JP2021184745A - 新規の最小utr配列 - Google Patents
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Abstract
Description
UTR配列は極度に短く、同時に該UTR配列を含有するRNA分子の高い翻訳効率を可
能にするという利点を組み合わせている、DNA分子に関する。さらに、本発明は、斯か
るDNA分子を含むベクターと、斯かるベクターを含む宿主細胞に関する。さらに、本発
明は、斯かるUTRを含有する対応RNA分子に関する。さらに、本発明は、上記のRN
A分子とオプションとして医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物、および、RNA
分子のコード領域を、前記コード領域によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質
へ翻訳するために上記UTRを使用することに関する。
になってきている。DNAベースの遺伝子療法とは対照的に、mRNAは核に輸送される
必要がなく、細胞質においてタンパク質に直接翻訳される(J Control Release, 2011, 1
50:238-247, and Eur J Pharm Biopharm, 2009, 71:484-489)。これにより、DNA遺伝
子薬の持つ可能性は低いが実在するリスクである潜在的な挿入変異を避けるのに、mRN
Aがより安全となる。結果として、mRNA療法は、広範な種々の医学的徴候における遺
伝子およびタンパク質補充療法の有望な代替として浮上しつつある(J Control Release,
2011, 150:238-247; Eur J Pharm Biopharm, 2009, 71:484-489; Nat Biotech, 2011, 2
9:154-157, and Nat Rev Genet, 2011, 12:861-874)。しかしながら、mRNAの臨床的
応用性をさらに確立するためには、従来のmRNAの強い免疫原性と限定的な安定性を克
服しなければならない。これに関しては、mRNAの安定性および特にmRNAの翻訳速
度が、想定される医療用途に必須のパラメータとなる。これは、mRNAの翻訳速度が、
mRNA薬の投与量および投与間隔を決定するからである。
こされる免疫原性応答を低減させることの両方において、成功することが分かっている。
これには、化学修飾されたヌクレオチドが含まれている;Current Opinion in Drug Disc
overy and Development, 2007, 10:523。Kormannらは、ウリジンおよびシチジン残基のわ
ずか25%を2−チオウリジンおよび5−メチル−シチジンで置換するだけでmRNAの
安定性を高め、in vitroで、外部投与されたmRNAにより引き起こされる自然
免疫の活性化を低減させるのに十分であることを示した(国際公開第2012/0195
936A1号;同2007024708A2号)。
の制御に中心的な役割を果たすことが報告されている。UTRは、RNA結合タンパク質
との相互作用を介して、翻訳開始、伸長、および終結、ならびに、mRNAの安定化およ
び細胞内局在に影響を与えることが知られている(Briefings in Bioinformatics, 2000,
1:236-249 and Cold Spring Harbor Monograph Archive, 2007, 48:87-128)。UTR内
の特定のモチーフに応じて、UTRはmRNAの代謝回転を高めることも低減させること
も可能である(Cell. Mol. Life Sci., 2012, 69:3613-3634; Nucleic Acids Research,
2005, 33:D141-D146; Science, 2005, 309:1514-1518 and Current Protein & Peptide S
cience, 2012, 13:294-304)。近年、mRNAの半減期と、対応するUTR配列について
のデータが公開されている(Nucleic Acids Research, 2011, 39:556-566 and Nucleic a
cids research, 37, e115)。
区域であり、つまり、翻訳されない配列である。これらの領域はコード領域と共に転写さ
れ、したがって、該領域は成熟mRNAに存在するエキソンである。mRNAの開始コド
ンの上流のUTRは、5´UTRと呼ばれ、いったん転写されると、特に、プロモーター
の(残留した3´の)一部に相当する配列およびいわゆるコザック配列を宿す。
のmRNAで生じることが知られている配列で、コンセンサス(gcc)gccRccA
UGGを有する。コザックコンセンサス配列は、翻訳プロセスの開始において主要な役割
を果たす。配列は、それを有名にした人物、Marilyn Kozakにちなんで名付けられた。m
RNA分子中のこの配列は翻訳開始部位のリボソームにより認識され、ここからタンパク
質がそのmRNA分子にコードされている。リボソームは、翻訳を開始するために、この
配列かまたは可能性のあるその変種を必要とする。配列は、記号(gcc)gccRcc
AUGGにより特定され、これは、以下のように、幅広いソース(全部で約699個)か
らコザックにより解析されたデータを要約するものである:小文字は、ある位置での最も
一般的な塩基を表示し(そうは言っても塩基は変わり得るが);大文字は、高度に保存さ
れた塩基を示し、つまり、「AUGG」配列は一定で、変わることがあったとしてもまれ
であり、Rはプリン(アデニンまたはグアニン)が常にその位置で観察されることを示し
(コザックはアデニンがより高頻度であると主張する);括弧内の配列((gcc))は
、異議不明である。
ドン(AUG、Aは本文脈では位置+1を定義する)の周りの点変異の解析により、AC
CAUGGとして定義された。699個の脊椎動物のmRNAのより詳細な変異原性によ
り、AUG開始コドンの上流の位置−3のAが、Gでもあり得る、コンセンサス配列GC
CGCCACCAUGGが生じた(Nucleic Acids Res., 1987, 15 (20):8125-8148)。
真核細胞におけるプレプロインスリンおよびアルファグロビン翻訳についての研究により
、位置−3のプリン(通常はA)が効率的な翻訳開始に必須であり、このプリンがない場
合、位置+4のGが必須であることが明らかになった(J. Cell Biol., 1989, 108:229-4
1)。mRNA分子から合成されるタンパク質量は、コザックエレメントの配列に強く左
右され:タンパク質のN末端メチオニンをコードしているAUG開始コドンが最も重要で
ある。強いコンセンサスのためには、位置+4(G)および−3(AまたはG)のヌクレ
オチドが、両方ともコンセンサスと一致しなければならない。十分なコンセンサス配列は
、これらの2つの部位の一つのみを有する一方、弱いコンセンサス配列は、位置+4でも
−3でも要件を満たさない。−1および−2の2つのシチジン残基は、それほど保存され
ておらず(Cell, 1986, 44 (2):283-92)、一方、位置−6のGは翻訳開始のために重要
である(Br. J. Haematol., 2004, 124 (2):224-31)。
引き起こされる免疫原性応答を低減させ、発現効率(つまり、転写効率および/または翻
訳効率)を高める手段および方法がすでに説明されているが、発現効率が、例えばmRN
A薬の投与量および投与間隔を決定し、最終的に、最終生成物、つまりコードされたペプ
チドまたはタンパク質のバイオアベイラビリティを決定するため、発現効率が想定される
医療用途に必須のパラメータとなることから、特に、発現効率(つまり、転写効率および
/または翻訳効率)を高めるさらなるまたは代わりの手段に関して、なお改善のニーズが
ある。同時に、さらに、mRNA薬を生成するコストを低減させ、生成されるmRNA分
子の収率を高め、実際の導入遺伝子、つまり、所望のポリペプチドをコードするコード領
域に利用可能なスペースを、生成されたmRNA分子において増大させることに対する一
定のニーズが存在する。
する。
し、それにより、mRNA薬の生成コストを低減させ、生成されるmRNA分子の収率を
高め、実際の導入遺伝子、つまり、所望のポリペプチドをコードするコード領域に利用可
能なスペースを、生成されたmRNA分子において増大させることが可能であることを見
出した。さらに、同時に、この最小UTR配列は、驚くべきことに、従来のUTR配列と
比較して、発現率を維持し、さらには改善する一方、この最小UTR配列における修飾が
mRNA分子の発現率さえ高めることを見出した。
列を宿すRNA分子の生成を可能にするDNA分子の提供および対応のRNA分子の提供
につながる。
様において、対応する分子をRNAレベルで記載する。
以下のエレメント:
(a)その5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と;
(b)前記コード配列のすぐ上流にある、以下の(b1)および(b2)からなる群
から選択される配列とを有する一本の鎖を含むか;または相補鎖を含み、
(b1)は、R1−CGCCACC(SEQ ID NO:1)か;または、
前記配列において、SEQ ID NO:1の位置6のCがAに置換され、SEQ ID
NO:1の位置7のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:1の位
置5のAがGに置換されている配列であり;
(b2)は、R1−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)であって、SE
Q ID NO:2の位置2のヌクレオチドNがT、G、C、もしくはAから成る群から
選択されるヌクレオチドである、配列か;または、
前記配列において、SEQ ID NO:2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID
NO:2の位置8のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:2の位
置6のAがGに置換されている配列であり、
R1は、DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターである、D
NA分子に関する。
列と同じである場合、「センス」と呼ばれる。反対の、相補的な鎖の配列は、「アンチセ
ンス」配列と呼ばれる。本発明のDNA分子は、センス鎖を参照することにより、上記の
(a)および(b)で定義される一方、対応する相補的なアンチセンス鎖は、塩基対合ル
ールを考慮すれば、当業者により容易に決定され得る。
発現の第1ステップであり、ここで、DNA分子の特定のセグメントが酵素RNAポリメ
ラーゼによりmRNA分子にコピーされる。転写時にDNA配列がRNAポリメラーゼに
より読み取られ、一次転写生成物と呼ばれる、相補的で非平行なRNA鎖が生成される。
鎖は、DNA依存性RNAポリメラーゼにより、転写時に3´末端から5´末端へ読み取
られる(3´→5´)。相補的RNAが反対側に5´→3´方向で作られ、これは、ウラ
シルがチミンにスイッチされることを除き、センス鎖の配列と一致している。この方向性
は、RNAポリメラーゼが、成長するmRNA鎖の3´末端にヌクレオチドを加えること
だけ可能であるからである。DNAの非鋳型センス鎖は、その配列が、新しく作られるR
NA転写物と(ウラシルのチミンへの置換を除き)同じであることから、コード鎖と呼ば
れる。これは、DNA配列を提示する本発明の文脈において、慣習により使用される鎖で
ある。
であり得る。
ポリペプチドをコードし、その5´末端に開始コドンを含むコード領域と、(b)前記コ
ード領域のすぐ上流にある、本明細書の上記の(b1)または(b2)で定義される配列
とを含む。斯かるDNA分子は、転写された場合に、上記の利点を提供する極めて短いU
TR配列を有するmRNAをもたらす。
下流にUTRを生じさせる配列を含む。したがって、本発明のDNA分子は、好適には、
コード領域と、転写時に生成されるmRNA分子に(5´および3´の)非翻訳領域(U
TR)を生じさせる配列とを宿す。
、コドンから構成されるDNA配列に関するものであり、前記コドンはDNA依存性RN
AポリメラーゼによりmRNA分子に転写され、対応するmRNA分子は「遺伝コード」
により提供される情報に従って解読され、リボソームによりタンパク質に翻訳され得る。
コード領域は、一般に、その5´末端において開始コドンで始まり、終止コドンで終わる
。概して、開始コドンはATGトリプレット(RNAレベルでのAUGトリプレットに相
当する)であり、終止コドンは、TAA、TAG、またはTGA(RNAでベルでのUA
A、UAG、またはUGAに相当する)である。コード領域部分は、タンパク質をコード
していることに加え、エキソンスプライシングエンハンサーまたはエキソンスプライシン
グサイレンサーとして、プレmRNAの制御配列として機能し得る。本発明に従って使用
するポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子のコード領域は、また、コード配
列またはCDS(coding DNA sequenceに由来する)としても知られており、遺伝子のD
NAまたはRNAの一部であり、エキソンからなり、ポリペプチドまたはタンパク質をコ
ードする。mRNAのコード領域は、エキソンの一部でもある5´非翻訳領域(5´UT
R)と3´非翻訳領域(3´UTR)に隣接している。さらに、mRNA分子は、いわゆ
る5´キャップとポリAテールをさらに含み得る。5´キャップ、5´UTR、3´UT
R、およびポリAテールは、タンパク質に翻訳されないmRNA分子の領域である。
始コドンの上流および終止コドン下流のmRNA区域に関し、そのため、それぞれ、5プ
ライム非翻訳領域(5´UTR)および3プライム非翻訳領域(3´UTR)と称される
。これらの領域はコード領域と共に転写され、したがって、該領域は、成熟mRNAに存
在することから、エキソンである。
続くメッセンジャーRNA(mRNA)区域に関する。3´UTRは、3´非翻訳領域内
にポリアデニル化およびmRNAの安定性に影響を与えることが知られている調節領域を
含み得る。多くの3´UTRは、また、AUリッチエレメント(ARE)を含有する。さ
らに、3´UTRは、好適には、ポリ(A)テールと呼ばれる数百のアデニン残基を、m
RNA転写物の末端に付加することを指示する配列AAUAAAを含有し得る。
いる)は、開始コドンのすぐ上流にあるmRNA領域である。5´UTRは転写開始部位
で始まり、コード領域の開始コドン(通常はmRNAのAUG)の1ヌクレオチド(nt
)前で終わる。真核生物では、5´UTRの長さは概して100〜数千ヌクレオチド長で
あるが、時には、より短いUTRが真核生物で生じる場合がある。
うな)の間の配列は極めて短く、転写時に、非常に短い「最小の」UTR配列を有するm
RNA分子をもたらす。
ドをコードするコード領域」(モジュール(a))は、特に限定されず、所与の細胞で発
現する任意の所望のコード領域であり得る。したがって、このモジュールは、所望のポリ
ペプチド、つまり所望の最終生成物をコードするコード領域であり得る。本発明は、「そ
の5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」に関して限定さ
れない。これは、コード領域の性質は、細胞で生成される所望の生成物に左右されるから
である。斯かるコード領域は、また、既知の天然配列とは異なり、変異(つまり、点変異
、挿入変異、欠失、およびその組み合わせ)を含有するヌクレオチド配列であり得る。さ
らに、斯かるコード領域は、部分的にまたは十分に、モジュール(a)として使用される
、天然配列に由来するコドン最適化配列であり得る。コドン最適化は、対象遺伝子に由来
するmRNAの翻訳効率を高めることにより、タンパク質発現を最大化する技法である。
天然遺伝子は、利用可能なコドンをランダムに使用せず、同じアミノ酸については特定の
コドンに対しある特定の嗜好性を示すことが知られている。したがって、遺伝コードの縮
重−1つのアミノ酸がいくつかのコドンによりコードされ得ること−により、対象遺伝子
のヌクレオチド配列は、同じまたは別の種の好適なコドンセットに形質転換される。
望のコード領域であり得る。従って、本発明の文脈では、「コード領域」は、細胞に導入
された場合に、ポリペプチド/タンパク質またはその断片に翻訳可能であるmRNA分子
に転写され得る、任意のポリ−デゾキシリボヌクレオチド分子を意味すると理解されたい
。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」には、ここでは、任意の種類のアミノ酸配
列、つまり、ペプチド結合を介して互いに連結し、ペプチドおよび融合タンパク質も含む
、2つ以上のアミノ酸鎖が包含される。
コード領域」は、細胞または細胞近傍でその機能が必要とされるか、または有益であるポ
リペプチド/タンパク質またはその断片、例えば、その欠陥型もしくは欠損型が疾患もし
くは疾病のトリガーとなるか、その提供が疾患もしくは疾病を軽減もしくは予防し得るタ
ンパク質か、または、身体にとって有益なプロセスを細胞またはその近傍で促進し得るタ
ンパク質をコードするデゾキシリボヌクレオチド配列を含有する。コード領域は、完全タ
ンパク質またはその機能性変異体の配列を含有し得る。さらに、コード領域のデゾキシリ
ボヌクレオチド配列は、因子、誘導因子、制御因子、刺激因子、もしくは酵素として作用
するタンパク質、またはその機能性断片をコードし得、この場合、このタンパク質は、障
害、特に代謝障害を治療するため、または、新生血管、組織などの形成といった、in
vivoのプロセスを開始するためにその機能が必要なものである。ここでは、機能性変
異体は、細胞においてその機能が必要であるか、または、その欠陥型または欠損型が病原
性であるタンパク質の機能を細胞において担う断片を意味することを理解されたい。
コード領域」は、治療効果もしくは予防効果を有する、治療的または医療的に活性なポリ
ペプチドまたはタンパク質をコードする。したがって、前記「その5´末端に開始コドン
を含み、ポリペプチドをコードするコード領域」を含み、mRNAに転写され得る本発明
のDNA分子は、核酸療法および関連用途で使用することができる。本文脈では、本発明
に従い、本発明のDNA分子のmRNAへの転写、さらには、ポリペプチドもしくはタン
パク質への翻訳は、特に、内因性遺伝子が欠損しているかもしくはサイレントで、遺伝子
発現の生成物をもたらさないか、または、不十分なもしくは欠陥のあるもしくは機能不全
の生成物をもたらす場合に、例えば、いくつか例を挙げると、嚢胞性線維症、血友病、ま
たは筋ジストロフィーのような多くの代謝疾患および遺伝疾患の場合などにおいて、内因
性遺伝子発現を補償するか、または、補完することを目的とし得る。本発明のDNA分子
のmRNAへの転写、さらにはポリペプチドまたはタンパク質への翻訳は、また、遺伝子
発現の制御、シグナル伝達、および他の細胞プロセスなどの任意の内因性細胞プロセスと
、発現生成物を、相互作用させるかまたは干渉させることも意図し得る。本発明のDNA
分子のmRNAへの転写、さらにはポリペプチドまたはタンパク質への翻訳は、また、遺
伝子導入されたまたは形質導入された細胞が存在するかまたは存在するように作られた生
物において、免疫応答を引き起こすことも意図し得る。例は、ワクチン接種のための抗原
を提示させるために、樹状細胞などの抗原提示細胞を遺伝子修飾することである。別の例
は、本発明のDNA分子を、mRNAへ転写し、さらにはポリペプチドまたはタンパク質
へ翻訳することであり、ここにおいて、前記コード領域はサイトカインをコードする。こ
れは、例えば、腫瘍特異的免疫応答を誘発するために、腫瘍において望ましい場合がある
。さらに、本発明のDNA分子のmRNAへの転写、さらにはポリペプチドまたはタンパ
ク質への翻訳は、また、再生医療のために、修飾T細胞または前駆体または幹細胞または
他の細胞などの、細胞療法用に一時的に遺伝子修飾された細胞をin vivoでまたは
ex vivoで生成することも意図し得る。
するコード領域」は、成長プロセスおよび血管新生において役割を果たすタンパク質をコ
ードし得、これは、例えば、再生の制御に必要であり、そのため、本発明のRNA分子の
導入により特異的に形成することが可能である。これは、例えば、成長プロセスまたは骨
異常、組織異常の処置のために、埋め込みおよび移植において有用であり得る。
開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」を含む本発明のRNA分子は
、体内に天然に存在するはずであるが、遺伝子欠損または疾患のために存在しないかまた
は欠陥型で存在するかまたは量が非常に少ないポリペプチドまたはタンパク質を、身体に
提供しなければならない場合に、適切に使用することが可能である。その欠乏または欠損
が疾患と関連するタンパク質およびそれをコードする遺伝子は、既知である。インタクト
なポリペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域のそれぞれのインタクトバージ
ョンを、本発明に従って使用することが可能である。
プローチの候補である。嚢胞性線維症、血友病、および他多数の単一遺伝子変異により引
き起こされる障害は、ある形質が子孫に現れる可能性に関し、優勢の場合も劣性の場合も
ある。優勢対立遺伝子は、該対立遺伝子の1コピーのみを有する個体において表現型を表
