KR20100027127A

KR20100027127A - 고효율 분비 신호 서열을 가진 포유류 발현 벡터

Info

Publication number: KR20100027127A
Application number: KR1020097025275A
Authority: KR
Inventors: 로버트 영; 제임스 랜스
Original assignee: 론자 바이올로직스 피엘씨
Priority date: 2007-06-04
Filing date: 2008-06-03
Publication date: 2010-03-10
Also published as: EP2152728B1; CA2687921A1; US8241870B2; WO2008148519A3; US20100240097A1; SG182147A1; IL202266A0; AU2008258832A2; AU2008258832A1; EP2152728A2; CN101687910B; CN101687910A; ES2410559T3; JP2010528634A; WO2008148519A2; GB0710614D0; AU2008258832B2; JP5301534B2

Abstract

본 발명은 포유류 세포 기재 발현 및 분비 시스템, 및 분비 신호 펩티드를 이용하는 재조합 단백질의 발현 및 분비에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유류 세포, 특히 CHO 세포로부터 이종 유전자의 분비에 유용한 발현 카세트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CHO 세포와 같은 포유류 세포로부터 이종 단백질을 분비하는 방법에 관한 것이다.

Description

고효율 분비 신호 서열을 가진 포유류 발현 벡터 {MAMMALIAN EXPRESSION VECTOR WITH A HIGHLY EFFICIENT SECRETORY SIGNAL SEQUENCE}

본 발명은 포유류 세포 기재 발현 시스템, 및 분비 신호 펩티드 이용에 의한 재조합 단백질의 발현 및 분비에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유류 세포, 특히 CHO 세포 유래의 이종 유전자 분비에 유용한 발현 카세트 (cassette) 에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 또한 CHO 세포 등의 포유류 세포 유래의 이종 단백질의 분비 방법 및 포유류 숙주 세포에서 분비된 재조합 단백질의 생산 방법에 대한 것이기도 하다.

항체와 같은, 의료, 연구 및 수의학 적용에서 재조합 폴리펩티드는 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 광범위한 종류의 유전자 조작 유기체를 이용하여 생산된다. 그러나, 다수의 이들 단백질은 번역 후 개질을 요구하는 당단백질이다. 따라서, 박테리아 세포와 같은 원핵 숙주 세포는 적합하지 않다. 이러한 이유로, 더 고등한 진핵생물의 세포, 예컨대 곤충 세포 또는 포유류 세포를 이용해 기타 단백질 발현 시스템을 개발하였었다. 바이러스의 발현 시스템은 곤충과 마우스 세포주 모두에서 재조합 단백질을 생산할 수 있으나, 몇 가지 심각한 문제점, 특히, 바이러스에 감염된 시스템으로부터의 재조합 단백질의 정제가 매우 곤란하다는 점이 있다.

생명공학에서의 주요 문제점은, 유전자 조작 유기체에서 용이하게 분비되지 않는 세포내 단백질 또는 단백질 서브유닛 (subunit) 등의 재조합 폴리펩티드의 생산 및 회수이다. 종종 이들 세포내 단백질 또는 단백질 서브유닛은, 세포 내에서 단지 보통 수준으로만 발현될 수 있는데, 이들의 정제에는 세포를 용해하는 단계 후에 기타 세포내 단백질에서 원하는 폴리펩티드를 단리하는 수 가지의 절차를 우선적으로 포함해야 한다.

이러한 문제점들을 해결하기 위한 한 가지 접근법은 재조합 단백질을 원형질막 주위공간 또는 배양 배지로 분비시키는 것이다. 가능할 때마다, 분비는 세포외 배지로부터 정제를 용이하고 유효하게 만들기 때문에, 바람직한 전략이다. 게다가, 재조합 단백질의 분비 생산물은, 단백질 분해를 피할 수 있고, 정확한 단백질 접기라는 더 나은 기회가 존재한다는 이점을 지닌다. 성공적인 단백질 분비에는 소포체 또는 원형질막을 횡단하는 단백질의 유효한 전위 (translocation) 가 요구된다. 세포막을 통해 세포로부터 분비되는 단백질들은 일반적으로 세포 내에서 전구체 형태로 생성되며, 이는 "프레단백질 (preprotein)" 로 지칭된다. 이러한 "프레단백질" 형태는, 아미노 말단에 추가의 펩티드 서열을 포함하는데, 이는 신생 펩티드 사슬을 소포체로 타겟팅시켜 분비 경로로 진입할 수 있게 하는데 필요하다. 이러한 추가적인 펩티드 서열을 신호 서열로 지칭한다.

그러나, 분비는 종종 원하는 정도로 작동되지 않는데, 예를 들면 재조합 단백질의 천연 신호 서열이 숙주 세포에서 종종 잘 작동되지 않기 때문이다. 현 재까지도, 각각의 발현 시스템은, 정확한 접기, 활성 및 원하는 수율이 확보되도록, 각 단백질 생산물의 요건을 충족하기 위한 특수 맞춤을 필요로 한다. 특정 재조합 단백질의 분비에 유용할 수 있는 꽤 많은 신호 서열들이 동정되어 있지만, 포유류 숙주 세포에서 재조합 단백질, 특히 면역글로불린의 유효한 분비를 촉진시킬 수 있는 추가의 신호 서열이 여전히 당업계에서는 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 기초가 되는 기술적인 과제는, 비분비 적격 (non-secretion competent) 폴리펩티드, 특히 항체 사슬을 중국 햄스터의 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포 등의 진핵 숙주 세포로부터 효과적으로 분비하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, 이러한 기술적인 과제를, 이종 단백질을 인코딩 (encoding) 하는 DNA 서열에 프레임 (frame) 으로 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는, 포유류 숙주 세포, 특히 CHO 세포에서, 이종 단백질을 분비하기 위한 발현 카세트를 제공함으로써 해결하는데, 이때 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: SEQ ID No. 2, SEQ No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7 또는 SEQ ID No. 9 에 나타낸 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열.

본 발명의 발명자들은, 발현 카세트에서 활용되는 신호 서열이 포유류 숙주 세포에서 작동적으로 연결된 폴리펩티드 서열의 적절한 프로세싱 (processing) 및 유효한 분비를 위해 제공된다는 점을 발견하였다. 초기 스크린 (screen) 으로서는, 재조합 단백질 생산에서 관례적으로 사용되는 CHO 세포에 분비된 상이한 종의 상이한 단백질로부터 유도한 19 개의 상이한 신호 서열을 시험하였었는데, 이들 중 오직 5 개만이 시험된 폴리펩티드의 분비를 개선시켰다. 그리하여, 상기 실험으로, 어느 한 종 유래의 신호 서열이 또 다른 한 종에서 작동할 수 있을지의 여부는 일반적으로 예측할 수 없다는 것이 입증되었다.

5 개의 신호 서열 중 2 개, 즉 V19 (SEQ ID No. 9) 및 V17 (SEQ ID No. 7) 은, 대조군 세포주보다 평균 항체 농도에서 두드러지게 크게 증가한 세포주를 도모했다.

신호 펩티드 V19 의 아미노산 서열을 기준으로 하여, 신호 펩티드의 하기의 공통 아미노산 서열을 유도하였다: MMRP [소수성 아미노산]_nTSALA. 신호 펩티드 V17 의 아미노산 서열을 기준으로 하여, 신호 펩티드의 하기 공통 아미노산 서열을 유도했다: MKT[소수성 아미노산]_nCATVHC.

