO：6)
Figure BPA00001373562500241
19D12/15H12重链-A(HCA)(SEQ ID NO：7)
Figure BPA00001373562500243
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser
Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn
Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn
Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
Ser
19D12/15H12重链-B(HCB)(SEQ ID NO：8)
Figure BPA00001373562500244
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser
Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn
Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
Ser
参见国际申请公开号WO 2003/100008，其通过全文引用并入本文。
2C6重链
MELGLSWIFLLAILKGVQC
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASWVRQAPGKGLEWVS
Figure BPA00001373562500252
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKWGHGTTVTVSS(SEQ ID NO：9)
2C6 CDR-H1：GFTFDDYAMH(SEQ ID NO：10)
2C6 CDR-H2：GISWNSGSKGYVDSVKG(SEQ ID NO：11)
2C6 CDR-H3：DIRIGVAASYYFGMDV(SEQ ID NO：12)
2C6轻链
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BPA00001373562500254
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BPA00001373562500255
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BPA00001373562500256
FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：13)
2C6 CDR-L1：RASQGISSVLA(SEQ ID NO：14)
2C6 CDR-L2：DASSLES(SEQ ID NO：15)
2C6 CDR-L3：QQFNSYPYT(SEQ ID NO：16)
9H2重链
MDWTWRILFLVAAATGAHS
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS
Figure BPA00001373562500257
WVRQAPGQRLEWMG
Figure BPA00001373562500258
RVTITRDTSASTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
Figure BPA00001373562500259
WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：17)
9H2 CDR-H1：GYTFTSYVMH(SEQ ID NO：18)
9H2 CDR-H2：WINAGNGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO：19)
9H2 CDR-H3：GGMPVAGPGYFYYYGMDV(SEQ ID NO：20)
9H2轻链
METPAQLLFLLLLWLPDTTG
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC
Figure BPA00001373562500261
WYQQKPGQAPRLLIY
Figure BPA00001373562500262
GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYCC
Figure BPA00001373562500263
FGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：21)
9H2 CDR-L1：RASQSVSRSYLA(SEQ ID NO：22)
9H2 CDR-L2：GASSRAT(SEQ ID NO：23)
9H2 CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO：24)
重链免疫球蛋白可变区#1.0序列
E VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CTASGFTFSS YAMNWVRQAP GKGLEWVSAI SGSGGTTFYADSVKGRFTIS RDNSRTTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAKDLG WSDSYYYYYG MDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：25)；
轻链免疫球蛋白可变区#1.0序列
DIQMTQFP SSLSASVGDR VTITCRASQG IRNDLGWYQQ KPGKAPKRLI YAASRLHRGVPSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPEDFATYYC LQHNSYPCSF GQGTKLEIKR(SEQ ID NO：26)；
本发明的实施方案包括以下那些：其中免疫球蛋白例如以任意在此所列的那些的组合(例如重链Ig.#1.0和轻链Ig.#1.0；或LCC和HCA；或LCF和HCA；或LCC和HCB)被表达。轻链和重链的配对可导致抗体或其抗原结合片段的生成。
在本发明的一个实施方案中，轻链融合至免疫球蛋白恒定链，例如κ链。在本发明的一个实施方案中，重链融合至免疫球蛋白恒定链，例如γ-1、γ-2、γ-3或γ-4链。
其它可使用本发明的方法和组合物表达的感兴趣的蛋白质包括受体、配体、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素以及酶。
生产方法和材料
通过本领域已知的数种方法的任何一种，可将包含要通过本发明方法表达的基因的载体例如质粒导入宿主细胞中。可例如通过Graham和Van der Eb，Virology，52：546(1978)所描述的磷酸钙沉淀法进行转化。还可使用其它用于将DNA导入细胞中的方法，例如通过核注射或通过原生质体融合。用于转化的方法还包括电穿孔、脂质体转化和DEAE-葡聚糖转化。
在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。CHO-K1细胞需脯氨酸且对于二氢叶酸还原酶(dhfr)基因是二倍体。在本发明的一个实施方案中，细胞系是DXB11CHO细胞系(Urlaub等.(1983)Cell 33：405-412)。其它细胞系包括例如HEK293。
可选择并筛选包含要使用本发明的方法表达的基因的宿主细胞，以鉴定带有用于表达靶基因所必需特性的克隆。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，一种常规的实现最大表达的方法涉及使用突变体细胞系并在数月内渐增针对共转染的选择标记例如二氢叶酸还原酶(DHFR)的选择压力(Kaufman等.(1982)J.Mol.Biol.159：601-621；Schimke等.(1982)Natl.Cancer Inst.Monogr.60：79-86)。为了实现高生产率，用包含与要表达的靶基因组合的功能性DHFR基因的表达载体转化二氢叶酸还原酶(DHFR)阴性细胞系(例如CHO细胞系)(Urlaub等.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220)。反应于加入渐增量的DHFR拮抗剂氨甲喋呤(MTX)至培养基，出现了载体插入的靶基因的扩增，并产生了携带有多拷贝重组基因的克隆或亚群且可进行选择(Wurm(1990)Biologicals 18：159-164)。该基因扩增过程通常需数月，直至获得显示高靶基因拷贝数和期望蛋白质的高生产率的稳定的细胞系。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸被整合入宿主细胞(例如CHO、CHO-K1、CHO DXB11)染色体DNA中或是异位的并且自主复制。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸以每个细胞数个拷贝(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个拷贝)存在于细胞中。在表达载体已整合入宿主细胞的基因组DNA以提高稳定性的情况下，载体DNA的拷贝数以及相伴地，其能表达的产物的量可通过选择的细胞系而得以增加，在所述细胞系中，载体序列在整合入宿主细胞的DNA后得到扩增。可通过标准方法针对染色体掺入的DNA的存在和相对量以及相应的mRNA和多肽合成筛选整合的基因。例如，可通过标准方法例如DNA测序、DNA印迹法、RNA印迹法和/或蛋白质印迹法检测期望整合物(integrate)的存在。
