ES2958832T3

ES2958832T3 - Plásmido que contiene una secuencia que codifica para un ARNm con una cola de poli(A) segmentada

Info

Publication number: ES2958832T3
Application number: ES19782636T
Authority: ES
Inventors: Zeljka Trepotec; Manish Kumar Aneja; Carsten Rudolph; Christian Plank; Ludwig Weiss
Original assignee: Ethris GmbH
Current assignee: Ethris GmbH
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2024-02-15
Anticipated expiration: 2039-10-10
Also published as: EP4306643A3; HUE063060T2; DK3864156T3; PL3864156T3; EP4306643A2; JP2022504663A; CA3115597A1; CN112805386A; MX2021003995A; PT3864156T; BR112021006597A2; EP3864156A1; US20210348172A1; KR20210075102A; AU2019358238A1; WO2020074642A1; EP3864156B1

Abstract

La presente divulgación proporciona un plásmido de ADN que comprende una secuencia que codifica una molécula de ARNm y una cola poli(A) modificada, en donde la parte de la secuencia que codifica la cola poli(A) modificada se caracteriza porque consta de al menos dos A elementos definidos cada uno como una secuencia de nucleótidos que consta de 55 a 65 nucleótidos T y al menos un elemento S, cada elemento S consta de un nucleótido que no es un nucleótido T, o de 2 a 10 nucleótidos, preferiblemente 6 nucleótidos, en donde cada uno de los dos terminales nucleótidos no es un nucleótido T, en el que el número de elementos A es uno más que el número de elementos S, y en el que dos elementos A cualesquiera están separados por un elemento S; mostrando dicho plásmido de ADN una recombinación reducida durante la amplificación en una célula huésped bacteriana en comparación con el mismo plásmido de ADN sin dicho al menos un elemento S. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Plásmido que contiene una secuencia que codifica para un ARNm con una cola de poli(A) segmentada

La presente invención se refiere a un plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN que contiene una primera secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm y, ubicada en el sentido de 3' de la misma, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, en el que dicha segunda secuencia de nucleótidos está caracterizada porque consiste en al menos dos elementos A definidos, cada uno, como una secuencia de nucleótidos que consiste en de 55 a 65 nucleótidos T y al menos un elemento S, consistiendo cada elemento S en i) un nucleótido que no es un nucleótido T, o ii) 6 nucleótidos, en el que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T, en el que el número total de elementos A es uno más que el número total de elementos S, y en el que cualesquiera dos elementos A están separados por un elemento S.

La información genética se almacena como ácido desoxirribonucleico (ADN) en la célula y puede transcribirse en ácido ribonucleico (ARN) cuando se requiera. Ambas moléculas de ADN y ARN están constituidas por nucleótidos que consisten en una base nitrogenada, un azúcar de cinco carbonos y al menos un grupo fosfato. Existen diferentes tipos de moléculas de ARN, incluyendo moléculas de ARNm que portan la información genética para la síntesis de proteínas. En eucariotas, estas moléculas de ARNm se transcriben a partir del ADN como moléculas de ARNm prematuras y posteriormente se modifican mediante la adición de, por ejemplo, una cola de poliadenosina (poli(A)) en 3'. La cola de poli(A) es característica de las moléculas de ARNm funcionales maduras, siendo una de las pocas excepciones conocidas los ARNm de histonas (Marzluffet al.,2008, Nat. Rev. Genet., 9(11):843-854; Yanget al.,2011, Genome Biology, 12:R16). La molécula de ARNm madura se transfiere entonces desde el núcleo celular al citoplasma donde se traduce en proteínas. Por tanto, la secuencia de ADN así como la cantidad, la estabilidad y la eficiencia de traducción de la molécula de ARNm madura determinan principalmente la síntesis de la proteína respectiva en una célula.

Para optimizar la síntesis de una proteína deseada en una célula, por ejemplo en contextos terapéuticos, los enfoques basados en ARNm representan una herramienta prometedora. El uso de moléculas de ARNm tiene la ventaja de que las moléculas deben introducirse únicamente en el citoplasma de una célula para la traducción de proteínas (Tavernieret al.,2011, J Control Release, 150(3):238-247; Yamamotoet al.,2009, Eur J Pharm Biopharm, 71(3):484-489). En comparación con el uso de la secuencia de ADN respectiva comprendida en un portador apropiado tal como un plásmido, el uso de moléculas de ARNm además es menos difícil, más eficiente y evita el riesgo considerable de que se altere el ADN cromosómico si el plásmido o partes del mismo se incorporan en el genoma. Los desafíos iniciales asociados con la introducción de moléculas de ARNm en células, tales como la inestabilidad de las moléculas de ARNm y las respuestas inmunitarias, se han superado con éxito usando, por ejemplo, nucleótidos químicamente modificados (documento WO 2011/012316; solicitud de patente EP n.° 18156466.7; Karikóet al.,2008, Mol. Ther., 16(11):1833-40). Hasta la fecha se han identificado e investigado varios determinantes de la eficiencia del ARNm, incluyendo la eficiencia de adición de caperuza en 5' y la composición de la caperuza en 5', la naturaleza de las regiones no traducidas, la optimización de codones de secuencias codificantes de proteína, la presencia de secuencias diana de miARN en la secuencia codificante de proteína y las regiones no traducidas, y la longitud de la cola de poli(A) en 3' (por ejemplo, Thess,et al.,2015, Mol. Ther., 23(9), 1456-1464; Trepotecet al.,2018, Tissue Engineering. Parte A, ten.TEA.2017.0485; Ziemniaket al.,2013, Future Med. Chem., 5(10), 1141-1172).

Para mejorar la eficiencia de los enfoques basados en ARNm, la optimización de la longitud de la cola de poli(A) es fundamental. Se considera que la longitud de la cola de poli(A) es un determinante importante del recambio de ARNm, ya que la degradación de la cola de poli(A) es la primera etapa en la degradación del ARNm antes de que se produzca o bien la hidrólisis de la caperuza en 5' o bien una degradación adicional de 3' a 5' (por ejemplo, revisado en Lodishet al.,Mol. Cell Biol. 4a edición, Nueva York: W. H. Freeman, 2000, sección 11.2; Ramanathanet al.,2016, Nucleic Acids Res., 44(16): 7511-7526). En mamíferos, por ejemplo, se ha notificado que las colas de poli(A) tienen una longitud promedio de aproximadamente 200 a 300 nucleótidos. Además, se ha notificado que las colas de poli(A) pueden presentar nucleótidos terminales distintos de nucleótidos A y que, por ejemplo, un nucleótido G terminal puede retardar la degradación de la cola de poli(A) (Changet al.,2014, Mol. Cell 53(6):1044-1052). Sin embargo, como la cola de poli(A) no está codificada en la secuencia de ADN respectiva, sino que se añade enzimáticamente a la molécula de ARNm prematura transcrita, su longitud sigue siendo difícil de optimizar.

Aunque se sabe que la longitud de la cola de poli(A) es uno de los factores fisiológicos más importantes que influyen en la eficiencia de traducción y la estabilidad del ARNm, las tecnologías existentes tienen problemas con la producción de moléculas de ARNm con una longitud de cola de poli(A) definida a gran escala. Las moléculas de ARNm para la síntesis de proteínas, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas, se generan principalmente mediante transcripciónin vitro.Tales enfoques se basan en moldes de ADN, en los que la cola de poli(A) ya está codificada y que se amplifican mediante clonación o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En comparación con una adición enzimáticamente catalizada de una cola de poli(A) a un ARNm generado, estos enfoques teóricamente tienen la ventaja de que proporcionan colas de poli(A) de longitud definida y reproducible (Holtkampet al.,2006, Blood, 108(13), 4009-4018). En vista de la producción a gran escala de moléculas de ARNm, los enfoques basados en plásmidos son de especial interés. La producción de plásmidos está bien establecida, puede aumentarse de escala fácilmente y realizarse en condiciones de buenas prácticas de fabricación. En comparación con los enfoques basados en PCR, los costes de la producción de plásmidos y el riesgo de obtener mutaciones no deseadas en las secuencias codificantes de la molécula de ARNm son comparativamente bajos. Sin embargo, sigue habiendo un desafío importante a la hora de usar plásmidos para la amplificación bacteriana de secuencias de ADN molde: las secuencias homopoliméricas, tales como la secuencia que codifica para la cola de poli(A), pueden recombinarse durante la amplificación bacteriana del ADN plasmídico y, como consecuencia, las secuencias que codifican para las colas de poli(A) se acortan con el tiempo de manera impredecible (Grieret al.,2016, Mol. Ther. Nucleic Acids, 5(4):e306). Por ejemplo, Grieret al.notificaron que las secuencias que codifican para una cola de poli(A) de 70 nucleótidos de longitud seguían siendo estables a diferencia de las secuencias que codifican para colas de poli(A) que consistían en al menos 100 nucleótidos, que es todavía mucho más corta que la cola de poli(A) que tiene una longitud promedio de 300 nucleótidos de las moléculas de ARNm maduras recién sintetizadas en eucariotas (Grieret al.,2016, Mol. Ther. Nucleic Acids, 5(4):e306). El documento WO2016005324 mostró que la presencia de un ligador dentro de la cola de poli(dA:dT) aumenta su estabilidad.

En un intento de aumentar la longitud de la cola de poli(A), la investigación se centró en el uso de un sistema de plásmidos lineales, lo que permite la clonación estable de secuencias que codifican para colas de poli(A) de hasta 500 nucleótidos (Grieret al.,2016, Mol. Ther. Nucleic Acids, 5(4):e306). En particular, una secuencia que codifica para la molécula de ARNm puede incorporarse en un plásmido usando un sitio de clonación múltiple (SCM). Usando un sitio único para una enzima de restricción específica del sitio, pueden añadirse secuencias que codifican para una cola de poli(A) comparativamente corta en un procedimiento iterativo, permitiendo de ese modo la expansión de la secuencia que codifica para la cola de poli(A) comprendida en el plásmido. Sin embargo, aún no está claro cómo puede aumentarse de escala de manera eficiente este sistema para la producción a gran escala de moldes para ARNm transcritosin vitro,ya que el plásmido lineal usado es un plásmido con un número de copias bajo (sistema de clonación lineal BigEasy® v2.0 (vectores pJAZZ®), Lucigen). Por tanto, sigue existiendo la necesidad de disponer de soluciones alternativas para poder suministrar a gran escala moldes para la transcripciónin vitrode moléculas de ARNm con una longitud cola de poli(A) definida y estable.

La presente solicitud aborda la necesidad de moldes de transcripciónin vitroque codifican para moléculas de ARNm con longitudes de cola de poli(A) definidas y que muestran una recombinación reducida de la secuencia que codifica para la cola de poli(A) durante la amplificación en una célula bacteriana al proporcionar las realizaciones tal como se recitan en las reivindicaciones.

En particular, la presente invención se refiere a un plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN que contiene (i) una primera secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm y, ubicada en el sentido de 3' de la misma, (ii) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, en el que dicha segunda secuencia de nucleótidos está caracterizada porque consiste en (a) al menos dos elementos A definidos, cada uno, como una secuencia de nucleótidos que consiste en de 55 a 65 nucleótidos T, y (b) al menos un elemento S, consistiendo cada elemento S en (b1) un nucleótido que no es un nucleótido T, o (b2) 6 nucleótidos, en el que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T; en el que el número total de elementos A es uno más que el número total de elementos S, y en el que cualesquiera dos elementos A están separados por un elemento S. Dicho de otro modo, la presente invención se refiere a un plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN que puede transcribirse, preferiblementein vitro,en una molécula de ARNm con una cola de poli(A) modificada, es decir, segmentada.

