CN107109435A

CN107109435A - 用于细胞转染和蛋白生产的新型选择性标记物

Info

Publication number: CN107109435A
Application number: CN201580070024.7A
Authority: CN
Inventors: B·杜马斯; N·劳尼斯
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi SA; Sanofi Aventis France
Priority date: 2014-10-23
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: CA2965202A1; US10557125B2; EP3209770A1; CN107109435B; WO2016062837A1; EP3209770B1; US20170335292A1; ES2769877T3; US20230025088A1; AU2015334872B2; AU2015334872A1; US11384342B2; CA2965202C; HUE048525T2; DK3209770T3; MX2017005295A; SG11201702516UA; US20200199543A1

Abstract

本发明属于工业蛋白生产领域。本发明提供使用二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)作为选择性标记物与来氟米特或其代谢物组合的新型表达系统，其尤其可用于在哺乳动物细胞系中使用。还提供编码DHODH的表达载体、包含所述载体的细胞系和生产重组蛋白的方法。

Description

用于细胞转染和蛋白生产的新型选择性标记物

发明领域

本发明属于工业蛋白生产领域。本发明提供使用二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)作为选择性标记物与DHODH抑制剂(特别是特立氟胺)组合的新型表达系统，其尤其可用于在哺乳动物细胞系中使用。还提供编码DHODH的表达载体、包含所述载体的细胞系和生产重组蛋白的方法。

发明背景

以工业规模生产重组蛋白需要分离产生大量重组蛋白的克隆。将异源基因引入动物宿主细胞并对所添加的基因的表达进行筛选是长期和复杂的过程。该过程涉及转染和对具有稳定的长期表达的克隆进行选择，和对对于相应的重组蛋白具有高表达率的克隆进行筛选。

当生成从表达载体表达重组蛋白的克隆时，经常使用在相同载体上编码感兴趣的蛋白和选择性标记物二者的DNA载体转染宿主细胞。这样的表达载体因此包含允许对其中存在表达载体的克隆进行选择的可选择标记物。这样的可选择标记物还可导致转染的DNA的共扩增，由此允许高生产克隆的分离。

大多数可选择标记物为对抗生素或其他毒性物质赋予抗性的蛋白或对细胞生存至关重要的蛋白。本领域已知数种这样的可选择标记物，包括例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、博莱霉素、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)。具体而言，GS在真核细胞中的工业重组蛋白生产领域中广泛用作可选择标记物。GS基因允许对于细胞生长至关重要的谷氨酰胺的合成，且受到MSX(L-甲硫氨酸亚磺酰亚胺)的抑制。在MSX存在下，仅表达大量GS的细胞将存活。适当筛选后，可能选择生产外源蛋白的细胞。

当生产重组蛋白时，开发其他允许对大量表达重组蛋白的克隆(至少其中一些以高水平表达蛋白)进行分离的表达系统将扩展可用的选择，并增加鉴定适于在大规模蛋白生产中使用的高表达克隆的可能性。

发明概述

本发明的发明人基于将二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)用作可选择的标记物开发了新的表达系统。DHODH是嘧啶合成所需的酶。抑制DHODH的化合物因此抑制DNA合成且进而抑制细胞增殖。基于化合物的毒性可由其靶标的过表达缓解的原理，发明人推测在细胞中过表达野生型DHODH可赋予对DHODH抑制剂的抗性。其建立了编码DHODH的抗体表达载体用于与DHODH抑制剂组合使用，所述DHODH抑制剂包括来氟米特(IUPAC名称:5-甲基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)和特立氟胺(IUPAC名称:(2Z)-2-氰基-3-羟基-N-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)。其惊人地发现了当DHODH抑制剂是特立氟胺时分离生产抗体的克隆更加有效。其显示了在使用特立氟胺培养的CHO(代表中国仓鼠卵巢)细胞中使用包含所述载体的表达系统使得能够以与标准GS标记物相当水平分离产生抗体的克隆。

在细胞培养中生产重组蛋白的背景下，这是首次将DHODH用作可选择标记物。

US2003/0166201描述了抗抑制剂或不由选择剂抑制的改变的DHODH作为可选择标记物的用途。然而，US2003/0166201未描述将DHODH作为用于生产重组蛋白的标记物。此外，US2003/0166201未公开野生型DHODH或由选择剂抑制的改变的DHODH的用途，其局限于不受选择剂抑制的DHODH的用途。

Ganesan等人(2011),Molecular and Biochemical Parasitology 177:29-34公开了酵母DHODH作为可选择标记物用于转染恶性疟原虫(P falciparum)的用途，其使用阿托伐醌和恶性疟原虫特异性抑制剂DSM1和DSM74作为选择剂。此外，Ganesan等人未描述DHODH作为标记物用于生产重组蛋白。此外，其结果特定于使用酵母DHODH转化恶性疟原虫基因。

总之，发明人首次显示DHODH是用于获得生产重组蛋白克隆的有效可选择标记物。此外，其还证实了对使用的选择剂敏感的野生型DHODH可用于该目的。

因此，本发明提供表达载体，其包含编码哺乳动物二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的核苷酸序列和至少一种用于表达重组蛋白的表达盒。所述DHODH可如下定义，且可具体包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或其具有DHODH活性的变体的序列。在一个实施方案中，所述变体对如本文所述的DHODH活性抑制剂敏感，优选对特立氟胺敏感。

在一些实施方案中，编码DHODH的所述序列的三联密码子已针对特定细胞例如CHO细胞或人细胞中的表达进行偏移(biased)。在一些实施方案中，所述核苷酸序列包含SEQID NO:1的序列或SEQ ID NO:3的序列。

在一些实施方案中，所述重组蛋白是抗体(例如单克隆抗体)、chimiokine、淋巴因子、激素(例如胰岛素)、用于诱导抗体响应的免疫原性蛋白或用于酶替代疗法或用于工业用途的酶。当所述蛋白是抗体时，所述载体可包含适于克隆抗体轻链的第一表达盒和适于克隆抗体重链的第二表达盒。

本发明进一步提供如本文定义的编码DHODH的核苷酸序列作为选择标记物用于分离生产重组蛋白的克隆的用途。在一个实施方案中，所述编码DODH的核苷酸序列与至少一种DHODH抑制剂组合使用，特别是与特立氟胺组合使用，优选以25-200μM的特立氟胺浓度，更优选50-100μM，仍更优选50μM。

本发明还提供包含本发明的表达载体的细胞系，其将在下文进一步详述。

进一步提供的是包含本发明的表达载体和任选的根据本发明的细胞系的表达系统。表达系统可进一步包含至少一种如本文所述的作为DHODH抑制剂的选择剂。在一个实施方案中，DHODH抑制剂是特立氟胺，优选浓度为25-200μM，更优选50-100μM，仍更优选50μM。

因此，本发明提供表达系统，其为下述的组合：(i)真核细胞系；和(ii)适于生产重组蛋白的表达载体，其中所述载体包含编码哺乳动物谷氨酰胺合成酶(DHODH)(对于真核细胞系同源或异源)的序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，和(iii)DHODH抑制剂。在一个实施方案中，DHODH抑制剂是特立氟胺，优选浓度为25-200μM，更优选为50-100μM，仍更优选为50μM。

在具体的实施方案中，所述真核细胞系是CHO或人细胞系。在特定的实施方案中，当真核细胞系是CHO细胞系时，包含于表达载体中的编码DHODH的序列不是仓鼠DHODH序列。

当将表达系统用于生产重组蛋白时，将载体引入细胞系(其例如可以稳定或瞬时转染入细胞系)。本发明因此提供表达系统，其为(i)其中载体存在于细胞系内的组合，或(ii)其中载体与细胞系分离的组合。