따라서, 본 발명은, 일반 아미노산 서열 MMRP [소수성 아미노산]_nTSALA 를 가진 신호 서열 및 나아가 일반 아미노산 서열 MKT[소수성 아미노산]_nCATVHC 을 가진 신호 서열도 제공함으로써, 기술적인 문제를 해결한다. 두 신호 서열 모두는 CHO 세포 등의 포유류 숙주 세포에서, 작동적으로 연결된 폴리펩티드 서열, 예를 들어 항체 사슬의 효율적인 분비에 대비한다. 중심 영역에서 소수성 아미노산은 알라닌 (Ala 또는 A), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 메티오닌 (Met 또는 M) 및 발린 (Val 또는 V) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. Ala 의 소수성 지표 (hydropathy index) 는 1.8 이다. Ile 의 소수성 지표는 4.5 이다. Leu 의 소수성 지표는 3.8 이다. Phe 의 소수성 지표는 2.8 이다. Met 의 소수성 지표는 1.9 이다. Val 의 소수성 지표는 4.2 이다. 바람직하게는, 소수성 아미노산의 중심 연속체 (stretch) 는 특히 Leu (L) 로 이루어져 있으며, 종종 Val, Ala, Phe 및 Ile 이 존재한다. 중심 소수성 연속체는 4 내지 9 개의 아미노산 잔기들을 갖는 것이 바람직하다. 중심 소수성 영역은 4 내지 16 개의 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 4 내지 9 개의 잔기를 포함한다.

본 발명은 또한, 이종 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 프레임으로 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 숙주 세포의 이종 단백질의 분비를 위한 발현 카세트에 관한 것으로, 이때 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 아미노산 서열 MMRP [소수성 아미노산]_nTSALA 을 인코딩하는 DNA 서열 또는 아미노산 서열 MKT [소수성 아미노산]_nCATVHC 을 인코딩하는 DNA 서열로부터 선택되고, 여기서 n 은 4 내지 16 의 정수이고, 소수성 아미노산은 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 메티오닌 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특히 바람직한 구현예에서, 신호 서열을 인코딩하는 DNA 서열은 SEQ ID No. 8 또는 SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 7 또는 SEQ ID No. 9 로 나타낸 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열로부터 선택된다.

본 발명은 또한 이종 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 프레임으로 연결되는 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는, 포유류 숙주 세포로부터의 이종 단백질 분비를 위한 발현 카세트에 관한 것으로, 이때 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 SEQ ID No. 2, SEQ No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7 또는 SEQ ID No. 9 로 나타낸 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 문맥에서, "발현 카세트" 란, 발현될 하나 이상의 유전자 및 이들의 발현을 조절하는 서열, 예컨대 시스-작용 전사 조절 요소들의 임의의 조합을 포함하는 프로모터/인핸서 (enhancer) 서열로 구성되어 있다. 유전자의 발현, 즉 이의 전사 및 그 전사 생산물의 번역을 조절하는 서열은 통상 조절 유닛 (unit) 으로 지칭된다. 조절 유닛의 대부분은 이종 유전자의 코딩 서열의 상류에 작동적으로 연결되어 위치한다. 발현 카세트는 또한 폴리아데닐화 부위를 포함하는 하류의 3' 비번역 영역을 포함할 수도 있다. 본 발명의 조절 유닛은 발현되는 유전자, 즉 전사 유닛에 직접적으로 연결되거나, 또는 이로부터, 개재 (intervening) DNA, 예컨대 이종 유전자의 5'-비번역 영역에 의해 분리된다. 바람직하게는, 발현 카세트는 하나 이상의 적합한 제한 부위에 인접하여 (flanking), 발현 카세트의 벡터로의 삽입 및/또는 벡터로부터의 이의 제거를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 발현 벡터, 특히 포유류 발현 벡터의 구축에 사용될 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "이종 코딩 서열" , "이종 유전자 서열", "이종 유전자", "재조합 유전자" 또는 "관심 유전자" 는 상호교환하여 사용된다. 이들 용어는, 포유류 세포에서 발현되어 다량으로 수확되도록 추구되는 재조합 또는 이종 단백질 생산물을 인코딩하는 DNA 서열을 지칭한다. 유전자의 생산물은 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있으나, 또한 펩티드도 가능하다. 이종 유전자 서열은 천연적으로 숙주 세포에 존재하지 않고, 상이한 종의 유기체에서 유도된다.

유전자의 생산물은 임의의 관심 단백질, 예를 들어 치료학적 단백질, 예컨대 인터류킨 또는 효소, 또는 다량체 단백질 (multimeric protein) 의 서브유닛, 예컨대 항체 또는 이의 절편일 수 있다. 바람직하게, 단백질은 항체 또는 조작된 항체 또는 이의 절편이며, 가장 바람직하게는, 이는 면역글로불린 G (IgG) 항체이다.

본 발명에 따르면, 용어 "신호 펩티드" 또는 "신호 서열" 은 상호교환적으로 사용되며, 분비된 및 막-결합 (membrane-bound) 의 단백질의 아미노-말단에서 아미노산 잔기의 계속되는 짧은 연속체를 지칭한다. 신호 펩티드는 단백질을 분비 경로로 타겟팅하고, 소포체 막에서 한번은 전위된 신생 사슬로부터 절단된다. 신호 펩티드는 3 가지 영역으로 이루어져 있다: 아미노-말단 극 영역 (N 영역) {종종 포지티브 전하 아미노산 잔기가 관찰됨}, 7 ~ 8 개의 아미노산 잔기의 중심 소수성 영역 (H 영역), 및 절단 부위를 포함하는 카르복시-말단 영역 (C 영역). 성숙한 단백질로부터 신호 펩티드의 절단은 상기 절단 부위에서 발생한다.

"프로모터" 는, RNA 폴리머라아제를 DNA 에 결합하도록 인도해 RNA 합성을 개시하는 것에 의한 전사 개시를 중재하는 유전자의 상류에 일반적으로 위치하는 조절 DNA 서열로서 정의된다.

용어 "작동적으로 연결된" 및 "작용적으로 연결된" 은 상호교환하여 사용되며, 둘 이상의 DNA 단편, 특히 발현될 유전자 서열과 이들의 발현을 조절하는 상기 서열 간의 작동적인 관계를 지칭한다. 예를 들어, 시스-작용 전사 조절 인자의 임의의 조합을 포함하는 프로모터/인핸서 서열은, 이것이 적절한 숙주 세포 또는 기타 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극 또는 조절하는 경우, 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 전사된 유전자 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 조절 서열은 전사된 서열에 물리적으로 인접해 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 이종 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 프레임으로 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터에 관한 것으로, 이때 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 아미노산 서열 MMRP [소수성 아미노산]_nTSALA 을 인코딩하는 DNA 서열 또는 아미노산 서열 MKT [소수성 아미노산]_nCATVHC 을 인코딩하는 DNA 서열 (여기서, n 은 4 내지 16 의 정수이고, 소수성 아미노산은 A, I, L, M, F 또는 V 임) 로부터 선택된다. 바람직하게도, 신호 서열을 인코딩하는 DNA 서열은 SEQ ID No. 8 또는 SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 7 또는 SEQ ID No. 9 로 나타낸 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열로부터 선택된다.

본 발명은 또한 이종 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 프레임으로 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터에 관한 것으로, 이때 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 SEQ ID No. 2, SEQ No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7 또는 SEQ ID No. 9 로 나타낸 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 이종 단백질의 분비를 위한 발현 카세트를 포함하는 포유류 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 문맥에서, "포유류 발현 벡터" 는, 적절한 포유류 숙주 세포 내로 트랜스펙션 (transfection) 시 그 숙주 세포 내에 재조합 유전자 생성물의 고수준의 발현을 제공하는 바람직하게는 단리된 및 정제된 DNA 분자이다. 재조합 또는 이종 유전자 생산물을 인코딩하는 DNA 서열에 더해, 발현 벡터는 숙주 세포주에서 DNA 코딩 서열의 mRNA 로의 효과적인 전사, 및 상기 mRNA 의 단백질로의 효과적인 번역을 위해 요구되는 조절 DNA 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 포유류 발현 벡터는 적어도 2 개의 개별적인 전사 유닛을 포함한다. 두 개의 개별적인 전사 유닛을 가진 발현 벡터는 또한 이중-유전자 벡터로서 지칭된다. 이의 예는, 제 1 의 전사 유닛이 항체의 중쇄 또는 그의 단편을 인코딩하고 제 2 의 전사 유닛이 항체의 경쇄를 인코딩하는 벡터이다. 또 다른 예는, 2 개의 전사 유닛이 효소와 같은 단백질의 2 개의 상이한 서브유닛을 인코딩하는 이중-유전자 벡터이다. 그러나, 본 발명의 발현 벡터가 2 개 초과의 개별적인 전사 유닛, 예를 들어 3 개, 4 개 또는 그 보다 더 많은 개별적인 전사 유닛을 포함하고, 이들 유닛 각각이 상이한 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것도 또한 가능하다. 이에 따른 예는, 4 개의 개별적인 전사 유닛을 가진 벡터인데, 상기 유닛 각각은 상이한 4 개의 서브유닛으로 이루어진 효소의 한 서브유닛을 인코딩하는 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 포유류 발현 벡터는 동물 세포에서 선택가능한 하나 이상의 발현가능한 마커 (marker) 를 추가로 포함한다. 티미딘 키나아제 (tk), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 또는 글루타민 합성효소 (GS) 와 같이 통상 사용되는 임의의 선택 마커가 사용될 수 있다.