すが、劣性対立遺伝子が顕性になるには、固体は、それぞれの親から1つずつ、2つのコ
ピーを有さなければならない。対称的に、多遺伝子性障害は、2つ以上の遺伝子により引
き起こされ、それぞれの疾患の発現はしばしば流動的で、環境因子に関係する。多遺伝子
性障害の例は高血圧、コレステロール値の上昇、がん、神経変性障害、精神疾患、および
他である。また、これらの場合、これらの遺伝子の1つまたは複数を表す治療用mRNA
が、その患者にとって有益であり得る。さらに、遺伝障害は、両親の遺伝子から受け継が
れていないはずであっても、新たな変異によっても引き起こされ得る。これらの場合も、
正しい遺伝子配列を表す治療用mRNAが、患者にとって有益であり得る。
びその表現型についての説明と共に含むオンラインカタログが、ONIM(Online Mende
lian Inheritance in Man)ウェブページ(http://onim.org)で利用可能であり;それぞ
れの配列はUniprotデータベース(http://www.uniprot.org)より利用可能である
。非限定的な例として、以下の表1は、いくつかの先天的疾患と対応する遺伝子を列挙す
るものである。細胞シグナル伝達経路の相互作用度が高いため、ある遺伝子の変異は、病
原症状の多重化を引き起こし、そのうち特徴的なものだけを表1に列挙する。
ら選択される。したがって、本発明のDNA分子は、治療用細胞タンパク質をコードし得
、コードされた治療用タンパク質は、表1に列挙するものか、またはその相同体である。
選択される。従って、本発明のDNA分子は、治療用融合タンパク質をコードし得、コー
ドされる治療用タンパク質またはその相同体は表1に列挙するものであり、第2タンパク
質は、治療用タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチドである。シグナルペプチド
は、短い、典型的には5−30アミノ酸長の、前記治療用タンパク質のN末端に存在する
アミノ酸配列であり、それはある小器官(つまり、小胞体、ゴルジ体、またはエンドソー
ム)を介して細胞分泌経路に融合タンパク質を導く。従って、斯かる融合タンパク質は細
胞もしくは細胞小器官から分泌されるか、または、細胞区画もしくは細胞表面の細胞膜(
例えば、マルチスパン膜貫通タンパク質)に挿入される。
ペプチドをコードするコード領域」(モジュール(a))は、限定するわけではないが、
疾患を引き起こす、疾患にかかりやすくする、または疾患から守る以下の遺伝子をコード
し得る。処置(または予防)できる斯かる障害の非限定的例としては、前記ポリペプチド
、タンパク質、またはペプチドが、以下の表1に略述するものからなる群から選択される
ものが挙げられる。
コード領域」は、天然タンパク質と同じかまたはそれ以上のレベルの細胞活性を含む部分
長または完全長のタンパク質に、転写および翻訳され得る。一部の実施形態では、「その
5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、治療効果また
は予防効果を有する、治療的または医薬的に活性なポリペプチド、タンパク質またはペプ
チドをコードし、前記ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドは、以下の表1に概説
するものからなる群から選択される。「その5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチド
をコードするコード領域」を使用して、天然タンパク質と同じまたはそれ以下のレベルの
細胞活性を有する部分長または全長タンパク質を発現させることができる。これは、RN
A分子の投与が指示され得る疾患の処置を可能にし得る。
とが可能な疾患につながる遺伝子の例を示し、前記DNA分子(および対応して転写され
るRNA分子)は、上記に開示した欠損遺伝子のタンパク質のインタクトバージョンまた
はその機能的断片をコードする、「その5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコ
ードするコード領域」を含む。特に好適な実施形態では、以下の遺伝性疾患が言及され得
る:例えば、SPB(サーファクタントタンパク質B)欠乏症、ABCA3欠乏症、嚢胞
性線維症、およびα1−アンチトリプシン欠乏症などの肺に影響を与える遺伝疾患、また
は、血漿タンパク質に影響を与える遺伝性疾患(例えば、先天的ヘモクロマトーシス(ヘ
プシジン欠乏症)、血栓性血小板減少性紫斑病(TPP、ADAMTS13欠乏症)、凝
固障害(例えば、血友病aおよびb)および補体欠損症(例えば、タンパク質C欠乏症)
を引き起こす遺伝性疾患、免疫欠如、例えばSCID(RAG1、RAG2、JAK3、
IL7R、CD45、CD3δ、CD3εなどの異なる遺伝子における変異によって引き
起こされる)または例えばアデノシンデアミナーゼの不足よる欠乏による(ADA−SC
ID)、敗血性肉芽腫症(例えば、gp−91−phox遺伝子、p47−phox遺伝
子、p67−phox遺伝子、またはp33−phox遺伝子の変異によって引き起こさ
れる)ならびに、ならびにゴーシェ病、ファブリー病、クラッベ病、MPS I、MPS
II(ハンター症候群)、MPS VI、糖原病II型またはムコ多糖症などの蓄積症
。
が有用であり得る他の障害には以下の障害が含まれる:SMN1関連脊髄性筋萎縮症(S
MA);筋萎縮性側索硬化症(ALS);GALT関連ガラクトース血症;嚢胞性線維症
(CF);シスチン尿症を含むSLC3A1関連障害;アルポート症候群を含むCOL4
A5関連障害;ガラクトセレブロシダーゼ欠乏症;X連鎖副腎白質ジストロフィーおよび
副腎脊髄神経症;フリードライヒ失調症;ペリツェウス・メルツバッハー病;TSC1お
よびTSC2関連結節硬化症;サンフィリッポB症候群(MPS IIIB);CTNS
関連シスチン症;脆弱性X症候群、脆弱性X関連性振戦/失調症候群および脆弱性X早発
卵巣不全症候群を含むFMR1関連障害;プラダー・ウィリー症候群;遺伝性出血性毛細
血管拡張症(AT);ニーマン・ピック病C1型;若年性ニューロンセロイドリポフスチ
ン症(JNCL)、青年バッテン病、サンタヴォリ・ハルチア病、ジャンスキー・ビール
スコフスキー病、ならびにPTT−1およびTPP1欠乏症を含むニューロンセロイドリ
ポフスチン関連疾患;EIF2B1、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4および
EIF2B5が関連する中枢神経系の髄鞘形成不全/白質消失を伴う小児運動失調;CA
CNA1AおよびCACNB4が関連する一過性運動失調2型;クラシックレット症候群
、MECP2関連重症新生児脳症およびPPM−X症候群を含むMECP2関連障害;C
DKL5関連非定型レット症候群;ケネディ病(SBMA);Notch−3関連の皮質
梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性遺伝性脳動脈症(CADASIL);SCN1A
およびSCN1Bが関連する発作障害;アルパーズ・フッテンロッハー症候群、POLG
関連感覚性運動失調性神経障害、構音障害および眼麻痺、およびミトコンドリアDNA欠
失を伴う常染色体優性および劣性進行性外眼筋麻痺を含むポリメラーゼG関連障害;X連
鎖副腎低形成;X連鎖無ガンマグロブリン血症;ファブリー病;ならびにウィルソン病。
明のDNA分子から転写されたRNAでの処置によって処置され、欠損遺伝子にコードさ
れるタンパク質またはその機能的断片が利用可能となり得る。転写物補充療法/酸素補充
療法は、根底にある遺伝子欠損に影響を与えず、患者に欠乏している酵素の濃度を高める
。例として、ポンペ病では、転写物補充療法/酵素補充療法により、欠乏しているリソソ
ーム酵素酸アルファ−グルコシダーゼ(GAA)が補充される。
プチドをコードするコード領域」によってコードされ得るタンパク質の非限定的例は、エ
リスロポエチン(EPO)、成長ホルモン(ソマトトロピン、hGH)、嚢胞性線維症膜
コンダクタンス制御因子(CFTR)、GM−SCF、G−CSF、MPS、タンパク質
C、ヘプシジン、ABCA3およびサーファクタントタンパク質Bなどの成長因子である
。本発明のRNAで処置可能な疾患のさらなる例は、血友病A/B、ファブリー病、CG
D、ADAMTS13、ハーラー病、X染色体媒介性A−γ−グロブリン血症、アデノシ
ンデアミナーゼ関連免疫不全症およびSP−Bと関連する新生児の呼吸窮迫症候群である
。特に好適には、本発明のDNA分子の「その5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチ
ドをコードするコード領域」は、サーファクタントタンパク質B(SP−B)またはエリ
スロポエチンの配列を含有する。本発明のDNA分子の「その5´末端に開始コドンを含
み、ポリペプチドをコードするコード領域」によってコードされ得るタンパク質のさらな
る例は、ヒト成長ホルモンhGH、BMP−2または血管新生因子などの成長因子である
。
をコードして、対象に免疫を付与し得る。別の実施形態では、「その5´末端に開始コド
ンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、機能的なモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体をコードし得、これは、生物学的標的(例えば、腫瘍壊死因子など
の刺激性サイトカイン)を標的とするおよび/または不活性化するために有用であり得る
。同様に、「その5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」
は、例えば、膜性増殖性糸球体腎炎II型もしくは急性溶血性尿毒症症候群の処置に有用
な機能性抗ネフローゼ因子抗体をコードする場合もあるし、がんなどの抗血管内皮成長因
子(VEGF)媒介性疾患の治療に有用なVEGF抗体をコードする場合もある。
するコード領域」は、ゲノム編集技術において使用され得るポリペプチドまたはタンパク
質をコードするコード領域であり得る。ゲノム編集は、ヌクレアーゼを使用して生物のゲ
ノムにDNAを挿入し、欠落させ、または置換する遺伝子工学の一種である。これらのヌ
クレアーゼは、ゲノムの所望の位置に部位特異的二本鎖切断(DSB)を生じさせる。誘
導された二本鎖切断は、非相同末端結合または相同組換えによって修復され、ゲノムに標
的変異をもたらし、それによりゲノムを「編集する」。異なるポリペプチドまたはタンパ
ク質を利用する多数のゲノム編集システム、つまり、例えばCRISPR−Casシステ
ム、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写活性化因子
様エフェクターベースヌクレアーゼ(TALEN)が当該技術分野で既知である。ゲノム
工学の方法は、Biotechnology, 2013, 31 (7), 397-405に概説されている。
をコードするコード領域」は、Cas(CRISPR関連タンパク質)タンパク質ファミ
リーのポリペプチドまたはタンパク質、好ましくはCas9(CRISPR関連タンパク
質9)をコードするデゾキシリボヌクレオチド配列を含有する。Casタンパク質ファミ
リーのタンパク質、好適にはCas9は、CRISPR/Cas9をベースにした方法お
よび/またはCRISPR/Cas9ゲノム編集技術において使用され得る。ゲノムの編
集、制御および標的化のためのCRISPR−Casシステムは、Nat. Biotechnol., 20
14, 32(4):347-355に概説されている。
するコード領域」は、メガヌクレアーゼをコードするデゾキシリボヌクレオチド配列を含
有する。メガヌクレアーゼは、「従来の」エンドデオキシリボヌクレアーゼとは対照的に
、大きい認識部位(例えば、12〜40塩基対の二本鎖DNA配列)を認識するエンドデ
オキシリボヌクレアーゼである。結果として、それぞれの部位は、数回のみ、好適には1
回のみ、任意の所与のゲノムに生じる。そのため、メガヌクレアーゼは、最も特異的な天
然に存在する制限酵素であると考えられ、したがって、ゲノム編集技術における適切なツ
ールである。
ドするコード領域」は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードするデゾキシ
リボヌクレオチド配列を含有する。ZFNは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをD
NA切断ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィン
ガードメインを操作して、特定の所望のDNA配列を標的することが可能であり、これに
よりジンクフィンガーヌクレアーゼは、複雑なゲノム内の特有の配列を標的することが可
能になる。内因性DNA修復機構を利用することにより、ZFNを使用して高等生物のゲ
ノムを正確に改変することができ、そのため、ZFNはゲノム編集技術に適したツールで
ある。
するコード領域」は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)をコー
ドするデゾキシリボヌクレオチド配列を含有する。TALENは、DNAの特定の配列を
切断するように操作することが可能な制限酵素である。TALENは、TALエフェクタ
ーDNA結合ドメインがヌクレアーゼのDNA切断ドメインに融合している融合タンパク
質である。転写活性化因子様エフェクター(TALE)を操作して、実際に任意の所望の
DNA配列に結合させることが可能である。したがって、ヌクレアーゼと組み合わせた場
合、特定の所望の場所でDNAを切断することが可能である。
に位置する配列を含む。
ル(b)を含み、前記モジュール(b)は、以下の(b1)および(b2)からなる群か
ら選択される配列であり、
(b1)は、R1−CGCCACC(SEQ ID NO:1)か;または、
前記配列において、SEQ ID NO:1の位置6のCがAに置換され、SEQ ID
NO:1の位置7のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:1の位
置5のAがGに置換されている配列であり;
(b2)は、R1−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)であって、SEQ
ID NO:2の位置2のヌクレオチドNが、T、G、C、もしくはAから成る群から
選択されるヌクレオチドである、配列か;または、
前記配列において、SEQ ID NO:2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID
NO:2の位置8のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:2の位
置6のAがGに置換されている配列であり、
R1は、DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターである。
けではなく、斯かる配列と比較してヌクレオチド付加を示す配列とも関連し、前記付加ヌ
クレオチドは、上記配列のR1の5´末端に付加され得る。付加ヌクレオチドには、最大
0(変化なし)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドの、好
適には、最大20ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖が含まれる。より好適には、11、
12、13、14、15、16、18、または19のヌクレオチドが5´末端に付加され
る。さらにより好適には、最大30ヌクレオチドが5´末端に付加される。
えることはないため、ヌクレオチドの付加の長さは、最大で40、50、60、70、8
0、90、またはさらには100ヌクレオチド、またはさらには、最大で200、300
、400、もしくは500ヌクレオチドでもあり得る。
、タンパク質に翻訳されるメッセンジャーRNAコピーの配列と同じであれば、「センス
」鎖と呼ばれる。反対の、相補鎖の配列は、「アンチセンス」配列と呼ばれる。したがっ
て、本発明のDNA分子は、上記エレメント(a)および(b)を有する一本の鎖を含む
、mRNAに対応する上記DNA分子に関するだけでなく、相補鎖、つまり、mRNAに
転写され得るアンチセンス鎖を含むDNA分子にも関する。本発明のDNA分子のこの相
補鎖は、塩基対合ルールを与えられると容易に決定することが可能であるアンチセンス鎖
を参照することにより、定義される。
ゼにより認識されるプロモーターR1を含む。好適には、前記プロモーターR1は、項目
(b1)または(b2)で定義した残りの配列に直接的に、つまり、任意の介在ヌクレオ
チドの発生なしに、結合する。
定されない。対応するDNA依存性RNAポリメラーゼがそれぞれの配列を認識すること
が可能である限り、任意のプロモーター(およびその変異体)を使用することが可能であ
る。多数のRNAポリメラーゼ(DNA依存性RNAポリメラーゼとしても知られ、しば
しば、RNAPまたはRNApolと省略される)が、当技術分野で既知である。これら
の酵素は、一次転写物RNAを生成することが可能である。上記で概説したように、DN
A依存性RNAポリメラーゼは、転写と呼ばれるプロセスにおいて、DNAを鋳型として
使用して、RNA鎖を合成することが可能である。DNA依存性RNAポリメラーゼは、
プロモーターとして知られる特定のDNA配列において、転写を開始する。次に、DNA
依存性RNAポリメラーゼは、鋳型DNA鎖に対し相補的なRNA鎖を生成する。RNA
鎖にヌクレオチドを付加するプロセスは、伸長反応として知られている。つまり、本発明
の文脈では、用語「認識する」は、好適には、DNA依存性RNAポリメラーゼが、その
対応するプロモーター配列R1を特異的に検出/結合することが可能であることだけを意
味するわけではない。この用語は、また、DNA依存性RNAポリメラーゼが転写を開始
し、次に、伸長反応時にRNA分子を生成できることも指す。
、それぞれのプロモーターを認識できるか否かを決定することが可能である。さらに、タ
ンパク質/DNA相互作用を評価する周知の方法を使用することにより、所与のDNA依
存性RNAポリメラーゼの、対応する(未知の)プロモーター配列R1を特定することが
可能であり、逆もまた同じである。
する能力、および、好適には、転写を開始する能力は、例えばJournal of Biological Ch
emistry, 1993, 268(26):19299-19304 に記載されているような当技術分野で既知の方法
により決定され得、一方、多数のDNA依存性RNAポリメラーゼの発見が、Journal of
Biological Chemistry, 2005, 280(52): 42477-42485)に概説されている。
R1は、バクテリオファージプロモーターである。
ATACGACTCACTATAGGGAGA(SEQ ID NO:3)を認識し、T
3DNA依存性RNAポリメラーゼは配列AATTAACCCTCACTAAAGGGA
GA(SEQ ID NO:4)を認識し、SP6DNA依存性RNAポリメラーゼは、
配列ATTTAGGTGACACTATAGAAG(SEQ ID NO:5)を認識し
、K11DNA依存性RNAポリメラーゼは、配列AATTAGGGCACACTATA
GGGA(SEQ ID NO:6)を認識することが知られている。しかしながら、こ
れらの例は、本発明がこれらのプロモーターおよび対応するDNA依存性RNAポリメラ
ーゼに限定されるわけではないことから、単なる例示を目的として提供するものである。
実際には、対応するDNA依存性RNAポリメラーゼ、好適にはバクテリオファージDN
A依存性RNAポリメラーゼがそれぞれの配列を認識することが可能である限り、任意の
プロモーター(およびその変異体)を使用することが可能である。
(i)TAATACGACTCACTATAGGGAGA(SEQ ID NO:3
)、または、SEQ ID NO:3と比較して1〜6個の置換を示し、T7DNA依存
性RNAポリメラーゼにより認識される配列;
(ii)AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO:
4)、または、SEQ ID NO:4と比較し1〜6個の置換を示し、T3DNA依存
性RNAポリメラーゼにより認識される配列;
(iii)ATTTAGGTGACACTATAGAAG(SEQ ID NO:5
)、またはSEQ ID NO:5と比較して1〜6個の置換を示し、SP6DNA依存
性RNAポリメラーゼにより認識される配列;および、
(iv)AATTAGGGCACACTATAGGGA(SEQ ID NO:6)
、またはSEQ ID NO:6と比較して1〜6個の置換を示し、K11DNA依存性
RNAポリメラーゼにより認識される配列からなる群から選択される。
り得る。ただし、対応する配列がなお、T7、T3、SP6、およびK11DNA依存性
RNAポリメラーゼそれぞれにより認識され得る場合に限る。さらに好適な実施形態では
、配列は、1〜2個の置換を示す配列であり得る。ただし、対応する配列がなお、T7、
T3、SP6、およびK11DNA依存性RNAポリメラーゼそれぞれにより認識され得
る場合に限る。最も好適には、配列は、1個の置換を示す配列であり得る。ただし、対応
する配列がなお、T7、T3、SP6、およびK11DNA依存性RNAポリメラーゼそ
れぞれにより認識され得る場合に限る。
列R1は、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5
