KR101623526B1 - 인간 보체 인자 h의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물세포에서 인간 보체 인자 H를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법을 통해 동물 세포에서 인간 보체 인자 H(hCFH)를 고수율 및 대량으로 생산할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 hCFH를 이용한 치료제의 생산 및 hCFH의 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 보체 인자 H의 생산 방법{METHOD FOR PRODUCING HUMAN COMPLEMENT FACTOR H}

본 발명은 인간 보체 인자 H의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 동물세포에서 인간 보체 인자 H를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

보체 시스템(complement system)은 생물로부터 병원균을 제거하는 항체 및 식세포의 작용을 도울 뿐만 아니라, 스스로도 세포의 분해(cytolysis), 식균작용 증진(opsonization), 염증반응(inflammation)의 활성화 및 면역복합체(immune complexes)의 제거 등과 같은 여러 가지 작용을 하여, 선천적 면역 체계의 일부분을 담당한다.

보체는 세 가지의 경로를 통하여 활성화되는 것으로 알려져 있다. 첫 번째는 고전 경로(classical pathway)로서, 일반적으로 항체 의존적 경로를 지칭하며, C1 복합체에 의해 활성이 시작된다. 두 번째는 대체 경로(alternative pathway)로서, C3 분자의 붕괴로 인해 활성이 시작된다 (Nat . Immunol ., 2010, Sep;11(9):785-97). 그리고, 세 번째는 렉틴 경로(lectin pathway)로서, 고전 경로와 유사하나 옵소닌(opsonin)이나 만노오스 부착 렉틴(mannose-binding lectin) 등에 의해 활성이 유도된다.

주로 대체 경로를 조절하는 것으로 알려진 '인간 보체 인자 H'(human complement factor H, 이하 'hCFH'라고도 함)는 20개의 짧은 반복 도메인(short consensus repeats, SCRs)을 지닌 155kD 크기의 커다란 당단백질로서, 인체 혈액 내에 약 200~300 μg/mL의 양으로 존재한다(Invest . Ophthalmol . Vis . Sci ., 2008, May; 49(5):1983-90). hCFH는 보체 인자 I(Factor I)와 함께 C3b 제거 및 C3 전환효소에 의한 붕괴 가속화를 저해하는 역할을 할 뿐만 아니라, 자기(self)와 비자기(non-self) 세포를 구분하여 자기 세포만을 선택적으로 방어하는 기능을 지니고 있다(Immunopharmacology, 49 (1-2): 149-57).

hCFH는 막성증식형신염 타입 II (membranoproliferative glomerulonephritis type II, MPGN type II), 비전형적 용혈성 요독 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS) 및 노인황반변성(age-related macular degeneration, AMD)을 포함하는 각종 면역관련 질환에 관여하는 것으로 보고되고 있다(Clin . Exp . Immunol ., 2008, Jan;151(1):1-13). 이에, 재조합 hCFH를 이용한 치료제 개발이 진행되고 있고, 이에 발맞추어 각종 발현 시스템을 활용하여 재조합 hCFH를 발현하는 시도들이 보고되고 있다. 예를 들어, 문헌[Gene, 1994, (143)301-2]에 따르면, 배큘로바이러스 시스템(Baculovirus system)에서 곤충 세포(insect cell)를 이용하여 5 mg/L의 수율로 재조합 hCFH를 얻을 수 있음이 보고되었다. 또한, 국제공개공보 제WO2008/113589호에 혈장 내 hCFH를 정제하는 방법이 개시되어 있으며, 미국 특허 제7745389호에 A549 세포를 이용하여 재조합 hCFH를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 나아가, 효모(yeast) 시스템을 이용하여 0.5 mg/L의 재조합 hCFH를 얻었다는 보고가 있었다(국제공개공보 제WO2011/077102호, Protein Expr . Purif., 2011, Apr; 76(2): 254-63). 하지만, 상기 선행기술들에 기술된 방법들은 hCFH의 발현량이 10 mg/L 이하로 매우 미미하여 실제 응용되기에 어려운 문제가 있다. 특히, hCFH의 경우 다른 단백질과는 달리 동물 세포 시스템에서 잘 발현되지 않으므로, 동물 세포에서 상기 단백질의 발현량을 획기적으로 높이는 방법이 요구된다.