특히 바람직한 구현예에서, 포유류 발현 벡터는 GS 선택 마커를 포함한다 (Bebbington et al., 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10:169-175; Cockett et al., 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification, Bio/Technology 8: 662-667). GS-시스템은 치료 단백질을 생산하는데 특히 중요한 오직 2 개의 시스템 중 하나이다. 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 시스템과 비교했을 때, GS 시스템은 발생 동안 큰 시간 이점을 제공하는데, 그 이유는 고도의 생산성의 세포주를 종종 초기 트랜스펙션체 (transfectant) 로부터 생산할 수 있어, 유전자 증폭을 달성하기 위해 증가하는 농도의 선택제의 존재하에서 수 회의 선택에 대한 필요를 피할 수 있기 때문이다 (Brown et al., 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9:231-236).

바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터는 또한 본 발명의 이종 단백질의 분비를 위한 발현 카세트의 삽입에 유용한 제한 부위를 제한된 수로 포함한다. 특히 일시적/에피솜 발현에 대해서만 사용될 경우, 본 발명의 발현 벡터는 진핵 숙주 세포에서 자발적 복제/에피솜 유지를 위한 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus, EBV) 또는 SV40 바이러스의 기원과 같은 복제 기원을 추가로 포함할 수 있으나, 선택 마커는 결여되어 있을 수 있다. 벡터의 복제를 촉진하는 관련 인자가 결핍된 세포에서 일시적 발현도 또한 가능하다.

본 발명의 추가적인 측면은 본 발명에 따른 포유류 발현 벡터를 포함하는 포유류 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 또는 "숙주 세포주" 는, 배지에서 성장할 수 있고, 원하는 단백질 재조합 생산물 단백질을 발현할 수 있는 임의의 세포, 특히 포유류 세포를 지칭한다.

포유류 숙주 세포는 인간 또는 비인간 세포일 수 있다. 포유류 숙주 세포의 바람직한 예에는 MRC5 인간 섬유모세포, 983M 인간 흑색종 세포, MDCK 갯과 신장 세포, Sprague-Dawley 래트에서 단리된 RF 배양된 래트 폐 섬유모세포, B16BL6 마우스 흑색종 세포, P815 마우스 비만세포종 세포 및 MT1A2 마우스 유방 샘암종 세포가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

특히 바람직한 구현예에서, 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터의 난소 (CHO) 세포 또는 세포주이다 (Puck et al., 1958, J. Exp. Med. 108: 945-955). 적합한 CHO 세포주에는 예를 들어 CHO K1 (ATCC CCL-61), CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12 또는 dhfr- CHO 세포주 DUK-BII (Chassin et al., PNAS 77, 1980, 4216-4220) 또는 DUXB11 (Simonsen et al., PNAS 80, 1983, 2495-2499) 이 포함된다.

본 발명에 따라 포유류 숙주 세포로 발현 벡터를 도입하기 위해서, 주어진 숙주 세포 유형에 적합하다면 당업계에 익히 공지된 기술과 같은 임의의 트랜스펙션 기술, 예를 들어, 전기천공, 칼슘 포스페이트 공침 (co-precipitation), DEAE-덱스트란 트랜스펙션, 리포펙션 (lipofection) 을 활용할 수 있다. 본 발명의 벡터로 트랜스펙션된 포유류 숙주 세포는 일시적 또는 안정적으로 트랜스펙션된 세포주인 것으로 해석되어야 하는 것에 주의한다. 따라서, 본 발명에 의하면, 본 포유류 발현 벡터는 에피솜으로 유지될 수 있거나, 포유류 숙주 세포의 게놈에 안정적으로 혼입될 수 있다.

일시적 트랜스펙션은 벡터가 지니는 선택 마커를 위한 임의의 선택압을 적용하지 않는 것을 특징으로 한다. 통상적으로 트랜스펙션 후 20 내지 50 시간 지속되는 일시적 발현 실험에서, 트랜스펙션된 벡터는 에피솜 요소로 유지되며, 아직은 게놈에 혼입되지 않는다. 숙주 세포 게놈에 통상적으로 혼입되지 않는 것은 트랜스펙션된 DNA 이다. 숙주 세포는 트랜스펙션된 DNA 를 유실하고, 일시적으로 트랜스펙션된 세포 풀을 배양할 때 개체군 내 트랜스펙션된 세포를 과성장시키는 경향이 있다. 이에 따라 발현은 트랜스펙션 직후의 기간 동안은 가장 강력하고, 시간에 따라 감소한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 일시적 트랜스펙션체는 트랜스펙션 후 90 시간의 시점까지 선택압 부재하 세포 배양물에서 유지되는 세포로서 이해된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 포유류 숙주 세포, 예를 들어 CHO 숙주 세포는 본 발명의 포유류 발현 벡터로 안정적으로 트랜스펙션된다. 안정적 트랜스펙션이란, 벡터 DNA 와 같은 새롭게 도입된 외래 DNA 가 통상적으로 무작위, 비(非) 상동 재조합에 의해 게놈 DNA 에 혼입되는 것을 의미한다. 벡터 DNA 의 복제수 및 동시에 유전자 생산물의 양은, DNA 가 숙주 세포에 혼입된 후 벡터 서열이 증폭되어진 세포주를 선택함으로써 증가될 수 있다. 따라서, 이러한 안정적 혼입은 유전자 증폭을 위한 추가적인 선택압에 노출시 CHO 세포에서 이중 미세 염색체를 초래하는 것이 가능하다. 게다가, 안정적 트랜스펙션은 예를 들어 게놈 혼입시 불필요하게 되는 박테리아 복제수 제어 영역과 같은 재조합 유전자 생산물의 발현에 직접 관련되지 않는 벡터 서열 부분의 손실을 초래할 수 있다. 따라서, 트랜스펙션된 숙주 세포는 발현 벡터의 적어도 한 부분 또는 상이한 부분들을 게놈에 혼입시킨다.

본 발명의 추가 측면은 하기의 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다:

a) 포유류 숙주 세포 또는 숙주 세포주를 발현 벡터로 트랜스펙션하는 단계, b) 적절한 조건 하 상기 세포를 배양하여 세포 증식 및 재조합 단백질의 발현 및 숙주 세포로부터 재조합 단백질의 배지로의 분비를 가능하게 하는 단계, 및 c) 배지로 분비된 재조합 단백질을 수확하는 단계.

