CN101687910B - 具有高效分泌信号序列的哺乳动物表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于哺乳动物细胞的表达和分泌系统，及利用分泌性信号肽表达和分泌重组蛋白。本发明也涉及使哺乳动物细胞，具体是CHO细胞分泌异源基因所用的表达盒。本发明还涉及使哺乳动物细胞，如CHO细胞分泌异源蛋白的方法。

Description

具有高效分泌信号序列的哺乳动物表达载体
本发明涉及基于哺乳动物细胞的表达系统，及利用分泌性信号肽表达和分泌重组蛋白。本发明也涉及使哺乳动物细胞，具体是CHO细胞分泌异源基因的表达盒。本发明还涉及使哺乳动物细胞，如CHO细胞分泌异源蛋白的方法，和利用哺乳动物宿主细胞生产分泌性重组蛋白的方法。
可利用各种各样经基因工程改造的生物，包括原核和真核细胞来生产医学、研究和兽医应用所需的重组多肽。然而，许多这些蛋白是糖蛋白，需要翻译后修饰。因此，原核宿主细胞如细菌细胞不适合。为此理由，开发了利用高等真核细胞，如昆虫细胞或哺乳动物细胞的其它蛋白表达系统。病毒表达系统能在昆虫和小鼠细胞系中产生重组蛋白，但具有几种严重缺点，特别是纯化病毒感染系统中的重组蛋白问题很多。
生产和回收重组多肽生物技术存在的主要问题是经基因工程改造的生物其胞内蛋白或蛋白亚基不易分泌。这些胞内蛋白或蛋白亚基在细胞内常常只中等水平表达，它们的纯化必须包括先裂解细胞，然后经几步程序使所需多肽与其它胞内蛋白分离。
解决这些问题的一种方法是使重组蛋白分泌到周质间隙或培养基中。只要可能分泌是优选策略，因为能够容易而有效地纯化胞外培养基中的重组蛋白。此外，分泌产生的重组蛋白优点是可避免被蛋白酶水解并且蛋白质正确折叠的机会更优。蛋白质的成功分泌要求蛋白质能有效穿越内质网膜或胞质膜转运。细胞分泌通过细胞膜的蛋白质在细胞内一般为其前体形式，称为“前蛋白”。这种“前蛋白”形式在其氨基末端含有一附加的肽序列，此附加序列为初生肽链靶向内质网使其能进入分泌通路所需。此附加肽序列称为信号序列。
然而，已知分泌常常不能达到所需程度，例如，重组蛋白自身的天然信号序列在宿主细胞中常常不能很好运作。迄今，每种表达系统都需要专门定制才能符合每种蛋白生产的需要以确保其正确折叠、活性和所需的产量。虽然已鉴定到可用于具体重组蛋白质分泌的相当多的信号序列，但该领域仍然需要能够促进哺乳动物宿主细胞有效分泌重组蛋白，特别是免疫球蛋白的其它信号序列。
因此，本发明要解决的技术问题是提供一种使真核宿主细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞能有效分泌非分泌性活性多肽，具体是抗体链的方法。
本发明通过提供一种能使哺乳动物宿主细胞，特别是CHO细胞分泌异源蛋白的表达盒而解决了此技术问题，此表达盒包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编码异源蛋白的DNA序列，其中，编码该信号肽的DNA序列选自：SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10，或编码SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9所示氨基酸序列的DNA序列。
本发明的发明人发现，表达盒中所用的信号序列能使与其操作性相连的多肽序列在哺乳宿主细胞中适当加工和有效分泌。作为初步筛选，测试了19种不同的信号序列，它们衍生自常规用于重组蛋白生产的与CHO细胞不同物种的不同分泌性蛋白质，其中只有5种导致所测试多肽分泌的改进。因此，这些实验证明一般不能预测来自一种物种的信号序列在另一物种中是否也具有功能。
上述5种信号序列中的二种，名为V19(SEQ ID No.9)和V17(SEQ IDNo.7)的序列可导致细胞系分泌的抗体平均浓度比对照细胞系特别强地增加。
根据信号肽V19的氨基酸序列产生了以下信号肽的共有氨基酸序列：MMRP[疏水性氨基酸]nTSALA。根据信号肽V17的氨基酸序列产生了以下信号肽的共有氨基酸序列：MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC。
因此，本发明也通过提供具有通用氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸]nTSALA的信号序列，和具有通用氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC的信号序列解决了上述技术问题。在哺乳动物宿主细胞，如CHO细胞中这二种信号序列能使与其操作性相连的多肽序列如抗体链有效分泌。此序列中心区的疏水氨基酸宜选自：丙氨酸(Ala或A)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、苯丙氨酸(Phe或F)、甲硫氨酸(Met或M)和缬氨酸(Val或V)。Ala的亲水指数为1.8，Ile的亲水指数为4.5，Leu的亲水指数为3.8，Phe的亲水指数为2.8，Met的亲水指数为1.9，Val的亲水指数为4.2。中心的疏水氨基酸延伸链宜由Leu(L)与一些Val、Ala、Phe和Ile组成。中心的疏水氨基酸延伸链长度宜为4-9个氨基酸残基。优选中心疏水区包含4-16个氨基酸残基，特别优选4-9个残基。