、またはSEQ ID NO:6の配列、または、それらと比較して1〜6個の置換を示
す配列の何れかに特に限定されるわけではなく、1〜7個、8個、9個、10個、11個
、または12個の置換を示す配列でもよい。ただし、対応する配列が、T7、T3,SP
6、およびK11DNA依存性RNAポリメラーゼそれぞれにより、なお認識され得る場
合に限る。
D NO:3)、AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID N
O:4)、ATTTAGGTGACACTATAGAAG(SEQ ID NO:5)、
またはAATTAGGGCACACTATAGGGA(SEQ ID NO:6)の配列
における上記置換から、SEQ ID NO:3〜6の上記配列の位置11〜12での5
ヌクレオチド「CACTA」での置換は除外される、これは、これら5つのヌクレオチド
が4つの配列間で保存されるためである。
SEQ ID NO:3〜6の上記配列の位置4におけるヌクレオチド「T」の置換は除
外される。これは、このヌクレオチドが、4つの配列間で保存されるためである。
SEQ ID NO:3〜6の上記配列の位置5におけるヌクレオチド「A」の置換は除
外される。これは、このヌクレオチドが、4つの配列間で保存されるためである。
SEQ ID NO:3〜6の上記配列の位置18におけるヌクレオチド「G」の置換は
除外される。これは、このヌクレオチドが、4つの配列間で保存されるためである。
ターR1を認識/結合する能力は、上記で概略したように、当技術分野で既知の方法によ
り決定され得る。
ール(b1)を含むDNA分子であって、前記モジュール(b1)において、SEQ I
D NO:2の位置2のヌクレオチドNはT、G、またはCからなる群から選択されるヌ
クレオチドであり、ヌクレオチドNはAではない、DNA分子である。
はTである。
ドがヌクレオチドGではない、DNA分子である。別の好適な実施形態では、本発明のD
NA分子は、開始コドンのすぐ下流に続くヌクレオチドがA、T、およびCからなる群か
ら選択される、ヌクレオチドである、DNA分子である。
b1)を含むDNA分子であって、前記モジュール(b1)は、SEQ ID NO:1
の位置6のCがAに置換され、SEQ ID NO:1の位置7のCがGに置換され;お
よび/またはSEQ ID NO:1の位置5のAがGに置換されており、開始コドンの
直ぐ下流に続くヌクレオチドがA、T、およびCからなる群から選択されるヌクレオチド
である、配列である、DNA分子である。
ル(b2)を含むDNA分子であって、前記モジュール(b2)は、SEQ ID NO
:2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID NO:2の位置8のCがGに置換され
;および/またはSEQ ID NO:2の位置6のAがGに置換されており、開始コド
ンの直ぐ下流に続くヌクレオチドがA、T、およびCからなる群から選択されるヌクレオ
チドである、配列である、DNA分子である。
置を指す。本発明の文脈において、上流はDNA分子のセンス鎖の5´末端に向かい、下
流は分子の3´末端に向かう。
ド領域のすぐ上流、より具体的には、コード領域の開始コドンのすぐ上流に位置する。し
たがって、本文脈における「すぐ上流」は、項目(b)で定義する配列と、開始コドンで
始まるコード配列の間にさらなるヌクレオチドがないことを意味する。したがって、開始
コードで始まるコード領域は、本明細書の上記の項目(b)で定義する配列と直接隣接し
ている。
voもしくはin vitro系において)または合成的に(例えば、PCR反応により
もしくは化学反応において)、生成/合成することができる。
子は、この組み合わせでは天然には生じないエレメントからなる。本発明の核酸分子は、
合成または半合成であり得る。
れで定義される)の融合DNA配列の形態で、つまり、前記モジュールを含有する少なく
とも2つのヌクレオチド配列を組み合わせることによって形成される(融合)DNA分子
の形態で存在し得る。典型的には、以下でさらにより詳細に説明するように、これは、R
NA分子への転写を可能にする発現ベクターにcDNAをクローン化することにより達成
することが可能である。したがって、本発明のDNA分子は、融合DNA配列、つまり、
あるヌクレオチドから別のヌクレオチドの3´炭素に結合したリン酸基を介して2つ以上
のポリヌクレオチドを連結し、あるモジュールの各末端と、別のモジュールの末端の間に
ホスホジエステル結合を形成することにより形成されるキメラ分子であり得る。このよう
に、前記少なくとも2つのモジュールを含有するDNA分子は、DNA分子の形態で連結
し合う。斯かる組換えDNA分子は、フレームにおいていったんクローニングされると、
次に、前記タンパク質、ポリペプチド、または酵素分子をコードする、それの対応するR
NA核酸配列に転写され得る。
クターに導入することができる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A labo
ratory manual, 2nd Ed, 1989を参照)。本発明の意味では、「発現ベクター」または「
クローニングベクター」などの用語「ベクター」は、染色体DNAから独立して細胞内で
自己複製し、遺伝物質を細胞に運ぶ媒体として使用され、細胞内で遺伝物質は複製されお
よび/または発現する(つまり、RNAに転写され、アミノ酸配列に翻訳される)、環状
二本鎖DNAユニットとして理解される。外来性DNAを含有するベクターを、組換えD
NAという。ベクター自体は、概して、典型的には、挿入物(例えば、本発明の核酸分子
/DNA分子)と、ベクターの「骨格」として機能するより大きい配列からなるDNA配
列である。本発明の意味でのプラスミドは、細菌で最も頻繁に見られ、細胞間で遺伝子を
転移する組換えDNA研究に使用され、それ自体は本発明の意味で使用される「ベクター
」の亜集団である。
である。例えば、誘導性発現を可能にする転写エンハンサーおよび/または配列を利用す
ることができる。適切な誘導系は、例えば、Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 89 (1992), 5547-5551)およびGossen, Trends Biotech. 12 (1994), 58-62等に記
載されるようなテトラサイクリン制御遺伝子発現、またはCrook, EMBO J. 8 (1989), 513
-519等に記載されるようなデキサメタゾン誘導遺伝子発現系である。
る。
または例えば遺伝子工学において従来使用されている別のベクターであり得、適切な宿主
細胞中でおよび適切な条件下で前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさ
らなる遺伝子を含んでいてもよい。
物の安定化を確実にするポリAシグナルも含有する。
ベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)エレクトロポレーション、バリス
ティック(例えば、遺伝子銃)、もしくは他の送達系を介した導入向けに設計することが
できる。さらに、バキュロウイルス系を、本発明の核酸分子の真核生物発現系として使用
することが可能である。
明のベクターを遺伝子導入または形質転換した宿主または本発明のベクターを担持する非
ヒト宿主、つまり、本発明のDNA分子または斯かるDNA分子を含むベクターで遺伝子
組み換えした宿主細胞または宿主に関する。用語「遺伝子組み換えされた」は、宿主細胞
または宿主が、その天然ゲノムに加えて、細胞もしくは宿主またはその先祖/親の1つに
導入された本発明のDNA分子またはベクターを含むことを意味する。DNA分子または
ベクターは、遺伝子組み換えされた宿主細胞または宿主中に、ゲノムの外側の独立した分
子として、好ましくは複製可能な分子として存在する場合もあるし、宿主細胞もしくは宿
主のゲノムに安定的に組み込まれる場合もある。本発明のベクターを用いた宿主細胞の形
質転換は、例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory M
anual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Labo
ratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載されるよう
な標準的方法によって行うことが可能である。宿主細胞は、特にpH値、温度、塩濃度、
通気、抗生物質、ビタミン、微量元素等に関して、使用される特定の宿主細胞の要件を満
たす栄養培地で培養される。
大腸菌または枯草菌のような、クローニングに概して使用されるものである。さらに、真
核細胞には、例えば、真菌細胞または動物細胞が含まれる。適切な真菌細胞の例は、酵母
細胞、好ましくはサッカロミセス属のもの、最も好ましくはサッカロミセス・セレビシエ
種のものである。適切な動物細胞は、例えば、昆虫細胞、脊椎動物細胞、好ましくは哺乳
動物細胞、例えば、HEK293、NSO、CHO、COS−7、MDCK、U2−OS
Hela、NIH3T3、MOLT−4、Jurkat、PC−12、PC−3、IMR
、NT2N、Sk−n−sh、CaSki、C33Aなどである。当該技術分野で既知の
さらに適切な細胞株は、例えば、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkult
uren GmbH(DSMZ)またはAmerican Type Culture Collection(ATCC)のような
細胞株保管所から入手可能である。本発明によれば、初代細胞/細胞培養物は宿主細胞と
して機能し得ることがさらに想定される。前記細胞は、特に、昆虫(ショウジョウバエ種
またはゴキブリ種の昆虫のような)または哺乳動物(ヒト、ブタ、マウスもしくはラット
のような)に由来する。前記宿主細胞は、神経芽細胞腫細胞株のような細胞株からの細胞
および/またはそれに由来する細胞も含み得る。上記の初代細胞は、当技術分野で周知で
あり、とりわけ、初代星状膠細胞、(混合)脊髄培養物または海馬培養物が含まれる。
物にも関する。
(a)その5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と;
(b)前記コード配列のすぐ上流にある、以下の(b1)および(b2)からなる群
から選択されるUTRとを含むRNA分子に関し、
(b1)は、配列R2−CGCCACC(SEQ ID NO:1)のUTRか、
または
前記UTR配列において、SEQ ID NO:1の位置6のCがAに置換され、SEQ
ID NO:1の位置7のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:
1の位置5のAがGに置換されている配列のUTRであり;
(b2)は、配列R2−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)であって、
SEQ ID NO:2の位置2のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群
から選択されるヌクレオチドである配列のUTRか、または前記UTR配列において、S
EQ ID NO:2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID NO:2の位置8の
CがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:2の位置6のAがGに置換さ
れている配列のUTRであり、
R2は、DNA依存性RNAポリメラーゼがRNA合成を開始するヌクレオチドで始
まるプロモーター領域の一部に相当するRNA配列である。
ヌクレオチドの鎖として集合したポリマー分子に関する。RNAの各ヌクレオチドは、1
´〜5´の番号が付けられた炭素を有するリボース糖を含有する。窒素塩基は、概して、
アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、またはウラシル(U)の1´位置に
結合する。ポリマーRNA分子では、リン酸基は、1つのリボースの3´位置および次の
5´位置に結合する。したがって、ポリマーRNA分子のヌクレオチドは互いに共有結合
し、一方のヌクレオチドからのリン酸基が、後続のヌクレオチドの3´炭素に結合し、そ
れによってホスホジエステル結合を形成する。したがって、RNA鎖は5´末端および3
´末端を有し、そのためリボース環上の炭素にちなんで命名される。慣例により、上流お
よび下流は、RNA転写が起きる5´から3´方向に関する。好適には、RNA分子はメ
ッセンジャーRNA(mRNA)分子である。mRNAは、遺伝情報をDNAから、遺伝
子発現のタンパク質生成物のアミノ酸配列が特定されるリボソームへ伝達する大きなRN
A分子ファミリーである。RNAポリメラーゼによる一次転写物mRNA(プレmRNA
として知られる)の転写に続き、プロセシングされた成熟mRNAは、分子生物学のセン
トラルドグマに要約されるように、アミノ酸のポリマー:タンパク質に翻訳される。DN
Aの場合と同様に、mRNAの遺伝情報はヌクレオチド配列内にあり、それらは3つの塩
基からそれぞれなるコドンに配列される。各コドンは、タンパク質合成を終結させる終止
コドンを除き、特定のアミノ酸をコードする。
ルを含む。さらに、本発明のRNA分子は、好適には、その3´末端にUTRを含む。し
たがって、本発明のRNA分子は、その構造に関して、天然に存在する「正常な」mRN
A分子に似ており、コード領域ならびに(5´および3´)非翻訳領域(UTR)ならび
に任意選択的にポリAテールを宿す。
伝コードによって提供される情報に従いリボソームによって解読され、タンパク質に翻訳
されるコドンから構成される配列に関する。コード領域は、一般に、その5´末端の開始
コドンで始まり、終止コドンで終わる。概して、開始コドンはAUGトリプレットであり
、終止コドンはUAA、UAG、またはUGAである。タンパク質をコードしていること
に加え、コード領域部分は、エキソンスプライシングエンハンサーまたはエキソンスプラ
イシングサイレンサーとして、プレmRNAの制御配列として機能し得る。本発明に従っ
て使用するポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子のコード領域は、また、コ
ード配列またはCDS(coding DNA sequenceに由来)としても知られており、遺伝子の
DNAまたはRNAの一部であり、エキソンからなり、ポリペプチドまたはタンパク質を
コードする。mRNAのコード領域は、エキソンの一部でもある5´非翻訳領域(5´U
TR)と3´非翻訳領域(3´UTR)に隣接している。さらに、mRNA分子は、いわ
ゆる5´キャップとポリAテールをさらに含み得る。5´キャップ、5´UTR、3´U
TR、およびポリAテールは、タンパク質に翻訳されないmRNA分子の領域である。
始コドンの上流および終止コドン下流のmRNA区域に関し、そのため、それぞれ、5プ
ライム非翻訳領域(5´UTR)および3プライム非翻訳領域(3´UTR)と称される
。これらの領域はコード領域と共に転写され、したがって、該領域は成熟mRNAに存在
することからエキソンである。
続くメッセンジャーRNA(mRNA)区域に関する。3´UTRは、ポリアデニル化お
よびmRNAの安定性に影響を与えることが知られている3´非翻訳領域内に、調節領域
を含み得る。多くの3´UTRは、また、AUリッチエレメント(ARE)を含有する。
さらに、3´UTRは、好適には、ポリ(A)テールと呼ばれる数百のアデニン残基をm
RNA転写物の末端に付加することを指示する配列AAUAAAを含有し得る。
RNAとしても知られている)は、開始コドンのすぐ上流にあるmRNA領域である。5
´UTRは転写開始部位で始まり、コーディング領域の開始コドン(通常はAUG)の1
ヌクレオチド(nt)前で終わる。真核生物では、5´UTRの長さは概して100〜数
千ヌクレオチド長であるが、時には、より短いUTRが真核生物で生じる場合がある。
Rは極めて短い。
ニル化と呼ばれるプロセスによりプレmRNAの3´末端に付加される、アデニンヌクレ
オチド(しばしば数百)の長い配列である。このテールは、核外輸送および翻訳を促進し
、mRNAを分解から守る。ポリアデニル化とは、ポリ(A)テールをメッセンジャーR
NAへ付加することである。ポリ(A)テールは、多数のアデノシン一リン酸からなり;
言い換えると、ポリ(A)テールは、アデニン塩基のみを有する一続きのRNAである。
真核生物では、ポリアデニル化は、翻訳用の成熟メッセンジャーRNA(mRNA)を生
成するプロセスの一部である。
ドをコードするコード領域」(モジュール(a))は、特に限定されず、所与の細胞に発
現する任意の所望のコード領域であり得る。用語「その5´末端に開始コドンを含み、ポ
リペプチドをコードするコード領域」(モジュール(a))の好ましい実施形態に関して
は、本発明のDNAの文脈において上で述べたのと同じものが、本発明のRNA分子に準
用される。
ジュール(b)は、以下の(b1)および(b2)からなる群から選択されるUTRであ
り:
(b1)は、配列R2−CGCCACC(SEQ ID NO:1)のUTRか、ま
たは、
前記UTR配列において、SEQ ID NO:1の位置6のCがAにより置換され、S
EQ ID NO:の位置7のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO
:1の位置5のAがGに置換されている配列のUTRであり;
(b2)は、配列R2−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)であって、S
EQ ID NO:2の位置2のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群か
ら選択されるヌクレオチドである配列のUTRか、または前記UTR配列において、SE
Q ID NO:2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID NO:2の位置8のC
がGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:2の位置6のAがGに置換され
ている配列のUTRであり
R2は、DNA依存性RNAポリメラーゼがRNA合成を開始するヌクレオチドで始
まるプロモーター領域の一部に相当するRNA配列である。
するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部に相当する任意のRNA配列を、使用
することが可能である。当業者は、DNA依存性RNAポリメラーゼがRNA合成を開始
するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部を、容易に決定できる立場にある。こ
のRNA配列R2は、転写されるプロモーターの一部に相当するプロモーター配列であり
、つまり、該配列は、いったん転写されると、転写物に実際に存在する。
NAポリメラーゼがRNA合成を開始するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部
に相当するRNA配列である。
3DNA依存性RNAポリメラーゼ、SP6DNA依存性RNAポリメラーゼ、またはK
11DNA依存性RNAポリメラーゼがRNA合成を開始するヌクレオチドで始まるプロ
モーター領域の一部に相当するRNA配列である。
TATAGGGAGA(SEQ ID NO:3;つまり、T7DNA依存性RNAポリ
メラーゼにより認識されるプロモーター)、AATTAACCCTCACTAAAGGG
AGA(SEQ ID NO:4;つまり、T3DNA依存性RNAポリメラーゼにより
認識されるプロモーター)、ATTTAGGTGACACTATAGAAG(SEQ I
D NO:5;つまり、SP6DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモ
ーター)、およびAATTAGGGCACACTATAGGGA(SEQ ID NO:
6;つまり、K11DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター)と
いうプロモーター配列の、下線をひいた配列である。下線を引いた配列は、DNA依存性
RNAポリメラーゼがRNA合成を開始する各プロモーターの一部に相当し、従って、該
配列は、いったん転写されると、RNA分子に(つまり、転写物に)実際に存在する。
列R2−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)のUTRと比較して、上記置換の
何れかを有するUTR配列は、配列R2−CGCCACC(SEQ ID NO:1)の
UTRを含むRNA分子および配列R2−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)
のUTRを含むRNA分子それぞれと同じかまたは類似した、好適にはより高い翻訳効率
を示すRNA分子をもたらし得る。本明細書に記載するUTRを含む所与のRNA分子の
翻訳効率は、当技術分野で既知の方法および以下に記載する方法によって、当業者により
決定され得る。
る。所与のmRNAの翻訳効率は、時間単位当たりで、mRNA当たりで翻訳されるタン
パク質またはポリペプチドの数として測定される。翻訳とは、細胞リボソームがタンパク