根据本发明的表达系统可例如以试剂盒的形式提供，例如其具有包含表达载体的一个小瓶，和包含细胞系的另一小瓶。本发明一般来说提供包含如本文所述的表达载体的试剂盒，和任选地本发明的细胞系和/或DHODH抑制剂。在一个实施方案中，DHODH抑制剂是特立氟胺，优选浓度为25-200μM，更优选为50-100μM，仍更优选为50μM。

本发明还提供生产重组蛋白的方法，其包括步骤：提供如本文所定义的本发明的细胞系；在适于生产重组蛋白的条件下培养获得的所述细胞系；和分离和/或纯化所述重组蛋白。所述方法可进一步包括将所述重组蛋白配制成为药物组合物的步骤。

还提供了根据本发明的表达载体、细胞系、表达系统或试剂盒用于生产重组蛋白的用途。

附图简述

图1显示实施例中使用的载体的示意图。

图2显示来氟米特(图2A)及其代谢物特立氟胺(图2B)的结构。

图3显示在CHO 9E4细胞中使用人DHODH作为选择标记物由生产抗13C3的过程中获得的14个半克隆实现的生产率。

图4显示在CHO 9E4细胞中使用人DHODH作为选择标记物由生产抗CD38的过程中获得的19个半克隆实现的生产率。

图5显示在CHO 9E4细胞中使用人GS作为选择标记物由生产抗13C3的过程中获得的5个半克隆实现的生产率。

发明详述

二氢乳清酸脱氢酶

如本文使用的术语“二氢乳清酸脱氢酶”或“DHODH”指能够催化二氢乳清酸(4,5-二氢乳清酸或2,6-二氧代-1,3-二氮杂烷-4-羧酸)转化为乳清酸(乳清酸或1,2,3,6-四氢-2,6-二氧代-4-嘧啶羧酸)的多肽，如通过下述反应所示：

这样的多肽分类在Enzyme Commission(EC)编号1.3.3.1下。能够催化上述反应的多肽呈现“DHODH活性”。

上述反应是DNA和RNA合成所需的尿苷单磷酸(rUMP)从头合成中的第四步骤。因此抑制DHODH具有抑制DNA和RNA合成的效果且因此抑制细胞增殖。

本发明中使用的DHODH(进一步称作“本发明的DHODH”)可包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％相同的序列，或由其组成。其还可包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的至少100、150、200、250、300或350个连续氨基酸的片段，或由其组成，只要所述蛋白保持DHODH活性和其对DHODH抑制剂的敏感性。

在一些实施方案中，根据本发明的DHODH包含与SEQ ID NO:2的序列和SEQ ID NO:4的序列二者都至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％相同的序列，或由其组成。

在一些实施方案中，根据本发明的DHODH是人DHODH，即人来源的DHODH。如本文使用的术语"人DHODH"指呈现DHODH活性的包含SEQ ID NO:4或由其组成的序列及其变体。这样的变体可例如对应人物种中天然存在的变体(如等位基因变体或剪接变体)。可替换地，这样的变体可对应通过基因工程获得的变体。在一个实施方案中，这样的变体与SEQ IDNO:4的序列不同仅在于相比SEQ ID NO:4存在至多25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化(所述变化包括取代、插入和缺失)。

在一些实施方案中，DHODH是仓鼠DHODH，即仓鼠来源的DHODH。仓鼠DHODH可以是例如中国仓鼠(Cetulus griseus)DHODH。如本文使用的术语"中国仓鼠DHODH"指呈现DHODH活性的包含SEQ ID NO:2或由其组成的序列及其变体。这样的变体可以例如对应仓鼠物种中天然存在的变体(如等位基因变体或剪接变体)。可替换地，这样的变体可对应通过基因工程获得的变体。在一个实施方案中，这样的变体与SEQ ID NO:2的序列不同仅在于相比SEQID NO:2存在至多25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化(所述变化包括取代、插入和缺失)。

在另一实施方案中，变体DHODH将具有DHODH活性，任选与野生型蛋白相同的活性水平，或为野生型蛋白50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或更多的活性水平。

在另一实施方案中，变体DHODH将保持对DHODH活性抑制剂例如特立氟胺的敏感性。

在一些实施方案中，DHODH对至少一种DHODH抑制剂特别是对特立氟胺敏感。DHODH的抑制剂包括辛可宁酸、布喹那(6-氟-2-(2′-氟-1,1′-联苯-4-基)-3-甲基-4-喹啉羧酸)、萘醌衍生物如dichloroally指甲花醌、异噁唑衍生物如来氟米特(5-甲基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)及其活性代谢物特立氟胺((2Z)-2-氰基-3-羟基-N-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)、喹诺酮羧酸、萘醌、异噁唑、苯氧基喹啉、redoxal和衍生物、指甲花醌、拉帕醇、阿托伐醌和(8-氯-4-(2-氯-4-氟-苯氧基)喹啉)。DHODH的抑制剂可能能够抑制DHODH至少20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100％的活性。所述抑制剂可以例如50、100、200、300、400、500、600、700、800、900nM、1、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900μM、1mM或更大的浓度使用。在具体的实施方案中，DHODH抑制剂是特立氟胺且其以25和200μM的浓度使用，优选50-100μM，更优选50μM。

具有与本发明询问的氨基酸序列至少例如95％"相同"的氨基酸序列的多肽的目的在于主题多肽的氨基酸序列与询问的序列相同，除了主题多肽序列可包括每询问的氨基酸序列的每100个氨基酸中至多5个氨基酸变化。换而言之，为获得具有与询问的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，可以用另一氨基酸插入、缺失或取代主题序列中至多5％(100个中的5个)的氨基酸残基。

序列同一性可在变体序列的全长、参照序列的全长或二者上确定。例如，同一性的百分比可使用整体比对计算(即将两序列在其全长上进行比较)。用于比较两个或多个序列同一性和同源性的方法为本领域已知。《Needle》程序使用Needleman-Wunsch整体比对算法(Needleman和Wunsch,1970J.Mol.Biol.48:443-453)以在考虑其整体长度时发现两序列的最佳对齐(包括缺口)，其可例如在实施整体比对使用。Needle程序例如可在ebi.ac.uk万维网网站上获得。依照本发明的同一性百分比优选使用EMBOSS::Needle(整体)程序(其中“缺口开放”参数等于10.0，“缺口延伸”参数等于0.5和Blosum62矩阵)计算。

参照序列的变体相比参照序列可包含突变，如缺失、插入和/或取代。在取代的情况中，取代优选对应保守取代，如下表所示。

保守取代	氨基酸的类型
		Ala、Val、Leu、lle、Met、Pro、Phe、Trp	具有脂肪族疏水侧链的氨基酸
Ser、Tyr、Asn、Gln、Cys	不带电但具有极性侧链的氨基酸
		Asp、Glu	具有酸性侧链的氨基酸
Lys、Arg、His	具有碱性侧链的氨基酸
		Gly	中性侧链

载体

根据本发明的载体适于生产重组蛋白，且包含编码二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的序列。载体优选为DNA载体。

根据本发明的载体包含编码根据本发明的DHODH般的序列。编码根据本发明般的DHODH的序列可以是天然存在的核苷酸序列。可替换地，编码该DHODH的序列的三联密码子可针对在CHO细胞中的表达进行偏移。用于偏移序列进而获得最佳表达的软件和算法为本领域已知，且包括例如Raab等人(2010,Syst Synth Biol.4:215-25)中所述的算法。该算法不仅提供用于表达的最佳可获得的密码子，还考虑GC含量且不存在非预期DNA基序。

例如，编码根据本发明的DHODH的序列可包含与SEQ ID NO:3的序列(即，编码SEQID NO:4的人DHODH的序列，其以经设计用于CHO细胞中的最佳表达)和/或SEQ ID NO:1的序列(即，编码SEQ ID NO:2的仓鼠DHODH的序列，其已经设计用于在CHO细胞中的最佳表达)至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，或由其组成。

在一个实施方案中，编码根据本发明的DHODH的序列包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的序列或由其组成。