本发明也涉及使哺乳动物宿主细胞分泌异源蛋白的表达盒，该表达盒包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编码异源蛋白的DNA序列，其中，编码该信号肽的DNA序列选自编码氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸]nTSALA的DNA序列，或编码氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC的DNA序列，其中n是4-16之间的整数，所述疏水氨基酸选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸。
在一特别优选的实施方式中，编码所述信号序列的DNA序列选自SEQID No.8或SEQ ID No.10，或编码SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示氨基酸序列的DNA序列。
本发明还涉及使哺乳动物宿主细胞分泌异源蛋白的表达盒，该表达盒包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编码异源蛋白的DNA序列，其中，编码该信号肽的DNA序列选自：SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10，或编码SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9所示氨基酸序列的DNA序列。
在本发明的内容中，“表达盒”由要表达的一个或多个基因和调控它们表达的序列如启动子/增强子序列组成，包括顺式作用转录控制元件的任何组合。调控基因表达，即基因转录和转录产物的翻译的序列通常称为调控单元。调控单元的大部分位于异源基因编码序列的上游并与其操作性相连。该表达盒也可包含含有聚腺苷酸化位点的下游3’非翻译区。本发明的调控单元或直接与要表达的基因即转录单元相连，或与其分开中间插入例如异源基因的5’非翻译区DNA。该表达盒优选侧接有一个或多个合适的限制性位点以便能将该表达盒插入到载体中和/或可从载体中切割下来。因此，可用本发明的表达盒构建表达载体，特别是哺乳动物表达载体。
在本发明的内容中，术语“异源编码序列”、“异源基因序列”、“异源基因”、“重组基因”或“感兴趣基因”可互换使用。这些术语指编码重组或异源蛋白产物，寻求在哺乳动物细胞中表达并以高产量收获的DNA序列。所述基因产物可以是蛋白或多肽，但也可以是肽。所述异源基因序列非天然存在于宿主细胞中，可衍生自不同物种的生物。
所述基因产物可以是任何感兴趣的蛋白质，例如治疗蛋白质如白介素，或酶，或多聚蛋白质的亚基如抗体或其片段。所述蛋白优选抗体或工程改造的抗体或其片段，最优选免疫球蛋白G(IgG)抗体。
按照本发明，术语“信号肽”或“信号序列”可互换使用，指分泌的膜结合蛋白质氨基末端的连续延伸氨基酸残基短链。该信号肽能使所述蛋白靶向分泌通路，使蛋白易化至内质网膜中后从其新生链上切断。信号肽由以下三个区域组成：一个氨基末端极性区(N区)，此区观察到有许多阳电荷氨基酸残基；一个由7-8个氨基酸残基组成的中心疏水区(H区)和一个包含有切割位点的羧基末端区(C区)。信号肽从该切割位点被切断产生成熟蛋白。
“启动子”定义为通常位于基因上游的DNA调控序列，它通过引导RNA聚合酶结合DNA并引发RNA合成而介导转录。
术语“功能性相连”和“操作性相连”可互换使用，指二个或多个DNA区段之间，特别是要表达的基因序列与调控其表达的那些序列之间的功能关系。例如，启动/增强子序列，如果需要其能刺激或调节某编码序列在合适的宿主细胞或其它表达系统中转录，包括顺式作用转录调控元件的任何组合的启动/增强子序列应操作性连接于编码序列。启动子调控序列应与被转录基因序列操作性相连并在物理上与该被转录序列毗连。
本发明另一方面涉及一种哺乳动物表达载体，其包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编码异源蛋白的DNA序列，其中，编码该信号肽的DNA序列选自编码氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸]nTSALA的DNA序列，或编码氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC的DNA序列，其中n是4-16之间的整数，所述疏水氨基酸是A、I、L、M、F或V。优选编码所述信号序列的DNA序列选自SEQ IDNo.8或SEQ ID No.10，或编码SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示氨基酸序列的DNA序列。
本发明也涉及一种哺乳动物表达载体，其包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编码异源蛋白的DNA序列，其中，编码该信号肽的DNA序列选自：SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10，或编码SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9所示氨基酸序列的DNA序列。