Se ha hallado sorprendentemente que un plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN de este tipo que codifica para una molécula de ARNm con una cola de poli(A) modificada muestra una recombinación reducida durante la amplificación de dicho plásmido de ADN en una célula bacteriana en comparación con el mismo plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para la misma molécula de ARNm con la misma cola de poli(A), pero sin dichos elementos S.

En el contexto de la presente invención, los términos “ADN” y “ARN” se refieren a moléculas de ADN o ARN monocatenarias o bicatenarias. Si no se indica lo contrario, los términos “ADN” y “molécula de ADN” se refieren a una molécula de ADN bicatenaria constituida por nucleótidos A, C, G y/o T, y los términos “ARN” y “molécula de ARN” se refieren a una molécula de ARN monocatenaria constituida por nucleótidos A, C, G y/o U. En el presente documento, dichos nucleótidos A, C, G, T y U se refieren a nucleótidos que comprenden adenina, guanina, citosina, timina y uracilo como la base nitrogenada respectiva.

En el contexto de la presente invención, el término “plásmido de ADN” se refiere a un plásmido que consiste en una molécula de ADN bicatenaria. Si no se indica lo contrario, el término “plásmido” se refiere a una molécula de ADN circular, aunque el término también puede abarcar moléculas de ADN lineales. En particular, el término “plásmido” también cubre moléculas que son el resultado de la linealización de un plásmido circular mediante su corte, por ejemplo, con una enzima de restricción, convirtiendo de ese modo la molécula de plásmido circular en una molécula lineal. Los plásmidos pueden replicarse, es decir, amplificarse en una célula independientemente de la información genética almacenada como ADN cromosómico en la célula y pueden usarse para la clonación, es decir, para la amplificación de la información genética en una célula bacteriana. Preferiblemente, el plásmido de ADN según la presente invención es un plásmido con un número de copias medio o alto, más preferiblemente un plásmido con un número de copias alto. Ejemplos de tales plásmidos con un número de copias alto son vectores basados en los plásmidos pUC, pBluescript®, pGEM®, pTZ o cualquier otro plásmido que contenga un origen de replicación (por ejemplo, μMB1, pColEI) que admite altos números de copias del plásmido.

El plásmido según la presente invención comprende preferiblemente al menos un origen de replicación (ORI), un gen marcador o un fragmento del mismo y/o un gen indicador o un fragmento del mismo, y sitios de restricción únicos que permiten la inserción de elementos de ADN, preferiblemente sitios de restricción en forma de un sitio de clonación múltiple (SCM). El ORI es esencial para la replicación. Un gen marcador tal como un gen de resistencia a antibióticos es ventajoso para identificar células que contienen un plásmido que comprende dicho gen marcador. Un gen indicador tal comolacZoluciferasaes ventajoso para medir la fuerza y/o regulación de la expresión de un gen diana que está unida a, o puede usarse como, un gen diana indirecto para someter a prueba la expresión y/o establecer un nuevo enfoque o sistema. Un SCM comprende varios sitios de restricción que son únicos dentro del plásmido de ADN y cada uno de ellos son reconocidos específicamente por una enzima de restricción. En particular, un SCM es ventajoso para incorporar elementos genéticos tales como la secuencia de ADN o la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención en un plásmido de ADN adecuado, preferiblemente un plásmido de ADN con un número de copias alto. En este último caso, el plásmido de ADN comprende además un gen diana (que codifica para un ARNm) al que se une la cola de poli(A) modificada codificada por la segunda secuencia de nucleótidos.

Una molécula de ADN bicatenaria tal como un plásmido de ADN consiste en dos cadenas de ADN complementarias. El término “complementario” se refiere a nucleótidos, cuyas bases nitrogenadas pueden unirse de manera natural entre sí mediante enlaces de hidrógeno, es decir nucleótidos A y T, nucleótidos A y U así como nucleótidos C y G. Según la presente invención, una de las dos cadenas de una molécula de ADN bicatenaria comprende una “secuencia de ADN”. En el presente documento, el término “secuencia de ADN” se refiere a una parte de una cadena de una molécula de ADN bicatenaria tal como un plásmido de ADN. Según la presente invención, dicha secuencia de ADN está constituida por nucleótidos A, C, G y T y comprende una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos tal como se define en el presente documento.

En el contexto de la presente invención, la “primera secuencia de nucleótidos” comprendida en dicha secuencia de ADN es una “secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm”. Dicho de otro modo, dicha primera secuencia de nucleótidos se refiere a la parte de dicha secuencia de ADN que puede usarse como molde durante la transcripción, es decir, la síntesis de una molécula de ARNm. Por tanto, en el caso de que una “molécula de ARNm” se transcriba a partir de la primera secuencia de nucleótidos, dicho ARNm tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a dicha primera secuencia de nucleótidos, excepto porque, en lugar de nucleótidos T, se usan nucleótidos U para la síntesis de la molécula de ARNm. Dado que la cola de poli(A) no está codificada de manera natural en la secuencia de ADN, sino que se añade enzimáticamente a la molécula de ARNm durante y/o después de la transcripción, el término una “secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm” se refiere a la parte de dicha secuencia de ADN que puede usarse como molde durante la transcripción de una molécula de ARNm sin ninguna cola de poli(A).

En el presente documento, “codificante” o “codificar” se refiere a i) información genética comprendida en una secuencia de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARNm y/o ii) información genética comprendida en una molécula de ARNm que puede traducirse en una secuencia de aminoácidos. Por tanto, estos términos también cubren información genética comprendida en el ADN que puede convertirse a través de la transcripción de una molécula de ARNm en una secuencia de aminoácidos tal como una proteína.

En el presente documento, los términos “molécula de ARNm” y “ARNm” se usan indistintamente y se refieren a una clase de moléculas de ARN, preferiblemente secuencias monocatenarias constituidas por nucleótidos A, C, G y U que contienen una o más secuencias codificantes. Dichas una o más secuencias codificantes pueden usarse como molde durante la síntesis de una secuencia de aminoácidos durante la traducción. Dicho de otro modo, debe entenderse que el término “ARNm” significa cualquier molécula de ARN que es adecuada para la expresión de una secuencia de aminoácidos o que puede traducirse en una secuencia de aminoácidos tal como una proteína.

A continuación se describen con mayor detalle características adicionales de la primera secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm y de la molécula de ARNm codificada.

Según la presente invención, a dicha primera secuencia de nucleótidos comprendida en la secuencia de ADN contenida en un plásmido de ADN le sigue una segunda secuencia de nucleótidos comprendida en dicha secuencia de ADN, es decir, dicha segunda secuencia de nucleótidos está ubicada en el sentido de 3' de dicha primera secuencia de nucleótidos. Dicho de otro modo, dichas dos secuencias están ubicadas en la misma cadena de una molécula de ADN monocatenaria o bicatenaria de manera que, en el caso de que tenga lugar la transcripción, en primer lugar se transcribe la primera secuencia de nucleótidos y luego la segunda secuencia de nucleótidos.

En particular, dichas dos secuencias de nucleótidos están ubicadas muy cerca una de otra o directamente unidas entre sí. En una realización preferida, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están directamente unidas entre sí, es decir, no hay nucleótidos intermedios. Sin embargo, también es posible que las secuencias de nucleótidos primera y segunda estén separadas por nucleótidos intermedios. Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos primera y segunda están separadas por no más de 100 nucleótidos, más preferiblemente por no más de 50, 40 o 30 nucleótidos, y lo más preferiblemente por no más de 20, 10 o 5 nucleótidos.

Según la presente invención, la secuencia de ADN del plásmido de ADN comprende una primera secuencia de nucleótidos y, ubicada en el sentido de 3' de la misma, una segunda secuencia de nucleótidos. Dicha “segunda secuencia de nucleótidos” es una “secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada”. En el presente documento, esto se refiere a la parte de dicha secuencia de a Dn que puede usarse como molde para la síntesis de una cola de poli(A) modificada durante la transcripción, preferiblemente durante la transcripciónin vitro,de dicha secuencia de ADN. Las colas de poli(A) que se producen de manera natural que se añaden enzimáticamente a una molécula de ARNm prematura consisten normalmente en nucleótidos A. Tales colas de poli(A) que se producen de manera natural también se denominan en lo sucesivo colas de poli(A) convencionales.

Según la presente invención, el término “cola de poli(A) modificada” se refiere a una cola de poli(A) segmentada que comprende nucleótidos distintos de nucleótidos A. En particular, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada según la presente invención está caracterizada porque consiste en (a) al menos dos elementos A definidos, cada uno, como una secuencia de nucleótidos que consiste en de 35 a 65 nucleótidos T, preferiblemente de 55 a 65 nucleótidos T, y (b) al menos un elemento S, consistiendo cada elemento S en (b1) un nucleótido que no es un nucleótido T, o (b2) 6 nucleótidos, en la que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T; en la que el número total de elementos A es uno más que el número total de elementos S, y en la que cualesquiera dos elementos A están separados por un elemento S.

Según la presente invención, dichos elementos A y dichos elementos S está dispuestos de manera alterna en dicha segunda secuencia de nucleótidos. Por tanto, se pretende que el término “en el que cualesquiera dos elementos A están separados por un elemento S” se entienda como “en el que cualesquiera dos elementos A consecutivos están separados por un elemento S”. A modo de ilustración, en el caso de tres elementos A y dos elementos S, la segunda secuencia según la presente invención consiste en un, es decir el primer, elemento A; un elemento S; otro, es decir el segundo, elemento A; otro elemento S; y un elemento A adicional, es decir el tercero. Por tanto, en este ejemplo, el término “cualesquiera dos elementos A” se refiere a los elementos A primero y segundo así como a los elementos A segundo y tercero, pero no a los elementos A primero y tercero. Por tanto, este término se refiere a cualquiera de los al menos dos elementos A y al elemento A más próximo de los elementos A restantes.

En algunas realizaciones, la secuencia de ADN según la presente invención comprende una primera secuencia de nucleótidos seguida de una segunda secuencia de nucleótidos seguida de uno o más nucleótidos adicionales distintos de nucleótidos T. Dichos nucleótidos adicionales son preferiblemente de 1 a 5 nucleótidos C, más preferiblemente 1 nucleótido C. Dicho de otro modo, la secuencia de ADN puede codificar para una molécula de ARNm, una cola de poli(A) modificada y nucleótidos adicionales, preferiblemente un nucleótido G.

Tal como demuestran los ejemplos adjuntos, se ha hallado que el uso de un plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN que contiene una primera y una segunda secuencias de nucleótidos que codifican para una molécula de ARNm y una cola de poli(A) modificada según la presente invención da como resultado una recombinación reducida durante la amplificación de dicho plásmido de ADN en una célula bacteriana en comparación con el mismo plásmido de ADN pero con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) no modificada que consiste en el mismo número total de nucleótidos A codificada por la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención. Dicho de otro modo, el uso de un plásmido de ADN según la presente invención da como resultado una recombinación reducida durante la amplificación de dicho plásmido de ADN en una célula bacteriana en comparación con el mismo plásmido de ADN pero sin dicho al menos un elemento S entre dichos al menos dos elementos A.

Sorprendentemente, también se ha observado que, al mismo tiempo, la estabilidad y la eficiencia de traducción del polirribonucleótido transcrito a partir de la secuencia de ADN según la presente invención generalmente no se ven afectadas negativamente por la cola de poli(A) modificada tal como se definió anteriormente.