数种本领域已知的细胞培养基的任何一种都可用于增殖表达靶基因的细胞。可利用数种商购培养基。如果表达要被治疗使用的蛋白质，则无动物产品培养基(例如无血清培养基(SFM))可能是所希望的。在本领域中已知有数种使细胞能适应于在无血清培养基中生长的方法。例如，直接适应包括仅仅将细胞从补充血清的培养基转换到无血清培养基。序贯适应(Sequential adaptation)或脱离(weaning)包括在数个步骤中将细胞从补充血清的培养基转换到无血清培养基中(例如25％SFM、50％SFM、75％SFM、接着90％SFM进行约3次传代，然后100％SFM)。与直接适应相比，序贯适应倾向于对细胞较不严苛。通常，与直接适应过程相比，为使细胞适应无血清培养基，培养物应当处于对数中期阶段、＞90％存活且以更高的初始细胞接种物接种。在本发明的一个实施方案中，初始哺乳动物细胞生长培养基是可从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)商购的EX-CELL ACF CHO培养基。该培养物是无动物成分、含有HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)、不含有L-谷氨酰胺、液体的、无菌过滤的且经细胞培养测试的。该培养基还包括无机盐、碳酸氢钠缓冲剂、必需和非必需氨基酸、维生素、重组人胰岛素、植物水解物、其它有机化合物、痕量元素和表面活性剂。该培养基还不含有抗生素、抗真菌剂或转铁蛋白并且也不含有动物来源的蛋白质或其它成分。通常，为了重构培养基，从业者应当在使用前向每升培养基无菌加入20-40ml的200mM L-谷氨酰胺溶液。
还可将包含含有要使用本发明的方法表达的基因的宿主细胞的细胞系保存在主细胞库(MCB)和/或工作细胞库(WCB)中。通常，在细胞系要被用于超过多个制造周期时，可建立由主细胞库或主种子库(MSB)和工作细胞库组成的双重细胞库系统。从单个宿主细胞克隆建立细胞系并将该细胞系用于构成MCB。通常，该MCB必须进行鉴定并对污染物例如细菌、真菌、病毒和支原体进行广泛地测试。可扩增来自MCB的细胞样品以形成WCB，在生产过程中于使用前对其进行细胞生存力的鉴定。可将MCB或WCB中的细胞保存于管形瓶中，例如，处于低温下(例如0℃或更低，-20℃或-80℃)。
通常，工作细胞库包括来自主库的一个管形瓶的细胞，该细胞在保存前已进行几次传代生长。一般而言，在将来需要细胞时，它们取自工作细胞库；然而，主细胞库仅在必要时使用，确保细胞保存物具有低传代数以避免在细胞培养中的遗传性变异。
本发明提供了两种用于生长细胞以及重组生产蛋白质的方法-“3级”方法和“增强的方法”。这两种方法都产生高水平的感兴趣的蛋白质，然而增强的方法产生特别高的水平。
在本发明的一个实施方案中，用于生产蛋白质，例如抗体(例如抗-IGF1R)的3级方法包括步骤：
1-在标准的初始哺乳动物生长培养基(例如加入L-谷氨酰胺(4mM)的Sigma CHO培养基)中扩增表达蛋白质的细胞。
该扩增可例如在摇瓶中进行。在本发明的一个实施方案中，通过以下步骤发生扩增：生长至约1-2X 106个细胞/ml，稀释那些细胞的样品(例如至约2.5-5x 105个细胞/ml的密度)并且，接着，再生长至约1-2X 106个细胞/ml，进行约10-30次传代。
2-用来自步骤(1)的扩增的细胞接种初始哺乳动物细胞生长培养基，至约2.5-5X 105个细胞/ml的细胞密度，并将添加物加入培养基。该添加物是小麦和/或大豆水解物、氨基酸进料、维生素/盐进料、葡萄糖和L-谷氨酰胺。
接种当天是“第0天”，下一天是“第1天”，再下一天是“第2天”，以此类推。
例如，在第0天或在活细胞密度已达到超过约106个细胞/ml后，加入大豆或小麦水解物。在本发明的一个实施方案中，在活细胞密度通常达到106个细胞/ml时，仅在第3天加入水解物。
例如，在第0天加入氨基酸进料(如上讨论的)，例如以达到大约如下所列的最终培养物浓度(不包括来自其它来源例如来自初始哺乳动物细胞生长培养基的任何所示成分的浓度)：