質を生成するプロセスであり、これは当業者に周知である。簡潔に言えば、翻訳では、D
NAからの転写によって生成されるメッセンジャーRNA(mRNA)がリボソームによ
って解読されて、特定のアミノ酸鎖またはポリペプチドもしくはタンパク質が生成される
。
訳効率は、好適には、同じ所与のRNAで、上記で定義したR2−CGCCACC(SE
Q ID NO:1)またはR2−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)それぞ
れのUTRを有するRNAの翻訳効率と比較して、同じであるか、または高い。したがっ
て、単位時間当たりで、RNA当たりで翻訳される、上記の置換の何れかを有する修飾U
TR配列を宿すRNA分子のコード領域によりコードされるタンパク質またはポリペプチ
ドの数は、単位時間当たりで、RNA当たりで翻訳される、上記で定義したR2−CGC
CACC(SEQ ID NO:1)またはR2−CNGCCACC(SEQ ID N
O:2)のUTRそれぞれを宿すRNA分子のコード領域によりコードされるタンパク質
またはポリペプチドの数と少なくとも同じであるか、または、好適にはそれより多い。
をコードするmRNAの量に対する、同じ時点で、前記細胞内でタンパク質に翻訳された
mRNAの割合である。したがって、翻訳効率は、ある時点において細胞内でタンパク質
に翻訳されたmRNAと、各タンパク質をコードするmRNAの量の商である。両パラメ
ータ、つまり、タンパク質に翻訳されたmRNAと各タンパク質をコードするmRNAの
量は、当技術分野で既知の方法により求めることが可能である。非限定的例として、細胞
内でタンパク質に翻訳されたmRNAの量は、例えば、フローサイトメトリー(FC)に
より求めるように求めることが可能である一方、各タンパク質をコードするmRNAの量
は、例えば、qPCRにより測定することが可能である。
わけではなく、斯かる配列と比較してヌクレオチド付加を示す配列を含むUTR配列とも
関連し、前記付加ヌクレオチドは、上記UTRの5´末端に付加され得る。付加ヌクレオ
チドは、最大0(変化なし)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレ
オチドの、好適には、最大20ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖を含む。より好適には
、11、12、13、14、15、16、17、18、または19ヌクレオチドが5´末
端に付加される。さらにより好適には、最大30ヌクレオチドが5´末端に付加される。
照らして、ヌクレオチドの付加の長さは、これらの配列が、本明細書の項目(b)で定義
するUTRと(上記の翻訳効率の点で)同様の機能を有する限り、最大40、50、60
、70、80、90、もしくは100ヌクレオチドか、またはさらには、200、300
、400、もしくは500ヌクレオチドであってもよい。
11、12、または13ヌクレオチドである。好適には、本明細書の上記の項目(b1)
で定義するUTRの最大長さは、R2がGGGAGA(SEQ ID NO:7)または
GGGAGA(SEQ ID NO:8)である場合、13ヌクレオチドである。
AG(SEQ ID NO:9)またはGGGA(SEQ ID NO:10)である場
合、11ヌクレオチドである。
は、12、13、または14ヌクレオチドである。好適には、本明細書の上記の項目(b
2)で定義するUTRの最大長さは、R2がGGGAGA(SEQ ID NO:7)ま
たはGGGAGA(SEQ ID NO:8)である場合、14ヌクレオチドである。
AG(SEQ ID NO:9)またはGGGA(SEQ ID NO:10)である場
合、12ヌクレオチドである。
に(例えば、in vivoまたはin vitro系で)または合成的に生成/合成す
ることができる。
NA合成を開始する、二本鎖プロモーター領域を含有する線形DNA鋳型を要する一方、
コード領域は二本鎖である場合も、一本鎖である場合もある。線形DNA鋳型が一本鎖コ
ード領域を含有する場合、コード領域のアンチセンス鎖(つまり、DNA依存性ポリメラ
ーゼにより読み取られる鎖)は鋳型の一部である。共通のDNA依存性RNAポリメラー
ゼは、T7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、およびK11ポリメ
ラーゼである。その各プロモーターの完全配列はSEQ ID NO:3〜6に示す。
たcDNA鋳型、PCRにより生成された鋳型、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド
、およびプラスミド構成体が挙げられる。多く広く使用されているプラスミドクローニン
グベクターには、多数のクローニング部位の各側でファージポリメラーゼプロモーターが
位置して、多数のクローニング部位に挿入されたヌクレオチド配列鎖の何れかの転写を可
能にする。一般に使用されるクローニングベクターとしては、例えば、Invitrog
en社のpCRII、Promega社のpGEM、およびStratagene社のB
luescriptベクターが挙げられる。Ambion社のベクターのpTRIPLE
scriptファミリーは、直列した3つのファージポリメラーゼプロモーターを全て(
多数のクローニング部位の同じ側に)含有し、3つのポリメラーゼ、SP6、T7、また
はT3をいずれも使用可能にする。
的に生成することができる。
tro転写系を使用して生成することができる。in vitro転写系は、一般に既知
であり、通常、RNA分子を「コードしている」DNA配列を含有する精製された線形D
NA鋳型を必要とし、前記DNA配列は、適切なプロモーターの制御下にある。さらに、
in vitro転写系は、また、一般に、リボヌクレオチド三リン酸、DTTおよびマ
グネシウムイオンを含む緩衝系、ならびに、DNA配列を本発明の対応するRNA分子に
in vitro転写するための酵素活性を提供する適切なRNAポリメラーゼを必要と
する。
チド配列合成装置において、従来の化学合成により、または、個々のDNA配列の化学的
合成およびそれに続く該DNA配列のin vitroもしくはin vivo転写によ
り、化学的に合成され得る。
分子を提供し、前記RNA分子の一モジュール、つまり「その5´末端に開始コドンを含
むコード領域」(モジュール(a))は、ポリペプチドをコードする。用語核酸およびポ
リヌクレオチドは区別なく使用され、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および
/または物質を含む。用語ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチ
ドを含む。用語リボ核酸およびポリリボヌクレオチドは区別なく使用され、ある実施形態
では、ヌクレオチドの50%超がリボヌクレオチドであるヌクレオチドのポリマーを含む
任意の化合物および/または物質を含む。ある実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、
ヌクレオチドの60%、70%、75%、80%、90%超、95%超、99%超または
100%がリボヌクレオチドであるヌクレオチドポリマーを含む。1つまたは複数のヌク
レオチドが修飾ヌクレオチドであるポリリボヌクレオチドは、修飾ポリリボヌクレオチド
と称され得る。しかしながら、用語ポリリボヌクレオチドは、修飾ポリリボヌクレオチド
を含み得る。
任意の適切な核酸に由来し得る。核酸の例としては、対象の遺伝子を含む任意の細菌また
は古細菌細胞由来のゲノムDNA、RNA、またはcDNAが挙げられる。ポリヌクレオ
チドは、変異遺伝子および遺伝子多型を担持する核酸に由来し得る。本発明のRNA分子
/ポリリボヌクレオチドは、特に限定されないが、モジュールAとして、所与の細胞で発
現する任意の所望のコード領域を含み得る配列を含む。好適な実施形態では、前記配列は
、上記で概説した所望のポリペプチド/タンパク質をコードするコード領域であり得る。
好適には、上記に従って、RNA分子/ポリリボヌクレオチドは、モジュールAの開始コ
ドンの上流(5´)に位置する非翻訳配列、モジュールAの終止コドンの下流(3´)に
位置する非翻訳配列、またはモジュールAの開始コドンの上流(5´)に位置する非翻訳
配列とモジュールAの終止コドンの下流(3´)に位置する非翻訳配列の両方をさらに含
む。好適な実施形態では、本発明のRNA分子/ポリリボヌクレオチドは、修飾RNA分
子/ポリリボヌクレオチドであり得る。
ウリジンに加えて、これらの核酸塩基の各々の類似体が多数存在する。場合によっては、
文献を通しておよび文献中で、これらの類似体、またはこれら類似体の1つまたは複数を
含むRNA分子/ポリリボヌクレオチドは、修飾されている(例えば、修飾ヌクレオチド
または修飾リボヌクレオチド)と言われる。いくつかの類似体は、上記の標準的な核酸塩
基とは異なるが、自然界に存在し得る。他の類似体は天然に存在しない。いずれのタイプ
の類似体についても考える。
体を含む(例えば、ポリリボヌクレオチドは、修飾ポリリボヌクレオチドを含む)。例示
的なヌクレオチド類似体を以下に提供する(例えば、Uの類似体;Cの類似体;Aの類似
体;Gの類似体)。さらに、ある実施形態では、本開示のRNA分子/ポリリボヌクレオ
チドまたは他の核酸は、ホスホジエステル骨格または核酸塩基間の結合において(付加的
または代替的に)修飾を含む場合がある。本開示のRNA分子/ポリリボヌクレオチドの
一部または全てを形成することが可能な例示的な核酸には、限定されないが、リボ核酸(
RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(
GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックされた核酸(ベータ−D−リボ立体配置を有
するLNA、アルファ−L−リボ立体配置を有するアルファ−LNA(LNAのジアステ
レオマー)、2´−アミノ官能化を有する2´−アミノ−LNA、および2´−アミノ官
能化を有する2´−アミノ−アルファ−LNAを含むLNA)またはそれらのハイブリッ
ドが挙げられる。
チド分子の骨格上にあり得る。ある実施形態では、修飾は、ヌクレオシドおよび骨格結合
の両方にあり得る。ある実施形態では、修飾は、in vitroでポリヌクレオチド内
に導入され得る。ある実施形態では、修飾リボヌクレオチド/ヌクレオチドは、また、古
典的な/天然のリボヌクレオチド/ヌクレオチドの共有結合修飾によって、転写後に合成
され得る。
ドであり得、ある実施形態では、プリンの類似体および/またはピリミジンの類似体を含
み得る。特定の実施形態では、本発明の修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチドは、ウリ
ジンの類似体および/またはシチジンの類似体などのピリミジン類似体を含む。ある実施
形態では、本発明の修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチドは、ウリジンの類似体および
シチジンの類似体を含む。ある実施形態では、修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチドは
、アデノシンの類似体および/またはグアノシンの類似体を含まない。ある実施形態では
、RNA分子/ポリリボヌクレオチドは、ウリジンの単一タイプの類似体およびシチジン
の単一タイプの類似体を含む(例えば、単一タイプの類似体であって、単一分子の類似体
ではない−単一の類似体は、本明細書に記載のいくつかのパーセンテージのいずれかで存
在し得る)。他の実施形態では、RNA分子/ポリリボヌクレオチドは、ウリジンおよび
/またはシチジンの2つ以上のタイプの類似体、ならびに任意選択的に、存在する場合に
は、アデノシンおよび/またはグアノシンの1つまたは複数(つまり何れか一方はないか
、または両方)の類似体を含む。
5´−メチルウリジン、シュードウリジン、5−ヨードウリジン(I5U)、4−チオウ
リジン(S4U)、5−ブロモウリジン(Br5U)、2´−メチル−2´−デオキシウ
リジン(U2´m)、2´−アミノ−2´−デオキシウリジン(U2´NH2)、2´−
アジド−2´−デオキシウリジン(U2´N3)、および2´−フルオロ−2´−デオキ
シウリジン(U2´F)から選択される。一部の場合では、修飾シチジン(例えば、シチ
ジンの類似体)は、5−メチルシチジン、3−メチルシチジン、2−チオ−シチジン、2
´−メチル−2´−デオキシシチジン(C2´m)、2´−アミノ−2´−デオキシシチ
ジン(C2´NH2)、2´−フルオロ−2´−デオキシシチジン(C2´F)、5−ヨ
ードシチジン(I5C)、5−ブロモシチジン(Br5C)および2´−アジド−2´−
デオキシシチジン(C2´N3)から選択される。類似体に言及する場合、上記は、それ
らの5´三リン酸型の類似体も指すことに留意されたい。ある実施形態では、シチジン類
似体は5−ヨードシチジンであり、ウリジン類似体は5−ヨードウリジンである。
リボヌクレオチドである。一部の場合では、修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチドは、
非修飾(または無修飾)RNA分子/ポリリボヌクレオチドと比較して、少なくとも25
%、より安定している。一部の場合では、修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチドは、非
修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチドと比較し、少なくとも30%より安定、少なくと
も35%より安定、少なくとも40%より安定、少なくとも45%より安定、少なくとも
50%より安定、少なくとも55%より安定、少なくとも60%より安定、少なくとも6
5%より安定、少なくとも70%より安定、少なくとも75%より安定、少なくとも80
%より安定、少なくとも85%より安定、少なくとも90%より安定、少なくとも95%
より安定であり得る。ある実施形態では、安定性はin vivoで測定される。特定の
実施形態では、安定性はin vitroで測定される。ある実施形態では、安定性は、
ポリリボヌクレオチドの半減期を測定することによって定量化される。
または異なる修飾ヌクレオチドの混合物を有し得る。修飾ヌクレオチドは、メッセンジャ
ーRNAにおいて天然に存在するか、または天然に存在しない修飾を有し得る。種々の修
飾ヌクレオチドの混合物を使用することが可能である。例えば、RNA分子/ポリリボヌ
クレオチド内の1つまたは複数の修飾ヌクレオチドは天然の修飾を有し得、別の部分はm
RNAに天然に見られない修飾を有する。さらに、いくつかの修飾ヌクレオチドは塩基修
飾を有し得る一方、他の修飾ヌクレオチドは糖修飾を有する。同様に、全ての修飾が塩基
修飾であるか、または全ての修飾が糖修飾であるか、またはそれらの任意の適切な混合物
である可能性がある。一部の場合では、修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチドの安定性
を、修飾ポリリボヌクレオチド内の修飾塩基の性質を変えることによって選択的に最適化
することが可能である。
ることが可能である:ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−ヨードウリジン、5−
ヨードシチジン、5−アザ−ウリジン、2´−アミノ−2´−デオキシシチジン、2´−
フルオロ−2´−デオキシシチジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン
、4−チオ−シュードウリジン、2−チオ−シュードウリジン、5−ヒドロキシウリジン
、3−メチルウリジン、5−カルボキシメチル−ウリジン、1−カルボキシメチル−シュ
ードウリジン、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、5−タ
ウリノメチルウリジン、1−タウリノメチル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−
2−チオ−ウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−ウリジン、5−メチル−ウリジン
、1−メチル−シュードウリジン、4−チオ−l−メチル−シュードウリジン、2−チオ
−l−メチル−シュードウリジン、1−メチル−l−デアザ−シュードウリジン、2−チ
オ−1−メチル−l−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュード
ウリジン、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メ
トキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン
、4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン、5−アザ−シチジン、シュードイソシチ
ジン、3−メチル−シチジン、N4−アセチルシチジン、5−ホルミルシチジン、5−メ
チルシチジン、N4−メチルシチジン、5−ヒドロキシメチルシチジン、1−メチル−シ
ュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、2−チオ−シ
チジン、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−シュードイソシチジン、4−チオ
−l−メチル−シュードイソシチジン、4−チオ−l−メチル−1−デアザ−シュードイ
ソシチジン、1−メチル−l−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−
ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼ
ブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキ
シ−シュードイソシチジン、4−メトキシ−l−メチル−シュードイソシチジン、2−ア
ミノプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−
アデニン、7−デアザ−2−アミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノプリン、
7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン
、1−メチルアデノシン、N6−メチルアデノシン、N6−イソペンテニルアデノシン、
N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2−メチルチオ−N6−(シス
−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6−グリシニルカルバモイルアデノシン、
N6−トレオニルカルバモイルアデノシン、2−メチルチオ−N6−トレオニルカルバモ
イルアデノシン、N6,N6−ジメチルアデノシン、7−メチルアデニン、2−メチルチ
オ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、イノシン、1−メチル−イノシン、ワイオシン
、ワイブトシン、7−デアザ−グアノシン、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チ
オ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ
−グアノシン、7−メチル−グアノシン、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチ
ルイノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチルグアノシン、N2−メチルグアノシ
ン、N2,N2−ジメチルグアノシン、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキ
ソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノ
シン、およびN2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシン。
ジンを含まない。ある実施形態では、本発明の修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチドは
、5−メチルシチジンを含まない。ある実施形態では、本発明の修飾RNA分子/ポリリ
ボヌクレオチドは、5−メチルウリジンを含まない。ある実施形態では、本発明の修飾R
NA分子/ポリリボヌクレオチドは、Uの類似体およびCの類似体を含み、斯かるUの類
似体は全て同じ類似体であっても、異なる類似体(例えば、複数のタイプの類似体)であ
ってもよく、斯かるCの類似体は全て同じ類似体であっても、異なる類似体(例えば、複
数のタイプの類似体)であってもよい。ある実施形態では、本発明の修飾RNA分子/ポ
リリボヌクレオチドは、アデノシンの類似体およびグアノシンの類似体を含まない。
ヌクレオチドを含む場合、類似体は、化合物中でヌクレオチドの特定の割合として存在し
得る(例えば、所与の核酸塩基の所与のパーセンテージは、本明細書に記載するように、
類似体であってもよい)。
RNA分子/ポリリボヌクレオチドである。ある実施形態では、修飾RNA分子/ポリリ