因此，本发明还涉及包含本发明分泌异源蛋白所用表达盒的哺乳动物表达载体。
在本发明内容中，“哺乳动物表达载体”优选是分离和纯化的DNA分子，将其转染入适当的哺乳动物宿主细胞中后能使该宿主细胞高水平表达重组基因产物。除编码重组或异源基因产物的DNA序列外，该表达载体还含有能在宿主细胞系中有效转录该DNA序列成为mRNA并且将该mRNA有效翻译成为蛋白质所需的调控性DNA序列。
在本发明一优选实施方式中，所述哺乳动物表达载体至少含有二个分开的转录单元。含二个分开转录单元的表达载体也称为双基因载体。一个例子是其中第一转录单元编码抗体的重链或其片段，第二转录单元编码抗体的轻链的载体。另一个例子是二个转录单元编码某蛋白质如酶的二个不同亚基的双基因载体。然而，本发明的表达载体也可包含二个以上分开的转录单元，例如三个、四个或甚至更多个分开的转录单元，每个单元包含编码不同多肽链的不同核苷酸序列。一个例子是含有四个分开的转录单元的载体，每个单元包含编码由四个不同亚基组成的酶的一个亚基的不同核苷酸序列。
本发明的哺乳动物表达载体优选还包含至少一个在动物细胞中可选择的表达标记。可采用任何常用的选择标记，如胸苷激酶(tk)、二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)。
在一特别优选的实施方式中，所述哺乳动物表达载体含GS选择标记(Bebbington等，1992，利用谷氨酰胺合成酶基因作为扩增选择标记使骨髓瘤细胞高水平表达重组抗体(High-level expression of a recombinant antibodyfrom myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiableselectable marker)，Bio/Technology 10：169-175；Cockett等，1990，利用谷氨酰胺合成酶基因扩增在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高水平表达金属蛋白酶组织抑制剂(High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases inChinese Hamster Ovary(CHO)cells using Glutamine synthetase geneamplification)，Bio/Technology 8：662-667)。此GS系统是对产生治疗性蛋白质特别重要的仅有的两种系统之一。与二氢叶酸还原酶(DHFR)系统相比，GS系统在发育过程中赋予了很大的时间优点，因为它常常能使最初的转染子产生高产细胞系，从而不需要在浓度递增的选择剂存在下进行多轮选择以实现基因扩增(Brown等，1992，利用谷氨酰胺合成酶(GS)系统生产重组抗体方法的发展(Process development for the production of recombinantantibodies using the glutamine synthetase(GS)system)，Cytotechnology9：231-236)。
本发明的表达载体还优选含有数目有限的有用的限制性位点以供插入本发明分泌异源蛋白的表达盒。在具体只用于短暂/游离型表达的情况下，本发明的表达载体还可包含在真核宿主细胞中能自身复制/维持游离型的复制起始位点，例如EB病毒(EBV)或SV40病毒的起始位点，但可缺乏选择标记。也可以在缺乏相关因子的细胞中短暂表达来促进该载体的复制。
本发明另一方面涉及含有本发明哺乳动物表达载体的哺乳动物宿主细胞。术语“宿主细胞”或“宿主细胞系”指能够在培养中生长并表达所需蛋白重组产物的任何细胞，特别是哺乳动物细胞。
哺乳动物宿主细胞可以是人或非人细胞。哺乳动物宿主细胞的优选例子包括但不限于：MRC5人成纤维细胞、983M人黑色素瘤细胞、MDCK犬肾细胞、分离自Sprague-Dawley大鼠的RF培养的大鼠肺成纤维细胞、B16BL6鼠黑色素瘤细胞、P815鼠肥大细胞瘤细胞和MT1A2鼠乳房腺癌细胞。
在一特别优选的实施方式中，所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或细胞系(Puck等，1958，J Exp Med.108：945-955)。适合的CHO细胞系包括例如，CHO K1(ATCC CCL-61)、CHO pro3-、CHO DG44、CHOP12或dhfr-CHO细胞系DUK-BII(Chassin等，PNAS 77，1980，4216-4220)或DUXB11(Simonsen等，PNAS 80，1983，2495-2499)。
为了将该表达载体引入本发明哺乳动物宿主细胞中，可采用本领域熟知的对给定类型宿主细胞适合的任何转染技术，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染、脂转染。注意用本发明载体转染的哺乳动物宿主细胞应解释成是能被短暂或稳定转染的细胞系。因此，本发明的哺乳动物表达载体可维持为游离型或可稳定地整合入哺乳动物宿主细胞的基因组中。