따라서, 본 발명의 목적은 동물 세포에서 인간 보체 인자 H를 고수율 및 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 인간 보체 인자 H(hCFH)를 발현하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 동물 세포주를 형질전환시키는 단계; (3) 상기 형질전환된 동물 세포주를 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (4) 상기 메토트렉세이트를 함유하는 배지에서 배양된 동물 세포주를 이스톨레이트(yeastolate)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 보체 인자 H를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법을 통해 동물 세포에서 인간 보체 인자 H(hCFH)를 고수율 및 대량으로 생산할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 hCFH를 이용한 치료제의 생산 및 hCFH의 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 hCFH 발현 벡터 pMSGneo-hCFH의 모식도이다.
도 2는 MTX 20 nM로 1차 증폭된 세포, 및 실시예 <3-2>에서 MTX 20 nM 및 80 nM, 또는 MTX 20 nM 및 320 nM로 2차 증폭된 세포의 hCFH 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 MTX로 2차 증폭된 세포를 배양하여 얻은 콜로니의 hCFH 발현량을 나타낸 그래프이다. 도면 내의 번호는 각각의 단일 클론을 구별하기 위해 지정한 번호이다.
도 4는 6개의 클론(1-3, 1-7, 1-8, 2-1, 2-2 및 2-6)을 7일간 배양한 후, ELISA에 의해 hCFH의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 hCFH 단백질의 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과이다. 상기 결과에서 레인 1은 양성 대조군으로서 혈장 정제된 인자 H를, 레인 2는 음성 대조군으로서 형질전환되지 않은 공(mock) CHO-DG44 세포의 무혈청 배양액을, 레인 3은 실시예 4에서 수득한 클론(1-7번)의 2일째 배양액을, 레인 4는 실시예 4에서 수득한 클론(1-7번)의 4일째 배양액을, 레인 5는 실시예 4에서 수득한 클론(1-7번)의 7일째 배양액을 로딩한 결과이다.
도 6은 현탁 배양된 세포의 세포수 및 hCFH 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 이스톨레이트(yeastolate) 처리하여 소규모 배양시 세포수 및 hCFH 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 대규모 배양시 hCFH의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 대규모 배양시 발현된 hCFH를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다. 상기 도면에서, 레인 1은 양성 대조군으로서 혈장 정제된 인자 H(comptech, # A137)를, 레인 2는 음성 대조군으로서 공(Mock) CHO-DG44 무혈청 배양액을, 그리고 레인 3은 본 발명의 세포의 7일째 배양액을 로딩한 결과이다.

본 발명은 인간 보체 인자 H(hCFH)를 고수율 및 대량으로 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(1) 인간 보체 인자 H(hCFH)를 발현하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

(2) 상기 재조합 발현 벡터로 동물 세포주를 형질전환시키는 단계;

(3) 상기 형질전환된 동물 세포주를 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계; 및

(4) 상기 메토트렉세이트를 함유하는 배지에서 배양된 동물 세포주를 이스톨레이트(yeastolate)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계.

본 발명의 방법에서 고수율 및 대량으로 생산하고자 하는 타겟 단백질인 '인간 보체 인자 H(hCFH)'는 20개의 짧은 반복 도메인(short consensus repeats, SCRs)을 지닌 155kD 크기의 커다란 당단백질로서, 막성증식형신염 타입 II (membranoproliferative glomerulonephritis type II, MPGN type II), 비전형적 용혈성 요독 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS) 및 노인황반변성(age-related macular degeneration, AMD)을 포함하는 각종 면역관련 질환에 관여하는 것으로 보고되고 있다(Clin . Exp . Immunol ., 2008, Jan;151(1):1-13). 상기 hCFH는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, 구체적인 사항은 Genbank Accession No. BC142699.1에 기술되어 있는 바와 같다.

본 발명의 방법에서, 단계 (1)은 인간 보체 인자 H(hCFH)를 발현하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계이다. 상기 단계를 통해 동물 세포에서 hCFH를 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터를 제조한다. 상기 재조합 발현 벡터는 동물 세포에서 외래 단백질을 발현시킬 수 있는 발현 벡터에 본 발명의 목적 단백질인 hCFH(예컨대, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 hCFH)를 코딩하는 유전자를 삽입함으로써 제조될 수 있다. 상기 발현 벡터로서 사용될 수 있는 벡터의 예로는 pMSGneo, pcDNA3.1 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, pMSGneo 벡터가 사용될 수 있다. 상기 pMSGneo 벡터는 핵 기질(nuclear matrix)에 결합하는 MAR(Matrix attachment region) 인자가 포함된 발현 벡터로서, 상기 포함된 MAR 인자는 발현벡터에 사용되는 경우 위치-독립적 발현(position-independent expression)을 유도하여 유전자 발현을 증대시키는 역할을 한다. 따라서 pMSGneo 벡터는 MTX를 통한 증폭 단계에서 다른 벡터에 비해 유전자 카피수를 현저히 증가시킬 수 있는 장점이 있다.