在根据本发明的载体中，编码DHODH的序列可置于本领域的技术人员已知的任何启动子控制下。

例如，编码DHODH的序列可例如置于适于驱动DHODH表达的启动子的控制下，例如猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40)启动子(例如SV40的晚期或早期启动子)、CMV启动子、延伸因子1启动子、GAPDH启动子、RPL37启动子、肌动蛋白启动子。早期SV40启动子描述于例如Benoist和Chambon(1981,Nature.290:304-10)和Moreau等人(1981,Nucleic AcidsRes.9:6047-68)中。具体而言，所述SV40启动子是全长启动子。所述SV40启动子还可具有包含72bp重复的复制起点。

在一些实施方案中，所述SV40启动子并非其中已移除位置128-270的SV40启动子，即所述SV40启动子并非韩国专利号10-0267720中所述的SV40启动子和转化大肠杆菌转化体(其于1997年12月17日保藏在Gene Bank,Institute of Bioengineering KIST，在保藏编号KCTC 8860P下)。

在其他实施方案中，编码根据本发明的DHODH的序列未置于SV40启动子的控制下。

适于生产重组蛋白的载体为本领域的技术人员已知。这样的载体通常对应包含复制起点和至少一个允许预期生产的重组蛋白的克隆和表达的表达盒的表达载体。表达盒通常包含5’非翻译区(其包含启动子和任选的增强子序列，或由其组成)、一个或多个允许编码重组蛋白的序列克隆的限制位点、3'非翻译区(例如多聚A信号)和任选的一个或多个内含子。启动子可对应任何本领域已知的强启动子，如例如人CMV启动子。任选地，根据本发明的载体包含原核复制起点(例如原核复制子如大肠杆菌中的ColE1)和至少原核选择性标记基因，也称为原核可选择标记物，进而载体允许在原核细胞中的复制。复制载体的细胞也表达原核细胞选择性标记基因，且因此可对其进行鉴定和选择。原核细胞可选择标记物基因为本领域的技术人员已知。原核细胞选择标记物基因的实例为例如编码赋予抗生素抗性的蛋白的核酸序列(例如，编码赋予对氨苄青霉素、氯霉素、灭菌素或卡那霉素的抗性的蛋白的序列)。根据本发明的载体可例如具有图1所述的结构，在实施例1中将对其进行更详细的阐释，其中编码13C3抗体或抗CD38抗体的重链和轻链的序列可使用两种其他编码序列(例如，编码另一抗体的重链和轻链的序列)替换。

重组蛋白可对应本领域的技术人员感兴趣的任何蛋白。如本文使用的术语"蛋白"意为涵盖肽(即少于50个氨基酸的氨基酸链)、多肽(即至少50个氨基酸的氨基酸链)、单体蛋白(即由一个氨基酸链组成的蛋白)和多聚体蛋白(即由两条或多条氨基酸链组成的蛋白，如例如单克隆抗体)。

根据本发明的载体通常包含与构成蛋白的不同氨基酸链数目相同的多个表达盒(例如，在单体蛋白或同二聚体蛋白的情况中为一个表达盒，在异二聚体蛋白或单克隆抗体的情况中为两个表达盒等)。

可替换地，即使预期生产异二聚体蛋白或单克隆抗体时，根据本发明的DNA载体可仅包含一个表达盒。在这样的情况中，编码蛋白其他氨基酸链的序列存在于不同的表达载体上，其与根据本发明的载体共转染入宿主细胞系。

在一个实施方案中，根据本发明的DNA载体可缺失表达盒。在这样的情况中，适于表达重组蛋白的表达盒存在于不同的载体上，其与根据本发明的载体共转染入宿主细胞系，特别是转染入CHO细胞系。

因此，在一些实施方案中，本发明的表达载体包含：

-编码DHODH的序列，其置于早期SV40启动子的控制下；

-第一表达盒，其中编码抗体轻链的序列置于CMV启动子的控制下；

-第二表达盒，其中编码抗体重链的序列置于CMV启动子的控制下；

-原核复制起点；和

-用于在原核细胞中使用的可选择标记，即编码赋予氨苄青霉素抗性的蛋白的序列，其置于其天然启动子的控制下。

贯穿本说明书，术语“重组蛋白”指预期其生产的任何重组蛋白。其可例如对应治疗性和/或预防性蛋白，即目的在于作为药物(包括疫苗)使用的蛋白。在特定的实施方案中，预期其生产的重组蛋白不是DHODH。在另一具体的实施方案中，预期其生产的重组蛋白是抗体，例如单克隆抗体。在另一具体的实施方案中，预期其生产的重组蛋白是抗原蛋白。

本文中术语“抗体”以其最广义使用且覆盖任何同种型的单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、多克隆抗体、多重特异性抗体(包括双特异性抗体)、抗体片段(如例如Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2片段)和包含抗体片段的融合蛋白。与特定抗原具有反应性的抗体可通过重组方法生成，如在噬菌体或相似的抗体中选择重组抗体的文库，或通过使用抗原或编码抗原的核酸免疫动物。

如本文使用的“单克隆抗体”是从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即形成该群体的抗体实质上相同，除可能以少量存在的天然发生的突变。这些抗体针对单表位(或在多重特异性单克隆抗体的情况中针对单组表位)且因此是高度特异性的。

典型的单克隆抗体由通过二硫键接合的两条相同的重链和两条相同的轻链组成。每条重链和轻链包含恒定区和可变区。每个可变区包含称为“互补决定区”(“CDR”)或“高变区”的三个区段，其主要负责结合抗原表位。其经常称作CDR1、CDR2和CDR3，从N末端顺序编号(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edition,National Institute of Health,Bethesda,MD,1991)。可变区更高度保守的部分称为“框架区”。

单克隆抗体可以例如是鼠类抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

当预期其生产的重组蛋白是单克隆抗体时，根据本发明的载体可包含适于克隆抗体轻链的第一表达盒和适于抗体重链克隆的第二表达盒。

在特定的实施方案中，所述第一和第二表达盒各包含巨细胞病毒(CMV)启动子，例如来自人或鼠类CMV的CMV启动子。更具体地，所述第一和第二表达盒可包含：

-CMV即刻早期增强子启动子(例如具有Teschendorf等人,2002,AnticancerRes.22:3325-30中所述的序列的一种)；或

-来自小鼠CMV的IE2启动子/增强子区(例如具有Chatellard等人,2007,Biotechnol Bioeng.96:106-17中所述的序列的一种)；或

-hCMV-MIE调节性元件(例如具有WO 89/01036中所述的序列的一种)。

术语“抗原蛋白”以最广义使用且覆盖能够单独或与佐剂组合生成免疫响应的任何蛋白。其目的在于在预防性疫苗或治疗性疫苗中使用。在特定的实施方案中，抗原蛋白是疫苗蛋白，即目的在于在预防性疫苗中使用的蛋白。

表达载体可包含至少一种编码感兴趣的重组蛋白的序列(例如，编码单聚体蛋白的一种序列、编码抗体链的一种序列，或分别编码抗体轻链和抗体重链的两种序列)，或其可以是空的(即缺少编码感兴趣的重组蛋白的这种序列)。

一方面，本发明针对根据本发明的载体本身。这样的载体优选目的在于在哺乳动物细胞系中使用。然而，其还可用于在其他真核细胞系如酵母、真菌或昆虫中表达蛋白。

细胞系

本发明提供包含根据本发明的载体的细胞系。在一个实施方案中，使用所述载体转染(稳定或瞬时转染)所述细胞系。在另一个实施方案中，所述细胞系包含整合入其基因组的所述载体。

细胞系是真核细胞系，例如哺乳动物细胞系如CHO细胞系，猴细胞系或人细胞系。

更具体地，本发明提供包含DNA表达载体的细胞系，且其中所述载体包含编码哺乳动物DHODH(对于真核细胞系同源或异源)的核苷酸序列和用于表达重组蛋白的至少一个表达盒。