短暂转染的特征是对载体上负载的选择标记不施加任何选择性压力。在常用的转染后至多20-50小时短暂表达的实验中，转染载体维持为游离型元件而不整合入基因组中。即转染的DNA通常不整合入宿主细胞的基因组中。宿主细胞倾向于丢失转染的DNA，并且转染细胞在该短暂转染细胞群培养中过度生长。因此，表达最强是在转染后的即刻时间内但随着时间推移而衰减。宜将本发明的瞬时转染子理解为转染后在缺乏选择压力的细胞培养中能维持生长最长达90小时的细胞。
在本发明一优选的实施方式中，用本发明的哺乳动物表达载体稳定转染哺乳动物宿主细胞，如CHO宿主细胞。稳定转染意味着新引入的外源DNA如载体DNA通常经随机非同源性重组掺入到基因组DNA中。通过选择载体序列整合入宿主细胞DNA中后已扩增的细胞系，使得载体DNA的拷贝数和伴随的基因产物产量增加。因此，这种稳定的整合有可能通过接触而进一步提高基因扩增的选择压力，使CHO细胞中的微小染色体加倍。此外，稳定转染可能导致与重组基因产物表达不直接相关的载体序列部分，如基因组整合时多余的细菌拷贝数控制区丢失。因此，转染的宿主细胞将该表达载体的至少一部分或不同部分整合入基因组中。
本发明的另一方面涉及一种生产重组蛋白的方法，包括以下步骤：
a)用表达载体转染哺乳动物宿主细胞或宿主细胞系，b)在合适条件下培养该细胞使之增殖，表达重组蛋白并且该重组蛋白由宿主细胞分泌到培养基中，和c)收获分泌到培养基中的重组蛋白。
因此，本发明还涉及一种生产重组蛋白的方法，包括：a)用表达载体转染哺乳动物宿主细胞或宿主细胞系，b)在合适条件下培养该细胞使之增殖，表达重组蛋白并且该重组蛋白由宿主细胞分泌到培养基中，和c)收获培养基中产生的重组蛋白。
哺乳动物细胞系的合适培养基和培养方法是本领域熟知的，例如可参见US 5,633,162中所述。实验室培养或低密度细胞培养并且符合特定类型细胞要求的标准细胞培养基的例子包括但不限于：Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)1640培养基(Morre，G.，美国医学会杂志，199：519，1967)、L-15培养基(Leibovitz，A等，Amer J.of Hygiene，78：173，1963)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Eagle最低必须培养基(MEM)、汉母F12(Ham’s F12)培养基(Ham，R等，Proc.Natl.Acad.Sc.53：288，1965)、或Iscoves改良的缺乏白蛋白、转铁蛋白和卵磷脂的DMEM培养基(Iscoves等，J ExpMed.1：923，1978)。例如，专门设计了汉母F10或F12培养基用于CHO细胞培养。欧洲专利EP-481,791中描述了专门适合CHO细胞培养的其它培养基。已知这类培养基可添加胎牛血清(FBS，也称为胎小牛血清FCS)，后者可提供天然来源的多种激素和生长因子。哺乳动物细胞的培养现今已是科学书籍和手册中有全面描述的常规操作，其细节可参见R.Ian Fresney的动物细胞培养(Culture of Animal cells)手册，第4版，Wiley-Liss/N.Y，2000。
在本发明的一优选实施方式中，所用的细胞培养基不含胎牛血清(FCS或FBS)，称之为“无血清”培养基。无血清培养基培养细胞通常需要在其中加入胰岛素和转铁蛋白方能最佳生长。转铁蛋白可用非肽类的螯合剂或铁载体如WO 94/02592中所述的托酚酮(tropolone)至少部分替代，或提高与抗氧化剂如维生素C有益结合的有机铁源的水平。大多数细胞系需要一种或多种合成的生长因子(包括重组多肽)，包括例如，表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I和II(IGFI、IGFII)等等。可能需要的其它类型的生长因子包括：前列腺素、转运和结合蛋白(如血浆铜蓝蛋白、高密度和低密度载脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA))、激素(包括类固醇激素)和脂肪酸。多肽生长因子的测试最好分步进行，在发现能够刺激生长的因子存在下检测新的多肽因子。这些生长因子可以是合成和重组的因子。动物细胞培养有几种熟知的方法，下文将描述其中一个例子。最初的步骤是从添加血清的培养基中转移后获得使细胞存活和/或缓慢生长3-6天的条件。对大多数类型的细胞而言，此条件至少部分根据接种密度。一旦发现最佳的激素/生长因子/多肽添加，可降低存活所需的接种密度。
在另一优选的实施方式中，所述细胞培养基无蛋白质，即无胎牛血清和单种蛋白生长因子添加剂或其它蛋白质如重组转铁蛋白。