ボヌクレオチドの少なくとも約5%は、本明細書に記載の類似体クレオチドなどの、修飾
されたまたは天然に存在しない(例えば、類似体もしくは修飾された)アデノシン、シチ
ジン、グアノシン、またはウリジンを含む。一部の場合では、修飾RNA分子/ポリリボ
ヌクレオチドの少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、
45%、50%は、修飾または天然に存在しない(例えば、類似体もしくは修飾された)
、アデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを含む。一部の例では、修飾RN
A分子/ポリリボヌクレオチドの多くとも約50%、45%、40%、35%、30%、
25%、20%、15%、10%、5%は、修飾または天然に存在しない、アデノシン、
シチジン、グアノシン、またはウリジンを含む。
の組み合わせを含有する。好ましくは、本発明のRNA分子は、国際公開第2011/0
12316号に記載されているように、修飾および非修飾のヌクレオチドの組み合わせを
含有する。斯かるRNA分子は既知であり、「SNIM(登録商標)−RNA」として商
業化もされている。国際公開第2011/012316号に記載のRNA分子は、安定性
の増大および免疫原性の減少を示すことが報告されている。好適な実施形態では、斯かる
修飾RNA分子において、シチジンヌクレオチドの5〜50%およびウリジンヌクレオチ
ドの5〜50%が修飾される。アデノシンおよびグアノシンを含有するヌクレオチドは非
修飾でもよい。アデノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドは非修飾でも部分
修飾でもよく、好適には非修飾型で存在する。好適には、シチジンヌクレオチドおよびウ
リジンヌクレオチドの10〜35%が修飾され、特に好適には修飾シチジンヌクレオチド
の含有量は7.5〜25%の範囲にあり、修飾ウリジンヌクレオチドの含有量は7.5〜
25%の範囲にある。実際、比較的低い含有量、例えば、それぞれわずか10%の修飾シ
チジンおよびウリジンヌクレオチドが所望の特性を達成可能であることが発見されている
。修飾シチジンヌクレオチドが5−メチルシチジン残基であり、修飾ウリジンヌクレオチ
ドが2−チオウリジン残基であることが特に好ましい。最も好適には、修飾シチジンヌク
レオチドの含有量および修飾ウリジンヌクレオチドの含有量は、それぞれ25%である。
シチジンの5〜50%がCの類似体であり、ウリジンの5〜50%がUの類似体である。
ある実施形態では、斯かる修飾ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンの5〜40
%がCの類似体であり、ウリジンの5〜40%がUの類似体である。ある実施形態では、
斯かる修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンの5〜30%がC
の類似体であり、ウリジンの5〜30%がUの類似体である。ある実施形態では、斯かる
修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンの10〜30%がCの類
似体であり、ウリジンの10〜30%がUの類似体である。ある実施形態では、斯かる修
飾ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンの5〜20%がCの類似体であり、ウリ
ジンの5〜20%がUの類似体である。ある実施形態では、斯かる修飾RNA分子/ポリ
リボヌクレオチド分子において、シチジンヌクレオチドの5〜10%およびウリジンヌク
レオチドの5〜10%が修飾される。ある実施形態では、斯かる修飾RNA分子/ポリリ
ボヌクレオチド分子において、シチジンヌクレオチドの25%およびウリジンヌクレオチ
ドの25%が修飾される。ある実施形態では、アデノシンおよびグアノシンを含有するヌ
クレオチドは非修飾でもよい。ある実施形態では、アデノシンヌクレオチドおよびグアノ
シンヌクレオチドは非修飾でも部分修飾でもよく、好適には非修飾型で存在する。
る実施形態では、Uの類似体は、Uの2つ以上のタイプの類似体を指す。ある実施形態で
は、Cの類似体は、Cの単一タイプの類似体を指す。ある実施形態では、Cの類似体は、
Cの2つ以上のタイプの類似体を指す。
るシチジンのパーセンテージは、ウリジンの類似体であるRNA分子/ポリリボヌクレオ
チドにおけるウリジンのパーセンテージと同じではない。ある実施形態では、シチジンの
類似体のパーセンテージは、ウリジンの類似体のパーセンテージよりも低い。上記のよう
に、これは、アデノシンおよびグアノシンの類似体が存在する場合も存在しない場合もあ
り得るが、ある実施形態では、アデノシン類似体もグアノシン類似体も存在しない。特定
の実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、15%未満、10%未満、5%未満
、または2%未満のアデノシン類似体、グアノシン類似体、またはその両方を含む。
およびウリジンの類似体を含み、シチジンの5〜20%がシチジンの類似体であり、ウリ
ジンの25〜45%がウリジンの類似体である。言い換えれば、RNA分子/ポリリボヌ
クレオチドは、修飾および非修飾シチジンならびに修飾および非修飾ウリジンを含み、シ
チジンの5〜20%はシチジンの類似体を含む一方、ウリジンの25〜45%はウリジン
の類似体を含む。他の実施形態では、RNA分子/ポリリボヌクレオチドは、5〜10%
のシチジン類似体および30〜40%のウリジン類似体を含み、例えば約7、7.5、ま
たは8%などの7〜9%のシチジン類似体、および例えば約33、34、35、36%な
どの32〜38%のウリジン類似体を含む。
使用することができ、任意選択的にシュードウリジンは除く。ある実施形態では、シチジ
ンの類似体は5−ヨードシチジンを含むか、または5−ヨードシチジンからなり(例えば
、からなる場合、使用されているのは単一の類似体タイプである)、ウリジンの類似体は
5−ヨードウリジンを含むか、または5−ヨードウリジンからなる(例えば、からなる場
合、使用されているのは単一の類似体タイプである)。
投入パーセンテージ(例えば、in vitro転写反応の開始などの開始反応における
類似体のパーセンテージ)を指す。上記の何れかのある実施形態の何れかでは、所与のヌ
クレオチドの類似体のパーセンテージは、アウトプット(例えば、合成または転写された
化合物におけるパーセンテージ)を指す。
に既知の方法によって、in vivo系で組み換え的に生成することができる。
例えば、以下により詳細に記載するin vitro転写系を用いて生成することができ
る。RNA分子/ポリリボヌクレオチドを生成することができるin vitro転写系
は、本発明の所望の特性を有する修飾RNA分子/ポリリボヌクレオチドを生成するため
に、修飾および非修飾のヌクレオシド三リン酸の投入混合物を必要とする。ある実施形態
では、斯かる投入混合物においてシチジンの5〜50%がシチジン類似体であり、斯かる
投入混合物においてウリジンの5〜50%がウリジン類似体である。ある実施形態では、
斯かる投入混合物においてシチジンの5〜40%がシチジン類似体であり、斯かる投入混
合物においてウリジンの5〜40%がウリジン類似体である。ある実施形態では、斯かる
混合物においてシチジンの5〜30%がシチジン類似体であり、斯かる混合物においてウ
リジンの5〜30%がウリジン類似体である。ある実施形態では、斯かる混合物において
シチジンの5〜30%がシチジン類似体であり、斯かる混合物においてウリジンの10〜
30%がウリジン類似体である。ある実施形態では、斯かる混合物においてシチジンの5
〜20%がシチジン類似体であり、斯かる混合物においてウリジンの5〜20%がウリジ
ン類似体である。ある実施形態では、斯かる混合物においてシチジンの5〜10%がシチ
ジン類似体であり、斯かる混合物においてウリジンの5〜10%がウリジン類似体である
。ある実施形態では、斯かる混合物においてシチジンの25%がシチジン類似体であり、
斯かる混合物においてウリジンの25%がウリジン類似体である。ある実施形態では、投
入混合物は、アデノシンおよび/またはグアノシンの類似体を含まない。他の実施形態で
は、任意選択的に、投入混合物は、1つまたは複数のアデノシンおよび/またはグアノシ
ン(つまり何れか一方はないか、または両方)の類似体を含む。
ジは、投入混合物におけるウリジン類似体であるウリジンのパーセンテージと同じではな
い。ある実施形態では、投入混合物におけるシチジン類似体のパーセンテージは、投入混
合物におけるウリジン類似体のパーセンテージよりも低い。上記のように、これは、投入
混合物にアデノシンおよびグアノシンの類似体が存在する場合も存在しない場合もあり得
るが、ある実施形態では、投入混合物においてアデノシンの類似体もグアノシンの類似体
も存在しない。
tro転写系用のヌクレオチド投入混合物は、シチジン類似体およびウリジン類似体を含
み、投入混合物のシチジンの5〜20%がシチジン類似体であり、投入混合物のウリジン
の25〜45%はウリジン類似体である。言い換えれば、投入混合物は、修飾および非修
飾シチジンならびに修飾および非修飾ウリジンを含み、投入混合物のシチジンの5〜20
%がシチジン類似体を含む一方、投入混合物のウリジンの25〜45%がウリジン類似体
を含む。他の実施形態では、投入混合物は、5〜10%のシチジン類似体および30〜4
0%のウリジン類似体を含み、例えば約7、7.5または8%などの7〜9%のシチジン
類似体、および例えば約33、34、35、36%などの32〜38%のウリジン類似体
を含む。
類似体およびシチジン類似体の何れかを使用することができる。ある実施形態では、シチ
ジン類似体は5−ヨードシチジンを含むか、または5−ヨードシチジンからなり(例えば
、使用されているのが単一のC類似体タイプである)、ウリジン類似体は5−ヨードウリ
ジンを含むか、またはそれからなる(例えば、使用されているのが単一のU類似体タイプ
である)。
ードする修飾ポリリボヌクレオチドについて、類似体および修飾レベルは、別段の指示が
ない限り、5´および3´非翻訳領域を含む所望のポリペプチド(モジュール(a))を
コードするポリリボヌクレオチド全体にわたって考慮される(例えば、修飾レベルは、転
写位置に類似体が組み込まれ得るようなin vitro転写反応における類似体の投入
比に基づく)。
準技術を使用する自動ヌクレオチド配列合成装置において、従来の化学合成によって、ま
たは個々のDNA配列の化学合成および後に続くそのin vitroもしくはin v
ivo転写によって、化学的に合成され得る。
対位置を指す。本発明の文脈において、上流はRNA分子の5´末端に向かい、下流は分
子の3´末端に向かう。
ード領域のすぐ上流、より具体的には、コード領域の開始コドンのすぐ上流に位置する。
したがって、本文脈における「すぐ上流」は、項目(b)で定義するUTRと、開始コド
ンで始まるコード配列の間にさらなるヌクレオチドがないことを意味する。したがって、
開始コードで始まるコード領域は、前記UTR配列に直接隣接している。
b)で定義される)の融合RNA配列の形態で、つまり、前記モジュールをコードする少
なくとも2つのヌクレオチド配列を組み合わせることによって作成されるハイブリッド遺
伝子の発現により形成される(融合)DNA分子の形態で存在し得る。典型的には、以下
でさらにより詳細に説明するように、これは、RNA分子への転写を可能にする発現ベク
ターにcDNAをクローン化することにより達成することが可能である。したがって、本
発明のRNA分子をコードするDNA分子は、融合DNA配列、つまり、あるヌクレオチ
ドから別のヌクレオチドの3´炭素に結合したリン酸基を介して2つ以上のポリヌクレオ
チドを連結し、あるモジュールの各末端と別のモジュールの末端の間にホスホジエステル
結合を形成することにより形成される、キメラ分子であり得る。このように、前記少なく
とも2つのモジュールをコードする上記DNA分子は、DNA分子の形態で連結し合う。
斯かる組換えDNA分子は、次に、それの対応するRNA核酸配列に転写される。
(i)GGGAGA(SEQ ID NO:7);
(ii)GGGAGA(SEQ ID NO:8);
(iii)GAAG(SEQ ID NO:9);および
(iv)GGGA(SEQ ID NO:10)からなる群から選択される。
RNA分子がRNA分子であり、SEQ ID NO:2の位置2のヌクレオチドNはU
、G、またはCからなる群から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドNはAでは
ない。
である。
ドがヌクレオチドGではない、RNA分子である。別の好適な実施形態では、本発明のR
NA分子は、開始コドンのすぐ下流に続くヌクレオチドがA、U、およびCからなる群か
ら選択されるヌクレオチドである、RNA分子である。
b1)を含むRNA分子であり、前記モジュール(b1)は、SEQ ID NO:1の
位置6のCがAにより置換され、SEQ ID NO:1の位置7のCがGに置換され;
および/またはSEQ ID NO:1の位置5のAがGに置換されており、開始コドン
のすぐ下流に続くヌクレオチドがA、U、およびCからなる群から選択されるヌクレオチ
ドである、配列である。
ル(b2)を含むRNA分子であり、前記モジュール(b2)は、SEQ ID NO:
2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID NO:2の位置8のCがGに置換され;
および/またはSEQ ID NO:2の位置6のAがGに置換されており、開始コドン
のすぐ下流に続くヌクレオチドがA、U、およびCからなる群から選択されるヌクレオチ
ドである、配列である。
、「R」で表される位置−3(つまり、開始コドンAUGから3ヌクレオチド上流)のヌ
クレオチドに関し、その位置がプリン(つまり、アデニンまたはグアニン)である限り、
変異体であり得る。上記UTRでは、その位置に対応するヌクレオチドを「A」と定義す
る。しかしながら、本発明は、または、その位置で「G」を有する対応するUTRを含む
RNA分子にも関する。
したUTRを含有し、(b1)の前記UTR配列において、SEQ ID NO:1の位
置5のAがGに置換されるか;または、(b2)の前記UTR配列において、SEQ I
D NO:2の位置6のAがGに置換されている。
用する場合、ポリAテールは、RNAの3´末端に位置するアデニンヌクレオチドの配列
に関する。ポリAテールは、一般に、ポリアデニル化と呼ばれるプロセスによりRNAの
3´末端に付加される。したがって、本発明は上記RNAの何れかに関し、該RNA分子
は、3´末端にポリAテールを含む。
A分子は、3´末端にポリAテールを含み、該ポリAテールの長さは、少なくとも50、
60、70、80、90、100、または110ヌクレオチドである。より好適な実施形
態では、本発明のRNA分子は、3´末端にポリAテールを含み、該ポリAテールの長さ
は、少なくとも120ヌクレオチドである。他の好適な実施形態では、本発明のRNA分
子は、3´末端にポリAテールを含み、該ポリAテールの長さは、少なくとも150、2
00、250、300、350、400、500、600、700、800、900、ま
たは1000ヌクレオチドである。
よって生成される場合、ポリAテールは、RNA分子の3´末端でUTRに隣接するRN
Aの3´末端に位置する一方、in vitroで転写されたRNA分子が前記ポリAテ
ールを確実に含有するように、本発明のRNA分子を宿すプラスミドはポリAテールの下
流でin vitro転写の前に線形化される。
列の形態で、つまり、前記モジュールをコードする少なくとも2つのヌクレオチド配列を
組み合わせることによって作成されるハイブリッド遺伝子の転写により形成される(融合
)RNA分子の形態で存在し得る。典型的には、これは、全RNA分子の転写を可能にす
る発現ベクターにcDNAをクローン化することにより達成される。融合構成体を作成す
る種々の方法が既知であり、本発明のRNA分子を「コード」する合成二本鎖核酸分子を
生成する核酸合成、ハイブリダイゼーション、および/または増幅が含まれる。斯かる二
本鎖核酸分子(つまり、DNA分子)は、一方の鎖に(つまり、コード鎖またはセンス鎖
に)、本発明のRNA分子に対応するDNA配列を宿し、従って、本発明のRNA分子を
「コード」する。言い換えると、斯かる二本鎖核酸/DNA分子は、鎖の上に、本明細書
の上記で定義する本発明の転写RNA分子に対応する遺伝情報を含む。本発明の文脈にお
ける用語「コード」または「コードする」は、その従来の意味、つまり、タンパク質をコ
ードする遺伝子のDNA(および、したがって、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ
酸配列に翻訳され得る遺伝情報)に関して使用されるだけではない。むしろ、本発明の観
点からいえば、モジュール(a)および(b)をコードする個々のDNA配列が単一の(
キメラ)DNA分子に「融合」または連結されている構成体において、構成体は、タンパ
ク質に翻訳されない成分(つまり、モジュール(b))も含む。それでもなお、モジュー
ル(b)に対応するDNA配列は、UTRの構造の情報、つまり「コード」を提供し、し
たがって、本発明における用語「コードする」は、例えば、二本鎖核酸分子中に存在する
場合に発現し得る、つまり、転写され得るUTRの遺伝情報にも関する。したがって、本
発明の文脈における用語「コードする」は、一般にはタンパク質のコード/発現に関して
のみ使用されるが、核酸分子が、タンパク質またはポリペプチドをコードする部分(つま
り、モジュール(a))とUTRを「コード」する部分(つまり、モジュール(b))を
宿す対応するRNA分子に転写され得ると理解するべきであり、ここで、UTRはタンパ
ク質またはポリペプチドに翻訳されないため、後者は発現した場合の最終生成物を表す。
斯かる二本鎖核酸は、標準的な分子生物学的技法(例えば、Sambrook et al., Molecular
Cloning, A laboratory manual, 2nd Ed, 1989を参照)によって、発現ベクターに挿入
され得る。本発明の意味における「発現ベクター」または「クローニングベクター」など
の用語「ベクター」は、細胞内で染色体DNAとは独立して自己複製し、遺伝物質を細胞
に運ぶための運搬体として使用され、そこで自己複製および/または発現し得る(つまり
、RNAに転写され、アミノ酸配列に翻訳される)、環状二本鎖のDNAユニットとして
理解される。外来性DNAを含有するベクターを、組換えDNAという。ベクター自体は
、概して、典型的には、挿入物(つまり、タンパク質に翻訳されないモジュール(b)お
よびモジュール(a)コード領域)と、ベクターの「骨格」として機能するより大きい配
列とからなるDNA配列である。本発明の意味でのプラスミドは、細菌で最も頻繁に見ら
れ、細胞間で遺伝子を転移するための組換えDNA研究に使用され、それ自体は本発明の
意味で使用される「ベクター」の亜集団である。
a)およびモジュール(b))をコードするDNAである。本発明の上記核酸分子は、好
ましくは、組換え核酸分子である。本発明の核酸分子は、合成または半合成であり得る。
、当業者にとって明らかである。例えば、誘導性発現を可能にする転写エンハンサーおよ
び/または配列を利用することができる。適切な誘導系は、例えば、Gossen and Bujard,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551)およびGossen, Trends Biotech. 1
2 (1994), 58-62に記載されるようなテトラサイクリン制御遺伝子発現、またはCrook, EM
BO J. 8 (1989), 513-519に記載されるようなデキサメタゾン誘導性遺伝子発現系である
。
。
本発明のDNA分子を含むベクターの文脈において上で述べたのと同じものが準用される
。
、本発明のベクターを用いて遺伝子導入または形質転換した宿主または本発明のベクター
を担持する非ヒト宿主、つまり、本発明の核酸分子または斯かる核酸分子を含むベクター
で遺伝子組み換えした、宿主細胞または宿主に関する。
上記で定義した本発明のDNA分子を含むベクターを含む宿主細胞の文脈において上で述
べたのと同じものが準用される。
る発現ベクターを宿す宿主細胞を、培養培地において培養し、RNA分子を宿主細胞また
は培養培地から回収することにより本発明のRNA分子を生成する方法にも関する。本発
明は、また、本発明の宿主細胞を培養するステップと、任意選択的に培養物からRNA分
子を回収するステップとを含む、本発明のRNA分子の生成方法にも関し得る。
既知である。
反応で生成する方法にも関する。より具体的には、本発明のRNA分子は、in vit
ro転写系を使用してin vitroで生成され得る。in vitro転写系は一般
に知られており、通常、上記で概説したように、モジュール(b)およびモジュール(a
)を「コード」するDNA配列を含有する精製線形DNA鋳型を必要とし、前記DNA配
列は適切なプロモーターの制御下にある。さらに、in vitro転写系は、また、一
般に、リボヌクレオチド三リン酸、DTTおよびマグネシウムイオンを含む緩衝系、なら
びにDNA配列の本発明のRNA分子へのin vitro転写のための酵素活性を提供
する適切なRNAポリメラーゼも必要とする。
当業者に周知であり、例えば、Methods Mol. Biol. 703 (2011):29-41に記載されている