따라서, 본 발명은 또한 a) 포유류 숙주 세포 또는 숙주 세포주를 발현 벡터로 트랜스펙션함, b) 적절한 조건 하에서 상기 세포를 배양하여, 상기 세포의 증식 및 재조합 단백질의 발현 및 숙주 세포로부터 재조합 단백질의 배지로의 분비를 가능하게 함, 및 c) 배지로부터 생산된 재조합 단백질의 수확을 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

포유류 세포주에 대한 적합한 배지 및 배양 방법은, 실례로 US 5,633,162 에 기술된 바와 같이 당업계에 익히 공지되어 있다. 실험실 플라스크 또는 저 밀도 세포 배양을 위하고 특정 세포 유형 요구에 맞춰진 표준 세포 배양 배지의 예에는 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지 (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p.519 f. 1967), L-15 배지 (Leibovitz, A. et al., Amer. J. of Hygiene, 78, 1p.173 ff, 1963), Dulbecco's modified Eagle 배지 (DMEM), Eagle 최소 필수 배지 (MEM), Ham's F12 배지 (Ham, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sc.53, p288 ff. 1965) 또는 알부민, 트란스페린 및 레시틴이 결핍된 Iscoves' modified DMEM (Iscoves et al., J. Exp. med. 1, p. 923 ff, 1978) 이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, CHO 세포 배양을 위해 Ham's F10 또는 F12 배지를 특수 제작했다. CHO 세포 배양에 맞게 특수 조작된 기타 배지는 EP-481 791 에 기술되어 있다. 이러한 배양 배지는 소태아 혈청 (FBS, 우태아 혈청 FCS 로도 불림) 로 보충될 수 있는데, 후자는 과잉의 호르몬 및 성장 인자의 천연 공급원을 제공하는 것으로 공지되어 있다. 포유류 세포의 세포 배양은 오늘날 과학 교과서 및 매뉴얼에 익히 기술되어 있는 통상의 작업이며, 이는 예를 들어 문헌 [R. Ian Fresney, Culture of Animal cells, a manual, 4^th edition, Wiley- Liss/N.Y., 2000] 에서 자세히 다루어지고 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 사용되는 세포 배양 배지는 우태아 혈청 (FCS 또는 FBS) 이 결여되어 있는데, 이때 이것을 '무(無)혈청' 으로 부른다. 무혈청 배지 내 세포는, 최적의 성장을 위해 무혈청 배지 중 일반적으로 인슐린 및 트란스페린을 필요로 한다. 트란스페린은, WO 94/02592 에서 기술한 바와 같이 비(非)-펩티드 킬레이트제 또는 철분포획체, 예컨대 트로폴론에 의해, 또는 유리하게 비타민 C 등의 항산화제와 함께 증가된 수준의 유기 철 공급원에 의해 부분적으로 치환될 수 있다. 대부분의 세포주는 예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 인슐린 유사 성장 인자 I 및 II (IGFI, IGFII), 등을 포함해, 하나 이상의 합성 성장 인자 (재조합 폴리펩티드를 포함함) 를 요구한다. 필수적일 수 있는 인자들의 기타 부류에는 하기가 포함된다: 프로스타글라딘, 수송 및 결합 단백질 (예를 들어 세룰로플라스민, 고 및 저 밀도 지질단백질, 소혈청 알부민 (bovine serum albumin; BSA)), 스테로이드-호르몬을 포함하는 호르몬, 및 지방산. 폴리펩티드 인자 테스트는 성장을 고무하는 것으로 밝혀진 것의 존재 하에서 새로운 폴리펩티드 인자를 시험하는 단계적 방식으로 수행하는 것이 가장 좋다. 이들 성장 인자는 합성체이거나 재조합체이다. 동물 세포 배양에서 익히 공지된 방법론적 접근법이 몇몇 존재하며, 그 예는 하기에 기술하였다. 초기 단계는 세포가 혈청-보충된 배양 배지에서 이동 후 3 내지 6 일 동안 생존 및/또는 서서히 성장하는 조건을 수득하는 것이다. 대부분의 세포 유형에서, 이는 적어도 일부는 접종물 밀도의 함수이다. 일단 최적의 호르몬/성장 인자/폴리펩티드 보충을 밝혀내면, 생존에 요구되는 접종물 밀도는 감소할 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 단백질이 없는데, 즉 태아 혈청 및 개별 단백질 성장 인자 보충물, 또는 재조합 트란스페린과 같은 기타 단백질 모두가 없는 것이다.

또 다른 구현예에서, 재조합 생성 단백질의 발현 및 수확에 관한 본 발명의 방법은 동물 숙주 세포의 고밀도 성장, 예를 들어 공업용 유가식 (fed-batch) 생물반응기 (bioreactor) 를 포함한다. 이후, 통상적인 하류 프로세싱이 적용될 수 있다. 결과적으로, 고밀도 성장 배양 배지가 이용되어야 한다. 상기와 같은 고밀도 성장 배지는 통상적으로 모든 아미노산과 같은 영양분, 상술된 범위의 글루코오스와 같은 에너지원, 무기염, 비타민, 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 완충액, 4 개의 뉴클레오시드 또는 그의 상응하는 뉴클레오티드, 글루타티온 (환원) 과 같은 항산화제, 비타민 C 및 기타 성분 예컨대 중요한 막 지질, 예를 들어, 콜레스테롤 또는 포스파티딜콜린 또는 지질 전구체, 예를 들어, 콜린 또는 이노시톨로 보충될 수 있다. 고밀도 배지는 이들 화합물 대부분 또는 모두로 강화될 것이며, 본질적으로 등장 배지의 삼투질농도를 조절하는 무기염을 제외하고, RPMI 1640 과 비교했을 때, GB2251 249 로부터 유추할 수 있는 바 상기 언급된 표준 배지보다 이들을 더 높은 (보강된) 양으로 포함할 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 고밀도 배양 배지는 트립토판을 제외한 모든 아미노산이 배양 배지 1 ℓ 당 75 mg 을 초과한다는 점에서 보강되어져 있다. 바람직하게는, 일반적인 아미노산 요건과 관련하여, 글루타민 및/또는 아스파라긴은 1 g/l 초과이며, 더욱 바람직하게는 2 g/l 초과의 고밀도 배양 배지이다. 본 발명의 문맥에서, 고밀도 세포 배양물은 10⁵ 세포/ml 이상 또는 초과, 바람직하게는 10⁶ 세포/ml 이상 또는 초과의, 생 (viable) 세포의 밀도를 임시로 갖는 동물 세포의 개체군으로 정의되는데, 상기 개체군은 배양물 부피가 일정하거나 증가하는 세포 배양 배지 중에서 단일 세포 또는 더 낮은 생 세포 밀도의 접종물로부터 지속적으로 성장한 것이다.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 유가식 배양을 포함한다. 유가식 배양은 개별적인 공급에 의한 글루코오스 농도 제어와는 별개로, 임의로 하나 또는 몇몇의 기타 아미노산, 바람직하게는 글리신과 함께 적어도 글루타민이 배지 내 그의 농도를 유지하기 위해 GB2251249 에 기술된 바와 같이 세포 배양물에 공급되는 배양 시스템이다. 더욱 바람직하게는, 글루타민 및 임의로 하나 또는 기타 아미노산의 공급은 EP-229 809-A 에서 기술된 바와 같이 세포 배양물에 글루코오스와 같은 하나 이상의 에너지원의 공급과 조합된다. 공급은 보통 배양 개시 후 25-60 시간에 시작되며; 예를 들어, 세포가 약 10⁶ 세포/ml 의 밀도에 도달하였을 때 공급을 시작하는 것이 유용하다. 배양된 동물 세포에서 '글루타민분해 (glutaminolysis)' (McKeehan et al., 1984, Glutaminolysis in animal cells,in: Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells, ed. MJ. Morgan, Plenum Press, New York, pp. 11-150) 가 성장 시기 동안 중요한 에너지원이 될 수 있음은 당업계에 익히 공지되어 있다. 총 글루타민 및/또는 아스파라긴 공급물 (아스파라긴에 의한 글루타민의 치환을 위해서는, Kurano, N. et al., 1990, J. Biotechnology 15, 113-128 참조) 은 통상 1 리터의 배양물 부피 당 0.5 내지 10 g, 바람직하게는 1 내지 2 g 범위이며; 공급물 내에 존재할 수 있는 기타 아미노산은 배양물 1 리터 당 10 내지 300 mg 총 공급물이며, 특히 글리신, 리신, 아르기닌, 발린, 이소류신 및 류신은 통상적으로 기타 아미노산과 비교할 때 적어도 150 내지 200 mg 의 높은 양으로 공급된다. 공급물은 샷 첨가 (shot-addition) 로서, 또는 지속적인 펌프식 공급으로서 첨가될 수 있으며, 바람직하게 공급물은 거의 지속적으로 생물반응기로 펌핑된다. pH 는, 염기 또는 완충액을 첨가하여 주어진 세포주에 최적인 대략의 생리학적 pH 로, 생물반응기에서의 유가식 배양 동안 조심스럽게 제어된다는 점은 말할 나위도 없다. 글루코오스가 에너지원으로 사용될 경우, 총 글루코오스 공급은 배양물 1 리터 당 통상적으로 1 내지 10, 바람직하게는 3 내지 6 그램이다. 아미노산의 포함과 별개로, 공급물은 바람직하게 배양물 1 리터 당 5 내지 20 mg 범위의 소량의 콜린을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 콜린의 공급물은 특히 글루타민 공급과 함께, 본질적으로 US 6,048,728 에서 기술된 바와 같이 에탄올아민의 보충물과 조합된다. 비-GS 발현 시스템과 비교할 때, GS-마커 시스템을 사용하는 경우, 내재적으로 생성되는 것 이외의 과량의 글루타민의 축적이 암모니아 생산 및 수반되는 독성을 초래할 수 있기 때문에, 글루타민을 더 적은 양 필요로 할 것이라는 점은 당연하다. GS 에 있어서, 배지 또는 공급물 중 글루타민은 대체로 그의 동등물 및/또는 전구체, 즉 아스파라긴 및/또는 글루타메이트에 의해 치환된다.