在另一实施方式中，本发明方法涉及在例如工业化分批进料生物反应罐中高密度培养动物宿主细胞来表达和收获重组蛋白产物。可能需要采用常规的下游加工。因此，必须用高密度生长培养基。这类高密度生长培养基通常添加有营养物，例如所有氨基酸、上述给定范围内的能源如葡萄糖、无机盐、维生素、微量元素(定义为通常最终浓度在微摩尔范围内的无机化合物)、缓冲剂、四种核苷或它们的相应核苷酸、抗氧化剂如谷胱苷肽(还原型)、维生素C和其它组分，如重要的膜脂质如胆固醇或磷酯酰胆碱，或脂质前体如胆碱或肌醇。高密度培养基将富含这些化合物的大多数或全部，除了无机盐需要根据基础等渗培养基的渗量调节外，它们的含量与RMPI1640相比，高于GB2251249的上述标准培养基(强化)。优选强化本发明的高密度培养基，使每升培养基除色氨酸外的所有氨基酸含量超过75mg。与通用氨基酸需求相结合，优选高密度培养基的谷氨酰胺和/或天冬酰胺每升含量超过1g，更优选每升2g。在本发明的内容中，高密度细胞培养定义为，动物细胞群中的活细胞短暂密度至少达到或超过105个细胞/毫升，优选至少达到或超过106个细胞/毫升，该细胞群以恒定的或递增的培养体积，在细胞培养基中接种一个细胞或接种低密度活细胞后不停地生长。
在另一优选实施方式中，本发明的方法包括分批进料培养。分批进料培养是一种培养系统，如GB2251249所述，此系统除了通过单独的进料控制葡萄糖浓度外，还在细胞培养时至少进料谷氨酰胺，任选与一种或几种其它氨基酸，优选甘氨酸一起进料以维持培养基中它们的浓度。更优选在细胞培养中进料谷氨酰胺和任选一种或几种其它氨基酸时，如EP-229809所述，共同进料一种或多种能源如葡萄糖。进料通常开始于启动培养后25-60小时；例如，当细胞密度达到106个细胞/毫升时开始进料。本领域熟知在培养的细胞中，“谷氨酰胺代谢(glutaminolysis)”(McKeehan等，1984，动物细胞中的谷氨酰胺代谢(Glutaminolysis in animal cells)，刊登在“培养细胞中的糖代谢(Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells)”，M.J.Morgan编，Plenum Press，纽约，第11-150页)可能成为生长期的重要能源。谷氨酰胺和/或天冬酰胺(用天冬酰胺替代谷氨酰胺，参见Kurano，N等，1990，J.Biotechnology 15：113-128)的进料总量通常范围是每升培养体积0.5-10g，优选1-2g；进料时每升培养基中的其它氨基酸总共10-300mg，具体说，与其它氨基酸相比，常常进料较高量的至少150-200mg的甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。可快速加入或连续泵入这种进料，优选几乎连续不断地将进料泵入生物反应罐中。不用说，应加入碱或缓冲剂以小心地将分批进料培养期间生物反应罐中的pH控制为给定细胞系生长所需的大约最佳生理pH。当采用葡萄糖作为能源时，葡萄糖的进料总量通常为每升培养基1-10g，优选3-6g。除了包括氨基酸外，进料宜包含每升培养基5-20mg的少量胆碱。更优选，基本上如US 6,048,728所述，胆碱进料与乙醇胺的添加组合，特别是与进料谷氨酰胺组合。不用说，当采用GS标记系统时，加入的谷氨酰胺比非GS表达系统要少，因为除了内源产生的以外，过量谷氨酰胺的积累会产生铵而伴有毒性。对于GS，培养基或进料中的谷氨酰胺常常可用其等价物和/或前体，即天冬酰胺和/或谷氨酸代替。
收集，即分离和/或纯化培养过细胞的培养基中给定蛋白质的方法是本领域熟知的。
附图中阐述了本发明的优选实施方式。显示的是：
图1显示不同的信号序列当用于CHOK1SV细胞短暂转染时对分泌的抗体浓度的影响。显示了用含不同信号序列的载体转染CHOK1SV细胞所获得抗体浓度。n＝6。
图2显示不同的信号序列当用于静置培养的稳定细胞系时对分泌的抗体浓度的影响。框图显示用含不同信号序列的载体稳定转染CHOK1SV细胞所获得抗体浓度范围。稳定的GS细胞系在24孔板中能过度生长14天，用蛋白A HPLC法测定此时的抗体浓度。显示了平均抗体浓度，用*号标出表明平均抗体浓度的统计学显著性增加(用ANOVA计算P≤0.05)。n＝100。
图3显示信号序列V19当用于悬浮培养的稳定细胞系时对分泌的抗体浓度的影响。框图显示用含对照序列或V19信号序列的载体稳定转染CHOK1SV细胞所获得的抗体浓度范围。产生了稳定的GS细胞系并评价了对设计用于最小实验室规模的生物反应罐分批进料培养最好的60个细胞系。用蛋白A HPLC法测定抗体浓度。显示了平均抗体浓度，用ANOVA计算P值。n＝60。
图4显示在10升生物反应罐中培养稳定细胞系时信号序列V19对分泌的抗体浓度的影响。框图显示用含对照序列或V19信号序列的载体产生的稳定细胞系在10升实验室规模生物反应罐中所获得的抗体浓度范围。产生了稳定的GS细胞系并评价了分批进料培养最好的8个细胞系。用蛋白AHPLC法测定抗体浓度。显示了平均抗体浓度。n＝8。
以下序列表显示：
SEQ ID No.1显示构建pV12所用信号肽的氨基酸序列。此信号肽衍生自黄白蛉(Sandfly yellow)相关蛋白，其序列如下：mrfffvflaivlfqgihg。此SEQID No.1信号肽也称为信号肽V12。
SEQ ID No.2显示编码SEQ ID No.2所示信号肽氨基酸序列的核酸序列，其序列如下：5’-atgagattctttttcgtgttcctggccatcgtgctgttccagggcatccacg-3’。