CHO细胞系通常用于工业蛋白生产，且许多CHO细胞系为本领域已知。例如，这样的CHO细胞系包括从American Type Culture Collection公共可获得的株如CHO-K1细胞系(ATCC编号:CCL-61)、CHO-S细胞系(通过例如Invitrogen和Gibco销售)、CHO DP-12细胞系(ATCC编号CRL-12444和12445)和CHO 1-15细胞系(ATCC编号CRL-9606)。适于工业蛋白生产的另一细胞系是CHO 9E4细胞系。9E4细胞系通过单细胞克隆方法建立自CHO-K1细胞系的克隆。CHO-K1细胞系在1957年由Puck获得且已保藏在ATCC的编号CCL-61下。

在具体的实施方案中，细胞系是CHO细胞系且DHODH是异源来源(即DHODH不是仓鼠DHODH)。

人细胞如HEK293(ATCC编号CRL-1573)、HKB11(ATCC编号CRL-12568)、PER-C6(Crucell)、HT1080(ATCC编号CRL-121)、Jurkat、Daudi、Raji和CAP(ATCC编号CRL-1098)细胞也可用于蛋白生产，进而获得重组人蛋白的天然糖基化形式。

在一个实施方案中，细胞系能够在无血清的培养基(例如化学上限定的培养基)和/或在悬液中生长。这样的细胞系可由本领域的技术人员通过使亲代细胞系适应在无血清培养基和/或悬液(例如通过单细胞克隆，通过逐步适应和/或通过“饥饿和挽救”方法)中生长容易地获得。细胞系可以是DHODH缺陷型细胞系或包含编码野生型DHODH多肽的内源DHODH基因的细胞系。

根据本发明的试剂盒、方法和用途

本发明提供包含全部或部分根据本发明的表达系统的试剂盒，或由其组成。试剂盒包含如本文所述的编码DHODH的表达载体。在这样的试剂盒中，载体优选是空的，因为这允许本领域的技术人员对感兴趣的蛋白进行克隆。此外，DNA载体优选分离自在该试剂盒中的细胞系。试剂盒可进一步包含如本文所述的细胞系，至少一种选择剂如至少一种如本文所述的DHODH的抑制剂、适于细胞系培养的培养基、适于将载体转染入细胞系的培养基、包装材料和/或表达系统的使用说明。在一个实施方案中，DHODH抑制剂是特立氟胺，优选浓度为25-200μM，更优选为50-100μM，仍更优选为50μM。

本发明进一步提供根据本发明的表达系统、或根据本发明的载体、或根据本发明的细胞系、或根据本发明的试剂盒用于在体外生产重组蛋白的用途。在一个实施方案中，将至少一种DHODH抑制剂特别是特立氟胺用于实施根据本发明的表达系统、根据本发明的载体、根据本发明的细胞系或根据本发明的试剂盒用于在体外生产重组蛋白的用途。当使用特立氟胺时，其优选在25-200μM的浓度使用，更优选50-100μM，仍更优选50μM。

本发明进一步提供根据本发明的表达系统、根据本发明的载体或根据本发明的细胞系或根据本发明的试剂盒用于分离在体外生产高水平的重组蛋白的克隆细胞(“高生产克隆”)的用途。在一个实施方案中，将至少一种DHODH抑制剂特别是特立氟胺用于实施根据本发明的表达系统、根据本发明的载体、根据本发明的细胞系或根据本发明的试剂盒用于在体外生产重组蛋白的用途。当使用特立氟胺时，其优选以25-200μM的浓度使用，更优选50-100μM，仍更优选50μM。

在本发明的背景中，术语“高水平的重组蛋白”意指在培养基中重组蛋白的浓度为至少0.05g/l，优选至少0.1g/l，仍优选至少0.2g/l，更优选0.3-1g/l。重组蛋白的浓度可通过本领域的技术人员已知的方法确定，包括具体而言酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白免疫印迹、卡尺技术(caliper technology)和对应重组蛋白的纯化蛋白的浓度范围。

本发明进一步提供体外生产重组蛋白的方法，所述方法包括或由下述步骤组成：

a)提供细胞系；

b)使用根据本发明的载体转染所述细胞系；

c)在适于生产所述重组蛋白的条件下培养在步骤(b)获得的转染的细胞系；和

d)分离和/或纯化所述重组蛋白。

在具体的实施方案中，上述方法的步骤(c)在DHODH抑制剂存在下实施且包括通过选择抗DHODH抑制剂的转染细胞构成的亚步骤。在该特定实施方案的一种实施中，DHODH抑制剂是特立氟胺。在上文记载的具体实施方案的另一种实施中，在包含25-200μM浓度的特立氟胺存在下实施步骤(c)，优选50-100μM，更优选50μM。

对本领域的技术人员显而易见的是，上述方面涉及根据本发明的表达系统，其中所述DNA载体分离自步骤(a)的细胞系。

本发明进一步提供体外分离产生高水平重组蛋白的克隆细胞的方法，所述方法包括或由下述步骤组成：

a)提供细胞系；

b)使用根据本发明的载体转染所述细胞系；

c)在适于生产所述重组蛋白的条件下培养在步骤(b)获得的转染细胞系；和

d)分离产生高水平重组蛋白的克隆细胞。

在特定的实施方案中，在DHODH抑制剂存在下实施上述方法的步骤(c)并包括通过选择抗DHODH抑制剂的转染细胞构成的亚步骤。在该特定实施方案的一种实施中，DHODH抑制剂是特立氟胺。在上文记载的该具体实施方案的另一种实施中，在包含25-200μM浓度的特立氟胺存在下实施步骤(c)，优选50-100μM，更优选50μM。

a)提供根据本发明的表达系统；

b)在适于生产所述重组蛋白的条件下培养转染的细胞系；和

c)分离和/或纯化所述重组蛋白。

在具体的实施方案中，上述方法的步骤(b)在DHODH抑制剂存在下实施且包括通过选择抗DHODH抑制剂的转染细胞构成的亚步骤。在该特定实施方案的一种实施中，DHODH抑制剂是特立氟胺。在上文记载的该具体实施方案的另一种实施中，在包含25-200μM浓度的特立氟胺存在下实施步骤(b)，优选50-100μM，更优选50μM。

本发明进一步提供体外分离生产高水平重组蛋白的克隆细胞的方法，所述方法包括或由下述步骤组成：

a)提供根据本发明的表达系统；

b)在适于生产所述重组蛋白的条件下培养转染的细胞系；和

c)分离生产高水平重组蛋白的克隆细胞。

对本领域的技术人员显而易见的是，上述方面涉及根据本发明的表达系统，其中所述细胞系包含步骤(a)的DNA载体(例如，细胞系之前已使用DNA载体转染)。

本发明进一步提供体外生产重组蛋白的方法，其包括或由下述步骤组成：

a)提供根据本发明的载体，其中所述载体包含至少一种编码重组蛋白的序列；

b)使用所述载体转染细胞系；

c)在适于生产所述重组蛋白的条件下培养步骤(b)获得的转染的细胞系；和

d)分离和/或纯化所述重组蛋白。

适于生产重组蛋白的条件为本领域的技术人员已知。举例来说可使用实施例中所述的方案。

在具体的实施方案中，当培养根据本发明的细胞系时，添加至少一种DHODH抑制剂如来氟米特或特立氟胺。在另一具体的实施方案中，当培养细胞系时添加增加浓度的该抑制剂。这允许对其中载体衍生的DHODH基因(且因此编码重组蛋白的序列)已扩增的克隆进行选择。在上文记载的特定实施方案的一种实施中，DHODH抑制剂是特立氟胺。在上文记载的该具体实施方案的另一种实施中，当培养根据本发明的细胞系时添加25-200μM的特立氟胺，优选50-100μM，更优选50μM。