。
in vitro転写方法によって生成される場合、上記ポリAテールは、本発明のRN
A分子の一部であり得(必ずしもクローニングベクター上にもともと位置するとは限らな
い)、RNA分子の3´末端に、例えば、RNAの3´末端でUTRに隣接して位置する
。本発明のRNA分子がin vitro転写方法によって生成される場合、in vi
troで転写されたRNA分子が前記ポリAテールを確実に含有するように、本発明のR
NA分子を宿すプラスミドは、ポリAテールの下流でin vitro転写の前に線形化
される。
る自動ヌクレオチド配列合成装置において、従来の化学合成によって、化学的に合成され
得る。
子をin vitro反応で生成し、RNA分子を反応から回収する方法にも関する。
である。
のポリペプチドまたはタンパク質の効率的な発現のために、当業者に既知のin vit
ro翻訳系において容易に使用することが可能である。
接的に使用することが可能である。あるいは、これらのin vitro翻訳系は、上記
のin vitro転写系と組み合わせることが可能である。in vitro転写およ
び/またはin vitro翻訳に対応する無細胞系は既知であり、利用可能である。こ
れらのタンパク質合成用無細胞系(in−vitroタンパク質合成または略してCFP
Sとも呼ばれる)は、生細胞を使用することなく、生物学的機構を使用して、ポリペプチ
ドまたはタンパク質の発現/生成を可能にする。これらの系において、in vitro
タンパク質合成環境は、細胞生存能を維持するのに必要な細胞壁または恒常性条件に制限
されず、タンパク質合成を研究するための、タンパク質生成の最適化、タンパク質複合体
の最適化、非天然アミノ酸の組み込み、高スループットスクリーン、および合成生物学を
含む、いくつかの用途に有利な直接的なアクセスおよび翻訳環境の制御を可能にする。無
細胞反応の共通の構成要素としては、細胞抽出物、エネルギー源、アミノ酸供給、マグネ
シウムなどの補助因子、および所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードするDNA
またはRNAが挙げられる。細胞抽出物は、対象の細胞を溶解し、細胞壁、DNAゲノム
、および他のデブリを遠心分離することによって得ることができる。残りは、リボソーム
、アミノアシル−tRNAシンテターゼ、翻訳開始および伸長因子、ヌクレアーゼなどを
含む、必要な細胞機構である。DNAから始まるポリペプチドまたはタンパク質の合成の
ための無細胞系では(つまり、in vitro転写およびin vitro翻訳のステ
ップを含む系では)、一般に、2種類のDNA、つまり、プラスミドまたは線形発現鋳型
(LET)の何れかが使用される。RNAから始まるポリペプチドまたはタンパク質の合
成のための無細胞系では(つまり、in vitro翻訳ステップのみを含む系では)、
RNAが直接使用され得る。これらのin vitro無細胞反応では、必要なエネルギ
ー源を含有する別の混合物により通常は提供されるエネルギー源を、反応のために抽出物
に加えられるアミノ酸供給とともに必要とする。一般のエネルギー源は、ホスホエノール
ピルビン酸、アセチルリン酸、およびクレアチンリン酸である。一般的に使用される一般
の細胞抽出物は、大腸菌(ECE)、ウサギ網状赤血球(RRL)、コムギ胚芽(WGE
)、昆虫細胞(ICE)から作成される。これらの抽出物は全て、商業的に利用可能であ
る。
ドされる所望のポリペプチドまたはタンパク質のin vitro翻訳のための、本発明
のRNA分子の使用に関する。
たRNAの文脈において上で述べたのと同じものが準用される。
治療において特に有用である。したがって、本発明は、また、本発明のRNA分子、本発
明の核酸分子、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞と、任意選択的に医薬的に許
容される担体とを含む医薬組成物にも関する。
効果を得ることを意味するために使用する。したがって、本発明の治療は、特定の疾患の
(急性)状態の処置に関し得るが、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する
点で、予防的治療にも関し得る。好適には、用語「処置」は、疾患ならびに/または疾患
に起因する有害作用および/もしくは症状を部分的にまたは完全に治すという点で、治療
的であると理解するべきである。この点で、「急性」は、対象が疾患の症状を示すことを
意味する。言い換えれば、治療される対象は処置を実際に必要としており、本発明の文脈
における用語「急性処置」は、疾患の発症または疾患の発生の後に疾患を実際に処置する
ためにとられる措置に関する。処置は、予防的または予防的処置、つまり、疾患の予防の
ために、例えば感染症および/または疾患の発症を予防するためにとられる措置であり得
る。
投与は、全身的、局所的、経口的、エアロゾル経由であり得、限定するわけではないが、
錠剤、注射、吸入器の使用、クリーム、泡、ゲル、ローション、および軟膏が含まれる。
ターまたは宿主細胞)と、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤または担体とを含
む、医薬組成物に関する。
まり本発明のRNA分子(または、核酸分子、ベクター、または宿主細胞)と一緒に製剤
化される不活性物質である。賦形剤は、しばしば「増量剤」、「充填剤」、または「希釈
剤」という。増量は、剤形を製造する際に、薬剤物質の簡便で正確な分配を可能にする。
それらはまた、薬物吸収もしくは溶解性の促進、または他の薬物動態学的考察などの、種
々の治療強化目的にも役立ち得る。賦形剤はまた、予想される貯蔵期間にわたる変性の防
止などのin vitro安定性を補助することに加えて、粉末流動性または非粘着特性
を促進することなどにより関連する活性物質の取り扱いを補助するために、製造過程にお
いて有用であり得る。適切な賦形剤の選択は、投与経路および剤形、ならびに有効成分お
よび他の要因にも左右される。
細胞)を含む医薬組成物は、固体、液体、または気体の形態であり得、とりわけ、粉末、
錠剤、溶液、またはエアロゾルの形態であり得る。前記医薬組成物は、任意選択的に医薬
的に許容される担体および/または希釈剤を含むことが好ましい。
リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルジョンなどのエマルジョン、種々のタイプの湿
潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。斯かる担体を含む組成物は、周知の従来の方法によっ
て製剤化することが可能である。これらの医薬組成物は、適切な投与量で、つまり当業者
により当該技術分野で既知の方法により容易に決定され得る「有効量」で対象に投与され
得る。投薬計画は主治医および臨床学的因子によって決定されるだろう。医学分野におい
て周知のように、任意の1人の患者への投薬量は、患者または対象のサイズ、体表面積、
年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康状態、ならびに
同時投与される他の薬物を含む多くの因子に左右される。
主細胞)は、有効量で含まれる。用語「有効量」は、医薬組成物を投与する対象において
検出可能な治療応答を誘導するのに十分な量を指す。上記によれば、医薬組成物における
本発明のRNA分子(または、核酸分子、ベクター、または宿主細胞)の含有量は、上記
のように処置に有用である限り限定されないが、好適には、全組成物に対して0.000
0001〜10重量%を含有する。さらに、本明細書に記載のRNA分子(または、核酸
分子、ベクター、または宿主細胞)は、好適には担体において利用される。概して、適切
な量の医薬的に許容される塩が、組成物を等張にするために担体において使用される。担
体の例としては、限定するわけではないが、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロ
ース溶液が挙げられる。好適には、許容される賦形剤、担体、または安定剤は、利用する
投薬量および濃度で非毒性であり、クエン酸塩、リン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤
;塩形成対イオン、例えば、ナトリウムおよびカリウム;低分子量(>10アミノ酸残基
)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、もしくはゼラチン;親水性ポリマ
ー、例えばポリビニルピロリドン;ヒスチジン、グルタミン、リシン、アスパラギン、ア
ルギニン、もしくはグリシンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキス
トリンを含む炭水化物;単糖類;二糖類;その他の糖、例えばスクロース、マンニトール
、トレハロースもしくはソルビトール;キレート剤、例えばEDTA;非イオン性界面活
性剤、例えばTween、プルロニックもしくはポリエチレングリコール;メチオニン、
アスコルビン酸およびトコフェロールを含む抗酸化剤;ならびに/または保存料、例えば
塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザル
コニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;アル
キルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;
シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール)が含まれる。適切な担
体およびそれらの製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mac
k Publishing Co.により詳細に記載されている。
NA分子(もしくは核酸分子、ベクター、もしくは宿主細胞)または本発明の医薬組成物
は、滅菌水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョン、ならびにクリームおよ
び坐剤中にあり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの有機エステルである。水性
担体としては、水、アルコール/水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、生理食
塩水および緩衝媒体が含まれる。防腐剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤
、キレート剤、および不活性ガスなども存在してよい。さらに、本発明の医薬組成物は、
医薬組成物の意図される用途に応じて、さらなる薬剤を含み得る。前記薬剤は、例えば、
商品名Tweenで市場で入手可能なポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、プ
ロピレングリコール、EDTA、クエン酸塩、スクロース、ならびに当業者にとって周知
の、医薬組成物の意図された用途に適した他の薬剤であり得る。
組成物に関する。
プチドをコードするコード領域」を含む本発明のRNA分子は、RNAベースの治療に使
用することができ、ここで「ポリペプチドをコードするコード領域」は、治療的または予
防的効果を有する治療的もしくは医薬的に活性なポリペプチドまたはタンパク質をコード
する。したがって、好適な実施形態では、本発明の医薬組成物は、上記の表1に列挙した
疾患の処置または予防におけるRNAベースの治療に使用することができる。したがって
、本発明のRNAベースの治療は、上記の表1に列挙された疾患の処置または予防に使用
することができる。
充療法/酵素補充療法によって治療または予防できる疾患につながる場合は、本発明の医
薬組成物をRNAベースの治療に使用することができ、ここでRNA分子は、開示の欠損
遺伝子を補うインタクトなバージョンのタンパク質またはその機能的断片をコードする「
ポリペプチドのコード領域」を含む。特に好適な実施形態では、本発明の医薬組成物を、
ゴーシェ病、ファブリー病、MPS I、MPS II(ハンター症候群)、MPS V
Iなどのリソソーム病および糖原病、例えば糖原病I型(フォン・ギールケ病)、II型
(ポンペ病)、III型(コリ病)、IV型(アンダースン病)、V型(マッカードル病
)、VI型(ハース病)、VII型(垂井病)、VII型、IX型、X型、XI型(ファ
ンコニ・ビッケル症候群)、XI型、または0型の治療または予防におけるRNAベース
の治療に使用することができる。転写物補充療法/酵素補充療法は、有益なことに、根底
にある遺伝子欠損に影響を与えず、患者に欠乏している酵素の濃度を高める。例として、
ポンペ病では、転写物補充療法/酵素補充療法は、欠乏しているリソソーム酵素酸アルフ
ァグルコシダーゼ(GAA)を補充する。
使用することができ、ここで「ポリペプチドをコードするコード領域」は、治療効果また
は予防効果を有する治療的または医薬的に活性なポリペプチド、タンパク質またはペプチ
ドをコードし、前記ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドは、表1に概説するよう
な遺伝子によってコードされる群から選択される。
ウイルス感染、免疫機能障害、自己免疫疾患、神経障害、遺伝性代謝障害、または遺伝病
、または細胞内で生成されるタンパク質もしくはタンパク質断片が患者に有益な効果を有
し得る任意の疾患の治療に使用するためのものであり得る。がんの例としては、頭頸部が
ん、乳がん、腎がん、膀胱がん、肺がん、前立腺がん、骨がん、脳がん、子宮頸がん、肛
門がん、結腸がん、大腸がん、虫垂がん、眼がん、胃がん、白血病、リンパ腫、肝臓がん
、皮膚がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、精巣がん、甲状腺がん、膣がん、外陰がん
、子宮体がん、心臓腫瘍および肉腫が挙げられる。
心筋症が挙げられる。
、多発性硬化症および喘息が挙げられる。
ルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスならびにB型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイ
ルスによる感染が挙げられる。
よび認知症が挙げられる。
トン尿症が挙げられる。
、心臓血管疾患、ウイルス感染、免疫機能障害、自己免疫疾患、神経障害、遺伝性代謝障
害、または遺伝病などの疾患を、RNAベースの治療で処置する方法に関する。処置方法
の好適な実施形態に関しては、RNA分子または上記で定義したRNAベースの治療で使
用するための医薬組成物の文脈において上で述べたのと同じものが準用される。
ウマ、げっ歯類、例えばラット、マウス、およびモルモット、または霊長類、例えばゴリ
ラ、チンパンジー、およびヒトなどの哺乳動物である。最も好適な実施形態では、対象は
ヒトである。
RNAベースの治療において特に有用である。したがって、本発明は、また、本発明のR
NA分子、核酸分子、ベクター、または宿主細胞と、任意選択的に医薬的に許容される担
体とを含む医薬組成物にも関する。
とが望ましいことがしばしばある。
(RNA干渉)機構を使用することにより可能である。実際に、本発明の小サイズの最小
UTRは、このUTRが二次構造も三次構造も形成せず、正常細胞には存在しないことか
ら、このアプローチは実行可能である。したがって、本発明の医薬組成物を使用した上記
疾患の処置の後、または上記RNAベースの治療の後に、斯かるUTR配列の相補的鎖を
医療機関において有利に使用し、それにより、本発明の治療用RNA分子を発現停止させ
ることができる。
A分子の効果を鎮めるための医薬組成物の調製のために使用することも想定される。
のmRNAを分解のために標的し、それによりその発現を停止させるために、二本鎖RN
Aを使用することを説明する。好適なRNAを阻害する分子は、二本鎖RNA(dsRN
A)、RNAi、siRNA、shRNA、およびstRNAからなる群から選択され得
る。遺伝子配列に適合するdsRNAは、in vitroで合成され、細胞に導入され
る。dsRNAは、また、センス配向およびアンチセンス配向で標的遺伝子配列を発現す
るベクターの形態で、例えば、ヘアピンmRNAの形態で、細胞に導入され得る。センス
配列およびアンチセンス配列は、また、別個のベクターより発現し得、それにより、個々
のアンチセンス分子およびセンス分子が、その発現時に二本鎖RNAを形成する。いくつ
かの場合では、センス配向での配列の発現、または、プロモーター配列の発現さえ、ds
RNAを生じさせ、続いて、細胞内の内在増幅機構によりsiRNAを生じさせることが
当技術分野で知られている。したがって、コード領域によりコードされるポリペプチドま
たはタンパク質の活性の低下を引き起こす全ての手段および方法を、本発明に従って使用
することができる。例えば、センス構成体、アンチセンス構成体、ヘアピン構成体、セン
ス分子、アンチセンス分子、およびそれらの組み合わせを使用して、これらのsiRNA
を生成/導入することが可能である。dsRNAは、天然だが、部分的にのみ理解されて
いる、dsRNA前駆体分子を短い干渉RNA(siRNA)に切断する高度に保存され
たヌクレアーゼダイサーを含むプロセスに供給される。siRNAの生成および調製なら
びに標的遺伝子の発現を阻害する方法は、とりわけ、国際公開第02/055693号、
Wei (2000) Dev. Biol. 15:239-255;La Count (2000) Biochem. Paras. 111:67-76;Bak
er (2000) Curr. Biol. 10:1071-1074;Svoboda (2000) Development 127:4147-4156、ま
たはMarie (2000) Curr. Biol. 10:289-292に記載されている。これらのsiRNAは、
次に、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)、つまり、サイレンシングトリガー
に対し相同のメッセンジャーRNAを破壊するマルチ複合体ヌクレアーゼの、配列特異的
部分を構築する。Elbashir (2001) EMBO J. 20:6877-6888は、21ヌクレオチドRNAの
二本鎖を細胞培養において使用して、哺乳類細胞の遺伝子発現を干渉することができるこ
とを示した。RNAiは、哺乳類細胞においてsiRNAにより非常に効率的に媒介され
るが、安定した細胞株または非ヒト遺伝子導入動物の生成は限定されたことがすでに知ら
れている。しかしながら、新しい世代のベクター、例えば、短ヘアピンRNA(shRN
A)を、安定して発現させるために利用することができる。哺乳類細胞におけるsiRN
Aの安定発現は、とりわけ、Brummelkamp (2002) Science 296:550-553に示されている。
また、Paul (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508は、ヒト細胞における小干渉RNAの
効率的な発現について述べた。哺乳類細胞における短干渉RNAおよびヘアピンRNAの
発現によるRNA干渉は、また、Yu (2002) PNAS 99:6047-6052により示された。遺伝子
サイレンシングのためのshRNAアプローチは当技術分野で周知であり、st(小分子
)RNAの使用を含み得る;とりわけ、Paddison (2002) Genes Dev. 16:948-958を参照
されたい。これらのアプローチは、ベクターベースであり得、例えば、pSUPERベク
ターまたはRNA pol IIIベクターを、とりわけYu (2002), loc. cit.; Miyagi
shi (2002), loc. cit. or Brummelkamp (2002), loc. citに例示されているように、利
用することができる。本発明の制御配列は、pSUPERベクターまたはRNA pol
IIIベクターをベースにする系と同様の方法で使用されることが想定される。
ods 26:199-213、siRNAの商業ベンダーのインターネットウェブサイト、例えば、Q
iagen GmbH(https://www1.qiagen.com/GeneGlobe/Default.aspx);Dhar
macon(www.dharmacon.com);Xeragon Inc.(http://www.dharmacon.c
om/Default.aspx)、およびAmbion(www.ambion.com)またはTom Tuschl
の研究グループのウェブサイト(http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/siRNA.h
tml)に記載されている。さらに、siRNAを所与のmRNA配列から推定するための
プログラムをオンラインで利用可能である(例えば、g. http://www.ambion.com/techlib
/misc/siRNA_finder.htmlまたはhttp://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/RNAi.html)
。2−nt 3´オーバーハングのウリジン残基は、活性を失うことなく2´デオキシチ
ミジンで置換することが可能であり、これは、RNA合成のコストを著しく低減させ、哺
乳類細胞に適用する場合に、siRNA二本鎖の耐性を高め得る(Elbashir (2001) loc.
