JP5301534B2 - 高効率の分泌性シグナル配列を有する哺乳類発現ベクター - Google Patents
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Description
a) 哺乳類の宿主細胞または宿主細胞株を発現ベクターでトランスフェクトすること、
b) 細胞の増殖および組換えタンパク質の発現および宿主細胞から培地への組換えタンパク質の分泌を可能にする適切な条件下で前記細胞を培養すること、および
c) 培地に分泌された組換えタンパク質を収穫すること。
a) 哺乳類の宿主細胞または宿主細胞株を発現ベクターでトランスフェクトすること、
b) 細胞の増殖および組換えタンパク質の発現および宿主細胞から培地への組換えタンパク質の分泌を可能にする適切な条件下で前記細胞を培養すること、および
c) 培地から産生された組換えタンパク質を収穫すること。
配列番号 1は、構築物 pV 12に使用されたシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。このシグナルペプチドはSandfly Yellow関連タンパク質から由来したmrfffvflaivlfqgihgである。配列番号 1のシグナルペプチドは、シグナルペプチド V12とも称される。
材料および方法
使用した細胞
CHO 細胞株 CHOK1 SVは、細胞株 CHO-K1のバリアントであり、浮遊および無タンパク質培地における成長に適応している。
CHOK1SV細胞を、6 mMのL-グルタミンを補充されたCD-CHO 培地(インビトロゲン)中で浮遊振盪フラスコでルーチン的に増殖した。種濃度(Seed concentration)は2 x 105細胞/mlであり、細胞は4日毎に分けられた。フラスコは、5% CO2で処理され、36.5゜C (35.5゜C および 37.0゜Cの間)で軌道振盪で140 rpmでインキュベーションされた。
一過性のトランスフェクションを、浮遊成長細胞(suspension-growing cells)を用いて行なった。細胞を、計数し、24-ウェルプレートのウェルに2.5 x 105 生細胞/ウェルで10% 血清 および 6 mM L-グルタミンを補充されたDMEMベースの培地中に分けられ、一晩+36.5 ゜Cでインキュベーションした。次の日に、馴化培地(conditioned medium)を1 mLの新鮮な培地(上記のとおり)で置換し、細胞を3 時間+37 ゜Cでインキュベーションした。
トランスフェクションに使用される細胞を、前に詳細に説明したとおり細胞浮遊培養で成長させた。成長している培養物からの細胞を、1.43 x 107細胞/mLの濃度に再懸濁される前に、遠心分離し、無血清培地で一度洗浄した。0.7 mL 容量の細胞懸濁液および40 μgのプラスミド DNAを、エレクトロポレーションキュベットに添加した。次に、キュベットをエレクトロポレーション装置に配置し、単一パルスの250 V および 400 μFをあたえた。トランスフェクションにつづき、10% dFCSを補充した非選択的なDMEM-ベースの培地を用いて、96ウェルプレートに約 2,500 宿主細胞/ウェル(5 x 104/mL)で細胞を分けた。プレートを、36.5゜C (35.5゜C および 37.0゜Cの間)で空気中に10% CO2の雰囲気でインキュベーションした。
96-ウェルのトランスフェクション プレートを、約 三 週間インキュベーションして、コロニー形成を許容させた。生じたコロニーを顕微鏡的に検査して、コロニーがアッセイに適切なサイズ(ウェルの底面の60%をこえて被覆している)であること、ただ一つのコロニーが各ウェルに存在したことを検証した。
サンプルの抗体濃度をサンドイッチ ELISAを用いて決定し、これにより会合したヒト IgGが測定された。これには抗-ヒト Fc 抗体で被覆した96ウェルプレートにサンプル および 標準を捕獲することが含まれる。結合した抗体は、抗ヒト軽鎖と西洋わさびペルオキシダーゼの連結および色素生産性の基質TMBで明らかとされる。色素の発生は、標準と比較した場合のサンプルに存在する抗体の濃度と比例的であった。
IgGの測定のためのプロテインA アフィニティークロマトグラフィー法は、Agilent 1100 HPLCで行われた。IgG 産物は、選択的にPoros プロテインA 免疫検出 カラムに結合する。非結合物質をカラムから洗浄し、残っている結合抗体を溶媒のpHを減少させて放出した。溶出を280 nmでの吸光度でモニターした。産物を、一般の抗体標準に対して定量した(Chemstation ソフトウェアを用いて)。補正を吸光係数における差に関して行った。
CHOK1SV 宿主細胞を、CHOK1SV 細胞株の貯蔵物から復活させた。続いて成長している培養物からの細胞を、1.43 x 107生細胞/mLの濃度に再懸濁する前に、遠心分離し、CD-CHO培地で一度洗浄した。各トランスフェクションに対して、約 0.7 mL の細胞懸濁液および40 μgのプラスミド DNAを、各エレクトロポレーションキュベットに添加した。四つのトランスフェクションを、二つのエレクトロポレーションキュベットの内容物を用いて調製した。各エレクトロポレーションキュベットをエレクトロポレーション装置に配置し、単一パルスの300 V, 900 μFをあたえた。トランスフェクションにつづき、全ての必要とされたキュベットからの細胞を、プールし、96ウェルプレートに約 2,500 宿主細胞/ウェル(0.50 x 105/mL)から10,000 宿主細胞/ウェル(2.00 x 105/mL)で培地 CD-CHO/フェノールレッドを用いて分けた。フェノールレッドは、細胞成長を示す目的でのみ添加された。プレートを、35.5 から 37.0゜Cで空気中に10% v/v CO2の雰囲気でインキュベーションした。