수확, 즉 세포가 배양되어진 배지로부터 주어진 단백질을 단리 및/또는 정제하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예를 도면에서 예시한다. 나타낸 바는 하기이다:

도 1 은 CHOK1SV 세포의 일시적 트랜스펙션에서 사용시, 상이한 신호 서열이, 분비된 항체의 농도에 미치는 영향을 나타낸다. 변이체 신호 서열을 사용한 벡터를 이용하는 CHOK1SV 세포의 일시적 트랜스펙션에 의해 달성된 항체 농도. n=6

도 2 는 정적 배양 중 안정한 세포주에서 사용시, 상이한 신호 서열이, 분비된 항체의 농도에 미치는 영향을 나타낸다. 상자그림은 변이체 신호 서열들을 사용한 벡터를 이용하는 CHOK1SV 세포의 안정적 트랜스펙션에 의해 달성된 항체 농도 범위를 나타낸다. 안정한 GS 세포주를 14 일 동안 24 웰 플레이트에서 과성장하게 두었는데, 그 과성장한 시점에서 항체 농도를 단백질 A HPLC 로 측정하였다. 평균 항체 농도를 나타냈으며, 평균 항체 농도에서 통계적으로 유의한 증가를 나타내는 것 (p≤0.05, ANOVA 로 산출함) 은 * 로 표시했다. n=100.

도 3 은 현탁 배양 중 안정한 세포주에서 사용시, 신호 서열 V19 가, 분비된 항체의 농도에 미치는 영향을 나타낸다. 상자그림은 대조군 또는 V19 신호 서열을 사용한 벡터를 이용하는 CHOK1SV 의 안정적 트랜스펙션에 의해 달성된 항체 농도의 범위를 나타낸다. 안정한 GS 세포주가 생성되었고, 수위 60 을 차지하는 것을, 모조 실험실 규모의 생물반응기로 고안된 유가식 공정에서 평가했다. 항체 농도를 단백질 A HPLC 로 측정했다. 평균 항체 농도를 나타냈으며, p 값은 ANOVA 로 산출했다. n=60.

도 4 는 안정한 세포주를 10 L 생물반응기에서 배양한 경우, 신호 서열 V19 가, 분비된 항체의 농도에 미치는 영향을 나타낸다. 상자그림은 대조군 또는 V19 신호 서열을 사용한 벡터를 이용해 생성된 세포주를 이용하여 10 L 실험실규모 생물반응기에서 달성된 항체 농도 범위를 나타낸다. 안정한 GS 세포주가 생성되었고, 수위 8 을 차지하는 것을 유가식 공정에서 평가했다. 항체 농도를 단백질 A HPLC 로 측정했다. 평균 항체 농도를 나타냈다. n=8.

서열 목록은 하기를 나타낸다:

SEQ ID No.1 은, 구축물 pV12 에서 사용된 신호 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 신호 펩티드는 Sandfly Yellow 관련 단백질로부터 유도된 것으로, 하기와 같다:

. SEQ ID No. 1 의 신호 펩티드는 또한 신호 펩티드 V12 로 지칭된다.

SEQ ID No.2 는, SEQ ID No. 2 로 나타낸 신호 펩티드의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 나타내며, 이는 하기와 같 다:

SEQ ID No. 3 은, 구축물 pV14 에서 사용된 신호 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 신호 펩티드는 Silkworm Fibroin LC 로부터 유도된 것으로, 하기와 같다:

SEQ ID No. 3 의 신호 펩티드는 또한 신호 펩티드 V14 로 지칭되기도 한다.

SEQ ID No. 4 는, SEQ ID No. 3 에 나타낸 신호 펩티드의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 나타내며, 하기와 같다:

.

SEQ ID No. 5 는 구축물 pV16 에서 사용된 신호 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 신호 펩티드는 Snake PLA2 로부터 유도된 것으로 하기와 같다:

SEQ ID No. 5 의 신호 펩티드는 또한 신호 펩티드 V16 으로도 지칭된다.

SEQ ID No. 6 은 SEQ ID No. 5 로 나타낸 신호 펩티드의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 나타내며, 하기와 같다:

.

SEQ ID No. 7 은 구축물 pV17 에서 사용되는 신호 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 신호 펩티드는 Cypridina Noctiluca 루시퍼라아제로부터 유도된 것으로

이다. SEQ ID No. 7 의 신호 펩티드는 또 한 신호 펩티드 V17 로서 지칭되기도 한다.

SEQ ID No. 8 은 SEQ ID No. 7 로 나타낸 신호 펩티드의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 나타내며 하기와 같다:

.

SEQ ID No 9 는 구축물 pV19 에 사용된 신호 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 신호 펩티드는 Pinemoth Fibroin LC 로부터 유도된 것으로,

이다. SEQ ID No. 9 의 신호 펩티드는 또한 신호 펩티드 V19 로서 지칭된다.

SEQ ID No. 10 은 SEQ ID No. 9 에 나타낸 신호 펩티드의 아미노산 서열을 인코딩하는 해당 핵산 서열을 나타내며, 하기와 같다:

.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명된다.

재료 및 방법

사용된 세포:

CHO 세포주 CHOK1SV: 은 CHO-K1 세포주의 변형체로, 현탁 및 단백질-결핍 배지 중의 성장에 적응되어져 있다.

CHOK1SV 세포의 증식:

CHOK1SV 세포를, 6 mM L-글루타민이 보충된 CD-CHO 배지 (Invitrogen) 중 현탁 진탕 플라스크에서 증식시켰다. 시드 (seed) 농도는 2 x 10⁵ 세포/ml 였으며, 세포는 매 4 일마다 분열 (split) 하였다. 플라스크는 5% CO₂ 가스 공급하였고 140 rpm 으로 회전식 (orbital) 진탕하며 36.5℃ (35.5℃ 내지 37.0℃) 에서 인큐베이션 (incubation) 하였다.

일시적 트랜스펙션:

일시적 트랜스펙션은 현탁-성장 세포를 사용하여 수행하였다. 세포를 계수하고, 10% 혈청 및 6 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM-기재 배지 중 웰 당 2.5 x 10⁵ 생 세포로 24-웰 플레이트의 웰에 분배하고, +36.5℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 익일, 컨디셔닝된 (conditioned) 배지를 1 mL 의 (상기와 같은) 신선한 배지로 대체하고, +37℃ 에서 3 시간 동안 세포를 인큐베이션하였다.