En el presente documento, el término “recombinación” se refiere a recombinación homóloga, en la que las secuencias de nucleótidos se intercambian entre dos secuencias de nucleótidos altamente similares o idénticas comprendidas, por ejemplo, en moléculas de ADN tales como plásmidos de ADN y/o cromosomas. El término “recombinación” comprende eventos de recombinación homóloga intramoleculares, es decir, recombinación de dos secuencias de nucleótidos altamente similares o idénticas comprendidas en la misma molécula de ADN. En el contexto de la presente invención, esto se refiere en particular a la recombinación de una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada y una convencional, respectivamente, y otra secuencia de nucleótidos altamente similar o idéntica comprendida en el mismo plásmido de ADN durante la amplificación de dicho plásmido, y/o a la recombinación de las dos partes terminales de una secuencia de nucleótidos de este tipo. Alternativa o adicionalmente, el término “recombinación” comprende eventos de recombinación homóloga intermoleculares entre una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada y una convencional comprendidas en un plásmido de ADN, respectivamente, y una secuencia de nucleótidos altamente similar o idéntica comprendida en otra molécula de ADN, por ejemplo, otro plásmido de ADN, comprendida en la misma célula, por ejemplo.

Según la presente invención, el término “recombinación reducida” significa que la recombinación se reduce en al menos el 5%, preferiblemente en al menos el 10%, más preferiblemente en al menos el 25%, incluso más preferiblemente en al menos el 50 %, y lo más preferiblemente en el 100 %.

Una reducción en la recombinación puede determinarse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento: se usan células bacterianas genéticamente idénticas para la amplificación de un plásmido de ADN según la presente invención (grupo 1) y para la amplificación del mismo plásmido de ADN excepto porque la segunda secuencia de nucleótidos no comprende dicho al menos un elemento S (grupo II), respectivamente. Mediante el uso de procedimientos rutinarios de laboratorio, las células bacterianas pueden someterse a lisis tras la amplificación, pueden obtenerse y linealizarse plásmidos de ADN y pueden purificarse las secuencias de ADN comprendidas o las segundas secuencias de nucleótidos. Luego pueden investigarse cualitativamente las secuencias de ADN obtenidas, especialmente las segundas secuencias de nucleótidos obtenidas, en vista de la composición de nucleótidos, la secuencia y/o la longitud, por ejemplo, mediante secuenciación y/o electroforesis tal como electroforesis en gel o capilar. Alternativa o adicionalmente, pueden determinarse cuantitativamente la aparición y la frecuencia de recombinación midiendo la longitud de las segundas secuencias de nucleótidos, calculando la razón de segundas secuencias de nucleótidos que tienen la longitud esperada tal como se define por la segunda secuencia de nucleótidos originalmente usada y el número total de segundas secuencias de nucleótidos dentro de cada grupo, y comparando la razón obtenida por grupo entre los grupos. Alternativamente, las secuencias de ADN extraídas pueden transcribirsein vitroantes de investigar la longitud de las colas de poli(A) transcritas dentro de y entre los grupos I y II tal como se describió anteriormente en el caso de las segundas secuencias de nucleótidos.

Se ha observado una reducción de la recombinación de este tipo para plásmidos de ADN que comprenden una segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención. En particular, por ejemplo, se ha observado que los elementos S que consisten en un solo nucleótido son ventajosos para reducir la recombinación durante la amplificación bacteriana. Por tanto, en una realización particularmente preferida de la presente invención, el plásmido de ADN comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, en el que uno cualquiera de dichos elementos S consiste en un nucleótido C o un nucleótido A, preferiblemente un nucleótido C.

En algunas realizaciones, la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención consiste en dos elementos A separados por un nucleótido A. Más preferiblemente, dichos dos elementos A están separados por un nucleótido C.

En algunas realizaciones, la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención consiste en tres elementos A, en la que cualesquiera dos elementos A están separados por un nucleótido A. Preferiblemente, cualesquiera dos de dichos tres elementos A están separados por un nucleótido C.

En algunas realizaciones, la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención consiste en cuatro elementos A, en la que cualesquiera dos elementos A están separados por un nucleótido A. Preferiblemente, cualesquiera dos de dichos cuatro elementos A están separados por un nucleótido C.

En algunas realizaciones, la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención consiste en cinco elementos A, en la que cualesquiera dos elementos A están separados por un nucleótido A. Preferiblemente, cualesquiera dos de dichos cinco elementos A están separados por un nucleótido C.

En algunas realizaciones, la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención consiste en seis elementos A, en la que cualesquiera dos elementos A están separados por un nucleótido A cada. Preferiblemente, cualesquiera dos de dichos seis elementos A están separados por un nucleótido C.

En algunas realizaciones, la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención consiste en siete elementos A, en la que cualesquiera dos elementos A están separados por un nucleótido A. Preferiblemente, cualesquiera dos de dichos siete elementos A están separados por un nucleótido C.

En algunas realizaciones, la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención consiste en ocho elementos A, en la que cualesquiera dos elementos A están separados por un nucleótido A. Preferiblemente, cualesquiera dos de dichos ocho elementos A están separados por un nucleótido C.

En el caso de que más de un elemento S esté comprendido en la segunda secuencia de nucleótidos, dichos al menos dos elementos S pueden tener la misma secuencia o pueden variar en su secuencia. Preferiblemente, dichos al menos dos elementos S consisten, cada uno, en i) el mismo nucleótido en el caso de un nucleótido, o ii) la misma secuencia de nucleótidos en el caso de 2 a 10 nucleótidos, preferiblemente 6 nucleótidos.

Por tanto, en algunas realizaciones, cada uno del al menos un elemento S comprendido en la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención consiste en un nucleótido A. Preferiblemente, cada uno del al menos un elemento S comprendido en la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención consiste en un nucleótido C.

En el caso de al menos dos elementos S, en algunas realizaciones, al menos uno, pero no la totalidad, de los elementos S puede consistir en un nucleótido A y cada uno del al menos un elemento S restante puede consistir en i) un nucleótido G o preferiblemente C, o ii) 6 nucleótidos, en el que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T.

En el caso de al menos dos elementos S, en algunas realizaciones, al menos uno, pero no la totalidad, de los elementos S consiste preferiblemente en un nucleótido G y cada uno del al menos un elemento S restante puede consistir en i) un nucleótido A o C, o ii) 6 nucleótidos, en el que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T.

En algunas realizaciones, el número de elementos A comprendidos en la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada contenida en dicha secuencia de ADN de un plásmido de ADN tal como se definió anteriormente es dos, tres o cuatro. Dicho de otro modo, en realizaciones particularmente preferidas, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en i) dos elementos A que flanquean un elemento S, ii) tres elementos A en orden alterno con dos elementos S, o iii) cuatro elementos A en orden alterno con tres elementos S; siendo los elementos A y S tal como se definieron anteriormente.

En algunas realizaciones, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en dos elementos A que consisten, cada uno, en el mismo número de nucleótidos T en orden alterno con un elemento S que consiste en i) 6 nucleótidos, en la que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T, o preferiblemente ii) un nucleótido C.

En algunas realizaciones, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en tres elementos A que consisten, cada uno, en el mismo número de nucleótidos T en orden alterno con dos elementos S, en el que la totalidad de dichos dos elementos S consisten, cada uno, en i) 6 nucleótidos, en la que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T, o preferiblemente ii) un nucleótido C.

En algunas realizaciones, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en cuatro elementos A que consisten, cada uno, en el mismo número de nucleótidos T en orden alterno con tres elementos S, en el que la totalidad de dichos tres elementos S consisten, cada uno, en i) 6 nucleótidos, en la que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T, o preferiblemente ii) un nucleótido C.

En algunas realizaciones, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en dos, tres o cuatro elementos A, en la que al menos dos de dichos elementos A difieren en su número de nucleótidos T, en orden alterno con uno, dos o tres elementos S, respectivamente, en la que la totalidad de dichos elementos S consisten, cada uno, en i) 6 nucleótidos, en la que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T.

En algunas realizaciones, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en dos, tres o cuatro elementos A, en la que al menos dos de dichos elementos A difieren en su número de nucleótidos T, en orden alterno con uno, dos o tres elementos S, respectivamente, en la que preferiblemente la totalidad de dichos elementos S consisten, cada uno, en un nucleótido C.

En algunas realizaciones del plásmido de ADN tal como se definió anteriormente, el número de elementos A es cuatro y las secuencias de nucleótidos de los cuatro elementos A, juntas, tienen una longitud global de 240 nucleótidos.

Preferiblemente, cada elemento A tiene una longitud de 60 nucleótidos. Dicho de otro modo, en realizaciones particularmente preferidas, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en cuatro elementos A en orden alterno con tres elementos S, en la que los cuatro elementos A, juntos, consisten en 240 nucleótidos y preferiblemente tienen, cada uno, la misma longitud.

Más preferiblemente, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en cuatro elementos A que consisten, cada uno, en 60 nucleótidos T en orden alterno con tres elementos S, en la que los tres elementos S consisten, cada uno, en i) 6 nucleótidos, en la que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T, o preferiblemente ii) un nucleótido C.

En algunas realizaciones del plásmido de ADN tal como se definió anteriormente, el número de elementos A es dos y las secuencias de nucleótidos de los dos elementos A, juntas, tienen una longitud global de 120 nucleótidos. Preferiblemente, cada elemento A tiene una longitud de 60 nucleótidos. Dicho de otro modo, en realizaciones particularmente preferidas, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en dos elementos A que, juntos, tienen una longitud total de 120 nucleótidos. Dicho de otro modo, en realizaciones particularmente preferidas, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en dos elementos A en orden alterno con un elemento S, en la que los dos elementos A, juntos, consisten en 120 nucleótidos y preferiblemente tienen, cada uno, la misma longitud.

Más preferiblemente, dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada consiste en dos elementos A que consisten, cada uno, en 60 nucleótidos T que flanquean un elemento S que consiste en i) 6 nucleótidos, en la que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T, o preferiblemente ii) un nucleótido C.

En algunas realizaciones del plásmido de ADN tal como se definió anteriormente, dicho plásmido de ADN contiene, en la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, tres elementos A que, juntos, tienen una longitud total de 120 nucleótidos. Dicho de otro modo, en esta realización del plásmido de ADN tal como se definió anteriormente, el número de elementos A es tres y dichas secuencias de nucleótidos de los tres elementos A, juntas, tienen una longitud global de 120 nucleótidos, teniendo preferiblemente cada elemento A una longitud de 40 nucleótidos. Por tanto, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica para dicha cola de poli(A) modificada puede consistir en tres elementos A en orden alterno con dos elementos S. Preferiblemente, cada uno de los tres elementos A consiste en 40 nucleótidos T y cada uno de los dos elementos S consiste en i) preferiblemente un nucleótido C, o ii) 6 nucleótidos, en los que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T.

Según la presente invención, el plásmido de ADN comprende una secuencia de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos seguida de una segunda secuencia de nucleótidos tal como se definió anteriormente. Preferiblemente, la primera secuencia de nucleótidos está precedida por un promotor comprendido en la secuencia de ADN o el plásmido de ADN. El promotor está implicado en el control y el inicio de la transcripción de la siguiente secuencia de nucleótidos tal como la secuencia de ADN que comprende la primera secuencia de nucleótidos o la primera secuencia de nucleótidos. Por tanto, un promotor comprendido en el plásmido de ADN, preferiblemente un promotor fuerte, puede ser ventajoso para comparar los efectos de otros elementos genéticos sobre la duración y/o intensidad de la transcripción de la siguiente secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm. Por otro lado, un promotor comprendido en la secuencia de ADN, preferiblemente un promotor fuerte, puede ser ventajoso para optimizar la duración y/o intensidad de la transcripción de la siguiente secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm.

El promotor comprende al menos un sitio de reconocimiento seguido de un sitio de unión. Los sitios de reconocimiento y de unión pueden interaccionar con las secuencias de aminoácidos que median o regulan la transcripción. El sitio de unión está ubicado más próximo a la primera secuencia de nucleótidos comprendida en la secuencia de ADN según la invención en comparación con el sitio de reconocimiento. Por ejemplo, el sitio de reconocimiento puede ser una caja -35 y el sitio de unión una caja -10 ubicada a una distancia de aproximadamente 35 nucleótidos y 10 nucleótidos antes del sitio de inicio de la transcripción, respectivamente. El sitio de unión puede ser, por ejemplo, una caja Pribnow en procariotas y una caja TATA en eucariotas. Preferiblemente, el sitio de unión es una caja Pribnow comprendida en el plásmido de ADN o la secuencia de ADN próxima a la primera secuencia de nucleótidos.