cit)。siRNAは、また、T7または他のRNAポリメラーゼを使用して、酵素的に
合成することができる(Donze (2002) Nucleic Acids Res 30:e46)。効率的なRNA干
渉(esiRNA)を媒介する短RNA二本鎖は、また、大腸菌RNase IIIを用
いた加水分解により生成され得る(Yang (2002) PNAS 99:9942-9947)。さらに、真核細
胞において、小ヘアピンRNAループに連結した二本鎖siRNAを発現する発現ベクタ
ーが開発されている(例えば、(Brummelkamp (2002) Science 296:550-553)。これらの
構成体の全てを、上記で名づけたプログラムの助けで開発することができる。さらに、配
列解析プログラムに組み込まれているか、または別個に売られている、商業的に利用可能
な配列予測ツール、例えば、www.oligoEngine.com(シアトル、ワシントン州)により提
供されるsiRNA Design Toolを、siRNA配列予測に使用することが
できる。
域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質の発現および/または機能のアンタゴニ
スト/サイレンサーとして使用することが可能である。これらのsiRNAは、相補的/
アンチセンスおよびセンス鎖により形成され、これにより、アンチセンス/センス鎖は、
少なくとも10、より好適には少なくとも12、より好適には少なくとも14、より好適
には少なくとも16、より好適には少なくとも18、より好適には少なくとも19、20
、21、または22ヌクレオチドを好適には含む。さらにより好適な実施形態では、アン
チセンス/センス鎖は、好適には、25以上のヌクレオチドを含む。
知である。本発明で提供する教示に基づき、当業者は、斯かるsiRNAを調製するだけ
でなく、siRNAが、本発明のRNA分子のコード領域にコードされたポリペプチドま
たはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現停止させることが可能であるか否
かを評価できる立場に容易に立つ。本明細書では、上記のsiRNAは、ポリペプチドま
たはタンパク質をコードするコード領域とUTR分子を宿す本発明のRNA分子の分解を
招き、それにより、本発明のRNA分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたは
タンパク質のポリペプチド/タンパク質レベルは下げられると考える。
NA分子に関する。
GUGGCGUCUCCC(SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:11
と比較して1〜4個の置換を示す配列を含む。
UGGUGGCNGUCUCCC(SEQ ID NO:12)であって、SEQ ID
NO:12の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択
されるヌクレオチドである、配列か、または、SEQ ID NO:12と比較し1〜4
個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領域にコードされたポ
リペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現停止させることが可
能である。
UUGGCGUCUCCC(SEQ ID NO:13)か、または、SEQ ID N
O:13と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UCUUGGCNGUCUCCC(SEQ ID NO:14)であって、SEQ ID
NO:14の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択
されるヌクレオチドであるが、Aがより好適である、配列か、または、SEQ ID N
O:14と比較し1〜4個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコー
ド領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/
発現停止させることが可能である。
GCGGCGUCUCCC(SEQ ID NO:15)か、または、SEQ ID N
O:15と比較し、1〜4個の置換を示す配列を含む。
UGGCGGCNGUCUCCC(SEQ ID NO:16)であって、SEQ ID
NO:16の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択
されるヌクレオチドである、配列か、または、SEQ ID NO:16と比較し1〜4
個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領域にコードされたポ
リペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現停止させることが可
能である。
UCGGCGUCUCCC(SEQ ID NO:17)か、または、SEQ ID N
O:17と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UCUCGGCNGUCUCCC(SEQ ID NO:18)であって、SEQ ID
NO:18の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択
されるヌクレオチドであるが、Aがより好適である、配列か、または、SEQ ID N
O:18と比較し1〜4個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコー
ド領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/
発現停止させることが可能である。
UGGUGGCGUCCC(SEQ ID NO:19)か、または、SEQ ID N
O:19と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UGGUGGCNGUCCC(SEQ ID NO:20)であって、SEQ ID N
O:20の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択され
るヌクレオチドである、配列か、または、SEQ ID NO:20と比較し1〜4個の
置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領域にコードされたポリペ
プチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現停止させることが可能で
ある。
UUGGCGUCCC(SEQ ID NO:21)か、または、SEQ ID NO:
21と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UCUUGGCNGUCCC(SEQ ID NO:22)であって、SEQ ID N
O:22の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択され
るヌクレオチドであるが、Aがより好適である、配列か、または、SEQ ID NO:
22と比較し1〜4個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領
域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現
停止させることが可能である。
GCGGCGUCCC (SEQ ID NO:23)か、または、SEQ ID NO
:23と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UGGCGGCNGUCCC(SEQ ID NO:24)であって、SEQ ID N
O:24の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択され
るヌクレオチドである、配列か、または、SEQ ID NO:24と比較し1〜4個の
置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領域にコードされたポリペ
プチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現停止させることが可能で
ある。
UCGGCGUCCC(SEQ ID NO:25)か、または、SEQ ID NO:
25と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UCUCGGCNGUCCC(SEQ ID NO:26)であって、SEQ ID N
O:26の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択され
るヌクレオチドであるが、Aがより好適である、配列か、または、SEQ ID NO:
26と比較し1〜4個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領
域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現
停止させることが可能である。
UGGUGGCGCUUC(SEQ ID NO:27)か、または、SEQ ID N
O:27と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UGGUGGCNGCUUC(SEQ ID NO:28)であって、SEQ ID N
O:28の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択され
るヌクレオチドである、配列か、または、SEQ ID NO:28と比較し1〜4個の
置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領域にコードされたポリペ
プチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現停止させることが可能で
ある。
UUGGCGCUUC(SEQ ID NO:29)か、または、SEQ ID NO:
29と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UCUUGGCNGCUUC(SEQ ID NO:30)であって、SEQ ID N
O:30の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択され
るヌクレオチドであるが、Aがより好適である、配列か、または、SEQ ID NO:
30と比較し1〜4個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領
域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現
停止させることが可能である。
GCGGCGCUUC(SEQ ID NO:31)か、または、SEQ ID NO:
31と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UGGCGGCNGCUUC(SEQ ID NO:32)であって、SEQ ID N
O:32の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択され
るヌクレオチドである、配列か、または、SEQ ID NO:32と比較し1〜4個の
置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領域にコードされたポリペ
プチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現停止させることが可能で
ある。
UCGGCGCUUC(SEQ ID NO:33)か、または、SEQ ID NO:
33と比較し1〜4個の置換を示す配列を含む。
UCUCGGCNGCUUC(SEQ ID NO:34)であって、SEQ ID N
O:34の位置10のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群から選択され
るヌクレオチドであるが、Aがより好適である、配列か、または、SEQ ID NO:
34と比較し1〜4個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のRNA分子のコード領
域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする/干渉する/発現
停止させることが可能である。
伸長する5´末端に追加のヌクレオチドを宿し、本発明のRNA分子のコード領域にコー
ドされる所望のポリペプチドまたはタンパク質の配列に対し相補的である、SEQ ID
NO:11〜34からなる群から選択されるRNA分子に関する。好適には、本発明の
UTR配列に対し相補的な上記配列を含む相補配列(つまり、SEQ ID NO:11
〜34からなる群から選択されるRNA分子)は、好適には、少なくとも15、より好適
には少なくとも16、より好適には少なくとも17、より好適には少なくとも18、より
好適には少なくとも19、より好適には少なくとも20、21、22、23、または24
ヌクレオチドを含む。さらにより好適な実施形態では、これらの配列は、25、30、3
5、40、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。相補配列の特異性を高めることにより
不所望の副作用を防ぐために、5´末端の長さを伸ばすことが望ましい場合がある。
ID NO:11〜34からなる群から選択され、上記のRNA分子に対し最大で5%、
10%、20%、または30%のミスマッチを含む、RNA分子にも関する。さらに、R
NA分子は、本明細書で上記したように化学的に修飾され得る。
明のベクター、または本発明の宿主細胞を含むキットにも関する。好適な実施形態に関し
ては、本発明のDNA分子、RNA分子、核酸分子、ベクター、または宿主細胞の文脈に
おいて上で述べたのと同じものが準用される。有利なことに、本発明のキットは、さらに
、任意選択的に、上記および以下の使用および方法の実行に必要な緩衝液、保存液、およ
び/または残りの試薬もしくは物質を含む。さらに、本発明のキットの一部は、バイアル
もしくはボトルにおいて個別に、または、容器もしくはマルチコンテナユニット中で組み
合わせて、パッケージ化することが可能である。本発明のキットは、とりわけ、本発明の
方法の実行または本発明のRNA分子の調製に有利に使用され得、本明細書で言及する種
々の応用において、例えば、上記および以下で概説する用途において利用することが可能
である。キットに含まれ得る別の構成要素は、キットの使用者に向けられた、キットの使
用についての指示書である。キットの製造は、好適には、当業者に既知である標準的な手
順に従う。
チドまたはタンパク質に翻訳するために、本明細書で上記したUTRを使用することにも
関する。
ングにコードされたポリペプチドまたはタンパク質に翻訳する効率を高めるために、本明
細書で上記したUTRを使用することにも関する。
べたのと同じものが準用される。
関する:
(a)その5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と;
(b)前記コード配列のすぐ上流にある、以下の(b1)および(b2)からなる群
から選択される配列とを有する一本の鎖を含むか;または相補鎖を含み、
(b1)は、R1−CGCCACC(SEQ ID NO:1)か;または、
前記配列において、SEQ ID NO:1の位置6のCがAに置換され、SEQ ID
NO:1の位置7のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:1の位
置5のAがGに置換されている配列であり;
(b2)は、R1−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)であって、SE
Q ID NO:2の位置2のヌクレオチドNがT、G、C、もしくはAから成る群から
選択されるヌクレオチドである、配列か;または、
前記配列において、SEQ ID NO:2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID
NO:2の位置8のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:2の位
置6のAがGに置換されている配列であり、
R1は、DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターである、D
NA分子。
(i)TAATACGACTCACTATAGGGAGA(SEQ ID NO:3
)、または、SEQ ID NO:3と比較して1〜6個の置換を示し、T7DNA依存
性RNAポリメラーゼにより認識される配列;
(ii)AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO:
4)、または、SEQ ID NO:4と比較し1〜6個の置換を示し、T3DNA依存
性RNAポリメラーゼにより認識される配列;
(iii)ATTTAGGTGACACTATAGAAG(SEQ ID NO:5
)、またはSEQ ID NO:5と比較して1〜6個の置換を示し、SP6DNA依存
性RNAポリメラーゼにより認識される配列;および、
(iv)AATTAGGGCACACTATAGGGA(SEQ ID NO:6)
、またはSEQ ID NO:6と比較して1〜6個の置換を示し、K11DNA依存性
RNAポリメラーゼにより認識される配列からなる群から選択される、項目1に記載のD
NA分子。
から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドNはAではない、項目1または2に記
載のDNA分子。
のDNA分子。
目6に記載の宿主細胞を含む、組成物。
;
(b)前記コード配列のすぐ上流にある、以下の(b1)および(b2)からなる群か
ら選択されるUTRとを含むRNA分子であって、
(b1)は、配列R2−CGCCACC(SEQ ID NO:1)のUTRか、ま
たは前記UTR配列において、SEQ ID NO:1の位置6のCがAに置換され、S
EQ ID NO:1の位置7のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID N
O:1の位置5のAがGに置換されている配列のUTRであり;
(b2)は、配列R2−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)であって、S
EQ ID NO:2の位置2のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群か
ら選択されるヌクレオチドである配列のUTRか、または前記UTR配列において、SE
Q ID NO:2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID NO:2の位置8のC
がGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:2の位置6のAがGに置換され
ている配列のUTRであり、
R2は、DNA依存性RNAポリメラーゼがRNA合成を開始するヌクレオチドで始
まるプロモーター領域の一部に相当するRNA配列である、RNA分子。
(i)GGGAGA(SEQ ID NO:7);
(ii)GGGAGA(SEQ ID NO:8);
(iii)GAAG(SEQ ID NO:9);および
(iv)GGGA(SEQ ID NO:10)からなる群から選択される、項目8
に記載のRNA分子。
群から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドNはAではない、項目8または9に
記載のRNA分子。
記載のRNA分子。
。
の何れか一つに記載のRNA分子。
目15に記載のベクター、または項目16に記載の宿主細胞と、任意選択的に医薬的に許
容される担体とを含む、医薬組成物。
のRNA分子、項目14に記載の核酸分子、項目5もしくは15に記載のベクター、また
は、項目6もしくは16に記載の宿主細胞を含む、キット。
タンパク質に翻訳するための、項目8(b)で定義したUTRの使用。
のであり、限定のためではない。本出願で言及する各刊行物、特許、特許出願、または他
の文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
プラスミドベクター
各5´UTR配列をコドン最適化ルシフェラーゼ配列と共にGeneScriptG(
ニュージャージー州、USA)により合成し、pUC57−Kan(GeneScrip
t)においてクローン化した。EPO(コドン最適化ヒトエリスロポエチン)およびOT
C(コドン最適化ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ)の場合、コード配列ルシフェ
ラーゼ遺伝子を、EPO(SEQ ID NO:35)とOTC(SEQ ID NO:
36)の遺伝子それぞれのコード配列と置き換えた。構成体において使用するUTR配列
は、各ルシフェラーゼレポーター構成体の名前と共に図1に示す。
in vitroで転写されたmRNA(IVT mRNA)を生成するために、プラ
スミドをBstBI消化により直線化し、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により
精製した。精製した直鎖状プラスミドをRiboMax Large Scale RN
A production System−T7(Promega,ドイツ)を使用して
、in vitro転写の鋳型として使用した。アンチリバースキャップアナログ(AR
CA)を反応混合物に加えて、5´キャップ化mRNAを生成し、mRNAをポリアデニ
ル化して(Thermo Scientific)、3´ポリAテールを生成した。
、メチル−CTPおよびチオ−UTP(Jena Bioscience,ドイツ)を、
ATP:CTP:UTP:メチル−CTP:チオ−UTP:GTPが7.57mM:5.