각 트랜스펙션을 위해, 5 ㎍ 의 각 SGV (HC 및 LC-SGV 가 함께 혼합됨) 또는 5 ㎍ 의 DGV 를 100 μL 트랜스펙션 배지 (OptiMEM, Invitrogen) 에 재현탁시켰다. 양성 대조군을 위해, 세포를 모델 항체로 작용하는 IgG₄/카파 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 유전자를 인코딩하는 벡터 pcB72.3 로 트랜스펙션시켰다. 음성 대조군 (오로지 물) 또한 포함하였다.

각 트랜스펙션을 위해, 5 μL 의 Lipofectamine-2000 시약 (Invitrogen) 을 100 μL 트랜스펙션 배지에 희석하고, 혼합하고 실온에서 5 분간 방치하였다. DNA 및 희석된 Lipofectamine 시약을 조합하고, 혼합하고 추가로 주위 온도에서 20 분 동안 방치하였다. 이어서, 상기 200 μL 혼합물을, 세포를 포함하는 24-웰 플레이트의 웰에 첨가하였고, 세포를 +37℃ 에서 4 또는 10 일 동안 인큐베이션하였다. 배양 상청액을 수집하고, 어셈블리 (assembly) ELISA 에 의한 항체의 존재에 대해 검정하기 전에 원심분리에 의해 정화시켰다.

정적 배양물의 생성을 위한 안정적 트랜스펙션 :

트랜스펙션에 사용된 세포는 상기 설명된 바와 같이 세포 현탁 배양으로 성장시켰다. 성장 배양으로부터의 세포를 원심분리하고 무혈청 배지에 1 회 세정한 후, 1.43 x 10⁷ 세포/mL 의 농도에 재현탁시켰다. 0.7 mL 부피의 세포 현탁액 및 40 ㎍ 의 플라스미드 DNA 를 전기천공 큐벳에 첨가하였다. 이어서, 큐벳을 전기청공 장치에 위치시키고 250 V 및 400 μF 의 단일 펄스를 가하였다. 트랜스펙션 후, 10% dFCS 가 보충된 비-선택적 DMEM-기재 배지를 사용하여 세포를 96-웰 플레이트에 약 2,500 숙주 세포/웰 (5 x 10⁴/mL) 로 분배하였다. 플레이트는 공기 중 10% CO₂ 의 대기 하 36.5℃ (35.5℃ 내지 37.0℃) 에서 인큐베이션하였다.

트랜스펙션 다음 날, 10% dFCS/66 μM L-메티오닌 술폭시민이 보충된 DMEM-기재 배지를 각 웰 (150 μL/웰) 에 첨가하여, 최종 L-메티오닌 술폭시민 농도를 50 μM 으로 만들었다. 비-트랜스펙션된 세포가 언제 치사하는지, 및 트랜스펙션 세포의 초점 (foci) 이 언제 나타나는지를 결정하기 위해 플레이트를 모니터링하였다. 트랜스펙션 세포의 초점은 트랜스펙션 약 3 내지 4 주 후에 뚜렷해졌다. 조사되고 진행된 모든 세포주는 단일 콜로니만을 포함하는 웰로부터 기인하였다.

정적 배양에서 세포주의 생산성 평가

96-웰 트랜스펙션 플레이트를 콜로니 형성을 허용하도록 약 3 주 동안 인큐베이션하였다. 수득된 콜로니를 현미경으로 조사하여, 콜로니가 검정에 적합한 크기 (웰 바닥을 60% 초과로 덮음) 이며, 오직 하나의 콜로니만이 각 웰에 존재함을 확인하였다.

적합한 콜로니를 1 mL 의 선택 성장 배지 (DMEM-기재 배지/10% dFCS/25μM L-메티오닌 술폭시민) 를 포함하는 24-웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 상기 배양물을 공기 중 10% CO₂ 대기 하 36.5℃ (35.5℃ 내지 37.0℃) 에서 14 일 동안 인큐베이션하였다. 각 웰의 상청액을 수확하고 단백질-A HPLC 방법에 의해 존재하는 항체의 농도에 대해 분석하였다.

어셈블리 ELISA:

샘플의 항체 농도를 어셈블리된 인간 IgG 를 측정하는 샌드위치 ELISA 를 사 용하여 측정하였다. 이는 항-인간 Fc 항체로 코팅된 96 웰 플레이트 상으로의 샘플 및 표준의 포획을 포함한다. 결합된 항체는 양고추냉이 과산화효소 (horseradish peroxidase) 및 발색성 기질 TMB 에 연결된 항-인간 경쇄로 밝혀졌다. 색상 현색은 표준과 비교할 때 샘플 내에 존재하는 항체의 농도와 비례하였다.

단백질 A HPLC:

IgG 의 측정을 위한 단백질 A 친화도 크로마토그래피 방법은 Agilent 1100 HPLC 상에서 수행하였다. IgG 생성물은 Poros 단백질 A 면역검출 컬럼에 선택적으로 결합한다. 비결합된 물질은 컬럼으로부터 세정하고 나머지 결합 항체는 용매의 pH 를 감소시켜 유리시켰다. 280 nm 에서의 흡광도로 용리를 모니터링하였고, 생산물은 일반적인 항체 표준에 대해 (Chemstation 소프트웨어를 사용하여) 정량하고, 흡광 계수에서의 차이에 대한 보정을 하였다.

현탁 배양물의 생성을 위한 안정적 트랜스펙션 :

CHOK1SV 숙주 세포를 CHOK1SV 세포주의 저장고 (stock) 로부터 재생시켰다. 후속해서 성장한 배양물의 세포를 원심분리하고, 1.43 x 10⁷ 생세포/mL 의 농도로 재현탁하기 전에 CD-CHO 배지에서 1 회 세정했다. 각각의 트랜스펙션을 위해, 약 0.7 mL 의 세포 현탁물 및 40 μg 의 플라스미드 DNA 를 각 전기천공 큐벳 에 첨가했다. 4 개의 트랜스펙션물을 두 전기천공 큐벳의 내용물을 이용해 준비했다. 각 전기천공 큐벳을 전기천공 장치에 위치시키고, 300 V, 900 μF 의 단일 펄스를 가했다. 트랜스펙션 후, 요구되는 모든 큐벳으로부터의 세포를 모아, 배지 CD-CHO/페놀 레드를 이용해 96-웰 플레이트에 약 2,500 숙주 세포/웰 (0.50 x 10⁵/mL) 내지 10,000 숙주 세포/웰 (2.00 x 1O⁵/mL) 로 분배했다. 페놀 레드는 단지 세포 성장을 나타내기 위해서 첨가했다. 플레이트를, 공기 중 10% v/v CO₂ 의 대기 하 35.5 내지 37.0℃ 에서 인큐베이션했다.

트랜스펙션 후 다음날, 150 μL 의 선택 배지 (CD-CHO/페놀 레드/66.6 μM MSX) 를 각 웰에 첨가했다. 각 웰 내 MSX 의 최종 농도는 50 μM 였다. 비-트랜스펙션된 세포가 치사하여 트랜스펙션된 세포의 초점을 언제 남기는지를 측정하기 위해 플레이트를 모니터링하였다. 트랜스펙션 세포의 초점은 트랜스펙션 약 3 내지 4 주 후에 뚜렷해졌다. 조사되고 진행된 모든 트랜스펙션체는 시각적인 평가로 측정하였을 때 단일 콜로니만을 포함하는 웰로부터 기인하였다.

정적 배양에서 평가를 위한 세포주의 선택:

96-웰 트랜스펙션 플레이트를 콜로니 형성을 허용하도록 약 3 내지 4 주 동안 인큐베이션하였다. 생성된 콜로니를 현미경으로 조사하여, 이들이 평가하기에 적당한 크기의 것 (웰 바닥을 60% 초과로 덮음) 이며, 오직 하나의 콜로니만이 각 웰에 존재함을 확인하였다. 배양 상청액을 제거하고 Lonza 의 ELISA 방법을 이용해 항체에 대해서 검정하였다. 웰의 포화도 (confluence) 백분율을 샘플링할 때에 평가했다. 검정 결과를 포화도% 로 나누어 수득한 값을 사용하여 세포주의 등급을 매기었다.