Opcionalmente, el promotor comprende al menos un elemento regulador adicional tal como un elemento en el sentido de 5' rico en AT ubicado aproximadamente 40 y/o 60 nucleótidos antes del sitio de inicio de la transcripción, y/o elementos reguladores adicionales ubicados entre los sitios de reconocimiento y de unión que potencian la actividad del promotor.

En una realización particularmente preferida, el promotor es un promotor fuerte. Dicho de otro modo, el promotor comprende secuencias que fomentan la transcripción de la siguiente secuencia de ADN según la presente invención. El experto en la técnica conoce promotores fuertes, por ejemplo, los promotores OXB18, OXB19 y OXB20 derivados del promotor RecA paraEscherichia coli,o pueden identificarse o sintetizarse mediante procedimientos rutinarios de laboratorio.

Opcionalmente, el promotor está precedido por elementos reguladores adicionales tales como potenciadores comprendidos en el plásmido de ADN que fomentan la transcripción de la secuencia de ADN según la presente invención.

La secuencia de ADN comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm, es decir, puede convertirse en una molécula de ARNm durante la transcripción, en la que la síntesis de la molécula de ARNm comienza con su extremo 5' y finaliza con su extremo 3'. A continuación se describen con más detalla las características de la primera secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm, en relación con la molécula de ARNm codificada.

La primera secuencia de nucleótidos comprende al menos una región que codifica para una región no traducida (UTR) y al menos una región codificante. Preferiblemente, la primera secuencia de nucleótidos codifica para al menos la 5' UTR y la región codificante de la molécula de ARNm codificada. La región codificante puede comprender partes no codificantes y codificantes. Preferiblemente, la región codificante consiste en al menos una parte codificante que codifica para la parte de la molécula de ARNm que puede traducirse en una secuencia de aminoácidos, o partes de la misma.

En una realización particularmente preferida, la primera secuencia de nucleótidos comprende una región que codifica para una 5' UTR seguida de una región codificante seguida de una región que codifica para una 3' UTR de la molécula de ARNm codificada.

Según la presente invención, la primera secuencia de nucleótidos codifica para una molécula de ARNm. Preferiblemente, la primera secuencia de nucleótidos codifica para un ARNm que comprende una 5' UTR, una secuencia codificante y una 3' UTR.

El extremo 5' de la 5' UTR está definido por el sitio de inicio de la transcripción y a su extremo 3' le sigue la secuencia codificante. La secuencia codificante termina mediante los codones de inicio y de parada, es decir, los tres nucleótidos primeros y últimos de la molécula de ARNm que pueden traducirse, respectivamente. La 3' UTR comienza después del codón de parada de la secuencia codificante y le sigue la cola de poli(A) modificada codificada por la segunda secuencia de nucleótidos según la presente invención.

La 5' UTR comprende generalmente al menos un sitio de unión al ribosoma (RBS) tal como la secuencia Shine-Dalgarno en procariotas y el sitio de inicio de la traducción o la secuencia Kozak en eucariotas. El RBS fomenta una traducción eficiente y precisa de una molécula de ARNm al reclutar los ribosomas durante el inicio de la traducción. La actividad de un RBs dado puede optimizarse variando su longitud y secuencia, así como su distancia hasta el codón de inicio. Alternativa u opcionalmente, la 5' UTR comprende sitios internos de entrada al ribosoma o IRES. En algunas realizaciones, la molécula de ARNm comprende una 5' UTR que comprende adicionalmente una o más secuencias reguladoras adicionales tales como un sitio de unión para una secuencia de aminoácidos que potencia la estabilidad de la molécula de ARNm, un sitio de unión para una secuencia de aminoácidos que potencia la traducción de la molécula de ARNm, un elemento regulador tal como un ribointerruptor, un sitio de unión para una molécula de ARN reguladora tal como un molécula de miARN, y/o una secuencia de nucleótidos que afecta positivamente al inicio de la traducción. Además, dentro de la 5' UTR preferiblemente no hay marcos de lectura abiertos en el sentido de 5' funcionales, sitios de inicio de la traducción en el sentido de 5' fuera de marco, codones de inicio en el sentido de 5' fuera de marco y/o secuencias de nucleótidos que dan lugar a una estructura secundaria que reduce o impide la traducción. La presencia de tales secuencias de nucleótidos en la 5' UTR puede tener un efecto negativo sobre la traducción.

La secuencia codificante está codificada por la al menos una parte codificante de la primera secuencia de nucleótidos y comprende codones que pueden traducirse en una secuencia de aminoácidos. A continuación se describen con detalle características adicionales de la secuencia de aminoácidos codificada.

La secuencia codificante puede contener los codones de una secuencia codificante que se produce de manera natural o puede ser una secuencia codificante parcial o completamente sintética. Alternativamente, la secuencia codificante puede ser una secuencia con codones parcial o totalmente optimizados derivada de la secuencia natural que va a usarse. La mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón, es decir, tres nucleótidos consecutivos de una molécula de ARNm que pueden traducirse en un aminoácido. Existen codones que se usan preferentemente en algunas especies para un aminoácido dado. La presencia de codones que se producen con mayor frecuencia puede potenciar la cantidad de secuencias de aminoácidos traducidas basándose en una molécula de ARNm dada en comparación con la misma molécula de ARNm pero que comprende codones comparativamente raros. Por tanto, es ventajoso adaptar de manera específica de especie los codones en una secuencia codificante dada evitando codones raros y potenciando la aparición de codones abundantes para un aminoácido dado para mejorar la traducción de dicho ARNm.

El ARNm también puede comprender opcionalmente una 3' UTR. La 3' UTR puede comprender una o más secuencias reguladoras tales como un sitio de unión para una secuencia de aminoácidos que potencia la estabilidad de la molécula de ARNm, un sitio de unión para una molécula de ARN reguladora tal como una molécula de miARN, y/o una secuencia señal implicada en el transporte intracelular de la molécula de ARNm.

En una realización particularmente preferida, la molécula de ARNm codificada por la primera secuencia de nucleótidos comprende una 5' UTR con al menos un RBS y/o IRES, una secuencia codificante con codones optimizados y una 3' UTR con al menos una secuencia reguladora tal como se definió anteriormente.

La molécula de ARNm según la presente invención comprende una secuencia codificante, es decir, una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos. En cuanto a la función de la secuencia de aminoácidos codificada, no hay limitación y a continuación se describen adicionalmente posibles secuencias de aminoácidos que va a codificarse por dicho polirribonucleótido. En el presente documento, el término “secuencia de aminoácidos” abarca cualquier clase de secuencia de aminoácidos, es decir, cadenas de dos o más aminoácidos, cada una de los cuales está unida a través de enlaces peptídicos, y se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos de interés. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos codificada tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos 10 aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 50, 100, 200 o 500 aminoácidos. Dicho de otro modo, el término “secuencia de aminoácidos” cubre péptidos cortos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas de fusión, proteínas, así como fragmentos de los mismos, tales como partes de proteínas conocidas, preferiblemente partes funcionales. Estas pueden ser, por ejemplo, partes biológicamente activas de una proteína o partes antigénicas tales como epítopos que pueden ser eficaces en la generación de anticuerpos.

Preferiblemente, la función de la secuencia de aminoácidos codificada en la célula o en las proximidades de la célula es necesaria o beneficiosa, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos cuya falta de forma o forma defectuosa es un desencadenante de una enfermedad o afección, cuya provisión puede moderar o prevenir una enfermedad o afección, o una secuencia de aminoácidos que puede fomentar un proceso que es beneficioso para el cuerpo, en una célula o en sus proximidades. La secuencia de aminoácidos codificada puede ser la secuencia de aminoácidos completa o una variante funcional de la misma. Además, la secuencia de aminoácidos codificada puede actuar como factor, inductor, regulador, estimulador o enzima, o un fragmento funcional de los mismos, donde esta secuencia de aminoácidos es una cuya función es necesaria para remediar un trastorno, en particular un trastorno metabólico, o para iniciar procesosin vivotales como la formación de nuevos vasos sanguíneos, tejidos, etc. En este caso, por variante funcional se entiende un fragmento que, en la célula, puede asumir la función de la secuencia de aminoácidos cuya función en la célula es necesaria o cuya falta de forma o forma defectuosa es patógena.

Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos de este tipo es ventajosa con respecto a las aplicaciones con fines de complementación o médicos para generar o regenerar funciones fisiológicas provocadas por una biosíntesis subóptima de la secuencia de aminoácidos y, por tanto, también para influir favorablemente, de manera directa o indirecta, en el transcurso de las enfermedades. Trastornos con base genética conocidas son, por ejemplo, fibrosis quística, hemofilia, hipertensión, nivel de colesterol elevado, cáncer, trastornos neurodegenerativos, enfermedad mental y otros. Hay disponibles un catálogo en línea, actualmente con 22.993 entradas de trastornos genéticos y génicos humanos, junto con sus genes respectivos y una descripción de sus fenotipos, en la página web de ONIM (Online Mendelian Inheritance in Man) (http://onim.org); cuyas secuencias están disponibles a partir de la base de datos de Uniprot (http://www.uniprot.org). Como ejemplos no limitativos, la tabla 1 siguiente enumera algunas enfermedades congénitas y el/los gen(es) correspondiente(s). Debido al alto grado de interacción de las rutas de señalización celular, la mutación de un determinado gen provoca múltiples síntomas patógenos, de los cuales únicamente se enumera una característica en la tabla 1.

Tabla 1

La proteína codificada por el polirribonucleótido según la presente invención también puede tener el potencial para inducir una reacción inmunogénica actuando, por ejemplo, como antígeno. Por tanto, los polirribonucleótidos según la invención se prestan a aplicaciones con fines de complementación o médicos incluyendo vacunación.

Secuencias de nucleótidos adecuadas de los elementos genéticos descritos anteriormente, tales como UTR, secuencias reguladoras y sitios de unión, son secuencias de nucleótidos que potencian la acción y/o duración de acción de la molécula de ARNm. Tales secuencias de nucleótidos así como las regiones codificantes y/o secuencias codificantes tal como se describió anteriormente pueden ser secuencias de nucleótidos que se producen de manera natural, mutagenizadas o sintetizadas, o una combinación de las mismas, y pueden identificarse y adaptarse mediante experimentos rutinarios conocidos por el experto en la técnica.

La presente invención se refiere además a una célula huésped bacteriana que comprende el plásmido de ADN tal como se describió anteriormente. El plásmido de ADN según la presente invención puede almacenarse y/o amplificarse en una célula huésped bacteriana que es competente para la transformación. Las células huésped competentes son células que tienen la capacidad de captar material genético extracelular libre tal como un plásmido de ADN independientemente de su secuencia. Las bacterias competentes de manera natural tienen la capacidad de unirse a material genético extracelular usando, por ejemplo, proteínas receptoras o complejos proteicos. Además, dichas células tienen la capacidad de transferir material genético desde el espacio extracelular a la célula usando, por ejemplo, péptidos, proteínas o complejos proteicos tales como una ADN translocasa. Una amplia gama de células bacterianas conocidas por el experto en la técnica puede captar de manera natural ADN exógeno a partir del entorno y, por tanto, pueden actuar como una célula huésped bacteriana según la presente invención. Además, las células huésped bacterianas competentes pueden obtenerse a partir de células bacterianas no competentes de manera natural usando, por ejemplo, electroporación o sustancias químicas tales como un tratamiento con iones de calcio acompañado de la exposición a temperatura elevada. Tras la captación, el plásmido de ADN preferiblemente ni se degrada ni se integra en la información genómica de la célula huésped bacteriana.