68mM:5.68mM:1.89mM:1.89mM:1.21mMという最終濃度に
加えた。完全IVT混合物を37℃で2時間インキュベーションし、続いて、37℃で2
0分間、DNaselでDNAを消化した。RNAを酢酸アンモニウムで沈殿させ(最終
濃度2.5M)、70%EtOHで洗浄した。洗浄ステップを2回実行した。最終的に、
RNAペレットをRNAseフリー水に再懸濁した。全てのmRNAを1%アガロースゲ
ル上で検証した。転写RNAは、ウリジン残基の約25%が2−チオウリジン(s2U)
でありシチジン残基の約25%が5−メチルシチジン(m5C)であるという点で化学修
飾されている。UTRの配列は図1で提供する。
ヒト肺胞上皮性細胞株(A549)およびヒト肝細胞がん細胞株(HepG2)を、9
6ウェルプレートに、それぞれ20,000細胞/ウェルおよび40,000細胞/ウェ
ルという密度で播種した。播種して24時間後に、商業的な遺伝子導入試薬Lipofe
ctamine(登録商標)2000を、1μgのmRNAにつき2.5μLのLipo
fectamine(登録商標)2000という比率で使用して、細胞に、SNIM R
NA構成体をコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入した(図2−6のX軸は、9
6ウェルプレートのウェル毎のSNIM RNAのng量を示す)。複合体形成を、以下
のように準備した:Lipofectamine(登録商標)2000とmRNAを別々
にOptiMEM遺伝子導入媒体で希釈し、それぞれ、45μLの総体積となるまで加え
た。これらの混合物を室温で5分間インキュベーションした。次に、Lipofecta
mine(登録商標)2000溶液をmRNA溶液と混ぜ、次に、室温でもう20分間イ
ンキュベーションした。遺伝子導入総体積90μLにおいて、細胞を37℃(5%CO2
レベル)で1時間インキュベーションした。その後、遺伝子導入培地を取り除き、細胞を
PBSで洗浄した。続いて、細胞を、10%FBSを含有するLeibovitz L−
15培地を用いて再度インキュベーションした。
ヒト肺胞腺がん細胞株(A549,ATCC CCL−185)を、10%FBSを補
充したHam F12K培地で増殖させた。ヒト肝細胞がん細胞株(HepG2,ATC
C HB−8065)を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM培地で培養した。全て
の細胞株を、5%CO2レベルの加湿雰囲気において増殖させた。
ホタルルシフェラーゼ(FFL)が共通のレポータータンパク質であり、これは、哺乳
動物には内因的に存在せず、発光画像法により容易に検出することが可能である。ルシフ
ェラーゼは、バイオルミネセンス発光を生じさせるルシフェリンと酸素の反応を触媒する
。
6ウェルプレートに、それぞれ、20,000細胞/ウェルおよび40,000細胞/ウ
ェルという密度で播種した。播種して24時間後に、Lipofectamine(登録
商標)2000を使用して、細胞に、SNIM RNA構成体をコードする異なるルシフ
ェラーゼを遺伝子導入した(X軸は、96ウェルプレートのウェル毎のSNIM RNA
のng量を示す)。バイオルミネセンスを遺伝子導入の24時間後に測定した。値を遺伝
子導入量に対しプロットし、GraphPad Prismによりデータ解析した。
動物から採取し、液体窒素で凍らせ、ホモジナイズし、細胞を溶解バッファー(0.1%
Tritron−X100を有する25mM Tris−HCl pH7.5)に溶解し
た。
6〜8週齢のメスのBALB/cマウスをJanvier,Route Des Ch
enes SecsBP5,F−53940 Le Genest St.Isle,F
ranceより得て、特定病原体除去条件下で維持した。実験前に少なくとも7日間、マ
ウスを動物施設の環境に順応させた。全ての動物手順が地方の倫理員会により承認および
制御され、ドイツの動物生態保護法のガイドラインに従って実行された。
リピドイドを以下のようにmRNAと共に製剤化した:C12−(2−3−2)、DO
PE、Chol、およびDSPE−PEG2k(3.6:0.18:0.76:1重量比
)をエタノールに溶解し、10.5という脂質/mRNA重量比でホタルルシフェラーゼ
をコードする化学修飾したmRNAを含む、クエン酸緩衝液(10mMクエン酸、150
mMNaCl、pH=4.5)に速やかに注入して、20%という最終エタノール濃度を
得て、水に対し透析を行った。結果として生じるリピドイド/mRNA複合体は、正に帯
電したナノ粒子(92.6±0.7nm;21.0±0.2mV)をもたらし、これを、
拘束したマウスの尾静脈に静脈内注射した。第2実験では、静脈内注射の前にリピドイド
/mRNA複合体をPBSに適合させたが、これはほぼ帯電していないナノ粒子(91.
5±0.6nm;−0.7±0.2mV)をもたらした。
投与して24時間後に、マウスをメデトミジン(11.5μg/kg BW)、ミダゾ
ラム(115μg/kg BW)、およびフェンタニル(1.15μg/kg BW)の
腹腔内注射により麻酔した。D−ルシフェリン基質(マウスにつき3mg/100μLP
BS)を、静脈内注射により適用した。10分後に、IVIS 100 Imaging
System(Xenogen,アラメダ,USA)とカメラ設定:Bin(HS)、
視野10、f1 f−stop、高分解能ビニング、および5分の露出時間を使用して、
バイオルミネセンスを測定した。Living Image Software ver
sion 2.50(Xenogen,アラメダ,USA)を使用して、シグナルを定量
化し、解析した。
凍ったプレートを解凍し、プレートにおいて直接的な細胞溶解を実行した。プロテアー
ゼ阻害剤(cOmplete,EDTAフリー,Roche Diagnostics,
ドイツ)およびDNase(DNase I溶液(2500U/mL),(Thermo
Fisher,USA)を補完した溶解バッファー(25mMTRIS、0.1%Tr
iton−X100、Sigma−Aldrich、ドイツ)を使用して、タンパク質を
溶解した。溶解後に、サンプルをNuPage(登録商標)LDS Sample Bu
fferおよびSample Reducing Agent(Thermo Fish
er,USA)と混ぜ、70℃で10分間加熱した。NuPAGE 10% Bis−T
ris Midi Gelの上で、XCell4 SureLock(商標)Midi,
Bio−Rad Criterion(商標)System(Thermo Fishe
r,USA)を用いて、ゲル電気泳動を15μLの可溶化物を使用して実行した。Tra
nsBlot(登録商標)Turbo(商標)Transfer System(Bio
rad,ドイツ)を30分間使用して、タンパク質を転移させた。転移後、膜を30分間
NET−ゼラチンで保護してから、該膜を一晩4℃で一次抗体と共にインキュベーション
し、NET−ゼラチン1:2000(OTCポリクローナル抗体(Center),AP
6928c−AB Biocat,ドイツ)に希釈した。NET−ゼラチンを用いた3回
の洗浄ステップの後、NET−ゼラチンに1:10,000で希釈した、ホースラディッ
シュ・ペルオキシダーゼ結合第2抗体(ヤギ抗ウサギIgG−HRP,sc−2004,
Santa Cruz Biotechnology,USA)を室温で一時間加えた。
膜を再び、NET−ゼラチンを用いて、シグナルが化学発光基質キット(Luminat
a Crescendo Western HRP基質,Merck Millipor
e,ドイツ)で可視化され、ChemiDoc(商標)MP System(Biora
d,ドイツ)で可視化されるまで、3回洗浄した。
FBS、Leibovitz L−15培地(Gibco)、Lipofectami
ne(登録商標)2000、およびOptiMEM(Gibco)を、Invitrog
en,ドイツから購入した。無菌PBSは社内で用意した。Ham F−12K、DME
M、およびトリプシン−EDTAをc.c.pro GmbH,ドイツより購入した。
II.a細胞培養実験
であることを示す。その塩基を除去すると、比較する細胞タイプの両方において、発現が
低減する。両構成体(図1の配列番号1および2)では、全用量範囲および直線範囲(除
外する値:62.5ng/ウェルより多い用量は分析から除いた)を、比較の便宜上、別
個に提示する。A549細胞およびHepG2細胞の両方において、Cの除去は、より低
い発現をもたらした。そのため、この余分なCを、全てのさらなる構成体の設計に含めた
。
」を含有する構成体を用いて行った(配列番号1:T7Luc2)。
配列1を鋳型として使用し、この配列に対し、何れかの単一ヌクレオチド(A、T、G
、もしくはC:それぞれ図1の配列番号3−6)、または、30ヌクレオチド長で任意の
予想可能な第2構造を欠いたランダム配列(配列7)、またはヒトαグロビン由来の5´
UTR(配列8)を、調査する「C」およびコザック配列の間に組み込んだ。
行した。より多い用量は線形範囲を外れたため、62.5ng/ウェルまでの用量反応の
みをここでは提示する。ヒトαグロビンに由来する5´UTRを、正の対照として使用し
た。
余分な「C」は、最小主義的な5´UTRを利用することにより高いタンパク質発現を達
成することに関し、必須であることを示す。ヌクレオチドを除去することは、発現の低下
をもたらす。余分な「C」とコザックエレメントの間に余分な「A」を追加することは、
発現に対し悪い影響を与える。ピリミジン塩基と、最も好適には「T」をその位置に加え
ると、hAgに由来する5´UTRで観察されるのと同等のレベルが得られる。
−最良に機能する配列(配列9)と組み合わせた場合のTISUの影響を解明し、
−hAg由来の5´UTRの影響が、細胞特異的な影響であるか、または、5´キャップ
と開始コドンの間の距離が重要であるか否かを決定する。
響を示す。「TISUエレメント」には、図1に示す配列番号4と比較して、図1の配列
番号9の「CC」の代わりに、「AG」が組み込まれている。A549細胞(図5Aおよ
びB)ならびにHepG2細胞(図5CおよびD)は、遺伝子導入の24時間後(A,C
)および48時間後(B,D)に、配列番号1の「C」と、この「C」とコザックエレメ
ントの間に追加の「T」を有するTISUエレメントを含有するルシフェラーゼで、著し
くより高いルシフェラーゼ発現を示した。
されており、ヒトαグロビンUTR(図1の配列8)を、同じ長さのランダム配列(図1
の配列7)と並べて比較することを可能にした実験の結果を示す。ルシフェラーゼ発現を
、示すように、SNIM RNAで遺伝子導入した24時間後に、HepG2(図6A)
およびA549細胞(図6B)において測定した。
後、標準として使用した国際公開第2012/170930A1号:図1および2)の5
´および3´UTR(SUSA UTR)を含有するmRNAをコードするhEPOと比
較した、mRNAをコードするhEPOを含有するTISUエレメントを用いた発現実験
の結果を示す。EPO量を、ELISAにより、遺伝子導入の24時間後に定量化した。
値は3反復の平均±SDを表す。
み込みで達成されるものと比較し、より高い発現をもたらした(図9A)。同等の発現レ
ベルがHepG2細胞でも観察された(図9B)。これは、特に、SUSA5´および3
´UTRの組み込みが、本発明のUTRと比較し、RNAを約200ヌクレオチド長くす
ることから、驚くべきである。
ードするhOTCを含有するTISUエレメントを、これまでに知られている他の全ての
組み合わせと比較し、最も高い発現を生成することが知られている5´ヒトαグロビンU
TRを含有するmRNAをコードするhOTCからのそれと比較した。
し、24時間後に溶解し、ウェスタンブロッティングによりOTC量を定量化した。
方が、同様のレベルのhOTC発現をもたらした(図10A)。ビンキュリンをハウスキ
ーパーとして使用し、帯強度を濃度測定を使用して比較した(図10B)。
結果を図7および図8に示す。
Luc2(+8+A)
Luc2(+8+T)
Luc2(+8+T)+TISU
Luc2−hAg
Luc2−Sp30
Luc2−SUSA UTR
V注射した。追加の対照として、5´末端でヒトCMVエンハンサーと隣接し、3´末端
でヒト成長ホルモン3´UTRと隣接しているLuc2配列(Luc2−SUSA)も、
生成した。この構成体においてUTRとして使用される配列は、Shireの特許(国際
公開第2012/170930A1号:配列ID1/図1)から取った。
秒/cm2/srとして定量化した値をプロットした。全動物画像化の結果を図7Aに示
し、全臓器を画像化した結果を図7B(肝臓)、7C(肺)、7D(脾臓)にそれぞれ示
す。
性を測定した。結果を図7E(肝臓)、7F(肺)、7G(脾臓)それぞれに示す。
Hematology Analyzerを利用することにより解析した:mRNA構成
体をコードする異なるルシフェラーゼを有するマウスの白血球数(WBC)(図8A)、
赤血球(RBC)(図8B)、血小板(図8C)、ヘモグロビン(図8D)、ヘマトクリ
ット(図8E)の値 は、有意な差を示さなかった。
に存在する同じ長さのヒトαグロビンの5´UTR(右)の予想第2構造。両配列の第2
構造は似てすらないが、似た発現レベルを生成し(図6Aおよび6B)、これは両方とも
、T7Luc2(+8+T)−TISUと比較し、等しく低かった。
Claims (17)
- mRNAに転写され得るDNA分子であって、以下のエレメント:
(a)その5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と;
(b)前記コード配列のすぐ上流にある、以下の(b1)および(b2)からなる群
から選択される配列とを有する一本の鎖を含むか;または相補鎖を含み、
(b1)は、R1−CGCCACC(SEQ ID NO:1)か;または、
前記配列において、SEQ ID NO:1の位置6のCがAに置換され、SEQ ID
NO:1の位置7のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:1の位
置5のAがGに置換されている配列であり;
(b2)は、R1−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)であって、SE
Q ID NO:2の位置2のヌクレオチドNがT、G、C、もしくはAから成る群から
選択されるヌクレオチドである、配列か;または、
前記配列において、SEQ ID NO:2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID
NO:2の位置8のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:2の位
置6のAがGに置換されている配列であり、
R1は、DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターであり、
DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識される前記プロモーターは:
(i)T7DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるTAATACGACT
CACTATAGGGAGA(SEQ ID NO:3);
(ii)T3DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるAATTAACCC
TCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO:4);
(iii)SP6DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるATTTAGG
TGACACTATAGAAG(SEQ ID NO:5);および、
(iv)K11DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるAATTAGGG
CACACTATAGGGA(SEQ ID NO:6)からなる群から選択される、D
NA分子。 - SEQ ID NO:2の位置2の前記ヌクレオチドNがT、G、またはCからなる群
から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドNはAではない、請求項1に記載のD
NA分子。 - SEQ ID NO:2の位置2の前記ヌクレオチドNがTである、請求項2に記載の
DNA分子。 - 請求項3のDNA分子を含むベクター。
- 請求項4のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜3の何れか一項に記載のDNA分子、請求項4に記載のベクター、または請
求項5に記載の宿主細胞を含む、組成物。 - (a)その5´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と;
(b)前記コード配列のすぐ上流にある、以下の(b1)および(b2)からなる群か
ら選択されるUTRとを含むRNA分子であって、
(b1)は、配列R2−CGCCACC(SEQ ID NO:1)のUTRか、ま
たは前記UTR配列において、SEQ ID NO:1の位置6のCがAに置換され、S
EQ ID NO:1の位置7のCがGに置換され;および/もしくはSEQ ID N
O:1の位置5のAがGに置換されている配列のUTRであり;
(b2)は、配列R2−CNGCCACC(SEQ ID NO:2)であって、S
EQ ID NO:2の位置2のヌクレオチドNがU、G、C、もしくはAからなる群か
ら選択されるヌクレオチドである配列のUTRか、または前記UTR配列において、SE
Q ID NO:2の位置7のCがAに置換され、SEQ ID NO:2の位置8のC
がGに置換され;および/もしくはSEQ ID NO:2の位置6のAがGに置換され
ている配列のUTRであり、
R2は、DNA依存性RNAポリメラーゼがRNA合成を開始するヌクレオチドで始ま
るプロモーター領域の一部に相当するRNA配列であり、
R2は、
(i)GGGAGA(SEQ ID NO:7);
(ii)GGGAGA(SEQ ID NO:8);
(iii)GAAG(SEQ ID NO:9);および
(iv)GGGA(SEQ ID NO:10)からなる群から選択され、
3´末端にはポリAテールを含む、RNA分子。 - SEQ ID NO:2の位置2の前記ヌクレオチドNがU、G、またはCからなる群
から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドNはAではない、請求項7に記載のR
NA分子。 - SEQ ID NO:2の位置2の前記ヌクレオチドNがUである、請求項8に記載の
RNA分子。 - 前記ポリAテールの長さは少なくとも120ヌクレオチドである、請求項7〜9の何れ
か一項に記載のRNA分子。 - 請求項7〜10の何れか一項に記載のRNA分子をコードする核酸分子。
- 請求項11の核酸分子を含むベクター。
- 請求項12のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項7〜10の何れか一項に記載のRNA分子、請求項11に記載の核酸分子、請求
項12に記載のベクター、または請求項13に記載の宿主細胞と、任意選択的に医薬的に
許容される担体とを含む、医薬組成物。 - RNAベースの治療で使用される、請求項14の医薬組成物。
- 請求項1〜3の何れか一項に記載のDNA分子、請求項7〜10の何れか一項に記載の
RNA分子、請求項11に記載の核酸分子、請求項4もしくは12に記載のベクター、ま
たは、請求項5もしくは13に記載の宿主細胞を含む、キット。 - RNA分子のコード領域を、前記コード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパ
ク質に翻訳するための、請求項7の(b)で定義したUTRの使用。
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