SEQ ID No.3显示构建pV14所用信号肽的氨基酸序列。此信号肽衍生自家蚕蚕丝蛋白(Silkworm Fibroin)LC，其序列如下：mkpiflvllvvtsaya。此SEQ ID No.3信号肽也称为信号肽V14。
SEQ ID No.4显示编码SEQ ID No.3所示信号肽氨基酸序列的核酸序列，其序列如下：5’-atgaagcccatctttctggtgctgctggtcgtgaccagcgcctacgcc-3’。
SEQ ID No.5显示构建pV16所用信号肽的氨基酸序列。此信号肽衍生自蛇PLA2，其序列如下：mrtlwimavlllgveg。此SEQ ID No.5信号肽也称为信号肽V16。
SEQ ID No.6显示编码SEQ ID No.5所示信号肽氨基酸序列的核酸序列，其序列如下：5’-atgaggaccctgtggatcatggccgtgctgctgctgggcgtggagggccaggtg-3’。
SEQ ID No.7显示构建pV17所用信号肽的氨基酸序列。此信号肽衍生自海萤夜光虫(Cypridina Noctiluca)萤光素酶，其序列是mktlilavalvycatvhc。此SEQ ID No.7信号肽也称为信号肽V17。
SEQ ID No.8显示编码SEQ ID No.7所示信号肽氨基酸序列的核酸序列，其序列如下：5’-atgaaaaccctgatcctggccgtggccctggtgtactgcgccaccgtgcactgc-3’。
SEQ ID No.9显示构建pV19所用信号肽的氨基酸序列。此信号肽衍生自蜂鸟窝(Pinemoth)丝蛋白LC，其序列是mmrpivlvllfatsala。此SEQ ID No.9信号肽也称为信号肽V19。
SEQ ID No.10显示编码SEQ ID No.9所示信号肽氨基酸序列的核酸序列，其序列如下：5’-atgatgaggcccatcgtgctggtgctgctgttcgccacctccgccctggcccaggtg-3’。
通过以下实施例更详细说明本发明。
实施例
材料和方法
所用细胞
CHO细胞系CHOK1SV：是细胞系CHO-K1的变体，已适应悬浮培养和在无蛋白培养基中生长。
CHOK1SV细胞的增殖：
在装有CD-CHO培养基(Invitrogen)和添加了6mM谷氨酰胺的摇瓶中常规悬浮培养增殖CHOK1SV细胞。接种浓度为2×105个细胞/ml，每4天分瓶培养一次。摇瓶充满含5％CO2的空气，36.5℃(35.5℃至37℃之间)140rpm轨道振摇培养。
短暂转染：
用悬浮培养细胞进行短暂转染。作细胞计数后分布到24孔板添加有10％血清和6mM L-谷氨酰胺的DMEM基础培养基的各孔中，每孔2.5×105个活细胞，+36.5℃培养过夜。次日用1ml新鲜培养基(同上)替换条件培养基，+37℃培养细胞3小时。
对于每种转染，将5μg的各SGV(HC和LC-SGV一起混合)或5μg的DGV重悬浮于100μL转染培养基(OptiMEM，Invitrogen)中。对于阳性对照，还用含编码模型抗体的IgG4/κ抗体重链和轻链基因的载体pcB72.3转染细胞。也包括阴性对照(只是水)。
对于每种转染，取5μL脂转染胺-2000试剂(Invitrogen)用100μL转染培养基稀释，混合后室温静置5分钟。合并DNA与稀释的脂转染胺试剂，混合后再室温静置20分钟。然后取200μL混合物加入到24孔板的含细胞孔中，+37℃培养细胞4或10天。收集培养上清液并通过离心澄清，然后用组装ELISA检测存在的抗体。
稳定转染产生静置培养的细胞：
如上所述，悬浮培养转染用的细胞。离心培养细胞，用无血清培养基洗涤一次，然后重悬成1.43x107个细胞/毫升的浓度。取0.7毫升体积的细胞悬液和40μg质粒DNA加入到电穿孔小杯中。将小杯置于电穿孔装置中输送250V和400μF单个电脉冲。转染后将细胞分种在96孔板的孔中，每孔约2500个宿主细胞(5×104个细胞/ml)，采用非选择性DMEM基础培养基并添加10％dFCS进行培养。36.5℃(35.5℃至37℃之间)在含10％CO2的空气环境中培养该板。
转染后当天，各孔加入添加有10％dFCS/66μM L-甲硫氨酸磺酰亚胺(L-methionine sulphoximine)的DMEM基础培养基(150μL/孔)，L-甲硫氨酸磺酰亚胺最终浓度50μM。监测该板确定非转染细胞死亡的时间和转染细胞灶出现的时间。大约在转染后3-4周转染细胞灶变得明显。检查所有的细胞系，进一步增殖只含单个集落的孔中的细胞。
评估静置培养细胞系的产率
培养96孔转染板大约3周使形成细胞集落。用显微镜检查产生的集落以查证大小适合(覆盖孔底60％以上)试验并且每孔只存在一个集落的细胞。
将合适的集落转移到含有1mL选择性培养基(DMEM基础培养基/10％dFCS/25μM L-甲硫氨酸磺酰亚胺)的24孔板的孔中。36.5℃(35.5℃至37℃之间)在含10％CO2的空气环境中培养这些培养物14天。收集各孔上清液用蛋白A HPLC方法分析存在的抗体浓度。
装配ELISA：
用能检测装配的人IgG的夹心ELISA测定样品的抗体浓度。这包括将样品和标准品捕获到包被有抗人Fc抗体的96孔板上。用连接了辣根过氧化物酶的抗人轻链(抗体)和显色底物TMB揭示结合的抗体。与标准品相比，显色程度与样品中存在的抗体浓度成比例。