96-ウェルのトランスフェクション プレートを、約 三から四 週間インキュベーションして、コロニー形成を許容させた。生じたコロニーを顕微鏡的に検査して、それらが評価に適切なサイズ(ウェルの底面の60%をこえて被覆している)であること、ただ一つのコロニーが各ウェルに存在したことを検証した。培養上清を、除去し、Lonza's ELISA法を用いて抗体をアッセイした。ウェルのコンフルエンスのパーセンテージ(percentage confluence)を、標本抽出の時間に評価した。コンフルエンスのパーセンテージでのアッセイ結果を除することにより得た値を使用して、細胞株をランクした。
培地 CD-CHO/25 μM MSXを用いて、浮遊培養をコンフルエントなT25 フラスコ培養から開始した。接種細胞の濃度の選択は、測定したT25 フラスコ中の生細胞濃度に依存的である。生細胞濃度が0.40 x 106 生細胞/mLより多い場合、CD-CHO/25 μM MSX 培地を添加して、125 mLの振盪フラスコにおいて5 から 30 mLの最終容量に0.20 x 106 生細胞/mLの生細胞濃度とした。生細胞濃度が0.25 から 0.40 x 106 生細胞/mLである場合、CD-CHO/25 μM MSX 培地を添加して、125 mLの振盪フラスコにおいて5 から 30 mLの最終容量に0.15 x 106 生細胞/mLの細胞濃度とした。生細胞濃度がT25フラスコ中で最大で十四日後に0.25 x 106/mL未満である場合、10 mLの各培養物を自動的に125 mLの振盪フラスコ中の10 mLのCD-CHO/25 μMのMSX培地に進行させた。
各々の選択された細胞株の培養物を、CM42/SPE培地を用いて250 mLの振盪フラスコに30 mLの細胞懸濁液で調製した。培養物を0.20 x 106 生細胞/mLで播種し、各培養の上部空間(headspace)を空気中に5% v/v CO2を含むもので平衡化した。培養物を35.5 から 37.0 ゜Cで140 ± 5 rpmの振盪プラットホームで、生細胞濃度(ポストピーク)が1.00 x 106 生細胞/mL未満もしくはその濃度と等しくなる又は15日に達する(過剰成長)までインキュベーションした。このポイントで、培養物を収穫した。
細胞株を1OLのバイオリアクターで評価した。十六の細胞株の培養の容量を、一つの10リットルのエアリフトバイオリアクターを播種するため十分な容量がえられるまで増加させた。播種物(inoculum)の容量を調整して、約 0.2x 106細胞/mlの種密度(seed density)を達成した。バイオリアクターを、流加を用いて15 日間行った。培養上清のサンプルをとり、会合した抗体に関してプロテインA HPLCでアッセイした。
可変領域をコード化している遺伝子至適化DNA配列(cB72.3 抗体)を合成した。合成の一部として、シグナル配列鎖をコード化している核酸配列を付加した。全体で19の異なるシグナル配列(配列 V1-V19)が使用された。軽鎖の配列を、Kappa 定常領域のDNA 配列を含むpEE12.4由来発現ベクター pConPlusKappaにクローン化した。重鎖を、IgG4 定常領域 DNA 配列を含むpEE6.4由来ベクター pConPlusIgG4にクローン化した。次に、二重の遺伝子発現ベクターを、関連するベクターのNot I/Pvu I 断片を共にクローニングすることで産生した。全ての構築物の配列を、DNAシークエンシングにより確認した。
Claims (6)
- 異種性のタンパク質をコード化しているDNA 配列にインフレームに連結されたシグナルペプチドをコード化しているDNA 配列に機能的に連結されたプロモーターを含んでいる哺乳類の宿主細胞からの異種性タンパク質の分泌のための発現カセットであって、前記シグナルペプチドをコード化しているDNA 配列は、配列番号10または配列番号9に示されるアミノ酸配列をコード化しているDNA 配列から選択される発現カセット。
- 異種性のタンパク質をコード化しているDNA 配列にインフレームに連結されたシグナルペプチドをコード化しているDNA 配列に機能的に連結されたプロモーターを含んでいる哺乳類の発現ベクターであって、前記シグナルペプチドをコード化しているDNA 配列は、配列番号10または配列番号9に示されるアミノ酸配列をコード化しているDNA 配列から選択される発現ベクター。
- 請求項2に記載の哺乳類の発現ベクターを含んでいる哺乳類の宿主細胞。
- 前記細胞はチャイニーズハムスター 卵巣 (CHO) 細胞である、請求項3に記載の哺乳類の宿主細胞。
- 組換えタンパク質の産生のための方法であって、以下の工程を含む方法:
a) 哺乳類の宿主細胞を請求項2に記載の発現ベクターでトランスフェクトすること、
b) 前記細胞の増殖および前記組換えタンパク質の発現および前記宿主細胞から培地への組換えタンパク質の分泌を可能にする適切な条件下の培地で前記宿主細胞を培養すること、
c) 前記培地から分泌された組換えタンパク質を収穫すること。 - 請求項5に記載の方法であって、前記哺乳類の宿主細胞がCHO 細胞である方法。
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