또한, 상기 목적 단백질인 hCFH를 코딩하는 유전자는 전장의 hCFH를 코딩하는 유전자 또는 이와 동일한 기능적 특성을 나타내는 단편이 사용될 수 있다. 바람직하게는 전장의 hCFH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 보다 구체적인 사항은 Genbank Accession No. BC142699.1을 참조한다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 pMSGneo 벡터의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site)에, hCFH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 제조될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 도 1에 도시된 구조(개열지도)를 가질 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터의 제조방법은 당업계에 알려진 통상적인 유전공학적 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에서, 단계 (2)는 상기 재조합 발현 벡터로 동물 세포주를 형질전환시키는 단계이다. 상기 동물 세포주로는 당업계에 공지된 CHO, BHK, COS7, HEK293 세포주 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는, CHO 세포, 더욱 바람직하게는 CHO-DG44 세포가 사용될 수 있다. 상기 CHO-DG44 세포주는 핵산 합성에 관여하는 주효소인 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dihydrofolate reductase; DHFR)가 결손된 세포주이다. 따라서 DHFR 유전자를 가진 플라스미드와 타겟 단백질 유전자를 가진 플라스미드를 동시에 CHO 세포에 도입한 후 핵산이 없는 선택배지에서 배양하여 재조합 세포주를 선별하고, 그 후 DHFR 효소의 기질로 이용되는 폴레이트(folate)의 유사체인 메토트렉세이트(methotrexate; MTX)를 배지 중에 첨가함으로써 외부에서 도입된 DHFR 유전자의 증폭을 유도하고 이 과정에서 함께 도입된 목적 유전자의 증폭을 동시에 유도함에 따라 본 발명의 목적물질인 hCFH의 생산도 증폭될 수 있다. 상기 형질전환은 당업계에 알려진 통상적인 형질전환 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에서, 단계 (3)은 상기 형질전환된 동물 세포주를 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 배지에서 1차 배양하는 단계이다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 동물 세포주에 MTX를 처리함으로써 hCFH의 발현을 증폭시킬 수 있다. 상기 MTX의 처리는 낮은 농도에서 높은 농도의 MTX로 순차적으로 수행될 수 있으며, 바람직하게는 20 nM의 MTX를 함유하는 배지로 동물 세포주를 1차 처리한 후, 80 nM 또는 320 nM의 MTX를 함유하는 배지로 동물 세포주를 2차 처리할 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 형질전환된 동물 세포주는 20 nM의 MTX를 함유하는 배지로 1차 처리된 다음, 80 nM의 MTX를 함유하는 배지로 2차 처리된다. 상기 MTX 처리과정에 사용되는 dFBS(dialyzed FBS)는 FBS를 12,000-14,000 분자량 컷오프(cut-off) 멤브레인을 사용하여 0.15M 염화나트륨 용액으로 글루코스 수준이 5 mg/dL 이하가 될 때까지 투석한 것으로서, 일반적으로 DHFR이나 GS 등 형질전환 세포 시스템에 대한 라벨링(labeling) 과정에서 뉴클레오시드와 같은 저분자량의 성분이 선별에 영향을 주는 실험에서 사용된다.

본 발명의 방법은 상기 1차 배양된 동물 세포주로부터 우수한 hCFH를 발현하는 단일 클론 선별(single clonal selection) 과정을 추가로 포함할 수 있다. 또한, hCFH의 발현을 위해, 상기 선별된 클론을 현탁 배양에 적응시키는 과정을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 단계 (4)는 상기 배양된 동물 세포주를 이스톨레이트(yeastolate)를 함유하는 배지에서 2차 배양하는 단계이다.

본원에 사용된 용어 "이스톨레이트"는 자가분해된 효모(yeast)나 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 동물 유래물질이 없는 수용성 부분을 지칭한다. 이스톨레이트는 펩톤, 아미노산, 탄수화물, 비타민 등의 성분으로 구성되며, 상업적으로 이용가능하다.

본 발명에 따른 동물 세포주는 상기 이스톨레이트(yeastolat)가 처리됨에 따라 hCFH를 배지 1 ml 당 1000 ng의 수준까지 생산할 수 있다. 상기 이스톨레이트는 배지의 총량을 기준으로 0.5 내지 10 g/L, 바람직하게는 5 내지 10 g/L의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 방법에 의해 배양된 동물 세포는 대규모 배양시에도 높은 발현 수준을 유지하고, hCFH가 변화 없이 배지 중으로 생산된다.

본 발명의 방법은 배지 중에 생산된 hCFH를 정제하는 단계 (5)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정제 방법은 당업계에 알려진 통상적인 단백질 정제 방법에 따라 수행될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: hCFH 발현 벡터의 제조

hCFH(human complement factor H)를 코딩하는 유전자 단편을 얻기 위해, pCMV-SPORT6-hCFH 벡터(Imagene, #IRATp970B10140D)를 주형으로 프라이머쌍(서열번호 3 및 4)을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 pCMV-SPORT6-hCFH 5 ng에 각 프라이머(10 nmol/mL) 1 μl, PCR 프리-믹스 1μL (AccuPower^® ProFi Taq PCR PreMix, Bioneer) 및 증류수 46 μL를 혼합하여 총 50 μL의 PCR 반응 혼합물을 만든 후, 상기 반응 혼합물을 94℃에서 30초, 65℃에서 60초 및 65℃에서 3분 20초간 30 사이클로 반응시켜 수행하였다. 상기 PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 겔 용리(gel elution)를 수행하여 hCFH를 코딩하는 유전자 단편을 수득하였다.