Figure BPA00001373562500291
Figure BPA00001373562500301
在本发明的一个实施方案中，不在培养基中加入氨基酸进料。
例如，在第3天到第5天之间或在活细胞密度达到约106个细胞/ml时，加入维生素/盐进料溶液(如上讨论的)，例如以达到大约如下所列的最终培养物浓度(不包括来自其它来源例如来自初始哺乳动物细胞生长培养基的任何所示成分的浓度)：
Figure BPA00001373562500302
Figure BPA00001373562500311
例如，在培养基中的葡萄糖浓度降至低于约1.5g/L时，加入葡萄糖，并且例如，在培养基中谷氨酰胺浓度降至低于约150mg/L时，加入L-谷氨酰胺。
3-任选地，例如在生存力低于60％时，通过从培养基中除去细胞(例如通过降低细胞的温度至约15℃，加入磷酸钠缓冲液以使pH稳定在约6.8并且对培养基进行离心以使其不含细胞)，从生产细胞培养基收获细胞。如果蛋白质被分泌，则可保留培养基用于进一步的处理，如果蛋白质不被分泌，则可保留细胞用于进一步的处理。
数种方法的任何一种都可用于从培养基中除去细胞，例如通过离心。例如，使用连续叠盘离心机，例如具有约9.27X 10-7的流速/σ(cm/sec)。
此外，使用或不使用离心机，培养基可经过滤除去细胞，例如通过深层过滤。例如，在本发明的一个实施方案中，使用离心机，该方法可包含使用8±2L液体培养基/ft2过滤器(例如带电的纤维素过滤器)；在本发明的一个实施方案中，不使用离心机，该方法可包含使用20±3L液体培养基/ft2过滤器。
此外，培养基可经精细过滤器过滤，所述过滤器例如具有0.2微米孔径(例如PVDF过滤器)。
并且；
4-任选地，例如，通过色谱法进一步纯化蛋白质，例如抗体。
在本发明的一个实施方案中，用于生产蛋白质例如抗体(例如抗-IGF1R)的增强的方法包含步骤：
1-在标准的初始哺乳动物生长培养基中扩增表达蛋白质的细胞。
该扩增可在例如摇瓶中进行。在本发明的一个实施方案中，通过以下步骤发生扩增：生长至约1-2X 106个细胞/ml，稀释那些细胞的样品(例如至约2.5-5x 105个细胞/ml的密度)并且，接着，再生长至约1-2X 106个细胞/ml，进行约10-30个循环。
2-用已扩增的细胞接种初始哺乳动物细胞生长培养基至约2.5-5X105个细胞/ml的细胞密度，并将添加物加入培养基。添加物是大豆和/或小麦水解物、氨基酸进料、维生素/盐进料、营养物进料、葡萄糖和L-谷氨酰胺。
接种当天是“第0天”，下一天是“第1天”，再下一天是“第2天”，以此类推。
例如，在第0天或在活细胞密度达到超过约106个细胞/ml后，加入大豆和/或小麦水解物。在本发明的一个实施方案中，仅在第3天加入水解物。
例如，在第0天加入氨基酸进料(如上讨论的)，例如以达到大约如下所列的最终培养物浓度(不包括来自其它来源例如来自初始哺乳动物细胞生长培养基的任何所示成分的浓度)：
Figure BPA00001373562500321
Figure BPA00001373562500331
在本发明的一个实施方案中，不在培养基中加入氨基酸进料。
例如，在第3天到第5天之间或在活细胞密度达到约1.2X 106个细胞/ml时，加入维生素/盐进料溶液(如上讨论的)，例如以达到大约如下所列的最终培养物浓度(不包括来自其它来源例如来自初始哺乳动物细胞生长培养基的任何所示成分的浓度)：
Figure BPA00001373562500332
Figure BPA00001373562500341
维生素/盐进料的某些成分也在其它进料例如氨基酸进料中。这些最终培养物浓度是来自维生素/盐进料的成分的浓度，并不反映来自氨基酸进料和维生素/盐进料两者的所示成分的累积浓度。
例如，在第3天到第5天之间或在活细胞密度达到约1.2X 106个细胞/ml时，加入营养物进料(如上讨论的)，例如以达到大约如下所列的最终培养物(不包括来自其它来源例如来自初始哺乳动物细胞生长培养基或氨基酸进料的任何所示成分的浓度)：
Figure BPA00001373562500342
Figure BPA00001373562500351
营养物进料的某些成分也在其它进料例如氨基酸进料中。这些最终的培养物浓度是来自营养物进料的成分的浓度，并不反映来自氨基酸进料和营养物进料两者的所示成分的累积浓度。
例如，在培养基中的葡萄糖浓度降至低于约1.5g/L时，加入葡萄糖，并且例如，在培养基中谷氨酰胺浓度降至低于约150mg/L时，加入L-谷氨酰胺。