蛋白A HPLC：
在Agilent 1100HPLC仪上进行蛋白A亲和色谱法检测IgG。IgG产物能选择性结合Poros蛋白A免疫检测柱。洗去柱上不结合的物质，降低溶剂的pH以释放仍旧结合的抗体。监测洗脱液的280nm吸收值，针对通用的抗体标准品给产物定量(用Chemstation软件)并针对消光系数差异作出修正。
稳定转染产生悬浮培养的细胞：
从贮藏的CHOK1SV细胞系复苏产生CHOK1SV宿主细胞。离心后来生长培养的细胞，用CD-CHO培养基洗涤一次后重悬浮成1.43×107个细胞/毫升的浓度。每次转染时，取大约0.7毫升细胞悬液和40μg质粒DNA加入到各电穿孔小杯中。用二个电穿孔小杯的内容物制备了4份转染。将各电穿孔小杯置于电穿孔装置中，输送300V和900μF单个电脉冲。转染后合并所有需要的小杯中的细胞，分种在96孔板的孔中，每孔约2500个宿主细胞(0.5×105个细胞/毫升)至10000个宿主细胞(2.00×105个细胞/毫升)，采用培养基CD-CHO/酚红。加入酚红只为显示有细胞生长。35.5℃至37℃在含10％体积CO2的空气环境中培养该板。
转染后当天，各孔加入150μL选择性培养基(CD-CHO/酚红/66μMMSX)。各孔中MSX的最终浓度为50μM。监测该板确定非转染细胞死亡时留下转染细胞灶。大约在转染后3-4周转染细胞灶变得明显。以目视评估确定，检查了所有的转染子，进一步增殖只含单个集落的孔中的转染子。
选择细胞系评价静置培养：
培养96孔转染板约3-4周使形成细胞集落。用显微镜检查产生的集落以查证大小适合(覆盖孔底60％以上)评估并且每孔只存在一个集落的细胞。取培养上清液，用Lonza ELISA法检测抗体。评估取样时该孔细胞生长融合的百分率。检测结果除以生长融合百分率所得的值可用于细胞系排序。
在含培养基CD-CHO/酚红/25μM MSX(此培养基用于整个静置培养期)的24孔板中扩增高排序细胞系。达到融合时，用此培养物接种T25培养瓶，剩余培养物用新鲜培养基再饲养并放回培养箱。在T25瓶中达到融合时，用新鲜培养基饲养该培养物以促进细胞形成多层而适应悬浮培养。
对于96孔板增殖的那些细胞系，进行了第二次产率评估。再培养经过增殖和重饲养的24孔板培养物14天直到细胞融合或达到低存活率(过度生长)。此时，收集培养上清液，用蛋白A HPLC方法检测抗体浓度。按产率给细胞系排序，增殖高排序细胞系以进行悬浮培养评价。
扩增细胞系进行CDACF悬浮培养：
从融合生长的T25瓶培养物开始悬浮培养，采用培养基CD-CHO/25μMMSX。接种细胞浓度的选择取决于T25瓶中检测到的活细胞浓度。如果活细胞浓度高于0.40×106个活细胞/毫升，加入CD-CHO/25μM MSX培养基至活细胞浓度为0.20×106个活细胞/毫升，125mL摇瓶中细胞悬浮液的最终体积为5-30mL。如果活细胞浓度为0.25-0.40×106个活细胞/毫升，加入CD-CHO/25μM MSX培养基至细胞浓度为0.15×106个活细胞/毫升，125mL摇瓶中细胞悬液的最终体积为5-30mL。如果T25瓶培养最长14天后活细胞浓度低于0.25×106个细胞/毫升，取10ml各培养物加入125mL摇瓶的10mL CD-CHO/25μM MSX培养基中自行增殖
从静置培养转为悬浮培养后，4天传代一次的培养方案用CD-CHO/25μM MSX培养基对细胞系作系列传代培养，直到培养的细胞系达到可接受的可繁殖的生长特性。在125mL摇瓶中制备培养物，培养体积30mL，最初细胞接种浓度为0.05-0.20×106个活细胞/毫升。当第4天(传代培养当天)活细胞浓度连续超过0.40×106个活细胞/毫升时，以0.20x106个活细胞/毫升常规接种培养细胞。
分批进料摇瓶培养：
在250mL摇瓶中对选出的各细胞系培养物用培养基CM42/SPE制备30mL细胞悬液。以0.20×106个活细胞/毫升接种培养物，各培养瓶顶部空间充满含5％体积CO2的空气。35.5℃至37℃在摇动平台上140±5rpm培养细胞直到峰值后活细胞浓度低于或等于1.00×106个活细胞/毫升或培养到15天(“过度生长”)。此时收集培养物。
用Vi-Cell自动细胞计数器测定第7天和14天时的细胞浓度。第3天各30mL培养物中加入2.1mL SF40。第8和11天培养物中分批进料加入360μL二代饲养的SF41。第7和14天取培养上清液样品，-20±5℃冻存直到用蛋白A HPLC检测装配的抗体。
10升生物反应罐培养：
评价了10升生物反应罐培养的细胞系。使16种细胞系培养物的体积增加到足够接种一个10升气升式生物反应罐。调节接种体积达到接种密度约0.20×106个细胞/毫升。用分批进料方法运转生物反应罐15天。取培养上清液样品，用蛋白A HPLC检测装配的抗体。
载体构建
合成了编码cB72.3抗体可变区的基因优化的DNA序列。作为合成中的一部分，加入编码信号肽链的核酸序列。总共采用了19种不同的信号序列(序列V1-V19)。将轻链序列克隆到pEE12.4衍生表达载体pConPlusκ中，此载体包含κ链恒定区的DNA序列。将重链克隆到pEE6.4衍生载体pConPlusIgG4中，此载体包含IgG4恒定区的DNA序列。然后一起克隆有关载体的NotI/PvuI片段产生双基因表达载体。经DNA测序证实所有构建物的序列正确。