Las células huésped bacterianas incluyen células deEscherichia coli(E. coli)que son bien conocidas por el experto en la técnica. En las células deE. coli,la integración de material genético extracelular en el material genético de la célula huésped puede tener lugar en un proceso dependiente de RecA, es decir, un proceso que depende de la proteína RecA. Esta proteína es esencial para la reparación y el mantenimiento de ADN y está implicada en la recombinación homóloga. Por tanto, en algunas realizaciones, la célula huésped bacteriana según la presente invención es una célula deE. coli,preferiblemente una célula deE. coli recA~.Esto puede ser ventajoso para evitar la integración de la información genética comprendida en el plásmido de ADN según la presente invención en el material genético original de la célula deE. coli.

La presente invención se refiere además al uso de una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada tal como se definió anteriormente para preparar un plásmido de ADN que muestra una recombinación reducida durante la amplificación en una célula huésped bacteriana, en el que dicha secuencia de nucleótidos está ubicada en el sentido de 3' de una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm.

El plásmido de ADN según la presente invención puede prepararse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica. Preferiblemente, se corta un SCM comprendido en el plásmido de ADN usando una enzima de restricción específica del sitio y se ligan los extremos del plásmido de ADN generado a los extremos de la secuencia de ADN. Por tanto, la secuencia de ADN según la presente invención está preferiblemente terminada en ambos sitios por dicho SCM.

En cuanto a la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, la secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm, el plásmido de ADN y la reducción de la recombinación durante la amplificación de dicho plásmido de ADN en una célula huésped bacteriana, se aplica lo mismo que se ha descrito anteriormente en relación con el plásmido de ADN y la secuencia de ADN según la invención. Además, las demás características de un plásmido de ADN y una secuencia de ADN de este tipo también pueden ser tal como se describió anteriormente.

La presente invención se refiere además al uso de una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada tal como se definió anteriormente para reducir la recombinación durante la amplificación de un plásmido de ADN en una célula huésped bacteriana. Dicho de otro modo, una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada tal como se definió anteriormente puede usarse para reducir la recombinación durante la amplificación de un plásmido de ADN que contiene esta secuencia de nucleótidos en una célula bacteriana en comparación con el mismo plásmido de ADN pero con una secuencia que codifica para una cola de poli(A) convencional, en particular en comparación con el mismo plásmido de ADN en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) no contiene ningún elementos S. El plásmido de ADN es preferiblemente un plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la cola de poli(A) modificada está colocada en el sentido de 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la molécula de ARNm. Es particularmente ventajoso reducir la recombinación del plásmido reemplazando una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) convencional por una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada tal como se definió anteriormente.

En cuanto a la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, la secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm, el plásmido de ADN y la reducción de la recombinación durante la amplificación de dicho plásmido de ADN en una célula huésped bacteriana, se aplica lo mismo que se ha descrito anteriormente en relación con el plásmido de ADN según la invención. Además, las demás características de un plásmido de ADN de este tipo también pueden ser tal como se describió anteriormente.

La presente invención se refiere además a un método para reducir la recombinación de un plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una molécula de ARNm y, ubicada en el sentido de 3' de la misma, una cola de poli(A), durante la amplificación en una célula huésped bacteriana, en el que dicha reducción se logra reemplazando la parte de la secuencia de ADN que codifica para la cola de poli(A) por una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada tal como se definió anteriormente.

El reemplazo de una parte de la secuencia de ADN puede realizarse, por ejemplo, usando un SCM que flanquea dicha parte de la secuencia de ADN y la secuencia de nucleótidos que se usa para el reemplazo. Por tanto, el plásmido de ADN puede cortarse usando enzimas de restricción en dicho SCM e investigarse los fragmentos obtenidos usando, por ejemplo, electroforesis en gel o capilar. Usando dicho SCM, pueden ligarse entonces la parte del plásmido de a Dn que no contiene la parte de la secuencia de ADN que codifica para la cola de poli(A) y la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada.

En cuanto a la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, la secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm, el plásmido de ADN, la célula huésped bacteriana y la reducción de la recombinación durante la amplificación de dicho plásmido de ADN en una célula huésped bacteriana, se aplica lo mismo que se ha descrito anteriormente en relación con el plásmido de ADN según la invención. Además, las demás características de un plásmido de ADN de este tipo también pueden ser tal como se describió anteriormente.

La presente invención se refiere además a un método para producir un polirribonucleótido que comprende una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos y una cola de poli(A) modificada codificada por la secuencia de nucleótidos tal como se definió anteriormente, comprendiendo dicho método la etapa de producir dicho polirribonucleótido mediante transcripciónin vitroa partir de un plásmido de ADN según la invención.

En el presente documento, el término “polirribonucleótido” se refiere a una molécula de ARN monocatenaria. El polirribonucleótido según la presente invención comprende la molécula de ARNm codificada por la primera secuencia de nucleótidos y la cola de poli(A) modificada codificada por la segunda secuencia de nucleótidos. Dicho de otro modo, el polirribonucleótido comprende una 5' UTR, una secuencia codificante, opcionalmente una 3' UTR, y una cola de poli(A) modificada.

En una realización particularmente preferida, el polirribonucleótido comprende una 5' UTR con al menos un RBS y/o IRES, una secuencia codificante con codones optimizados, opcionalmente una 3' UTR con al menos una secuencia reguladora, y una cola de poli(A) modificada. Opcionalmente, el polirribonucleótido comprende nucleótidos adicionales distintos de nucleótidos A que siguen a la cola de poli(A) modificada, preferiblemente un nucleótido G. Esto puede prolongar la vida útil y, por tanto, la duración de acción del polirribonucleótido producido cuando se introduce en una célula, por ejemplo.

En cuanto a la 5' UTR, la secuencia codificante, la 3' UTR y la cola de poli(A) modificada, se aplica lo mismo que se ha descrito anteriormente. Además, las demás características de tales elementos genéticos también pueden ser tal como se describió anteriormente.

El polirribonucleótido según la presente invención puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente, el polirribonucleótido se transcribein vitrousando la secuencia de ADN según la presente invención como molde. La transcripciónin vitrorequiere un molde de ADN lineal purificado que contiene un promotor, trifosfatos de ribonucleótido, un sistema tampón y una ARN polimerasa apropiada tal como una ARN polimerasa T7. Por tanto, el plásmido de ADN según la invención se obtiene generalmente mediante lisis celular y se purifica. Luego se corta el plásmido de ADN purificado, por ejemplo, usando una enzima de restricción específica del sitio, i) antes del promotor que precede a la primera secuencia de nucleótidos y ii) directamente después de la segunda secuencia de nucleótidos que codifica para la cola de poli(A) modificada o, en el caso de que los nucleótidos adicionales no sean nucleótidos T, directamente después de dichos nucleótidos adicionales, preferiblemente después de un nucleótido C. Luego se usa la secuencia de molde lineal obtenida para la transcripciónin vitrodel polirribonucleótido según la presente invención en presencia de nucleótidos A, C, G y U usando protocolos convencionales de laboratorios. Dado que el molde se corta en las posiciones i) y ii), el molde para la transcripción termina exactamente con la cola de poli(A) modificada deseada o el nucleótido adicional deseado que no es un nucleótido T. Por tanto, pueden usarse ARN polimerasas que tengan o no tengan la capacidad de terminar la transcripción en una posición dada como, por ejemplo, permitiendo de ese modo la transcripción de salida (“run-off’).Por tanto, cortar el plásmido de ADN en la posición i) y ii) y usar la secuencia de nucleótidos generada como molde para la transcripción, preferiblemente para la transcripciónin vitro,garantiza la síntesis de polirribonucleótidos según la presente invención que comprenden una molécula de ARNm y una cola de poli(A) modificada de longitud definida. La cantidad y la calidad de los polirribonucleótidos transcritosin vitropueden medirse, por ejemplo, mediante espectrofotometría, electroforesis capilar y/o secuenciación.

En una realización preferida, el polirribonucleótido producido se modifica adicionalmente mediante la adición enzimática de una caperuza en 5' tal como una caperuza C1-m7G o una caperuza m7GpppG. Esto puede ser ventajoso para ajustar y/o prolongar la duración de acción del polirribonucleótido en una célula.

En algunas realizaciones de la presente invención, el polirribonucleótido se produce mediante transcripciónin vitroen presencia de nucleótidos no modificados y/o modificados. Dicho de otro modo, un polirribonucleótido tal como se describió anteriormente puede sintetizarse mediante transcripciónin vitrousando al menos una secuencia de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm y una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada según la presente invención como molde usando nucleótidos no modificados y/o modificados.