이어서, 상기 수득한 hCFH를 코딩하는 유전자 단편과 발현 벡터로서 pMSGneo 벡터(목암연구소 제작)를 NotI 및 XhoI으로 동일하게 처리한 다음, T4 리가아제(ligase)를 이용하여 라이게이션하여 hCFH의 발현 벡터를 수득하였다. 상기 발현 벡터를 "pMSGneo-hCFH"로 명명하였다(도 1 참조).

상기 발현 벡터 내에 hCFH가 제대로 삽입되었는지 여부를 확인하기 위해, 상기 pMSGneo-hCFH 발현 벡터로 대장균 DH5α를 형질전환시키고, 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 얻은 후, 이를 ScaI으로 처리하였다. 상기 플라스미드를 전기영동으로 확인한 결과, 목적하는 4kb의 hCFH를 코딩하는 유전자 단편이 올바르게 삽입되어 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: 동물 세포주의 형질전환

실시예 1에서 제조된 pMSGneo-hCFH 발현 벡터 및 DHFR 유전자가 포함된 pDCH1P 벡터(Dr L. Chasin, Columbia University) 50:1; 5 μg:100 ng)로 CHO-DG44 세포주(Dr L. Chasin, Columbia University)를 형질전환시켜 hCFH 발현 세포주를 제조하였다. 상기 형질전환은 1X10⁷의 CHO-DG44 세포에 네온 형질도입 시스템(Neon transfection system, Invitrogen, #MPK5000)을 이용하여 1700V 및 20 ms의 펄스를 1차례 가하여 수행하였다.

상기 형질전환된 세포주를 10% FBS(LONZA, #14-501F)가 첨가된 MEM-α 배지(Gibco, # 12571-063)에서 2일간 배양하였다. 이후, 상기 배지를 MEM-α(no nucleosides; Gibco, # 12561-072)로 교체한 다음, 10% dFBS (LONZA, # DE14-810F) 및 500 μg/ml G418(Sigma-aldrich, #G8168-100ML)을 처리하여 DHFR이 들어간 세포주를 선별하였다. 이때 G418로 인해 사멸한 세포주를 제거하고 2-3일에 한번씩 배지를 교체하면서 컨플루언시(confluency)가 90%에 도달할 때까지 동일한 과정을 반복함으로써 hCFH 발현 세포주를 선별하였다.

실시예 3: MTX 를 이용한 발현 증폭

<3-1> MTX 20 nM 을 이용한 증폭(1차 증폭)

hCFH의 발현량을 증폭시키기 위해, hCFH 발현 세포주에 메토트렉세이트(MTX)를 처리하였다.

구체적으로, 메토트렉세이트(Sigma-aldrich, #M8407)를 NaOH에 용해시켜 1 mM의 스톡 용액을 준비하였다. 이후, MTX 20 nM를 MEM-α(no nucleosides), 10% dFBS(dialyzed FBS) 및 500 μg/ml G418과 혼합한 후, 상기 혼합물을 실시예 2에서 수득한 hCFH 발현 세포주에 처리하였다(1차 증폭 단계). 그리고 나서, PBS 5 ml로 세포를 세척하여 dFBS를 제거하고, 0.25% 트립신-EDTA(Gibco, #25200-056) 1 ml을 처리하여 세포를 떼어내었다. 이어서, 상기 세포를 10% dFBS 및 500 μg/ml G418 8 ml을 함유하는 MEM-α(no nucleosides)에 현탁하고, 이 중 1/5을 취하여 10% dFBS 및 500 μg/ml G418을 함유하는 MEM-α(no nucleosides)에서 배양하였다. 이 때, 2-3일에 한번씩 배지 교체를 해주면서 다시 증폭에 성공하여 살아 남은 세포들이 콜로니를 이루고 그 컨플루언시가 90% 정도가 될 때까지 배양을 진행하여 MTX 20 nM을 사용하여 발현 증폭된 세포주 집단을 얻었다.

