DE202015009961U1 - Artifizielle Nukleinsäuremoleküle für eine verbesserte Proteinexpression - Google Patents

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Abstract

Artifizielles Nukleinsäuremolekül, umfassend
a) mindestens einen offenen Leserahmen (ORF); und
b) eine 3'-untranslatierte Region (3'-UTR), umfassend
mindestens zwei separate Poly(A)-Sequenzen, wobei eine Poly(A)-Sequenz eine Sequenz aus 20 bis 400 Adenin-Nukleotiden ist und wobei die Gesamtzahl an Adenin-Nukleotiden, die von den mindestens zwei separaten Poly(A)-Sequenzen umfasst werden, mindestens 70 beträgt, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül ein mRNA-Molekül ist, das mindestens einen offenen Leserahmen aufweist, der für ein Antigen kodiert, das von einem mit einer Infektionskrankheit assoziierten viralen Pathogen abgeleitet ist,
zur Verwendung als Medikament, zur Verwendung als Vakzine oder zur Verwendung in der Gentherapie,
wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül mit einer kationischen oder polykationischen Verbindung assoziiert oder komplexiert ist, und
wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül, das Medikament oder die Vakzine intramuskulär verabreicht wird.

Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die Erfindung wird durch die angefügten Ansprüche definiert und betrifft ein artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung wie in den Ansprüchen definiert, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül einen offenen Leserahmen und eine 3'-UTR umfasst, die mindestens zwei getrennte Poly(A)-Sequenzen umfasst und wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine mRNA ist. Die Erfindung betrifft ferner eine Zelle, die das artifizielle Nukleinsäuremolekül umfasst, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das artifizielle Nukleinsäuremolekül umfasst, und ein Kit, das das artifizielle Nukleinsäuremolekül, die Zelle oder die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer 3'-UTR für ein Verfahren zur Erhöhung der Proteinproduktion von einem artifiziellen Nukleinsäuremolekül.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Gentherapie und genetische Vakzinierung gehören zu den vielversprechendsten und sich schnell entwickelnden Verfahren der modernen Medizin. Sie bieten hochspezifische und individuelle Möglichkeiten zur Therapie einer Vielzahl von Krankheiten. Insbesondere genetisch bedingte Erbkrankheiten, aber auch Autoimmunerkrankungen, Krebs- oder Tumorerkrankungen sowie entzündliche Erkrankungen können Gegenstand solcher Behandlungsansätze sein. Es ist auch vorgesehen, das (frühe) Auftreten solcher Krankheiten durch diese Ansätze zu verhindern.
  • Das wichtigste konzeptionelle Grundprinzip der Gentherapie ist die geeignete Modulation einer gestörten Genexpression, die mit pathologischen Zuständen bestimmter Krankheiten einhergeht. Eine pathologisch veränderte Genexpression kann dazu führen, dass wesentliche Genprodukte, zum Beispiel Signalfaktoren, wie beispielsweise Hormone, Housekeeping-Faktoren, Stoffwechselenzyme, Strukturproteine oder dergleichen, fehlen oder überproduziert werden. Eine veränderte Genexpression kann nicht nur auf eine Fehlregulation der Transkription und/oder Translation zurückzuführen sein, sondern auch auf Mutationen innerhalb des ORF, der für ein bestimmtes Protein kodiert. Pathologische Mutationen können zum Beispiel durch Chromosomenaberrationen oder durch spezifischere Mutationen, wie beispielsweise Punkt- oder Frame-Shift-Mutationen verursacht werden, die alle zu einer eingeschränkten Funktionalität und möglicherweise zu einem vollständigen Funktionsverlust des Genprodukts führen. Es kann jedoch auch zu einer Fehlregulierung der Transkription oder Translation kommen, wenn Mutationen Gene betreffen, die für Proteine kodieren, die an der Transkriptions- oder Translationsmaschinerie der Zelle beteiligt sind. Solche Mutationen können zu einer pathologischen Hoch- oder Herunterregulierung von Genen führen, die als solche funktionell sind. Gene, die für Genprodukte kodieren, die solche regulierenden Funktionen ausüben, können zum Beispiel Transkriptionsfaktoren, Signalrezeptoren, Botenproteine oder dergleichen sein. Der Funktionsverlust solcher Gene, die für regulatorische Proteine kodieren, kann jedoch unter Umständen durch die artifizielle Einführung anderer Faktoren, die weiter stromabwärts des beeinträchtigten Genprodukts wirken, rückgängig gemacht werden. Solche Gendefekte können auch durch Gentherapie kompensiert werden, indem das betroffene Gen selbst substituiert wird.