上述方法可进一步包括将重组蛋白配制成为药物组合物的步骤。

本发明进一步提供体外分离生产高水平重组蛋白的克隆细胞的方法，其包括或由下述步骤组成：

b)使用所述载体转染细胞系；

d)分离生产高水平重组蛋白的克隆细胞。

在具体的实施方案中，当培养根据本发明的细胞系时(即步骤(c))，添加至少一种DHODH抑制剂如来氟米特或特立氟胺。在另一具体的实施方案中，当培养所述细胞系时，添加增加浓度的该抑制剂。这允许对其中载体衍生的DHODH基因(且因此编码重组蛋白的序列)已扩增的克隆进行选择。在该特定实施方案的一种实施中，DHODH抑制剂是特立氟胺。在上文记载的该具体实施方案的另一种实施中，在步骤(c)中添加25-200μM的特立氟胺，优选50-100μM，更优选50μM。

本发明进一步提供用于共扩增编码重组蛋白的重组DNA序列的方法，其包括或由下述步骤组成：

a)提供根据本发明的载体，其中所述载体包含编码所述重组蛋白的序列；

b)提供细胞系；

c)使用所述载体转染所述细胞系；和

d)在允许选择包含扩增拷贝数的编码DHODH的载体衍生序列的转化体的条件下培养所述转染的细胞系，其中所述转化体还包含扩增拷贝数的编码重组蛋白完整氨基酸序列的序列。

在具体的实施方案中，上述方法的步骤(d)可包括在包含DHODH抑制剂的培养基中培养转染的细胞系和选择抗DHODH抑制剂特别是逐渐增加水平的DHODH抑制剂的转化体细胞。在上述具体实施方案的一种实施中，DHODH抑制剂是特立氟胺。在上文记载的具体实施方案的另一种实施中，DHODH抑制剂是特立氟胺且其以25-200μM的浓度使用，优选50-100μM，更优选50μM。

本发明进一步提供体外分离生产高水平的重组蛋白的克隆细胞的方法，其包括或由下述步骤组成：

b)提供细胞系；

c)使用所述载体转染所述细胞系；和

e)从步骤(d)的转染细胞分离生产高水平重组蛋白的克隆细胞。

本发明进一步提供将DNA载体在共转化方法中用作显性可选择标记物的方法，其中所述方法包括或由下述步骤组成：

a)提供根据本发明的载体，其中所述载体包含编码重组蛋白的序列；

b)提供细胞系；

c)使用所述载体转染所述细胞系；和

d)选择抗DHODH抑制剂的转化体细胞，由此对其中编码DHODH的载体衍生的重组DNA序列作为显性可选择和共扩增标记物发挥作用的转化体细胞进行选择。

在上述方法的具体实施方案中，所选的转化体细胞抗DHODH抑制剂特立氟胺。在上述方法的另一实施方案中，所选转化体细胞抗25-200μM浓度的特立氟胺，优选50-100μM，更优选50μM。

贯穿说明书，术语如‘包含’、‘包括’、‘含有’且可具有将其归属于大多数专利司法管辖范围优选在有关的司法管辖范围中的含义，例如，其可意为‘包括’、‘包含’、‘含有’等。术语‘由…组成’、‘基本上由…组成’和‘基本上由…组成’具有将其归属于大多数专利司法管辖范围优选在有关的司法管辖范围中的含义，例如其表明排除全部、大多数或全部但可忽略的量的其他元素，其允许元素不被明确记载，但排除在现有技术中发现的或影响本发明基本或新特征的元素。

贯穿本说明书文本引用了数个文件。本文引用的每篇文件(包括任何期刊文章或摘要、公开或未公开的专利申请、颁发的专利、制造商的说明、指导等)在此处通过提述并入。然而，并不存在对本文引用的任何文件事实上对于本发明为现有技术的承认。

本发明将进一步通过参照下述附图和实施例进行描述，其仅为阐述性的，且目的并非在于限制本发明。本发明通过权利要求限定，其应结合说明书和附图进行解读。

序列简述

SEQ ID NO:1显示编码中国仓鼠(Cricetulus griseus)来源的DHODH的cDNA序列。

SEQ ID NO:2显示中国仓鼠来源的DHODH的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3显示编码人来源的DHODH的cDNA序列。

SEQ ID NO:4显示人来源的DHODH的氨基酸序列。

实施例

实施例1:包含DHODH标记物的表达载体的生成

本发明的发明人目的在于开发新型用于在真核细胞系中表达和生产重组蛋白的载体。设计了两组用于抗体表达的载体，分别并入人和中国仓鼠DHODH作为可选择标记物。

第一组载体包含两条编码13C3抗体人源化版本的cDNA(分别为编码13C3重链的一条cDNA和编码13C3轻链的另一条cDNA，所述链的组合形成人源化的13C3抗体)。鼠类13C3抗体是与人β-淀粉样蛋白的原纤维形式特异性结合的抗体，如WO 2009/065054中所述。如本文进一步使用，术语“13C3”指鼠类13C3抗体的人源化版本。

第二组载体包含两条编码抗CD38抗体的cDNA(分别为编码重链的一条cDNA和编码轻链的另一条cDNA，所述链的组合形成抗CD38抗体)。

所述载体在图1中示意性地表示。这些载体包含：

-编码DHODH的序列，其置于早期SV40启动子的控制下；

-原核复制起点；和

-用于在原核细胞中使用的可选择标记物，即编码赋予对氨苄青霉素的抗性的蛋白的序列，其置于其天然启动子的控制下。

更具体地，将编码DHODH的序列置于SV40启动子(包括SV40增强子)的控制下。这样的SV40早期启动子包含与21-bp非串联重复和排除任何编码序列的SV40早期先导蛋白序列连接的SV40 72-bp串联重复增强子。该区作为强启动子的使用描述于Benoist和Chambon(1981,Nature.290:304-10)和Moreau等人(1981,Nucleic Acids Res.9:6047-68)中。其在哺乳动物细胞中作为用于选择标记物表达的经典启动子使用。在pBH3694-pBH3700七种载体中，破坏了天然的HindIII限制位点，并在启动子区的5’和3’末端添加独特的限制位点(SalI和XmaI)，以这种方式允许不同DHODH cDNA容易地交换。

在每组载体中，将编码具有不同来源的DHODH的序列克隆入载体。

更具体地，使用可在公共数据库获得的天然存在(野生型)的氨基酸序列分别生成编码来自中国仓鼠(Cricetulus griseus)和人(智人，Homo sapiens)的DHODH的cDNA。始于这些序列，使用CHO细胞中最常见的密码子的矩阵回译蛋白。其后，修饰cDNA以包含适当的克隆位点并优化核苷酸序列。需要注意的是，尽管优化核苷酸序列用于CHO表达，编码的蛋白的氨基酸序列保持与天然存在的编码蛋白相同。

更具体地，将不同DHODH天然存在的编码序列考虑为起始点。人DHODH氨基酸序列对应NCBI参照序列:NP_001352.2(SEQ ID NO:4)中所显示的。中国仓鼠DHODH氨基酸序列对应NCBI参照序列:XP_007634457.1(SEQ ID NO:2)中所显示的。始于天然存在的cDNA序列，使用由Wagner及其同事开发的软件将编码该DHODH的序列的三联密码子针对CHO细胞中的表达进行了偏移，所述软件基于Raab等人(2010,Syst Synth Biol.4:215-25)中所述的算法。该技术不仅提供用于表达的最佳可获得密码子，还考虑GC含量和不合意DNA基序的不存在。