3-任选地，例如在生存力低于60％时，通过从培养基中除去细胞(例如通过降低细胞的温度至约15℃，加入磷酸钠缓冲液以使pH稳定在约6.8并且对培养基进行离心以使其不含细胞)，从生产细胞培养基收获细胞。如果蛋白质被分泌，则可保留培养基用于进一步的处理，如果蛋白质不被分泌，则可保留细胞用于进一步的处理。
数种方法的任何一种都可用于从培养基中除去细胞，例如通过离心。例如，使用连续叠盘离心机，例如具有约9.27X 10-7的流速/σ(cm/sec)。
此外，使用或不使用离心机，培养基可经过滤除去细胞，例如通过深层过滤。例如，在本发明的一个实施方案中，使用离心机，该方法可包含使用8±2L液体培养基/ft2过滤器(例如带电的纤维素过滤器)；在本发明的一个实施方案中，不使用离心机，该方法可包含使用20±3L液体培养基/ft2过滤器。
此外，培养基可经精细过滤器过滤，所述过滤器例如具有0,2微米孔径(例如PVDF过滤器)。
并且；
4-任选地，例如，通过色谱法进一步纯化蛋白质，例如抗体。
任选地，在使用3级或增强的方法时，使培养物的重量摩尔渗透压浓度从约400mOsm改变至约500mOsm(如上讨论的)。在本发明的一个实施方案中，在细胞处于1X 106个细胞/ml或超过1X 106个细胞/ml的密度时，发生该改变。
任选地，在使用3级或增强的方法时，使培养物的温度改变至33℃-约35℃(如上讨论的)。在本发明的一个实施方案中，发生该改变，在本发明的一个实施方案中，在第4天到第8天之间，例如在24小时内活细胞密度改变小于10％时，发生该改变。
在本发明的一个实施方案中，在使用3级或增强的方法时，在细胞生长期间连续监测和调节细胞培养物O2浓度、pH和温度状况。在本发明的一个实施方案中，在细胞生长期间监测O2浓度并维持处于约60％；和/或在细胞生长期间连续监测pH并维持处于约6.8(例如±0.02)；和/或在细胞生长期间连续监测温度并维持处于约36.5℃(例如约±0.5℃)。
可在数种系统中的任何一种进行细胞生长。例如，可在简单烧瓶例如玻璃摇瓶中进行细胞生长。其它系统包括罐式生物反应器、袋式生物反应器和一次性生物反应器。罐式生物反应器通常包括金属容器(例如有不锈钢套的容器)其中，细胞在液体培养基中生长。罐式生物反应器可用于多种培养体积(例如100l、150l、10000l、15000l)。罐式生物反应器通常具有用于控制细胞生长条件的附加特征，包括用于温度控制、培养基搅拌、控制鼓气(sparge gas)浓度、控制pH、控制O2浓度、从培养基中取出样品、反应器重量指示和控制、清洗硬设备、消毒硬设备、布管或铺管以送递所有服务、加入培养基、控制pH、控制溶液、和控制气体、将无菌液体泵入生长容器中、以及监控和数据采集的装置。罐式生物反应器的分类包括搅拌罐式反应器，其中机械搅拌器(例如叶轮)用于混合反应器以散布热和物质(例如氧和底物)。泡罩塔反应器是高大的反应器，其仅使用空气来混合内容物。气升式反应器类似于泡罩塔反应器，但不同之处在于它们包含通风管。通风管通常是一种改善循环和氧转运且均衡反应器中剪切力的内管。在流化床反应器中，细胞被“固定”在随流体而移动的小颗粒上。该小颗粒形成用于细胞粘附的大表面积并使得能够进行高速的氧和营养物转运至细胞。在填充床反应器中，细胞被固定在大颗粒上。这些颗粒并不随液体而移动。填充床反应器容易构建且易于操作，但可能会遭遇堵塞和不良氧转运。一次性生物反应器是一种用后可丢弃的、一次使用的生物反应器。通常，一次性生物反应器具有类似于非一次性生物反应器的特征(例如搅拌系统、鼓泡装置、探头、端口等)。
本发明进一步包括通过在此所列的方法的任何一种所产生的任何液体培养基；例如，通过如下方法所产生的液体培养基，该方法包括用表达抗体轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的CHO DXB11宿主细胞接种预热至约37℃的初始哺乳动物细胞生长培养基至约2.5-5X 105个细胞/ml的细胞密度；该培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且其不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分；并且在所述接种前、同时或之后立即在培养基中加入下列添加物：
大豆水解物至约10g/L的终浓度；
以及，任选地，加入氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure BPA00001373562500371
Figure BPA00001373562500381