<3-2> MTX 80 nM 또는 320 nM 을 이용한 증폭(2차 증폭)

2차 증폭단계로서, 상기 <3-1>에서 증폭된 세포를 PBS 5 ml로 세척하여 dFBS를 제거하고, 0.25% 트립신-EDTA(Gibco, #25200-056) 1 ml을 처리하여 세포를 떼어내었다. 이어서, 상기 세포를 10% dFBS, 500 μg/ml G418 및 MTX 80 nM 또는 MTX 320 nM가 함유된 MEM-α(no nucleosides) 현탁하고, 이 중 1/5을 취하여 동일한 MEM-α(no nucleosides)에서 배양하였다. 이 때, 2-3일에 한번씩 배지 교체를 해주면서 다시 증폭에 성공하여 살아 남은 세포들이 콜로니를 이루고 그 컨플루언시가 90% 정도가 될 때까지 배양을 진행하여 MTX 80 nM 또는 MTX 320 nM을 사용하여 발현 증폭된 세포주 집단을 얻었다.

실험예 1: MTX 증폭된 세포의 hCFH 발현량 분석

상기 실시예 <3-1>에서 MTX 20 nM로 1차 증폭된 세포, 및 실시예 <3-2>에서 각각 MTX 20 nM 및 80 nM, 또는 MTX 20 nM 및 320 nM로 2차 증폭된 세포에 대하여 ELISA 방법을 이용하여 hCFH 발현량을 분석하였다. ELISA는 샌드위치(Sandwich) ELISA 형태의 보체 H 인자, 인간 ELISA 키트(Complement factor H, Human, ELISA Kit; Hycult BioTech, #HK342-02)를 사용하여 수행하였다. 상기 실험결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 1차 증폭된 세포 및 2차 증폭된 세포에서의 발현량은 2 내지 10 ng/mL의 수준으로 예상보다 상당히 낮음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 단일 클론 선별( Single clonal selection )

실시예 3에서 발현 증폭된 세포의 발현량을 더 높이기 위해, 실시예 3에서 2차 발현 증폭된 세포를 단일 세포 형태로 둥근바닥 96-웰 플레이트(Thermo scientific, #168136)에 뿌리고 클론 선택(clonal selection)을 통해 성장한 세포주 중 고발현 세포주를 선별하였다. 구체적으로, 각각의 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 처리하여 떼어낸 다음, 이를 둥근바닥 96웰 플레이트에 뿌리되, 상기 세포를 웰당 0.5개 세포/100 μl가 되도록 배지에 부유시켰다. 상기 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 2주간 정치 배양하여 세포 콜로니를 얻었다. 상기 콜로니의 배양액을 대상으로 ELISA로 hCFH의 발현량을 측정하였다. 상기 측정 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 기재된 번호는 각각의 단일 클론에 부여된 번호이다.

도 3에서 보는 바와 같이, 80 nM의 MTX로 2차 증폭된 콜로니로부터 얻은 단일 세포들에서 50 ng/ml 이상의 월등히 높은 발현량이 확인되었다. 상기 6개의 클론(1-3, 1-7, 1-8, 2-1, 2-2 및 2-6) 간의 발현량을 동일한 세포수로 조정하여 더 정확하게 비교하기 위하여, 상기 클론을 24웰 플레이트에서 90%의 컨플루언시까지 배양한 다음, 6웰로 옮겨 재배양하였다. 6웰에 적응한 각 클론의 세포를 떼어낸 후, 같은 수로 6 웰에 시딩(seeding)하고, 각 클론의 발현량을 측정하였다. 먼저 세포를 0.25% 트립신-EDTA를 이용하여 떼어낸 후 6웰에 5 mL당 3x10⁵의 세포를 시딩하였다. 다음날, 배지를 MTX 80nM가 첨가된 무혈청 배지(HyClone™ SFM4CHO-Utility™ Media, #SH30516.02)로 교체한 후(D0), 2일(D2), 4일(D4) 및 7일(D7) 후에 500 μL씩 배양 배지를 취하여 -20℃에 보관하였다. 최종적으로 모든 시료가 모아진 후 준비된 배양액을 이용하여 ELISA로 각 클론의 발현량을 측정하였다. 상기 측정 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 1-7번 클론이 초기 발현량부터 최종 발현량까지 가장 높은 발현을 보이는 것으로 나타나, 최종 세포주로 1-7번 클론을 선택하였다.