  • Die genetische Vakzinierung ermöglicht es, eine gewünschte Immunantwort auf ausgewählte Antigene, wie beispielsweise charakteristische Bestandteile von Bakterienoberflächen, Viruspartikel, Tumorantigene oder dergleichen, hervorzurufen. Generell ist die Vakzinierung eine der wichtigsten Errungenschaften der modernen Medizin. Wirksame Vakzine sind derzeit jedoch nur für eine kleinere Zahl von Krankheiten verfügbar. Dementsprechend erkranken jedes Jahr immer noch Millionen von Menschen an Infektionen, die sich durch Vakzinierungen nicht verhindern lassen.
  • Im Allgemeinen werden Vakzine in Vakzine der „ersten“, „zweiten“ und „dritten“ Generation unterteilt. „Bei den Vakzinen der ersten Generation handelt es sich in der Regel um Ganzorganismus-Vakzine. Sie basieren entweder auf lebenden und abgeschwächten oder abgetöteten Pathogenen, zum Beispiel Viren, Bakterien oder dergleichen. Der größte Nachteil von lebenden und abgeschwächten Vakzinen ist das Risiko einer Rückentwicklung zu lebensbedrohlichen Varianten. Daher können solche Pathogene, auch wenn sie abgeschwächt sind, immer noch unvorhersehbare Risiken bergen. Abgetötete Pathogene sind möglicherweise nicht so wirksam wie gewünscht, um eine spezifische Immunantwort hervorzurufen. Um diese Risiken zu minimieren, wurden Vakzine der „zweiten Generation“ entwickelt. Dabei handelt es sich in der Regel um Subunit-Vakzine, die aus definierten Antigenen oder rekombinanten Proteinkomponenten bestehen, die von Pathogenen abgeleitet sind.
  • Genetische Vakzine, d.h. Vakzine für die genetische Vakzinierung, werden in der Regel als Vakzine der „dritten Generation“ verstanden. Sie bestehen in der Regel aus gentechnisch veränderten Nukleinsäuremolekülen, die die Expression von Peptid- oder Protein (Antigen)-Fragmenten ermöglichen, die für ein Pathogen oder ein Tumorantigen in vivo charakteristisch sind. Genetische Vakzine werden nach Verabreichung an einen Patienten und Aufnahme durch kompetente Zellen exprimiert. Die Expression der verabreichten Nukleinsäuren führt zur Produktion der kodierten Proteine. Wenn diese Proteine vom Immunsystem des Patienten als fremd erkannt werden, wird eine Immunreaktion ausgelöst.
  • Wie aus den obigen Ausführungen ersichtlich ist, beruhen beide Verfahren, die Gentherapie und die genetische Vakzinierung, im Wesentlichen auf der Verabreichung von Nukleinsäuremolekülen an einen Patienten und der anschließenden Transkription und/oder Translation der kodierten genetischen Information. Alternativ kann die genetische Vakzinierung oder Gentherapie auch Verfahren umfassen, die die Isolierung spezifischer Körperzellen aus einem zu behandelnden Patienten, die anschließende In-vitro-Transfektion dieser Zellen und die erneute Verabreichung der behandelten Zellen an den Patienten beinhalten.