；并且，在活细胞密度达到超过约1.2X 106个细胞/ml时，加入添加物进料，其中通过所述添加物进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure BPA00001373562500382
Figure BPA00001373562500391
Figure BPA00001373562500401
；并且，在细胞生长期间，在葡萄糖水平降至低于约1.5g/L时，在培养基中加入葡萄糖，并且在L-谷氨酰胺水平降至低于约150mg/L时，加入L-谷氨酰胺；并且在细胞生长期间，维持O2浓度处于约60％；pH处于约6.8±0.02并且温度处于约36.5℃±0.5℃；例如，其中培养基包含已达到60％生存力的细胞。
实施例
为更加清楚地描述本发明提供以下信息，不应被解释为限制本发明。以下所描述的任何以及所有的组合物和方法，无论是全部还是一部分，均落入本发明的范围内。
实施例1：使用3级和增强的方法表达抗-IGF1R
进行使用增强的方法和3级方法的几次运转。在这些运转中，使表达抗-IGF1R LCF(κ)和HCA(γ-1)链的CHO DXB11细胞生长。加入了添加物的初始哺乳动物细胞生长培养基是EX-CELL ACF CHO培养基(Sigma-Aldrich；St.Louis，MO)。
进行相似的一组运转，其中没有加入进料(除了过程中的谷氨酰胺和葡萄糖之外)。在这些条件下，获得435mg/L的效价。通过对特异性附着于蛋白A的所产生的免疫球蛋白进行定量，估算该效价。根据对附着于反相色谱底物的免疫球蛋白进行定量，估算在下列3级和增强的方法运转中所获得的效价。如果使用反相定量法，在没有加入进料的运转中将获得约300mg/L的估算效价。
相对于在排除进料加入的运转中获得的效价，3级和增强的方法(如下讨论的)产生非常优良的效价。
增强的方法
细胞最初以3-4x 105个细胞/ml接种在预热至37℃的EX-CELLACF CHO培养基(Sigma-Aldrich；St.Louis，MO)中并调节至pH 6.8。
表1.对于增强的方法运转所加入的进料。
Figure BPA00001373562500411
SHYS进料：来自DMV international(荷兰)的200g/L(aq)大豆水解物进料
Hys进料：来自Kerry Biosciences的200g/L(aq)大豆水解物进料
CHO进料1：50X维生素/盐进料
CHO进料2：50X营养物进料
50X氨基酸进料
100X氨基酸进料
连续监测pH并调节至6.8的设定值。
连续监测氧浓度并调节至60％的设定值。
连续监测温度并维持在37±1℃。在所示批次中执行过程中的温度下调至34℃。
加入葡萄糖，例如，在培养基中的葡萄糖浓度降至低于1.5g/L时，并且加入L-谷氨酰胺，例如，在培养基中的谷氨酰胺浓度降至低于150mg/L时。由于加入营养物进料，重量摩尔渗透压浓度被改变至超过400mOsm。除在更早(第14-18天)收获的第3和4批之外，在第21-24天之间收获细胞；通常，在细胞生存力降低到约60％时。
表2.增强的方法运转的结果。
  批次   效价   比生产力
  1   2.2   26
  2   2.3   27
  3*   1.9   30
  4*   1.6   33
  5   2.2   26
*短缩的批次运转
在增强的方法中使用营养物进料时，可省去加入氨基酸进料。
3级方法
细胞最初以3-4x 105个细胞/ml被接种在预热至37℃并调节至pH6.8的EX-CELL ACF CHO培养基(Sigma-Aldrich；St.Louis，MO)中。
表3.对于3级方法所加入的进料
Figure BPA00001373562500421
SHYS进料：来自DMV international(荷兰)的200g/L(aq)的大豆水解物进料
CHO进料1：50X维生素/盐进料
50X氨基酸进料
100X氨基酸进料
连续监测pH并保持在6.8±0.02。
连续监测氧浓度并调节至60％的设定值。
连续监测温度并保持在36.5±0.5℃。
加入葡萄糖，例如，在培养基中的葡萄糖浓度降至低于1.5g/L时，并且加入L-谷氨酰胺，例如，在培养基中的谷氨酰胺浓度降至低于150mg/L时。
表4.3级方法运转的结果
  批次   效价(g/L)   比生产力
  A   1.4   19
  B   1.2   22
所使用的进料以及每种进料的成分的终浓度如下所列。
表5.维生素/盐进料
Figure BPA00001373562500431
Figure BPA00001373562500441
表6.氨基酸进料#1(50X).
表7.氨基酸进料#2(100X).
Figure BPA00001373562500451
表8.营养物进料.