将获得的cDNA克隆入具有用于13C3和抗CD38抗体的表达盒的骨架，由此收获图1中所示的载体。

这些载体以及来源的名称和所编码的DHODH的序列示于下表中。

实施例2:以来氟米特和特立氟胺作为选择剂的载体在CHO表达细胞中的使用

使用CHO 9E4细胞实施的初步实验表明来氟米特可用作选择剂。简言之，初步实验显示使用50和100μM的来氟米特培养CHO 9E4细胞未杀伤细胞但抑制了生长。使用带有编码仓鼠DHODH和用于生产13C3抗体的遗传材料的cDNA的质粒转染CHO 9E4细胞并在具有40μM来氟米特的96孔板中培养。其获得了27孔具有生长细胞的孔。对于这27孔，4孔产生虽低但显著的量的13C3抗体。然而，生产是不稳定的且效率低于0.1％。这些实验作为DHODH可用作可选择标记物用于重组蛋白生产的原理证据发挥作用，进而实施进一步的实验。

使用带有编码人DHODH cDNA的cDNA和用于生产抗CD38或13C3抗体的遗传材料的两种不同的质粒(载体pBH4952和pBH4967)转染CHO 9E4细胞系。作为用于选择的对照载体，将带有编码人GS cDNA而非DHODH的cDNA(pBH3695)的质粒转染入CHO 9E4细胞系。使用标准电穿孔技术转染遗传材料。

转染后24小时，开始选择过程。对于人和仓鼠DHODH二者，在包含50μM或100μM来氟米特或特立氟胺的CD-CHO培养基中稀释细胞。将对照载体等同转染并提交至相同的选择过程。

在每种情况中，以2000细胞/孔接种480孔。对于对照载体，在50和100μM特立氟胺即使在25天后也未在任何孔中观察到生长。

在50和100μM使用来氟米特的选择是无效的：来自人或仓鼠来源的DHODH存在20天后，全部孔都展示生长的克隆。对于对应480孔的全部上清，测试了其生产抗体的能力，且无上清展示可检测量的抗体，确认了来氟米特难以用于这类实验的使用。

在特立氟胺选择的转染中，生长细胞在2周后在使用带有编码人DHODH cDNA和用于生产抗CD38的遗传材料的cDNA的载体转染的细胞、以及使用带有编码人DHODH cDNA的cDNA和用于生产抗13C3抗体的遗传材料的载体转染的细胞(分别为载体pBH4967和pBH4952)的约8-10％的孔中出现。一定比例的孔产生抗体，一些超过10μg/ml，如表1和2中所示。相比之下，在任何包含使用带有编码仓鼠DHODH cDNA的cDNA和用于生产抗CD38或抗13C3抗体的遗传材料的载体(分别为载体pBH4940和pBH4939)转染的细胞的孔中未观察到生长。

表1:使用13C3抗体的结果。15-20天后占用的孔显示生长的克隆。

特立氟胺50μM(13C3)	孔的数目
		测试的	480
占用的	38
		占用的％	8
生产者的％	3
		抗体:少于10μg/ml	24
抗体:多于10μg/ml	14

表2:使用抗CD38抗体的结果。15-20天后占用的孔显示生长的克隆。

特立氟胺50μM(抗CD38)	孔的数目
		测试的	480
占用的	48
		占用的％	10
生产者的％	4
		抗体:少于10μg/ml	29
抗体:多于10μg/ml	19

总体而言，在13C3的情况中，480孔中的14孔包含生产大于10μg/ml抗体的克隆，而对于抗CD38，480孔中的29孔包含生产大于10μg/ml抗体的克隆。该效率与标准选择标记物人GS cDNA和伴侣GS酶抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)是可比的，其中所占用的孔的百分比范围为1-10％。该实验典型的结果在表3中给出。

表3:使用GS/MSX表达系统利用13C3抗体的结果。15-20天后占用的孔显示生长的克隆。

MSX 25μM(13C3)	孔的数目
		测试的	960
占用的	46

实施例3:使用特立氟胺作为选择剂的生产力评估

为更深入地测量生产的抗体的量，扩增了最有希望的克隆并在方案模拟生物反应器条件中对其生产力进行了评估。

选择实施例1中来自生产最高水平抗体的孔的细胞用于进一步扩增。在实验初始每孔包含2000个细胞，因此，每孔不包含克隆本身。每孔细胞在此处称作半克隆。

对应生产13C3抗体的半克隆的14孔和对应生产抗CD38抗体的半克隆的19孔在适当的条件中生长。

作为阳性对照，扩增对应MSX/GS转染的5个半克隆。

在具有5％CO₂和80％湿度的37℃，在分别包含用于选择人DHODH或人GS的50μM特立氟胺或25μM MSX的CD-CHO培养基(Life Technologies)中实施全部扩增实验。

将生长生产每种抗体的细胞的96孔转移入在24孔板的1ml培养基中。生长3天后，将1ml细胞悬液转移入包含4ml新鲜培养基的25cm²烧瓶中并伴随搅拌再使细胞生长3天。温育3天后，添加5ml新鲜培养基。编号细胞悬液后，以0.3x10⁶细胞每ml接种另一培养物并使其再生长3天。该生长后，起始在CD-CHO+30％的Feed B中以0.3x10⁶细胞每ml接种的最终培养用于抗体生产。

温育细胞悬液13天并在温育第10天和13天取样用于评估抗体浓度。

图3显示50μM特立氟胺存在下在第10天和第13天14个DHODH/13C3半克隆的生产力。

图4显示50μM特立氟胺存在下在第10天和第13天19个DHODH/抗CD38半克隆的生产力。

整体而言，实现的生产力(在第13天0.5-0.8g/l)和频率(约3-10％的96孔生产半克隆)与参照CHO 9E4细胞(参见表3)中的人GS或CHO K1SV细胞中的仓鼠GS在相同的范围。这从图5中可见，其显示了25μM MSX存在下在第8天和第13天GS/13C3CHO 9E4半克隆的生产力。

实施例4:使用参照GS载体和基于DHODH的载体的CHO细胞的瞬时转染

实验A：将13C3抗体用于测量带有载体的DHODH选择标记物的转染效率。

为此，根据Maxcyte等人的说明书制备了载体，例如低内毒素，260nm/280mn比率接近2，浓度为5mg/ml。使用由Maxcyte开发的高效电穿孔方案在Maxcyte设备上对CHO-9E4细胞进行电穿孔，一式四份，使用带有编码人GS cDNA而非DHODH的cDNA的对照载体即质粒pBH3695和使用带有DHODH的载体即pBH4952。转染前细胞以1x10⁶ 24h分裂。对于每种转染条件，将80x10⁶细胞在300g离心10分钟。使用200μl Hyclone缓冲液(Maxcyte)重悬沉淀。以0.3μg/μl添加DNA并将混合物(细胞、缓冲液和DNA)转移入400μl Maxcyte电穿孔盒。使用的加工组件为OC-400，其特异性针对400μl盒，并选择用于HEK-293FS的优化程序。对于恢复期，将转染的细胞转移入125ml烧瓶并在37℃温育40分钟而无搅拌。添加20ml预先温热的Freestyle培养基(Invitrogen)并在37℃、5％CO₂、80％湿度和110rpm搅拌在24小时过程中使细胞生长。通过添加丁酸钠1M(Merck)以达到1mM终浓度终止细胞生长。在13天过程中，在32℃维持培养细胞10天并以3.6％的特殊生产进料(2.5％EfficientFeedA(Invitrogen)、0.5％Yeastcolate(Invitrogen)、2g/L葡萄糖(Sigma)和0.25mM GlutaMAX(Invitrogen))补给。

转染后7、10、11、12和13天，使用卡尺技术和人纯化抗体的浓度范围，测量了由瞬时转染的细胞生产的抗体浓度。这些浓度展示于表4中。

表4:由瞬时转染的细胞系生产的13C3抗体的浓度(以mg/L给出)

实验B:

该实验主要目的在于(i)比较使用不同载体(即编码人GS作为选择标记物的载体pBH3695和编码人DHODH作为选择标记物的载体pBH4952)瞬时转染的细胞的13C3抗体的生产，和(ii)比较使用载体pBH4952和pBH4967的两种不同抗体(即13C3和抗CD38抗体)的生产。