높은 등급의 세포주를 배지 CD-CHO/페놀 레드/25 μM MSX (이 배지를 정적 배양 전체 기간 동안 사용함) 로 확장시켰다. 포화도에 도달했을 때, 상기 배양물을 이용하여 T25 플라스크에 접종하는 한편, 잔존하는 배양물에 신선한 성장 배지를 재공급한 후 인큐베이터로 되돌려 보냈다. T25 플라스크에서 포화도에 도달하였을 때, 상기 배양물에 신선한 배지를 공급하여 세포가 다중층이 되도록 촉진하여 현탁 배양에 적응시켰다.

96-웰 플레이트로부터 진행한 상기 세포주에 대해서, 제 2 의 생산성 평가를 수행했다. 진행시켜왔고 재공급했었던 24-웰 플레이트 배양물을, 포화도 또는 낮은 생존력에 도달할 때까지 ('과성장') 추가 14 일 동안 인큐베이션했다. 상기 시점에서, 배양 상청액을 수집하고, 단백질 A HPLC 방법을 이용해 항체 농도를 측정하였다. 세포주를 생산성에 따라 등급 매기고, 높은 등급의 세포주를 현탁 배양에서 평가되도록 진척시켰다.

CDACF 현탁 배양으로의 세포주 확장:

현탁 배양을 CD-CHO/25μM MSX 배지를 이용하는 포화성 T25 플라스크 배양으로부터 시작하였다. 접종 세포 농도의 선택은 T25 플라스크 내 측정된 생세포 농도에 따랐다. 생세포 농도가 0.40 x 10⁶ 생세포/mL 초과인 경우, CD-CHO/25μM MSX 배지를 첨가하여, 125 mL 진탕 플라스크 중 5 내지 30 mL 의 최종 부피에서 0.20 x 10⁶ 생세포/mL 의 생세포 농도를 만들었다. 생세포 농도가 0.25 내지 0.40 x 10⁶ 생세포/mL 인 경우, CD-CHO/25μM MSX 배지를 첨가하여, 125 mL 진탕 플라스크 중 5 내지 30 mL 의 최종 부피에서 0.15 x 10⁶ 생세포/mL 의 생세포 농도를 만들었다. 생세포 농도가 T25 플라스크에서 최고 14 일 후에, 0.25 x 10⁶/mL 미만인 경우, 10 mL 의 각 배양물을 자동적으로 125 mL 진탕 플라스크 중 10 mL 의 CD-CHO/25μM MSX 배지로 진행시켰다.

정적 배양에서 현탁 배양으로의 이동 후, 세포주를 CD-CHO/25μM MSX 배지에서 허용가능하고 재생가능한 성장 특성을 얻을 때까지 계단 계대배양 (serial subculture) 을 4 일의 계대배양 체제로 하였다. 0.05 내지 0.20 x 10⁶ 생세포/mL 의 초기 접종 세포 농도로 하고, 30 mL 부피의 배양물을 포함하는 125 mL 진탕-플라스크에서 배양을 준비했다. 일단 4 일 째 (계대배양 일) 에 생존가능한 농도가 일관되게 0.40 x 10⁶ 생세포/mL 초과라면, 배양물에 0.20 x 10⁶ 생세포/mL 를 관례대로 접종했다.

유가식 진탕-플라스크 배양:

각각의 선택된 세포주의 배양물을, CM42/SPE 배지를 이용하는 30 mL 의 세포 현탁물 함유 250 mL 진탕-플라스크에서 준비하였다. 배양물을 0.20 x 10⁶ 생세포/mL 로 접종하고, 각 배양물의 공간부분 (headspace) 이 공기 중 5% v/v CO₂ 와 평형을 유지하게 했다. 배양물을, 피크 후 생세포 농도가 1.00 x 10⁶ 생세포/mL 이하이거나 또는 제 15 일에 도달할 때까지 ('과성장'), 140 ± 5 rpm 에서 진탕 플랫폼 상 35.5 내지 37.0℃ 에서 인큐베이션했다. 상기 시점에서, 배양물을 수확했다.

세포 농도를 제 7 일 및 제 14 일에 Vi-Cell 자동 세포 계수기를 이용해 측정했다. 제 3 일에, 2.1 mL 의 SF40 를 거환 (bolus) 으로서 각각의 30 mL 배양물에 첨가했다. 제 8 일 및 제 11 일에, 360 μL 의 제 2 의 공급물 SF41 샷을 유가식 배양에 적용했다. 배양 상청액 샘플을 제 7 및 제 14 일에 취하여, -20 ± 5℃ 에서 동결시킨 후 단백질 A HPLC 로 어셈블리된 항체에 대해서 검정하였다.

10L 생물반응기 배양:

세포주를 10L 생물반응기에서 평가했다. 16 개의 세포주 배양물의 부피를, 하나의 10 리터 공수 생물반응기에 접종하기에 충분한 부피를 수득할 때까지 증가시켰다. 접종물 부피를 시드 밀도가 약 0.2 x 10⁶ 세포/ml 에 도달하도록 조절하였다. 생물반응기를 유가식 전략을 이용하여 15 일 동안 작동시켰다. 배양 상청액의 샘플을 취해 단백질 A HPLC 로 어셈블링된 항체에 대해 검정했다.

벡터 구축

cB72.3 항체 가변 영역을 인코딩하는 유전자 최적화된 DNA 서열을 합성했다. 합성의 일부로서, 신호 서열 사슬을 인코딩하는 핵산 서열을 첨가했다. 총 19 개의 상이한 신호 서열 (V1 - V19 서열) 을 이용했다. 경쇄 서열을, 카파 불변 영역 DNA 서열을 포함하는, pEE12.4 유도 발현 벡터 pConPlusKappa 에 클로닝하였다. 중쇄를 IgG4 불변 영역 DNA 서열을 포함하는 pEE6.4 유도 벡터 pConPlusIgG4 로 클로닝했다. 이후, 이중-유전자 발현 벡터를 Not I/ Pvu I 단편의 관련 백터를 함께 클로닝함으로써 제조하였다. 모든 구축물의 서열을 DNA 서열화로 확인했다.

초기 스크린으로서, 19 개 구축물을, 통상 사용되는 신호 서열을 이용한 적절한 대조군과 함께, Lipofectamine-2000 (Invitrogen) 을 이용한 CHOK1SV 숙주 세포주로 일시적 트랜스펙션하였다. 구축물을 6 회 트랜스펙션하고, ELISA 로 배지 내 항체 농도를 측정했다. 이 검정으로, 19 개 구축물 중 5 개의 구축물은 대조군보다도 평균 항체 농도를 현저히 증가시켰으며, 나머지 구축물은 항체 농도를 동일 또는 감소시켰다는 점을 확인하였다. 상기 5 개의 구축물은 SEQ ID No. 1 의 신호 서열 (신호 서열 V12) 을 함유하는 pV12, SEQ ID No. 3 의 신호 서열 (신호 서열 V14) 을 함유하는 pV14, SEQ ID No. 5 의 신호 서열 (신호 서열 V16) 을 함유하는 pV16, SEQ ID No. 7 의 신호 서열 (신호 서열 V17) 을 함유하는 pV17, 및 SEQ ID No. 9 의 신호 서열 (신호 서열 V19) 을 함유하는 pV19 였다.

이어서, 일시적 트랜스펙션 시스템에서 개선된 발현을 증명하는 5 개의 신호 서열을 이용한 구축물을 사용해 CHOK1SV 세포에서 안정한 세포주를 만들었다. 구축물 당 100 개의 세포주로부터 배지 내 항체 농도를 단백질 A HPLC 로 측정했다. 대조군 세포주로부터의 평균 항체 농도는 89 mg/L 였다. 5 개의 신호 서열 중 2 개의 신호 서열은, 대조군 세포주보다 평균 항체 농도가 통계학적으로 유의한 증가를 보이는 세포주를 도모하였으며, 서열 V17 (SEQ ID No.7) 은 106 mg/L (19% 증가, p=<0.05) 의 평균 항체 농도를 도모하였고, 서열 V19 (SEQ ID No. 9) 는 118 mg/L (32% 증가, p=<0.05) 의 평균 항체 농도를 도모하였다. 안정한 세포주의 데이타를 도 1 에 나타내었다.