실험예 2: 웨스턴 블롯을 이용한 hCFH 발현 확인

hCFH 단백질이 전장으로서 발현되는 것을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 첫 번째 레인에는 양성 대조군으로서 혈장 정제된 인자 H(comptech, # A137) 100 ng을 로딩하였고, 두 번째 레인에는 음성 대조군으로서 형질전환되지 않은 공(mock) CHO-DG44 세포의 무혈청 배양액 30 μL를 로딩하였으며, 세 번째 레인에는 실시예 4에서 수득한 클론(1-7번)의 2일째 배양액 30 μL를 로딩하였고, 네 번째 레인에는 실시예 4에서 수득한 클론(1-7번)의 4일째 배양액 30 μL를 로딩하였으며, 5번째 레인에는 실시예 4에서 수득한 클론(1-7번)의 7일째 배양액 30 μL를 로딩하였다. 상기 단백질을 탐지하기 위한 항체로서 Hycult biotech의 보체 H 인자, 인간 mAb C18/3(Complement factor H, Human, mAb C18/3; #HM2248)을 사용하였다. 상기 웨스턴 블롯 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 실험 결과, 시판중인 hCFH와 동일한 크기의 밴드가 실시예 4에서 수득한 클론(1-7번)의 배양액에서 검출되었고, 음성 대조군에서는 아무런 밴드도 검출되지 않아, 실시예 4에서 수득한 클론이 hCFH를 잘 발현하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 세 번째 내지 다섯 번째 레인을 비교하면, 배양 시간이 길어질수록 더 많은 hCFH가 발현되는 양상 및 분해되지 않고 축적되는 양상을 정성적으로 확인할 수 있었다.

실시예 5: 세포의 현탁 배양

상기 클론 1-7번을 부착 상태에서 현탁액 상태로 적응시키는 작업을 수행하였다. 우선, 세포 수를 조정하기 위해 6웰에 담긴 세포를 떼어내 75cm²의 T-플라스크로 옮긴 후, 1주일 가량 90% 컨플루언시까지 성장시킨 다음, 다시 세포를 떼어내 175cm²의 T-플라스크에서 성장시켰다. 이후, 세포를 떼어내 5X10⁵ 세포/ml로 50ml이 되게 무혈청 배지(HyClone™ SFM4CHO-Utility™ 배지 + MTX 80 nM)에 재부유한 다음, 125ml 엘른마이어 플라스크에 시딩(seeding)한 후 37℃, 5% CO₂ 환경에서 120rpm으로 현탁 배양하였다. 2-3 계대배양 후 세포의 성장 양상이 2-3일에 3배 정도로 성장하는 것으로 보아 세포가 현탁 상태에 적응한 것으로 판단되었다.

실험예 3: 현탁 배양된 세포의 발현량 검증

실시예 5에서 수득한 세포 50 ml(3X10⁵ 세포/ml)을 시딩(seeding)하여 10일까지 유가 회분 배양(fed-batch culture)을 수행하였다. 그리고 나서, 2, 4, 7, 8, 9, 10일째에 세포수를 측정하고 500 μL씩 배양액을 취한 후 ELISA로 CFH 발현량을 측정하였다. 상기 측정 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 현탁 배양된 세포의 수는 2일째 최고 1.3X10⁶ 세포/ml 수준으로 증가한 후 점차 감소하는 양상을 보였다. 그에 반해, hCFH의 발현량은 2일째 50 ng/ml 수준으로 시작하여 9일, 10일 정도에 최대 250 ng/ml 수준까지 증가되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 이스톨레이트(yeastolate)의 처리

<6-1> 소규모 배양

세포의 발현량을 높이기 위해, 세포를 유가 회분 배양(fed-batch culture)하면서 3일째에 이스톨레이트(yeastolate, BD science, #255772)를 2.5 g/L 농도로 처리하였다. 이때, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10일째에 세포수를 측정하고 500 μL씩 배양액을 취한 후 ELISA로 hCFH 발현량을 측정하였다. 상기 측정 결과를 도 7에 나타내었다.

상기 측정 결과, 이스톨레이트를 처리한 3일 이후부터 hCFH의 발현량이 급격히 높아지기 시작하여 7일째에는 1000 ng/ml 수준까지 상승하였다. 또한 세포수도 4.5X10⁶ 세포/ml 수준까지 계속적으로 증가하였다.

<6-2> 대규모 배양

<6-1>의 결과를 토대로 더 큰 규모에서도 발현이 잘 유지되는지 확인하기 위해, 4개의 2L 엘른마이어 플라스크에서 각각 800mL의 배지(총 3.2 L)에 세포를 유가 배양한 후, ELISA에 의해 hCFH의 발현량을 측정하였다. 상기 측정 결과를 도 8에 나타내었다.

측정 결과, 이소톨레이트로 처리된 세포에서 7일째에 평균 1000 ng/ml 수준의 발현량을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 규모확장(scale-up) 상태에서도 hCFH 단백질이 대량으로 발현됨을 보여준다.

한편, 상기 대규모 배양액 중에 발현된 hCFH의 상태를 검증하기 위해, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 구체적으로, 첫 번째 레인은 양성 대조군으로서 혈장 정제된 인자 H(comptech, # A137) 30 ng을, 두 번째 레인은 음성 대조군으로서 공(Mock) CHO 무혈청 배양액 30 μL를, 그리고 세 번째 레인은 3.2L 규모의 7일째 배양액(ELSIA 측정 기준 30 ng)을 로딩하였다. 상기 측정 결과를 도 9에 나타내었다.