使用的实验操作与上文公开的用于实验A的相同。然而，在实验B中测试了两种不同的CHO细胞系(即CHO 9E4和CHO 30D12(其中编码谷氨酰胺合成酶的基因已被敲除的细胞系))并在第20天测量了由转染的细胞生产的抗体的浓度。此外，测试了载体pBH4952的三种可替换的纯化方法(分别使用经典Qiagen柱、HiSpeed柱(由Qiagen销售)和Macherey-Nagel柱的方法)以研究纯化方法对抗体最终生产的潜在影响。

可从下文总结该实验结果的表5显而易见的是，无论使用哪一种纯化方案纯化载体，生产的抗体的量是相似的。此外，抗体生产在CHO 9E4和CHO30D12中相似。除此之外，由于通过使用表达DHODH作为选择标记物的载体转染的细胞生产的13C3和抗CD38抗体的浓度相似(参见与载体pBH4952和pBH4967相关的数据)，可以得出的结论是抗体生产并不取决于抗体的性质。

总之，上述结果清楚显示DHODH可在表达系统中用作选择标记物且该表达系统至少与使用选择标记物GS的系统同样有效。

总之，这些结果显示本发明的载体可在瞬时转染或稳定转染中使用。其具有产生重组抗体的能力，所述抗体在两种转染技术中具有与参照载体相同的效率。

序列表

<110> 赛诺菲

<120> 用于细胞转染和蛋白生产的新型选择性标记物

<130> FR2014/014

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1188

<212> DNA

<213> 原仓鼠(Cricetus cricetus)

<400> 1

atggcttggc ggcagatgcg gaagagagcc ctggacgccg ctatcatcct gggaggcgga 60

ggcctgctgt tcacctctta cctgacagcc accggcgacg accacttcta cgccgagtac 120

ctgatgcctg ccctgcagag actgctggac cctgagtctg cccaccggct ggccatcaga 180

ttcacctccc tgggcctgct gcccagagcc accttccagg actccgacat gctggaagtg 240

cgggtgctgg gccacaagtt cagaaacccc gtgggaatcg ccgctggctt cgacaagcac 300

ggcgaggctg tggacggcct gtacaagctg ggcttcggct tcgtggaagt gggctccgtg 360

acaccccagc cccaggaagg caaccccaga cctagagtgt tccggctgcc tgaggaccag 420

gccgtgatca acagatacgg cttcaactcc cacggcctgt ccgtggtgga acaccggctg 480

agagccagac agcagaagca gaacaagctg accgccgacg gcctgcccct gggcatcaat 540

ctgggcaaga acaagacctc cgaggacgct gccgccgact acgtggaagg cgtgcgagtg 600

ctgggacctc tggccgatta cctggtcgtg aacgtgtcct cccccaacac cgctggcctg 660

agaagcctgc agggaaaggc cgagctgaga aggctgctgg ccaaggtgct gcaggaacgg 720

gacgctctga agggcgccca gaaacctgcc gtgctcgtga agatcgcccc tgacctgacc 780

gcccaggaca aagaggatat cgcctccgtg gccagagagc tgggcatcga cggactgatc 840

gtgaccaaca ccaccgtgtc tcggcctacc ggactgcagg gcgctctgag atctgagatg 900

ggcggcctgt ctggcaagcc tctgagggac ctgtccaccc agaccatcag agagatgtac 960

accctgaccc agggccggat ccccatcatt ggagtgggcg gagtgtcctc tggccaggac 1020

gccctggaaa agatccaggc tggcgcctct ctggtgcagc tgtataccgc cctgaccttt 1080

ctgggccctc ccgtggtggt gcgagtgaag agagaactgg aagccctgct gaaagagcgg 1140

ggcttcaaca ccgtgaccga ggccatcggc gctgaccaca gaagatga 1188

<210> 2

<211> 395

<212> PRT

<213> 原仓鼠

<400> 2

Met Ala Trp Arg Gln Met Arg Lys Arg Ala Leu Asp Ala Ala Ile Ile

1 5 10 15

Leu Gly Gly Gly Gly Leu Leu Phe Thr Ser Tyr Leu Thr Ala Thr Gly

20 25 30

Asp Asp His Phe Tyr Ala Glu Tyr Leu Met Pro Ala Leu Gln Arg Leu

35 40 45

Leu Asp Pro Glu Ser Ala His Arg Leu Ala Ile Arg Phe Thr Ser Leu

50 55 60

Gly Leu Leu Pro Arg Ala Thr Phe Gln Asp Ser Asp Met Leu Glu Val

65 70 75 80

Arg Val Leu Gly His Lys Phe Arg Asn Pro Val Gly Ile Ala Ala Gly

85 90 95

Phe Asp Lys His Gly Glu Ala Val Asp Gly Leu Tyr Lys Leu Gly Phe

100 105 110

Gly Phe Val Glu Val Gly Ser Val Thr Pro Gln Pro Gln Glu Gly Asn

115 120 125

Pro Arg Pro Arg Val Phe Arg Leu Pro Glu Asp Gln Ala Val Ile Asn

130 135 140

Arg Tyr Gly Phe Asn Ser His Gly Leu Ser Val Val Glu His Arg Leu

145 150 155 160

Arg Ala Arg Gln Gln Lys Gln Asn Lys Leu Thr Ala Asp Gly Leu Pro

165 170 175

Leu Gly Ile Asn Leu Gly Lys Asn Lys Thr Ser Glu Asp Ala Ala Ala

180 185 190

Asp Tyr Val Glu Gly Val Arg Val Leu Gly Pro Leu Ala Asp Tyr Leu

195 200 205

Val Val Asn Val Ser Ser Pro Asn Thr Ala Gly Leu Arg Ser Leu Gln

210 215 220

Gly Lys Ala Glu Leu Arg Arg Leu Leu Ala Lys Val Leu Gln Glu Arg

225 230 235 240

Asp Ala Leu Lys Gly Ala Gln Lys Pro Ala Val Leu Val Lys Ile Ala

245 250 255

Pro Asp Leu Thr Ala Gln Asp Lys Glu Asp Ile Ala Ser Val Ala Arg

260 265 270

Glu Leu Gly Ile Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Thr Thr Val Ser Arg

275 280 285

Pro Thr Gly Leu Gln Gly Ala Leu Arg Ser Glu Met Gly Gly Leu Ser

290 295 300

Gly Lys Pro Leu Arg Asp Leu Ser Thr Gln Thr Ile Arg Glu Met Tyr

305 310 315 320

Thr Leu Thr Gln Gly Arg Ile Pro Ile Ile Gly Val Gly Gly Val Ser

325 330 335

Ser Gly Gln Asp Ala Leu Glu Lys Ile Gln Ala Gly Ala Ser Leu Val

340 345 350

Gln Leu Tyr Thr Ala Leu Thr Phe Leu Gly Pro Pro Val Val Val Arg

355 360 365

Val Lys Arg Glu Leu Glu Ala Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Asn Thr