El término “nucleótido no modificado” usado en el presente documento se refiere a nucleótidos A, C, G, T y U tal como se describió anteriormente. Particularmente, en el caso de la transcripciónin vitrode un polirribonucleótido, dicho término se refiere a nucleótidos A, C, G y U. Estos últimos cuatro se denominan en el presente documento los cuatro tipos de nucleótidos comprendidos en un polirribonucleótido. El término “nucleótido modificado” usado en el presente documento se refiere a cualquier isómero que se produce de manera natural o químicamente sintetizado de los nucleótidos A, C, G, T y U, así como a cualquier nucleótido o isómero análogo, alternativo o modificado que se produce de manera natural o químicamente sintetizado de los mismos que tiene, por ejemplo, modificaciones químicas o residuos sustituidos. Los nucleótidos modificados pueden tener una modificación de base y/o una modificación de azúcar. Los nucleótidos modificados también pueden tener modificaciones de grupo fosfato, por ejemplo, con respecto a la caperuza en 5' de los polirribonucleótidos que comprenden una secuencia que codifica para una proteína. Los nucleótidos modificados también incluyen nucleótidos que se sintetiza de manera posterior a la transcripción mediante modificación covalente de los nucleótidos. Además, es posible cualquier mezcla adecuada de nucleótidos no modificados y modificados. En la bibliografía pueden encontrarse varios ejemplos no limitativos de nucleótidos modificados (por ejemplo, Cantaraet al.,Nucleic Acids Res, 2011, 39(Issue suppl_1):D195-D201; Helm y Alfonzo, Chem Biol, 2014, 21(2):174-185; Carellet al.,Angew Chem Int Ed Engl, 2012, 51 (29):7110-31) y algunos nucleótidos modificados preferibles se mencionan a modo de ejemplo a continuación basándose en su residuo de nucleósido respectivo: 1-metiladenosina, 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina, 2-metiladenosina, 2-O-ribosilfosfato de adenosina, N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina, N6-acetiladenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-metiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina, 1,2-O-dimetiladenosina, N6,2-O-dimetiladenosina, 2-O-metiladenosina, N6,N6,0-2-trimetiladenosina, 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina, 2-metiltio-N6-metiladenosina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, 2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina, N6-2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina, 7-metiladenosina, 2-metiltio-adenosina, 2-metoxi-adenosina, 2'-amino-2'-desoxiadenosina, 2'-azido-2'-desoxiadenosina,2'-fluoro-2'-desoxiadenosina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 7-desaza-adenosina, 7-desaza-8-aza-adenosina, 7-desaza-2-aminopurina, 7-desaza-8-aza-2-aminopurina, 7-desaza-2,6-diaminopurina, 7-desaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 2-tiocitidina, 3-metilcitidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 5-hidroxicitidina, lisidina, N4-acetil-2-O-metilcitidina, 5-formil-2-O-metilcitidina, 5,2-O-dimetilcitidina, 2-O-metilcitidina, N4,2-O-dimetilcitidina, N4,N4,2-O-trimetilcitidina, isocitidina, pseudocitidina, pseudoisocitidina, 2-tio-citidina, 2'-metil-2'-desoxicitidina, 2'-amino-2'-desoxicitidina, 2'-fluoro-2'-desoxicitidina, 5-yodocitidina, 5-bromocitidina y 2'-azido-2'-desoxicitidina, 2'-amino-2'-desoxicitidina, 2'-fluoro-2'-desoxicitidina, 5-aza-citidina, 3-metil-citidina, 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-l-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-I-metil-1-desaza-pseudoisocitidina, 1-metil-l-desaza-pseudoisocitidina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metil-citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-I-metil-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina; 1-metilguanosina, N2,7-dimetilguanosina, N2-metilguanosina, 2-O-ribosilfosfato de guanosina, 7-metilguanosina, hidroxiwybutosina, 7-aminometil-7-desazaguanosina, 7-ciano-7-desazaguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, N2,7,2-0- trimetilguanosina, N2,2-O-dimetilguanosina, 1,2-O-dimetilguanosina, 2-O-metilguanosina, N2,N2,2-O-trimetilguanosina, N2,N2J-trimetilguanosina, isoguanosina; 4-desmetilwyosina, epoxiqueuosina, hidroxiwybutosina inframodificada, hidroxiwybutosina inframodificada metilada, isowyosina, peroxiwybutosina, galactosil-queuosina, manosil-queuosina, queuosina, arqueosina, wybutosina, metilwyosina, wyosina, 7-aminocarboxipropildesmetilwyosina, 7-aminocarboxipropilwyosina, éster metílico de 7-aminocarboxipropilwyosina, 7-desaza-guanosina, 7-desaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-desaza-guanosina, 6-tio-7-desaza-8-azaguanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metilinosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metilguanosina, 8-oxoguanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, N2,N2-dimetil-6-tioguanosina, N1-metilguanosina, 2'-amino-3'-desoxiguanosina, 2'-azido-2'-desoxiguanosina, 2'-fluoro-2'-desoxiguanosina; 2-tiouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina, 3-metiluridina, 4-tiouridina, 5-metil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-carboximetiluridina, 5-carboximetilaminometiluridina, 5-hidroxiuridina, 5-metiluridina, 5-taurinometiluridina, 5-carbamoilmetiluridina, éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)uridina, dihidrouridina, 5-metildihidrouridina, 5-metilaminometil-2-tiouridina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)-2'-O-metiluridina, 5-(isopentenilaminometil)uridina, 5-(isopentenilaminometil)-2-tiouridina, 3,2-O-dimetiluridina, 5-carboximetilaminometil-2-O-metiluridina, 5-carbamoilhidroximetiluridina, 5-carbamoilmetil-2-O-metiluridina, 5-carbamoilmetil-2-tiouridina, 5-metoxicarbonilmetil-2-O-metiluridina, 5-(isopentenilaminometil)-2-O-metiluridina, 5,2-O-dimetiluridina, 2-O-metiluridina, 2-O-metil-2-tiouridina, 2-tio-2-O-metiluridina, ácido 5-oxiacético de uridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, éster metílico del ácido 5-oxiacético de uridina, 5-metoxiuridina, 5-aminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-metilaminometil-2-selenouridina, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina, 5-taurinometil-2-tiouridina, pseudouridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina, 1-metilpseudouridina, 3-metilpseudouridina, 2-O-metilpseudouridina, 5-formiluridina, 5-aminometil-2-geraniluridina, 5-taurinometiluridina, 5-yodouridina, 5-bromouridina, 2'-metil-2'-desoxiuridina, 2'-amino-2'-desoxiuridina, 2'-azido-2'-desoxiuridina y 2'-fluoro-2'-desoxiuridina; inosina, 1-metilinosina, 1,2-O-dimetilinosina y 2-O-metilinosina, 5-azauridina, 2-tio-5-aza-uridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetilpseudouridina, 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tiouridina, 1- taurinometil-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1-metil-pseudouridina, 4-tio-I-metil-pseudouridina, 2-tio-I-metilpseudouridina, 1-metil-l-desaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-l-desaza-pseudouridina, dihidropseudouridina, 2-tiodihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tiouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina; lo más preferiblemente pseudo-uridina, N1-metil-pseudo-uridina, 2'-fluoro-2'-desoxicitidina, 5yodocitidina, 5-metilcitidina, 2-tiouridina, 5-yodouridina y/o 5-metil-uridina.

El término “nucleótido modificado” comprende nucleótidos que contienen isótopos tales como deuterio. El término “isótopo” se refiere a un elemento que tiene el mismo número de protones pero un número diferente de neutrones, lo que da como resultado números másicos diferentes. Por tanto, los isótopos de hidrógeno, por ejemplo, no se limitan al deuterio, sino que también incluyen el tritio. Además, el polirribonucleótido también puede contener isótopos de otros elementos incluyendo, por ejemplo, carbono, oxígeno, nitrógeno y fósforo. También es posible que los nucleótidos modificados estén deuterados o contengan otro isótopo de hidrógeno o de oxígeno, carbono, nitrógeno o fósforo.

En el caso de que un polirribonucleótido según la presente invención se produzca mediante transcripciónin vitroen presencia de los cuatro tipos de nucleótidos, es decir nucleótidos A, C, G y U, el número total de tipos de nucleótidos modificados puede ser de 0, 1, 2, 3 o 4. Dicho de otro modo, en algunas realizaciones, al menos un nucleótido de un tipo de nucleótido, por ejemplo, al menos un nucleótido U, puede ser un nucleótido modificado. En algunas realizaciones, al menos un nucleótido de dos tipos de nucleótidos en total, por ejemplo, al menos un nucleótido U y al menos un nucleótido C, puede ser un nucleótido modificado. En algunas realizaciones, al menos un nucleótido de tres tipos de nucleótidos en total, por ejemplo, al menos un nucleótido G, al menos un nucleótido U y al menos un nucleótido C, puede ser un nucleótido modificado. En algunas realizaciones, al menos un nucleótido de los cuatro tipos de nucleótidos puede ser un nucleótido modificado. En todas estas realizaciones, uno o más nucleótidos por tipo de nucleótido puede estar modificado, siendo el porcentaje de dichos nucleótidos modificados por tipo de nucleótido del 0 %, el 2,5 %, el 5 %, el 7,5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 100 %.

En algunas realizaciones, el porcentaje total de nucleótidos modificados comprendidos en el polirribonucleótido según la presente invención es del 0 %, el 2,5 %, el 5 %, el 7,5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 100 %. Preferiblemente, el polirribonucleótido según la invención está caracterizado porque del 5 al 30 % de los nucleótidos U y del 5 al 30 % de los nucleótidos C están modificados. Dichos nucleótidos U modificados son preferiblemente 5-yodouridina y dichos nucleótidos C modificados son preferiblemente 5-yodocitidina.

Más preferiblemente, el polirribonucleótido según la invención está caracterizado porque del 7,5 al 25 % de los nucleótidos U y del 7,5 al 25 % de los nucleótidos C están modificados. Dichos nucleótidos U modificados son preferiblemente 5-yodouridina y dichos nucleótidos C modificados son preferiblemente 5-yodocitidina.

La presente invención se refiere además a un polirribonucleótido que puede obtenerse mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

Tal como se describió anteriormente, el polirribonucleótido según la presente invención comprende una 5' UTR, una secuencia codificante, opcionalmente una 3' UTR, y una cola de poli(A) modificada codificada por las secuencias de nucleótidos primera y segunda. Preferiblemente, el polirribonucleótido comprende una 5' UTR con al menos un RBS y/o IRES, una secuencia codificante con codones optimizados, opcionalmente una 3' UTR con al menos una secuencia reguladora, y una cola de poli(A) modificada. Además, el polirribonucleótido puede comprender opcionalmente un nucleótido adicional distinto de nucleótidos A que sigue a la cola de poli(A) modificada, preferiblemente un nucleótido G.

En cuanto al polirribonucleótido y a los métodos para obtener dicho polirribonucleótido, se aplica lo mismo que se describió anteriormente en relación con la secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm y la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, la molécula de ARNm y la cola de poli(A) modificada, así como los métodos para producir un polirribonucleótido que comprende una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos y una cola de poli(A) modificada según la presente invención. Además, las demás características de un polirribonucleótido de este tipo pueden ser tal como se describió anteriormente.

En algunas realizaciones, el polirribonucleótido tal como se describió anteriormente comprende uno o más tipos de nucleótidos modificados. Esto puede ser ventajoso para reducir la inmunogenicidad en el caso de transfectar una célula con dicho polirribonucleótido. Además, puede ser ventajoso para potenciar la cantidad de secuencia de aminoácidos que puede obtenerse mediante dicho polirribonucleótido en una célula.

En cuanto al polirribonucleótido y a los métodos para obtener dicho polirribonucleótido, se aplica lo mismo que se describió anteriormente en relación con la secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm y la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, la molécula de ARNm y la cola de poli(A) modificada, así como los métodos para producir un polirribonucleótido que comprende una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos y una cola de poli(A) modificada usando nucleótidos modificados según la presente invención. Además, las demás características de un polirribonucleótido de este tipo también pueden ser tal como se describió anteriormente.

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que contiene un polirribonucleótido tal como se describió anteriormente junto con un portador farmacéuticamente aceptable. El polirribonucleótido se incluye preferiblemente en una cantidad eficaz, es decir, una cantidad suficiente para inducir una respuesta terapéutica detectable en el sujeto al que se le administra la composición farmacéutica. El polirribonucleótido o la composición farmacéutica de la invención puede estar en disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles, así como en cremas y supositorios, pero también puede tener la forma de polvos, comprimidos o aerosoles.

El término “portador farmacéuticamente aceptable” usado en el presente documento se refiere a compuestos químicos, materiales, componentes y/o composiciones que, dentro del alcance del juicio médico razonable, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, compatible con una relación beneficio/riesgo razonable. Por tanto, un portador farmacéuticamente aceptable es una sustancia inactiva formulada junto con la sustancia farmacéuticamente activa para facilitar su manipulación en vista de las consideraciones de dosificación, adsorción, solubilidad o farmacocinética.

En la técnica se conocen bien ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables adecuados, e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, tampón, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes y disoluciones estériles. En particular, los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos tales como oleato de etilo. Los ejemplos adicionales de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución de Ringery disolución de dextrosa, citrato, fosfato y otros ácidos orgánicos; contraiones formadores de sales, por ejemplo, sodio y potasio; polipéptidos de bajo peso molecular (> 10 residuos de aminoácido); proteínas, por ejemplo, albúmina sérica o gelatina; polímeros hidrófilos, por ejemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como histidina, glutamina, lisina, asparagina, arginina, o glicina; hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; monosacáridos; disacáridos; otros azúcares, por ejemplo, sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; agentes quelantes, por ejemplo, EDTA; tensioactivos no iónicos, por ejemplo, monolaurato de polioxietilen-sorbitano disponible en el mercado con el nombre comercial Tween, propilenglicol, Pluronics o polietilenglicol; antioxidantes incluyendo metionina, ácido ascórbico y tocoferol; y/o conservantes, por ejemplo, cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, por ejemplo, metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados y sus formulaciones se describen con mayor detalle en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1985, Mack Publishing Co. Además, también pueden estar presentes conservantes, estabilizadores y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, nanosistemas o liposomas, y similares.

La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a través de una amplia gama de clases de formas de administración conocidas por el experto, tales como inyección por aguja, el uso de inhaladores, cremas, espumas, geles, lociones y pomadas. La dosis y la duración de acción dependen de la función que va a cumplir dicho polirribonucleótido y debe ajustarse intencionadamente en cada caso. La duración de acción será lo más larga posible, por ejemplo, si dicho polirribonucleótido se usa para terapia prolongada de una enfermedad debido a un gen deficiente, mientras que con otras indicaciones puede ajustarse a un intervalo de tiempo específico. Además, es posible la administración sistémica de dichos uno o más polirribonucleótidos tal como se describió anteriormente.