作为初步筛选，将19种构建物与采用常规信号序列的相应对照用脂转染胺-2000(Invitrogen)瞬时转染入CHOK1SV宿主细胞中。转染这些构建物六次，用ELISA检测培养基中的抗体浓度。该试验鉴定到19种构建物中有五种可导致平均抗体浓度比对照显著增加，而其余构建物导致的抗体浓度与对照相等或减少。这些构建物是：含信号序列SEQ ID No.1的pV12(信号序列V12)、含信号序列SEQ ID No.3的pV14(信号序列V14)、含信号序列SEQ ID No.5的pV16(信号序列V16)、含信号序列SEQ ID No.7的pV17(信号序列V17)和含信号序列SEQ ID No.9的pV19(信号序列V19)。
采用在瞬时转染系统中表达改善的含5种信号序列的构建物在CHOK1SV细胞中创建了稳定的细胞系。用蛋白A HPLC检测了每种构建物100个细胞系培养基中的抗体浓度。对照细胞系的平均抗体浓度为89mg/L。5种信号序列中的二种产生的细胞系平均抗体浓度比对照细胞系有统计学上的显著增加，序列V17(SEQ ID No.7)导致的平均抗体浓度为106mg/L(增加19％，P＝＜0.05)，序列V19(SEQ ID No.9)导致的平均抗体浓度为118mg/L(增加32％，P＝＜0.05)。稳定细胞系的数据见图1。
利用SDS-电泳评价产物质量时，观察用对照序列或替代的信号序列所产生抗体之间无大的结构差异。质谱法评价产物质量表明，用替代信号序列产生的抗体与对照预期质量相当，提示它们可能已被正确加工。此研究证明不同的信号序列以不同效率起效，表明信号序列的选择可能是优化抗体表达的关键因素。
为了明确在整个细胞系构建过程中此种序列是否导致了抗体浓度增加，制备了编码cB72.3的IgG1/κ抗体的构建物。该构建物使用经基因优化的与编码信号序列SEQ ID No.9(V19)(pcB72，3IgG1V19)或常用的抗体衍生信号序列(pcB72.3IgG1)的DNA序列融合的基因。
将这些构建物稳定转染入CHOK1SV细胞中。96孔板中筛选转染子，在24孔板中扩增高排序细胞系。达到融合生长时，在T25培养瓶中增殖最好的60个细胞系然后使之适应摇瓶悬浮培养。评估分批与分批进料摇瓶培养的产率，用第14天分批进料过度生长培养物的培养上清液分析产物的质量。
在分批进料培养中，采用信号序列SEQ ID No.9的构建物显示平均抗体浓度比对照增加6％(p＝0.08)。用SDS-电泳分析、IEF、寡聚糖分析进行产物质量评估时揭示，用对照或含信号序列SEQ ID No.9(V19)的构建物转染的培养物之间无明显差别。用电喷质谱显示用V19序列产生的抗体质量与用对照构建物产生的相同，提示抗体分泌过程中V19序列已被正确加工。
在采用10升实验室规模生物反应罐的分批进料生物反应罐培养中，进行了16次10升实验室规模生物反应罐培养。诸细胞系达到最大活细胞浓度的范围很广。含信号序列SEQ ID No.9(V19)的细胞系达到了9.6-17.9×106个细胞/毫升，对照信号序列的细胞系达到了8.5-19.1×106个细胞/毫升。“新信号序列”培养物活细胞浓度的平均时间积分(IVC)为2395×106个细胞.小时/毫升，而对照细胞系的IVC为2511×106个细胞.小时/毫升。含信号序列V19(SEQ ID No.9)的细胞系收获的平均抗体浓度为2870.3mg/L，对照细胞系为2577.1mg/L。第15天收获生物反应罐培养物。
根据实验室规模生物反应罐培养的结论是，含V19的细胞系导致平均抗体浓度提高11％，然而差异无统计学意义是由于观察到的产率范围太广。

Claims (6)

1.一种使哺乳动物宿主细胞分泌异源蛋白的表达盒，该表达盒包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编码异源蛋白的DNA序列，其中，编码该信号肽的DNA序列选自SEQ ID No.10，或编码SEQ ID No.9所示氨基酸序列的DNA序列。
2.一种哺乳动物表达载体，其包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编码异源蛋白的DNA序列，其中，编码该信号肽的DNA序列选自SEQ ID No.10，或编码SEQ ID No.9所示氨基酸序列的DNA序列。
3.含有权利要求2所述哺乳动物表达载体的哺乳动物宿主细胞。
4.如权利要求3所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
5.一种生产重组蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)用权利要求2所述的表达载体转染哺乳动物宿主细胞，
b)在合适的条件下在培养基中培养该宿主细胞，使细胞增殖和表达重组蛋白，并且重组蛋白由宿主细胞分泌到培养基中，
c)收获培养基中分泌的重组蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。
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