Figure BPA00001373562500452
Figure BPA00001373562500461
***************************
本发明不限于在此所描述的特定实施方案的范围内。实际上，本发明的范围包括本文中特别所列的实施方案以及没有在本文中特别所列的实施方案；在本文中特别所列的实施方案并不必定意在穷举。根据前述描述，对于本领域技术人员而言，除那些在本文中所描述的之外，本发明的各种修改将变得显而易见。这样的修改旨在落入权利要求的范围中。
专利、专利申请、出版物、产品说明书以及实验方案引用本申请通篇中，为了所有目的其通过全文引用并入本文。
Figure IPA00001373562100011
Figure IPA00001373562100031
Figure IPA00001373562100041
Figure IPA00001373562100051
Figure IPA00001373562100061
Figure IPA00001373562100071
Figure IPA00001373562100081
Figure IPA00001373562100091
Figure IPA00001373562100101
Figure IPA00001373562100111
Figure IPA00001373562100121
Figure IPA00001373562100131

Claims (38)

1.用于生产蛋白质的方法，包括用表达该蛋白质的宿主细胞接种初始哺乳动物细胞生长培养基并将添加物加入该培养基中，所述添加物包括：
葡萄糖；
L-谷氨酰胺；
大豆水解物或小麦水解物或两者；
硫酸腺嘌呤；
腺苷；
钒酸铵；
生物素；
氯化胆碱；
氯化钴；
硫酸铜；
胞苷；
D-泛酸钙；
盐酸乙醇胺；
黄素腺嘌呤二核苷酸；
叶酸；
甘氨酸；
鸟苷；
次黄嘌呤；
i-肌醇；
L-丙氨酸；
L-精氨酸；
L-天冬酰胺；
L-天冬氨酸；
L-瓜氨酸；
L-半胱氨酸盐酸盐；
L-胱氨酸；
L-谷氨酸；
L-组氨酸；
硫辛酸；
L-异亮氨酸；
L-亮氨酸；
L-赖氨酸；
L-甲硫氨酸；
L-鸟氨酸盐酸盐；
L-苯丙氨酸；
L-脯氨酸；
L-丝氨酸；
L-苏氨酸；
L-色氨酸；
L-酪氨酸；
L-缬氨酸；
四水合氯化锰；
烟酸；
六水合二氯化镍；
孕酮；
二盐酸腐胺；
盐酸吡哆素；
核黄素；
无水钼酸钠；
磷酸二氢钠；
亚硒酸钠；
盐酸硫胺素；
胸苷；
无水氯化锡；
尿苷；
维生素B12；
维生素E；和
硫酸锌。
2.权利要求1的方法，其中从所述添加物加入培养基的成分的终浓度约为如下所列的那些：
Figure FPA00001373562400031
Figure FPA00001373562400041
3.权利要求1的方法，其中添加物是从包含以约如下浓度存在的氨基酸的氨基酸进料加入的：
Figure FPA00001373562400042
Figure FPA00001373562400051
4.权利要求3的方法，其中每升培养基加入约20ml氨基酸进料。
5.权利要求1的方法，其中添加物是从包含以约如下浓度存在的氨基酸的氨基酸进料加入的：
6.权利要求5的方法，其中每升培养基加入约10ml氨基酸进料。
7.权利要求1的方法，其中添加物是从包含以约如下浓度存在的添加物的营养物进料加入的：
Figure FPA00001373562400053
Figure FPA00001373562400061
8.权利要求7的方法，其中每升培养基加入约20ml营养物进料。
9.权利要求1的方法，其中添加物是从包含以约如下浓度存在的添加物的维生素/盐进料加入的：
Figure FPA00001373562400062
10.权利要求9的方法，其中每升培养基加入约20ml维生素/盐进料。
11.权利要求1的方法，进一步包括从宿主细胞收获培养基；其中所述蛋白质由所述细胞分泌至培养基中。
12.权利要求13的方法，其中在细胞生存力低于约60％时，从宿主细胞收获培养基。
13.权利要求11的方法，进一步包括通过对培养基进行离心和/或对培养基进行深层过滤和/或经0.2微米过滤器对培养基进行过滤而从细胞纯化培养基。
14.权利要求1的方法，其中蛋白质是抗体或其抗原结合片段的一条或更多条免疫球蛋白链。
15.权利要求14的方法，其中抗体或片段特异性结合IGF1R。
16.权利要求15的方法，其中抗体或片段包含：含有示于选自SEQ ID NOs：1、3，-6、13、21和26的成员的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs；和/或
含有选自SEQ ID NOs：2、7-9、17和25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链，或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs。
17.权利要求16的方法，其中由宿主细胞分泌的抗体或片段是包含以下成分的抗体：含有SEQ ID NO：3、4、5或6的氨基酸20-128的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO：8或9的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白。
18.权利要求17的方法，其中轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于γ-1免疫球蛋白恒定链。
19.权利要求1的方法，其中加入了添加物的初始哺乳动物细胞生长培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分。
20.用于生产抗体的方法，包括用表达抗体轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的CHO DXB11宿主细胞接种预热至约37℃的初始哺乳动物细胞生长培养基至约2.5-5X 105个细胞/ml的细胞密度；该初始培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且其不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分；并且在所述接种前、同时或之后立即在培养基中加入下列添加物：
大豆水解物至约10g/L的终浓度；
以及，任选地，加入氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure FPA00001373562400091