상기 측정 결과, 대규모 배양액 중에 발현된 hCFH는 양성 대조군과 동일한 크기로 발현되는 것으로 나타났다. 상기 결과는 규모 확장에도 불구하고 hCFH 단백질이 변화 없이 잘 발현됨을 보여준다.

<110> Green Cross Corporation <120> METHOD FOR PRODUCING HUMAN COMPLEMENT FACTOR H <130> FPD/201310-0098 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys 65 70 75 80 Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr 100 105 110 Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu 115 120 125 Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val 130 135 140 Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe 165 170 175 Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys 180 185 190 Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile 195 200 205 Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys 210 215 220 Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly 225 230 235 240 Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp 245 250 255 Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile 260 265 270 Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp 275 280 285 Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly 290 295 300 Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys 305 310 315 320 Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr 340 345 350 Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr 355 360 365 Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro 370 375 380 Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln 385 390 395 400 Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys 405 410 415 His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met 420 425 430 Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys 435 440 445 Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln 450 455 460 Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly 465 470 475 480 Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys 485 490 495 Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro 500 505 510 Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu 515 520 525 Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr 530 535 540 Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp 545 550 555 560 Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val 565 570 575 His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val 580 585 590 Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser 595 600 605 Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys 610 615 620 Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn 625 630 635 640 Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu 645 650 655 Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln 660 665 670 Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu 675 680 685 Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu 690 695 700 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser 705 710 715 720 Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly 725 730 735 Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys 740 745 750 Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys 755 760 765 Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys 770 775 780 Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu 785 790 795 800 Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln 805 810 815 Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly 820 825 830 Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly 835 840 845 Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys 850 855 860 Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr 865 870 875 880 Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys 885 890 895 Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu 900 905 910 Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly 915 920 925 Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His 930 935 940 Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe 945 950 955 960 Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu 965 970 975 Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu 980 985 990 Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr 995 1000 1005 Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys Met 1010 1015 1020 Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr Gly Arg 1025 1030 1035 1040 Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn 1045 1050 1055 Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg 1060 1065 1070 Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu 1075 1080 1085 Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp 1090 1095 1100 Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile 1105 1110 1115 1120 Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr 1125 1130 1135 Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys 1140 1145 1150 Arg Asn Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val 1155 1160 1165 Ile Ser Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr 1170 1175 1180 Ala Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val 1185 1190 1195 1200 Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr 1205 1210 1215 Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg 1220 1225 1230 <210> 2 <211> 3696 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60 tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 