생산물 품질을 SDS-전기영동으로 평가하였을 때, 대조군 또는 대체 신호 서열을 이용하여 생성한 항체들 사이에서 어떠한 총체적인 구조적 차이도 관찰되지 않았었다. 질량분광법에 의한 생산물 품질의 평가는, 대체 신호 서열을 이용해 생산한 항체가, 대조군과 비교했을 때 기대되는 질량을 갖는다는 점을 입증하였는데, 이는 이들 항체가 적절하게 프로세싱될 가능성이 있음을 시사한다. 이러한 작업으로, 신호 서열의 선택이 최적의 항체 발현에 핵심 기여자일 가능성이 있음을 나타내는, 상이한 신호 서열들은 시시각각의 효율로 작동한다는 것이 입증되었다.

상기 서열이 세포주 구축 프로세스 내내 항체 농도를 증가시킬지 여부를 측정하기 위해, cB72.3 의 IgG1/카파 항체 버젼을 인코딩하는 구축물을 제조했다. 상기 구축물을 SEQ ID No. 9 의 신호 서열 (V19) 를 인코딩하는 DNA 서열과 융합된 유전자-최적화된 유전자 (pcB72.3IgG1V19), 또는 통상 사용되는 항체 유도 신호 서열 (pcB72.3IgG1) 을 사용했다.

이들 구축물을 CHOK1SV 세포로 안정적으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션체를 96-웰 플레이트에서 스크리닝하고, 높은 등급의 세포주를 24-웰 플레이트 로 확장시켰다. 포화에 이르면, 수위 60 생성자를 T25 플라스크로 진행시킨 다음 진탕-플라스크 내 현탁에 적응시켰다. 배치 (batch) 및 유가식 진탕 플라스크 배양 모두에서 생산성을 평가하였고, 생산물 품질을 14 일된 유가식 과성장 배양물의 배양 상청액을 이용해 분석했다.

유가식 배양에서, SEQ ID No. 9 의 신호 서열이 활용된 구축물은 대조군과 비교했을 때 평균 항체 농도가 6% 증가했음을 입증했다 (p=0.08). 생산물 품질 평가로, SDS-전기영동, IEF, 올리고당 분석으로 분석했을 때 대조군 또는 SEQ ID No. 9 의 신호 서열 (V19) 을 갖는 구축물로 트랜스펙션된 배양물 사이에서 어떠한 두드러진 차이도 없음이 드러났다. 전기분무 질량 분광법을 사용하여, V19 서열을 이용해 생성한 항체의 질량이 대조군 구축물을 이용해 생성했을 때의 것과 동일하다는 점이 보여졌는데, 이는 V19 서열이 항체 분비 동안 정확하게 프로세싱되었음을 시사한다.

10L 실험실규모 생물반응기를 이용하는 유가식 생물반응기 배양에서, 16 가지의 10 리터 실험실-규모 생물반응기 배양을 수행했다. 세포주가 광범위한 생세포 최고 농도에 도달했다. SEQ ID No. 9 의 신호 서열 (V19) 을 함유하는 세 포주는 9.6 내지 17.9 x 10⁶ 세포/mL 에 도달했으며, 대조군 신호 서열 세포주는 8.5 내지 19.1 x 10⁶ 세포/mL 에 도달했다. '새로운 신호 서열' 배양물에 대한 생세포 농도의 평균 시간 적분 (IVC) 은 2395 x 10⁶ 세포.h/mL 인 반면에, 대조군 세포주에 대한 IVC 는 2511 x 10⁶ 세포.h/mL 였다. 수확시 평균 생산물 농도는 신호 서열 V19 (SEQ ID NO. 9) 를 가진 세포주에 대해서는 2870.3 mg/L 이었고, 대조군 세포주에 대해서는 2577.1 mg/L 이었다. 생물반응기 배양물을 15 일에 수확했다.

실험실-규모 생물반응기 배양을 기준으로 할 때, V19 함유 세포주는 평균 항체 농도를 11% 증가시키나, 그 차이는 관찰되는 생산성이 광범위하므로 통계학적으로 유의하지 않다는 점으로 결론내렸다.

<110> Lonza Biologics plc <120> Mammalian expression vector with a highly efficient secretory signal sequence <130> LBP1015PC00 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 1 Met Arg Phe Phe Phe Val Phe Leu Ala Ile Val Leu Phe Gln Gly Ile 1 5 10 15 His Gly <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 2 atgagattct ttttcgtgtt cctggccatc gtgctgttcc agggcatcca cg 52 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 3 Met Lys Pro Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Val Thr Ser Ala Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 4 atgaagccca tctttctggt gctgctggtc gtgaccagcg cctacgcc 48 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 5 Met Arg Thr Leu Trp Ile Met Ala Val Leu Leu Leu Gly Val Glu Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 6 atgaggaccc tgtggatcat ggccgtgctg ctgctgggcg tggagggcca ggtg 54 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 7 Met Lys Thr Leu Ile Leu Ala Val Ala Leu Val Tyr Cys Ala Thr Val 1 5 10 15 His Cys <210> 8 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 8 atgaaaaccc tgatcctggc cgtggccctg gtgtactgcg ccaccgtgca ctgc 54 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 9 Met Met Arg Pro Ile Val Leu Val Leu Leu Phe Ala Thr Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ala <210> 10 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 10 atgatgaggc ccatcgtgct ggtgctgctg ttcgccacct ccgccctggc ccaggtg 57

Claims

이종 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 프레임으로 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는, 포유류 숙주 세포로부터 이종 단백질의 분비를 위한 발현 카세트로서, 이때 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 아미노산 서열 MMRP [소수성 아미노산]_n TSALA 을 인코딩하는 DNA 서열 또는 아미노산 서열 MKT [소수성 아미노산]_n CATVHC 를 인코딩하는 DNA 서열로부터 선택되며, n 은 4 내지 16 의 정수이고, 소수성 아미노산은 A, I, L, M, F 또는 V 인 발현 카세트.
제 1 항에 있어서, 신호 서열을 인코딩하는 DNA 서열이, SEQ ID No. 8 또는 SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 7 또는 SEQ ID No. 9 에 나타낸 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열로부터 선택되는 발현 카세트.
이종 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 프레임으로 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터로서, 이때 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은 아미노산 서열 MMRP [소수성 아미노산]_n TSALA 를 인코딩하는 DNA 서열 또는 아미노산 서열 MKT [소수성 아미노산]_n CATVHC 를 인코딩하는 DNA 서열로부터 선택되며, n 은 4 내지 16 의 정수이고, 소 수성 아미노산은 A, I, L, M, F 또는 V 인 포유류 발현 벡터.
제 3 항에 있어서, 신호 서열을 인코딩하는 DNA 서열이 SEQ ID No. 8 또는 SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 7 또는 SEQ ID No. 9 에 나타낸 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열로부터 선택되는 포유류 발현 벡터.
제 3 항 또는 제 4 항에 따른 포유류 발현 벡터를 함유하는 포유류 숙주 세포.
제 5 항에 있어서, 세포가 중국 햄스터의 난소 (CHO) 세포인 포유류 숙주 세포.
하기 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법:

a) 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 벡터로 포유류 숙주 세포를 트랜스펙션함,

b) 적절한 조건 하 배지 내에서 상기 숙주 세포를 배양하여 세포 증식 및 재조합 단백질의 발현 및 숙주 세포로부터 재조합 단백질의 배지로의 분비를 가능하게 함,

c) 분비된 재조합 단백질을 배지로부터 수확함.
제 7 항에 있어서, 포유류 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.