；并且，在活细胞密度达到超过约1.2X 106个细胞/ml时，加入添加物进料，其中通过所述添加物进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure FPA00001373562400092
Figure FPA00001373562400101
；并且，维持培养基中的葡萄糖浓度处于约1.5g/L并维持培养基中的L-谷氨酰胺浓度处于约150mg/L；并且在细胞生长期间维持O2浓度处于约60％；pH处于约6.8±0.02并且温度处于约36.5℃±0.5℃；并且，任选地，在细胞生存力低于约60％时，从培养基中除去宿主细胞。
21.权利要求20的方法，其中抗体包含：含有示于选自SEQ ID NOs：1、3，-6、13、21和26的成员的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs；和/或
含有选自SEQ ID NOs：2、7-9、17和25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链，或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs。
22.权利要求21的方法，其中抗体或片段包含由宿主细胞分泌的抗体，所述抗体包含：含有SEQ ID NO：3、4、5或6的氨基酸20-128的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO：8或9的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白。
23.权利要求22的方法，其中轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于γ-1免疫球蛋白恒定链。
24.权利要求23的方法，进一步包括通过对培养基进行叠盘离心、对培养基进行深层过滤和经具有约0.2微米孔径的过滤器对培养基进行过滤而从细胞回收培养基。
25.权利要求24的方法，进一步包括通过柱色谱分离而从培养基中纯化免疫球蛋白。
26.含水液体细胞培养基，包含：
约10g/L大豆水解物，
约1.5g/L葡萄糖，
约150mg/L L-谷氨酰胺，
约6.8±0.02的pH，
HEPES，
碳酸氢钠缓冲剂，
无机盐，
非必需氨基酸，
重组人胰岛素，
痕量元素，
表面活性剂，
氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure FPA00001373562400121
；其中该培养基不包含抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分。
27.通过如下方法生产的含水液体培养基，该方法包括用表达抗体轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的CHO DXB11宿主细胞接种预热至约37℃的初始哺乳动物细胞生长培养基至约2.5-5X 105个细胞/ml的细胞密度；该培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且其不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分；并且在所述接种前、同时或之后立即在培养基中加入下列添加物：
大豆水解物至约10g/L的终浓度；
以及，任选地，加入氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure FPA00001373562400131
；并且，在活细胞密度达到超过约1.2X 106个细胞/ml时，加入添加物进料，其中通过所述添加物进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些：
Figure FPA00001373562400132
Figure FPA00001373562400141
Figure FPA00001373562400151
；并且，维持培养基中的葡萄糖浓度处于约1.5g/L并且维持培养基中的L-谷氨酰胺浓度处于约150mg/L；并且在细胞生长期间维持O2浓度处于约60％；pH处于约6.8±0.02并且温度处于约36.5℃±0.5℃。
28.权利要求27的含水液体培养基，其中宿主细胞包含编码抗体的免疫球蛋白的载体，其中该抗体分泌入培养基中。
29.权利要求28的含水液体培养基，其中宿主细胞生存力为约60％或更低和/或其中宿主细胞生长已进行约14-24天。
30.权利要求29的含水液体培养基，其中从培养基中除去宿主细胞。
31.权利要求30的含水液体培养基，其中通过对培养基进行离心和/或对培养基进行深层过滤和/或经0.2微米过滤器对培养基进行过滤而从培养基中除去宿主细胞。
32.权利要求31的含水液体培养基，其中抗体特异性结合IGF1R。
33.权利要求32的含水液体培养基，其中免疫球蛋白重链包含示于选自SEQ ID NOs：1、3，-6、13、21和26的成员的氨基酸序列；或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs；
并且免疫球蛋白轻链包含选自SEQ ID NOs：2、7-9、17和25的氨基酸序列，或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs。
34.权利要求33的含水液体培养基，其中抗体或片段是由宿主细胞分泌的抗体，其包含：含有SEQ ID NO：3、4、5或6的氨基酸20-128的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO：8或9的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白。
35.权利要求34的含水液体培养基，其中轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于γ-1免疫球蛋白恒定链。
36.包含权利要求27的含水液体培养基的容器。
37.权利要求36的容器，其是烧瓶、生物反应器、罐式生物反应器、袋式生物反应器或一次性生物反应器。
38.权利要求37的容器，其中生物反应器是搅拌罐式生物反应器、泡罩塔生物反应器、气升式生物反应器、流化床生物反应器或填充床生物反应器。
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