120 acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 180 aatataataa tggtatgcag gaagggagaa tgggttgctc ttaatccatt aaggaaatgt 240 cagaaaaggc cctgtggaca tcctggagat actccttttg gtacttttac ccttacagga 300 ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 360 ctaggtgaga ttaattaccg tgaatgtgac acagatggat ggaccaatga tattcctata 420 tgtgaagttg tgaagtgttt accagtgaca gcaccagaga atggaaaaat tgtcagtagt 480 gcaatggaac cagatcggga ataccatttt ggacaagcag tacggtttgt atgtaactca 540 ggctacaaga ttgaaggaga tgaagaaatg cattgttcag acgatggttt ttggagtaaa 600 gagaaaccaa agtgtgtgga aatttcatgc aaatccccag atgttataaa tggatctcct 660 atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 720 tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 780 tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 840 aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 900 gcaacccggg gaaatacagc caaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 960 accttgaaac cttgtgatta tccagacatt aaacatggag gtctatatca tgagaatatg 1020 cgtagaccat actttccagt agctgtagga aaatattact cctattactg tgatgaacat 1080 tttgagactc cgtcaggaag ttactgggat cacattcatt gcacacaaga tggatggtcg 1140 ccagcagtac catgcctcag aaaatgttat tttccttatt tggaaaatgg atataatcaa 1200 aattatggaa gaaagtttgt acagggtaaa tctatagacg ttgcctgcca tcctggctac 1260 gctcttccaa aagcgcagac cacagttaca tgtatggaga atggctggtc tcctactccc 1320 agatgcatcc gtgtcaaaac atgttccaaa tcaagtatag atattgagaa tgggtttatt 1380 tctgaatctc agtatacata tgccttaaaa gaaaaagcaa aatatcaatg caaactagga 1440 tatgtaacag cagatggtga aacatcagga tcaattacat gtgggaaaga tggatggtca 1500 gctcaaccca cgtgcattaa atcttgtgat atcccagtat ttatgaatgc cagaactaaa 1560 aatgacttca catggtttaa gctgaatgac acattggact atgaatgcca tgatggttat 1620 gaaagcaata ctggaagcac cactggttcc atagtgtgtg gttacaatgg ttggtctgat 1680 ttacccatat gttatgaaag agaatgcgaa cttcctaaaa tagatgtaca cttagttcct 1740 gatcgcaaga aagaccagta taaagttgga gaggtgttga aattctcctg caaaccagga 1800 tttacaatag ttggacctaa ttccgttcag tgctaccact ttggattgtc tcctgacctc 1860 ccaatatgta aagagcaagt acaatcatgt ggtccacctc ctgaactcct caatgggaat 1920 gttaaggaaa aaacgaaaga agaatatgga cacagtgaag tggtggaata ttattgcaat 1980 cctagatttc taatgaaggg acctaataaa attcaatgtg ttgatggaga gtggacaact 2040 ttaccagtgt gtattgtgga ggagagtacc tgtggagata tacctgaact tgaacatggc 2100 tgggcccagc tttcttcccc tccttattac tatggagatt cagtggaatt caattgctca 2160 gaatcattta caatgattgg acacagatca attacgtgta ttcatggagt atggacccaa 2220 cttccccagt gtgtggcaat agataaactt aagaagtgca aatcatcaaa tttaattata 2280 cttgaggaac atttaaaaaa caagaaggaa ttcgatcata attctaacat aaggtacaga 2340 tgtagaggaa aagaaggatg gatacacaca gtctgcataa atggaagatg ggatccagaa 2400 gtgaactgct caatggcaca aatacaatta tgcccacctc cacctcagat tcccaattct 2460 cacaatatga caaccacact gaattatcgg gatggagaaa aagtatctgt tctttgccaa 2520 gaaaattatc taattcagga aggagaagaa attacatgca aagatggaag atggcagtca 2580 ataccactct gtgttgaaaa aattccatgt tcacaaccac ctcagataga acacggaacc 2640 attaattcat ccaggtcttc acaagaaagt tatgcacatg ggactaaatt gagttatact 2700 tgtgagggtg gtttcaggat atctgaagaa aatgaaacaa catgctacat gggaaaatgg 2760 agttctccac ctcagtgtga aggccttcct tgtaaatctc cacctgagat ttctcatggt 2820 gttgtagctc acatgtcaga cagttatcag tatggagaag aagttacgta caaatgtttt 2880 gaaggttttg gaattgatgg gcctgcaatt gcaaaatgct taggagaaaa atggtctcac 2940 cctccatcat gcataaaaac agattgtctc agtttaccta gctttgaaaa tgccataccc 3000 atgggagaga agaaggatgt gtataaggcg ggtgagcaag tgacttacac ttgtgcaaca 3060 tattacaaaa tggatggagc cagtaatgta acatgcatta atagcagatg gacaggaagg 3120 ccaacatgca gagacacctc ctgtgtgaat ccgcccacag tacaaaatgc ttatatagtg 3180 tcgagacaga tgagtaaata tccatctggt gagagagtac gttatcaatg taggagccct 3240 tatgaaatgt ttggggatga agaagtgatg tgtttaaatg gaaactggac ggaaccacct 3300 caatgcaaag attctacagg aaaatgtggg ccccctccac ctattgacaa tggggacatt 3360 acttcattcc cgttgtcagt atatgctcca gcttcatcag ttgagtacca atgccagaac 3420 ttgtatcaac ttgagggtaa caagcgaata acatgtagaa atggacaatg gtcagaacca 3480 ccaaaatgct tacatccgtg tgtaatatcc cgagaaatta tggaaaatta taacatagca 3540 ttaaggtgga cagccaaaca gaagctttat tcgagaacag gtgaatcagt tgaatttgtg 3600 tgtaaacggg gatatcgtct ttcatcacgt tctcacacat tgcgaacaac atgttgggat 3660 gggaaactgg agtatccaac ttgtgcaaaa agatag 3696 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PCR <400> 3 tagcggccgc catgagactt ctagcaaag 29 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PCR <400> 4 cgcctcgagc tatctttttg cacaagttgg 30

Claims (8)

1. (1) 인간 보체 인자 H(hCFH)를 발현하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
   (2) 상기 재조합 발현 벡터로 CHO 세포주를 형질전환시키는 단계;
   (3) 상기 형질전환된 세포주를 20 nM의 메토트렉세이트(MTX)가 포함된 배양 배지에서 1차 배양한 다음, 80 nM의 메토트렉세이트가 포함된 배양 배지에서 2차 배양하는 단계; 및
   (4) 상기 메토트렉세이트를 함유하는 배지에서 배양된 동물 세포주를 이스톨레이트(yeastolate)를 배양 배지를 기준으로 0.5 내지 10 g/L의 양으로 함유하는 배지에서 배양하는 단계
   를 포함하는, 인간 보체 인자 H를 생산하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터가 pMSGneo 벡터의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site)에 hCFH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 것임을 특징으로 하는, 인간 보체 인자 H를 생산하는 방법.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 단계 (4) 이후에 배지 중에 생산된 인간 보체 인자 H를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 보체 인자 H를 생산하는 방법.

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