En cuanto al polirribonucleótido, se aplica lo mismo que se describió anteriormente en relación con la secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm y la secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, así como los métodos para producir un polirribonucleótido que comprende una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos y una cola de poli(A) modificada y los polirribonucleótidos según la presente invención. Además, las demás características de un polirribonucleótido de este tipo también pueden ser tal como se describió anteriormente.

Figura 1: Cuantificación de la recombinación de colas de poli(A) basándose en el porcentaje de clones recombinantes para los constructos poli(A)120, poli(A)3x40_6 y poli(A)2x60_6.

Figura 2: Cuantificación de la recombinación de colas de poli(A) basándose en el porcentaje de clones recombinantes usando un espaciador de un nucleótido diferente.

Figura 3: Determinación de la actividad de la proteína luciferasa y cinética de degradación del ARNm de diferentes constructos de poli(A) 24 h tras la transfección (250 ng/pocillo) en células A549. (a) Actividad luciferasa en lisados proteicos de células A549 transfectadas con diferentes constructos de poli(A). (b) Cuantificación de ARNm de luciferasa en células A549. (c) La productividad de ARNm se calculó dividiendo los valores de luminiscencia de la luciferasa (ULR; a) entre las cantidades de ARNm (datos de qPCR en tiempo real; b) y normalizando estas razones con respecto a las observadas con el constructo de poli(A)120. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de ANOVA bilateral con valores de p: *p<0,5, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001, n=6.

Figura 4: Cuantificación de los niveles de proteína eritropoyetina humana (hEPO) secretada tal como se mide mediante ELISA en los sobrenadantes de células HEK293 transfectadas o bien con constructo poli(A)i20 o bien con constructo poli(A)2*60_6 24 h tras la transfección (250 ng/pocillo). Los valores representan la media ± desviación estándar de tres réplicas. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de ANOVA bilateral con valores de p: **p<0,01, ***p<0,001, n=3.

Figura 5: Determinación de la actividad de la proteína luciferasa y cuantificación de ARNm de diferentes constructos de cola de poli(A) 24 h tras la transfección (250 ng/pocillo) en células A549. (a) Actividad luciferasa en lisados proteicos de células A549 transfectadas con diferentes constructos de cola de poli(A), (b) Cuantificación de ARNm de luciferasa en células A549 transfectadas con diferentes constructos de cola de poli(A), (c) La productividad de ARNm de luciferasa se calculó dividiendo los valores de luminiscencia de la luciferasa (ULR; a) entre las cantidades de ARNm (datos de qPCR en tiempo real; b) y normalizando estas razones con respecto a las observadas con el constructo poli(A)i20. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de ANOVA bilateral con valores de p: *p<0,5, ****p<0,0001, n=6.

Otros aspectos y ventajas de la invención se describirán en los siguientes ejemplos, que se proporcionan con fines de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplos

En el presente documento se describen métodos y materiales para su uso en la presente divulgación; también pueden usarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos.

Las abreviaturas usadas en el presente documento y sus descripciones respectivas se enumeran en la tabla 2. Tabla 2

Materiales y métodos

Materiales, dispositivos, software y sistema de prueba usados

Los materiales se enumeran en la tabla 3.

Tabla 3

Los dispositivos se enumeran en la tabla 4.

Tabla 4

El software se enumera en la tabla 5.

Tabla 5

El sistema de prueba se enumera en la tabla 6.

Tabla 6

Preparación de plásmidos

Se introdujeron secuencias de cola de poli(A) sintéticas en una estructura principal de vector pUC57-kanamicina o bien como oligonucleótidos complementarios hibridados o bien como fragmentos creados mediante una estrategia basada en PCR. Se diseñó un conjunto específico de oligonucleótidos complementarios para las secuencias que comprendía constructos poli(A)2x60_6 y constructos poli(A)3x40_6 y se hibridaron. Los constructos de poli(A) sintéticos poli(A)i20, poli(A)2x60_c, poli(A)2x60_G y poli(A)2x60_T se crearon mediante PCR.

Se hibridaron los dos conjuntos de oligonucleótidos complementarios de la siguiente manera: se mezclaron 100 |iM de cada oligonucleótido con 40 |il de tampón de hibridación y se incubaron durante 5 min a 95 °C (Tris HCl 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). Después de la reacción, se dejó enfriar la mezcla hasta temperatura ambiente antes de proceder con la digestión de restricción (BglIl-BstBI).

Para el alto rendimiento de la reacción de PCR, se usó mezcla maestra para PCR de alta fidelidad Phusion. Además de la mezcla maestra que contenía ADN polimerasa Phusion 2x, se añadieron a la reacción nucleótidos y tampón de reacción optimizado que incluía MgCl2, 0,5 |iM de cebador directo e inverso, DMSO al 3 % y 100 ng de ADN molde. El volumen total de 25 |il por reacción se desnaturalizó inicialmente a 98 °C durante 30 s, seguido de 30 ciclos a 98 °C durante 10 s, hibridación a 72 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 30 s/kb. La extensión final se realizó a 72 °C durante 10 min. El tamaño del producto de PCR se confirmó en gel de agarosa al 1 %, y se purificó la banda deseada usando el kit de gel NucleoSpin y limpieza para PCR. El producto de PCR purificado se digirió conNhel-BstBIy se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.

Después de la digestión con enzimas de restricción de los oligonucleótidos hibridados (BglIl-BstBI)y los fragmentos de PCR (Nhel-BstBI),se clonaron los constructos de cola de poli(A) en vectores pUC57-kanamicina digeridos por consiguiente que comprendían la región codificante de elección (luciferasa de luciérnaga, hEPO, d2EGFP).

Se muestra una lista de secuencias de poli(A) segmentadas y la estrategia de clonación correspondiente con conjuntos de cebadores de PCR u oligonucleótidos en la tabla 7.

Tabla 7

Clonación en E. coli

Las ligaciones se purificaron usando precipitación en cloroformo-etanol y se sometieron a electroporación en la cepa DH10B deE. coli.Para la electroporación, se usó el dispositivo Gene Pulser II de Biorad. Las condiciones de electroporación seguidas fueron: 25<p>F, 200 ohm, 1,8 kV. Tras la electroporación, las bacterias se hicieron crecer en 2 ml de medio LB a 30 °C durante 1,5 horas. Posteriormente, se centrifugó el cultivo a 5000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 200<p>l de medio LB nuevo. A partir de este, se sembraron 100 |il en placas de LB-agar que contenían el antibiótico apropiado (kanamicina a una concentración final de 50 |ig/ml o ampicilina a una concentración final de 100 |ig/ml). Las placas se incubaron durante la noche a 30 °C.

Preparación de plásmidos usando el kit Mini-Prep

Los clones se inocularon en medio LB que contenía el antibiótico apropiado (kanamicina a una concentración final de 50 |ig/ml o ampicilina a una concentración final de 100 |ig/ml) y se hicieron crecer a 30 °C durante la noche en un agitador bacteriano (250 rpm). Posteriormente se aislaron los plásmidos a partir de los cultivos durante la noche usando el kit Mini-Prep. Se sometieron a prueba los plásmidos para determinar el inserto usando digestión de restricción y se confirmó mediante secuenciación. Para los clones correctos, se prepararon reservas de glicerol mediante la adición de 200 |il de glicerol esterilizado en autoclave a 800 |il de cultivo bacteriano durante la noche. Las reservas de glicerol se almacenaron a -80 °C.

Preparación de plásmidos usando el kit Maxi-Prep

El plásmido para la producción de ARN se preparó usando el kit Maxi-Prep. Se inoculó la reserva de glicerol del/de los clon(es) deseado(s) en 5 ml de medio LB que contenía antibióticos apropiados (kanamicina a una concentración final de 50 |ig/ml o ampicilina a una concentración final de 100 |ig/ml) y se hizo crecer el cultivo durante la noche a 30 °C en un agitador bacteriano (250 rpm). Se usaron 3 ml de este cultivo iniciador para inocular 300 ml de medio LB que contenía el antibiótico apropiado (kanamicina a una concentración final de 50 |ig/ml o ampicilina a una concentración final de 100 |ig/ml) que posteriormente se incubó durante la noche a 30 °C en un agitador bacteriano (250 rpm). Se centrifugó el cultivo durante la noche a 5000 rpm, 4 °C durante 30 min. Se descartó el sobrenadante y se usó el sedimento bacteriano para aislar el plásmido.

Generación de ARNm

Para generar ARNm transcritoin vitro,los plásmidos se linealizaron mediante digestión conBstBIy se purificaron mediante extracción con cloroformo y precipitación en etanol. Los plásmidos lineales purificados se usaron como molde para la transcripciónin vitro.Los moldes de plásmido (0,5 |ig/|il) se sometieron a transcripciónin vitrousando 3 U/|il de ARN polimerasa T7, tampón de transcripción II, 1 U/|il de inhibidor de ARNasa RiboLock, 0,015 U/|il de pirofosfatasa inorgánica 1 con una elección definida de ribonucleótidos. Se incubó la mezcla de IVT completa a 37 °C durante 2 h. Después de eso, se añadieron 0,01 U/|il de ADNasa I durante 45 min adicionales a 37 °C para retirar el molde de plásmido. Se precipitó el ARN con acetato de amonio a una concentración final de 2,5 mM, seguido de dos etapas de lavado con etanol al 70 %. Se resuspendió el sedimento en agua para preparaciones inyectables. Se añadió enzimáticamente una estructura de caperuza C1-m7G mediante 0,5 mM de enzima de adición de caperuza del virus de la vacuna al extremo 5' del transcrito previamente desnaturalizado (1 mg/ml) a 80 °C durante 5 min. La mezcla de reacción de adición de caperuza también contenía tampón de adición de caperuza 1x, GTP 0,5 mM, S-metiladenosina 0,2 mM, 2,5 U/|il de caperuza de ARNm 2'-o-metiltransferase y 1 U/|il de inhibidor de ARNasa RiboLock. Se incubó la mezcla de adición de caperuza durante 60 min a 37 °C, seguido de la precipitación del ARN con acetato de amonio a una concentración final de 2,5 mM y dos etapas de lavado con etanol al 70 %. Se resuspendió el sedimento en agua para preparaciones inyectables.

Se midieron espectrofotométricamente la calidad y la concentración del ARN en un dispositivo NanoDrop2000C. Se determinaron su peso y pureza correctos a través de electroforesis capilar automática.

Cultivo celular

Las células A549 (ACC-107) y HEK293 (ACC-305) se adquirieron de DSMZ. Todas las células se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) con Glutamax. Los medios se complementaron con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Las células se cultivaron en una incubadora del 5 % de CO<2>humidificada a 37 °C.

Transfección in vitro

Ambas líneas celulares, A549 y HEK293, se transfectaron con 250 ng de ARNm por pocillo. Las células A549 y HEK293 se sembraron a una densidad de 2*104 células/pocillo y 4*104 células/pocillo, respectivamente, en una placa de 96 pocillos, con el propósito de un ensayo ELISA de hEPO y luciferasa de luciérnaga. 24 horas tras la siembra, las células se transfectaron usando el reactivo de transfección comercial Lipofectamine® 2000. Se prepararon complejos a una razón de 2 |il de Lipofectamine® 2000 por 1 |ig de ARNm.

El ARNm se diluyó 1:20 en agua, y Lipofectamine® 2000 1:10 por separado en MEM libre de suero. El ARNm se añadió a la disolución de Lipofectamine® 2000 seguido de un tiempo de incubación de 20 min a TA. La concentración de la disolución de ARNm/Lipofectamine® 2000 final era de 25 ng/|il, y se realizó una dilución 1:2 en serie. Se añadieron 10 |il de la disolución de complejo a las células y se incubaron las células durante 24 y 48 h, respectivamente. Para cada constructo de ARNm, se prepararon tres o seis réplicas.