370 375 380

Val Thr Glu Ala Ile Gly Ala Asp His Arg Arg

385 390 395

<210> 3

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人

<400> 3

atggcttggc ggcacctgaa gaagagggcc caggacgccg tgatcatcct gggaggcgga 60

ggcctgctgt tcgcctctta cctgatggct accggcgacg agcggttcta cgccgagcat 120

ctgatgccca cactgcaggg cctgctggac cctgagtctg cccatagact ggccgtgcgg 180

ttcacctccc tgggactgct gcctagagcc cggttccagg actccgacat gctggaagtg 240

cgggtgctgg gccacaagtt cagaaacccc gtgggaatcg ccgctggctt cgacaagcac 300

ggcgaggctg tggacggcct gtacaagatg ggcttcggct tcgtggaaat cggctccgtg 360

acccccaagc cccaggaagg caaccccaga cctcgggtgt tcagactgcc tgaggaccag 420

gctgtgatca acagatacgg cttcaactcc cacggcctgt ccgtggtgga acaccggctg 480

agagccagac agcagaagca ggccaagctg accgaggatg gcctgcctct gggagtgaac 540

ctgggcaaga acaagacctc cgtggacgcc gccgaggatt acgctgaagg cgtgcgagtg 600

ctgggacccc tggctgatta cctggtcgtg aacgtgtcct cccccaacac cgctggcctg 660

agatctctgc agggcaaggc cgagctgcgg agactgctga caaaggtgct gcaggaacgc 720

gacggcctgc ggagagtgca tagacctgcc gtgctcgtga agatcgcccc cgacctgacc 780

agccaggaca aagaggatat cgcctccgtc gtgaaagagc tgggcatcga cggactgatc 840

gtgaccaaca ccaccgtgtc taggcctgcc ggactgcagg gggctctgag atctgaaacc 900

ggcggactgt ccggcaagcc tctgagggat ctgtccaccc agaccatcag agagatgtac 960

gccctgaccc agggccgggt gccaatcatt ggagtgggcg gagtgtcctc cggccaggat 1020

gccctggaaa agatcagagc cggcgcttcc ctggtgcagc tgtacaccgc tctgaccttt 1080

tggggccctc ccgtcgtggg caaagtgaag agagagctgg aagccctgct gaaagagcag 1140

ggatttggcg gcgtgaccga tgccatcggc gctgaccaca gaagatga 1188

<210> 4

<211> 395

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Met Ala Trp Arg His Leu Lys Lys Arg Ala Gln Asp Ala Val Ile Ile

1 5 10 15

Leu Gly Gly Gly Gly Leu Leu Phe Ala Ser Tyr Leu Met Ala Thr Gly

20 25 30

Asp Glu Arg Phe Tyr Ala Glu His Leu Met Pro Thr Leu Gln Gly Leu

35 40 45

Leu Asp Pro Glu Ser Ala His Arg Leu Ala Val Arg Phe Thr Ser Leu

50 55 60

Gly Leu Leu Pro Arg Ala Arg Phe Gln Asp Ser Asp Met Leu Glu Val

65 70 75 80

Arg Val Leu Gly His Lys Phe Arg Asn Pro Val Gly Ile Ala Ala Gly

85 90 95

Phe Asp Lys His Gly Glu Ala Val Asp Gly Leu Tyr Lys Met Gly Phe

100 105 110

Gly Phe Val Glu Ile Gly Ser Val Thr Pro Lys Pro Gln Glu Gly Asn

115 120 125

Pro Arg Pro Arg Val Phe Arg Leu Pro Glu Asp Gln Ala Val Ile Asn

130 135 140

Arg Tyr Gly Phe Asn Ser His Gly Leu Ser Val Val Glu His Arg Leu

145 150 155 160

Arg Ala Arg Gln Gln Lys Gln Ala Lys Leu Thr Glu Asp Gly Leu Pro

165 170 175

Leu Gly Val Asn Leu Gly Lys Asn Lys Thr Ser Val Asp Ala Ala Glu

180 185 190

Asp Tyr Ala Glu Gly Val Arg Val Leu Gly Pro Leu Ala Asp Tyr Leu

195 200 205

Val Val Asn Val Ser Ser Pro Asn Thr Ala Gly Leu Arg Ser Leu Gln

210 215 220

Gly Lys Ala Glu Leu Arg Arg Leu Leu Thr Lys Val Leu Gln Glu Arg

225 230 235 240

Asp Gly Leu Arg Arg Val His Arg Pro Ala Val Leu Val Lys Ile Ala

245 250 255

Pro Asp Leu Thr Ser Gln Asp Lys Glu Asp Ile Ala Ser Val Val Lys

260 265 270

Glu Leu Gly Ile Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Thr Thr Val Ser Arg

275 280 285

Pro Ala Gly Leu Gln Gly Ala Leu Arg Ser Glu Thr Gly Gly Leu Ser

290 295 300

Gly Lys Pro Leu Arg Asp Leu Ser Thr Gln Thr Ile Arg Glu Met Tyr

305 310 315 320

Ala Leu Thr Gln Gly Arg Val Pro Ile Ile Gly Val Gly Gly Val Ser

325 330 335

Ser Gly Gln Asp Ala Leu Glu Lys Ile Arg Ala Gly Ala Ser Leu Val

340 345 350

Gln Leu Tyr Thr Ala Leu Thr Phe Trp Gly Pro Pro Val Val Gly Lys

355 360 365

Val Lys Arg Glu Leu Glu Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gly Phe Gly Gly

370 375 380

Val Thr Asp Ala Ile Gly Ala Asp His Arg Arg

385 390 395

Claims

1.表达载体，其包含编码哺乳动物二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中所述DHODH包含与SEQ ID NO:2的序列或与SEQ ID NO:4的序列至少90％相同的序列。

2.根据权利要求1的表达载体，其中所述DHODH对至少一种DHODH抑制剂敏感。

3.根据权利要求1-2任一项的表达载体，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的序列或SEQ ID NO:3的序列。

4.根据权利要求1-3任一项的表达载体，其中所述重组蛋白是单克隆抗体。

5.根据权利要求1-4任一项的表达载体，其中所述载体包含适于抗体轻链克隆的第一表达盒和适于抗体重链克隆的第二表达盒。

6.根据权利要求1-5任一项的表达载体，其中所述DHODH对特立氟胺敏感。

7.包含根据权利要求1-6任一项的表达载体的细胞系。

8.根据权利要求7的细胞系，其为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或人细胞系。

9.包含根据权利要求1-6任一项的表达载体的表达系统。

10.根据权利要求9的表达系统，其进一步包含根据权利要求7或权利要求8的细胞系。

11.根据权利要求10的表达系统，其进一步包含至少一种DHODH抑制剂。

12.根据权利要求11的表达系统，其中所述至少一种DHODH抑制剂是特立氟胺。

13.根据权利要求10-12任一项的表达系统，其中当所述细胞系是CHO细胞系时，由包含在所述表达载体中的编码DHODH的核苷酸序列编码的DHODH不是仓鼠DHODH。

14.包含根据权利要求7或权利要求8的细胞系和至少一种DHODH抑制剂的试剂盒。

15.根据权利要求14的试剂盒，其中所述至少一种DHODH抑制剂是特立氟胺。

16.体外生产重组蛋白的方法，其包括步骤：

a)提供根据权利要求7或权利要求8的细胞系；

b)在适于生产所述重组蛋白的条件下培养获得的所述细胞系；和

c)分离和/或纯化所述重组蛋白。

17.根据权利要求16的方法，其中在至少一种DHODH抑制剂存在下实施步骤(b)。

18.根据权利要求17的方法，其中所述至少一种DHODH抑制剂是特立氟胺。

19.根据权利要求16-18任一项的方法，其进一步包括将所述重组蛋白配制成为药物组合物的步骤。

20.权利要求1-6任一项的表达载体、根据权利要求7或权利要求8的细胞系、根据权利要求9-13任一项的表达系统或根据权利要求14或15的试剂盒用于生产重组蛋白的用途。

21.根据权利要求20的用途，其中所述表达载体、所述细胞系、所述表达系统或所述试剂盒与至少一种DHODH抑制剂组合使用。

22.根据权利要求21的用途，其中所述至少一种DHODH抑制剂是特立氟胺。

23.如权利要求1定义的编码DODH的核苷酸序列作为用于分离生产重组蛋白的克隆的选择性标记物的用途。

24.根据权利要求23的用途，其中所述编码DODH的核苷酸序列与至少一种DHODH抑制剂组合使用。

25.根据权利要求24的用途，其中所述至少一种DHODH抑制剂是特立氟胺。