Análisis por citometría de flujo para d2EGFP

Las células se lavaron con PBS, se desprendieron con TryμLE y se resuspendieron en tampón de citometría de flujo (PBS complementada con FBS al 10 %). Poco antes de la medición, las células se tiñeron con yoduro de propidio para la discriminación entre células vivas y muertas (1 |ig/ml). Las células vivas (>97 %) se activaron adicionalmente para discriminar entre células que expresan d2EGFP y aquellas que no. El análisis se realizó en un citómetro de enfoque acústico Attune con el software Attune Cytometric (versión 2.1) y FlowJo (versión 10).

Ensayo de luciferasa de luciérnaga

Para la detección de la actividad luciferasa de luciérnaga, el ensayo se realizó 24 h tras la transfección. En el punto de tiempo apropiado, las células se lavaron con PBS, seguido de la adición de 100 |il de tampón de lisis (Tris-HCl 25 mM, Triton X-100 al 0,1 %, pH 7,4). Las células se agitaron durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la lisis, se usaron 50 |il del lisado celular para medir la actividad luciferasa a través de la emisión de luminiscencia de fotones durante 5 s usando el dispositivo InfiniteR 200 PRO. Se cuantificó la cantidad de proteína en cada muestra en 5 |il del lisado celular con el ensayo de proteínas BioRad, usando albúmina sérica bovina como patrón. Los valores de luciferasa se normalizaron con respecto a la concentración de proteína.

Aislamiento y transcripción inversa del ARN

Con el fin de determinar la cantidad real de ARNm 24 h tras la transfección, se sometieron a lisis las células cultivadas (A549, HEK293) y se aisló el ARN según el protocolo del fabricante usando el kit de lisis celular SingleShot. A partir de los lisados (1 |ig de ARN), se sintetizó ADNc usando el kit de síntesis de ADNc iScript Select con cebadores oligo(dT) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc sintetizado se almacenó a -20 °C.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa(qPCR) en tiempo real

La qPCR en tiempo real se realizó con sondas de hidrólisis cortas para las dianas d2EGFP y luciferasa (biblioteca universal de sondas n.° 37 y n.° 29) en un dispositivo Roche LightCycler 96. Se usaron los siguientes cebadores para d2EGFP: 5'-cctgaagttcatctgcacca-3' y 5'-ctcgtgaccaccctgacc-3'; y para la diana luciferasa: 5'-acgccgagtacttcgagatg-3' y 5'-attcagcccatagcgcttc-3'. Se calcularon los valores absolutos de ARNm mediante interpolación a partir de la curva de calibración.

Análisis estadístico

Cada experimento se realizó con al menos tres réplicas técnicas por muestra. Los resultados se muestran como medias ± DE a menos que se indique lo contrario. El análisis estadístico se realizó usando el software GraphPad Prism (versión 6). Se sometió a prueba la distribución normal de los datos usando la prueba general de normalidad de D'Agostino-Pearson. Se llevaron a cabo comparaciones múltiples mediante ANOVA bilateral, seguido de la prueba de Sidak (comparación de datos emparejados) o la prueba de Dunett (comparación de muchos con uno). Un valor de p ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Las colas de poli(A) segmentadas reducen drásticamente la recombinación bacteriana

Se examinó si el uso de colas de poli(A) segmentadas afectaba a la recombinación de plásmidos tras la transformación enE. coli.Para ello, se combinaron secuencias de marco de lectura abierto de diferentes genes (luciferasa, d2EGFP, hEPO) con cualquiera de los tres constructos de poli(A), poli(A)120, poli(A)2x60_6 y poli(A)3x40_6, y se clonaron en un vector pUC57-kanamicina. Tras la transformación enE. coli,se cribaron los clones para determinar el inserto y se cribaron adicionalmente los clones positivos que contenían el inserto deseado para determinar la longitud de la cola de poli(A) respectiva. Para cada uno de los tres constructos de cola de poli(A), la cola de poli(A) se digirió con enzimas de restricción y las digestiones se resolvieron en un analizador de fragmentos (electroforesis en gel capilar) para medir el tamaño de la cola de poli(A) respectiva. Se observó recombinación en la cola de poli(A) para más del 50 % de los clones que contenían la cola de poli(A) homóloga, poli(A)120. Al dividir la cola de poli(A) o bien en poli(A)3x40_6 o bien en poli(A)2x60_6, la recombinación enE. colipudo reducirse significativamente con la mayoría de los clones estables (≤20 % de recombinación) obtenidos con plásmidos que contenían poli(A)2x60_6 (figura 1; tabla 8). Esta tendencia se observó para las tres secuencias de marco de lectura abierto sometidas a prueba, lo que indica que esta reducción en la recombinación es independiente de la secuencia. El efecto más favorable se observó para los constructos poli(A)2x60_6 con una recombinación del 20 % o menos. Tabla 8

Efecto de un espaciador de un nucleótido de longitud dentro de una cola de pol((A) sobre la recombinación

Se examinó el efecto de un espaciador de un nucleótido de longitud en un constructo poli(A)<2>x<60>(C, T o G) sobre la recombinación enE. coliinvestigando clones que comprendían la secuencia de marco de lectura abierto de la luciferasa de luciérnaga y el constructo poli(A)<2>x<60>_C, poli(A)<2>x<60>_G o poli(A)<2>x<60>_T respectivo. Curiosamente, los constructos que comprendían G como espaciador en la cola de poli(A) no se recombinaron en absoluto. Un espaciador con una única T se recombinó en el 10 % de los casos, y aquel con una C como nucleótido espaciador se recombinó en el 50 % de los casos (figura 2), que a primera vista parece ser comparable a las eficiencias de recombinación observadas con A<120>(figura 1), pero aun así es significativamente más baja. Esto resulta evidente a partir de la siguiente tabla 9, que resume las eficiencias de recombinación observadas para los constructos sometidos a prueba en las figuras 1 y 2.

Tabla 9

Efecto de un espaciador de seis nucleótidos de longitud sobre los niveles de ARNm y proteína

Se investigó la degradación de la proteína luciferasa y del ARNm en células A549 24 h tras la transfección con ARNm de luciferasa, que contenía uno cualquiera de los constructos poli(A)2x60_6, poli(A)3x40_6 o poli(A)i20. El uso del constructo poli(A)2x60_6 segmentado aumentó significativamente los niveles de proteína tras la transfección en comparación con la referencia poli(A)i20 (figura 3). No se observaron diferencias significativas entre las cantidades de ARNm para los diferentes ARNm de luciferasa que contienen formatos de poli(A) entre las modificaciones.

Además, se sometieron a prueba los efectos de la segmentación de poli(A) sobre la transcripción y la traducción de una diana fisiológica usando eritropoyetina humana (hEPO) como prototipo de proteínas secretoras y ARNm cortos (0,9 kb). Se clonó la secuencia con codones optimizados que codifica para hEPO en un vector pUC57-kanamicina en el sentido de 5' de uno cualquiera de los constructos poli(A)i20 o poli(A)2x60_6. Se determinaron las concentraciones de proteína hEPO mediante ELISA 24 h tras la transfección (figura 4). Se observó una diferencia significativa entre los dos constructos de cola de poli(A) comparados, dando lugar el constructo poli(A)2x60_6 significativamente más proteína en comparación con el constructo poli(A)i20 de referencia.

Efecto de un espaciador de un nucleótido de longitud sobre los niveles de ARNm y proteína

Se sometió a prueba el efecto de un solo nucleótido espaciador dentro de una cola de poli(A)2x60 sobre la expresión de proteínas y la productividad de ARNm. Se determinaron la expresión de ARNm de luciferasa y la actividad de proteína transfectando células A549 con constructos de ARNm que contenían un solo nucleótido espaciador, C, T o G, dentro de la cola de poli(A)2x60 respectiva. Como referencia, se usó el constructo poli(A)i20 patrón. Entre los tres constructos de espaciador de un solo nucleótido, no hubo ninguna diferencia significativa en la expresión de proteínas, pero todos ellos dieron como resultado significativamente más proteína en comparación con el constructo poli(A)i20 (figura 5). Al calcular la productividad de ARNm, parece que el constructo con una C como espaciador tiene la productividad más alta en general. La productividad de ARNm de poli(A)i20 fue significativamente más baja en comparación con la de cualquiera de los tres constructos segmentados sometidos a prueba, poli(A)2x60_C, poli(A)2x60_G, poli(A)2x60_T.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN que contiene

(i) una primera secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm y, ubicada en el sentido de 3' de la misma,

(ii) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada, en el que dicha segunda secuencia de nucleótidos está caracterizada porque consiste en

(a) al menos dos elementos A definidos, cada uno, como una secuencia de nucleótidos que consiste en de 55 a 65 nucleótidos T, y

(b) al menos un elemento S, consistiendo cada elemento S en

(b1) un nucleótido que no es un nucleótido T, o

(b2) 6 nucleótidos, en el que cada uno de los dos nucleótidos terminales no es un nucleótido T;

en el que el número total de elementos A es uno más que el número total de elementos S, y

en el que cualesquiera dos elementos A están separados por un elemento S.

2. El plásmido de ADN según la reivindicación 1, en el que uno cualquiera de dichos elementos S consiste en un nucleótido C o un nucleótido A, preferiblemente un nucleótido C.

3. El plásmido de ADN según la reivindicación 1 o 2, en el que el número de elementos A es dos, tres o cuatro.

4. El plásmido de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el número de elementos A es cuatro y en el que dichas secuencias de nucleótidos de los cuatro elementos A, juntas, tienen una longitud global de 240 nucleótidos, teniendo preferiblemente cada elemento A una longitud de 60 nucleótidos.

5. El plásmido de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el número de elementos A es dos y en el que dichas secuencias de nucleótidos de los dos elementos A, juntas, tienen una longitud global de 120 nucleótidos, teniendo preferiblemente cada elemento A una longitud de 60 nucleótidos.

6. Una célula huésped bacteriana que comprende el plásmido de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. La célula huésped bacteriana según la reivindicación 6, que e s una célula deE. coli,preferiblemente una célula deE. coli recA~.

8. Uso de una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada tal como se define en la reivindicación 1 (ii) y en las reivindicaciones 2 a 5 para preparar un plásmido de ADN que muestra una recombinación reducida durante la amplificación en una célula huésped bacteriana, en el que dicha secuencia de nucleótidos está ubicada en el sentido de 3' de una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de ARNm.

9. Uso de una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada tal como se define en la reivindicación 1 (ii) y en las reivindicaciones 2 a 5 para reducir la recombinación durante la amplificación de un plásmido de ADN en una célula huésped bacteriana.

10. Un método para reducir la recombinación de un plásmido de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una molécula de ARNm y, ubicada en el sentido de 3' de la misma, una cola de poli(A), durante la amplificación en una célula huésped bacteriana, en el que dicha reducción se logra reemplazando la parte de la secuencia de ADN que codifica para la cola de poli(A) por una secuencia de nucleótidos que codifica para una cola de poli(A) modificada tal como se define en la reivindicación 1 (ii) y en las reivindicaciones 2 a 5.

11. Un método para producir un polirribonucleótido que comprende una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos y una cola de poli(A) modificada codificada por la secuencia de nucleótidos tal como se define en la reivindicación 1 (ii) y en las reivindicaciones 2 a 5, comprendiendo dicho método la etapa de producir dicho polirribonucleótido mediante transcripciónin vitroa partir de un plásmido de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12.El método según la reivindicación 11, en el que dicho polirribonucleótido se produce mediante transcripciónin vitroen presencia de nucleótidos no modificados y/o modificados.

13. Un polirribonucleótido que puede obtenerse mediante el método según la reivindicación 11 o 12.

14. El polirribonucleótido según la reivindicación 13, en el que el polirribonucleótido comprende uno o más tipos de nucleótidos modificados.

15. Una composición farmacéutica que contiene un polirribonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14 junto con un portador farmacéuticamente aceptable.