  • Als Nukleinsäuremoleküle für die Verabreichung im Kontext der Gentherapie oder der genetischen Vakzinierung können sowohl DNA als auch RNA verwendet werden. DNA ist bekanntlich relativ stabil und leicht zu handhaben. Die Verwendung von DNA birgt jedoch das Risiko, dass die verabreichten DNA-Fragmente unerwünscht in das Genom des Patienten eingebaut werden, was zu einem Funktionsverlust der betroffenen Gene führen kann. Als weiteres Risiko hat sich die unerwünschte Erzeugung von Anti-DNA-Antikörpern herausgestellt. Ein weiterer Nachteil ist das begrenzte Expressionsniveau des kodierten Peptids oder Proteins, das nach der Verabreichung der DNA und ihrer Transkription/Translation erreicht werden kann. Unter anderem hängt das Expressionsniveau der verabreichten DNA vom Vorhandensein spezifischer Transkriptionsfaktoren ab, die die DNA-Transkription regulieren. Fehlen solche Faktoren, führt die DNA-Transkription nicht zu ausreichenden Mengen an RNA. Infolgedessen ist die Menge des translatierten Peptids oder Proteins begrenzt.
  • Durch die Verwendung von RNA anstelle von DNA für die Gentherapie oder genetische Vakzinierung wird das Risiko einer unerwünschten genomischen Integration und der Erzeugung von Anti-DNA-Antikörpern minimiert oder vermieden. Allerdings gilt RNA als eine eher instabile molekulare Spezies, die leicht durch ubiquitäre RNAsen abgebaut werden kann.
  • In vivo trägt der RNA-Abbau zur Regulierung der RNA-Halbwertszeit bei. Dieser Effekt wurde für die Feinabstimmung der Regulation der eukaryotischen Genexpression berücksichtigt und nachgewiesen (Friedel et al., Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life, Nucleic Acid Research, 2009, 1-12). Demnach hat jede natürlich vorkommende mRNA eine individuelle Halbwertszeit, die von dem Gen abhängt, von dem die mRNA erhalten wurde. Sie trägt zur Regulation des Expressionsniveaus dieses Gens bei. Instabile RNAs sind wichtig, um die transiente Genexpression zu bestimmten Zeitpunkten zu realisieren. Langlebige RNAs können jedoch mit der Akkumulation bestimmter Proteine oder der kontinuierlichen Expression von Genen verbunden sein. In vivo kann die Halbwertszeit von mRNAs auch von Umweltfaktoren, wie zum Beispiel einer Hormonbehandlung, abhängig sein, wie zum Beispiel für mRNA des Insulin-like Wachstumsfaktors I, Aktin und Albumin gezeigt wurde (Johnson et al., Newly synthesized RNA: Simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of insulin-like growth factor I, actin, and albumin in growth hormone-stimulated hepatocytes, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 88, S. 5287-5291, 1991).
  • Für die Gentherapie und die genetische Vakzinierung ist in der Regel eine stabile RNA erwünscht. Dies liegt zum einen daran, dass sich das von der RNA-Sequenz kodierte Produkt in vivo anreichern soll. Andererseits muss die RNA bei der Herstellung einer geeigneten Darreichungsform, während der Lagerung und bei der Verabreichung ihre strukturelle und funktionelle Integrität beibehalten. Daher wurde der Bereitstellung stabiler RNA-Moleküle für die Gentherapie oder die genetische Vakzinierung große Aufmerksamkeit gewidmet, um zu verhindern, dass sie frühzeitig abgebaut werden oder zerfallen.
  • Es wurde berichtet, dass der G/C-Gehalt von Nukleinsäuremolekülen deren Stabilität beeinflussen kann. So können Nukleinsäuren mit einem erhöhten Anteil an Guanin- (G) und/oder Cytosin- (C) Resten funktionell stabiler sein als Nukleinsäuren mit einem hohen Anteil an Adenin- (A) und Thymin- (T) oder Uracil- (U) Nukleotiden. In diesem Zusammenhang stellt die WO 02/098443 eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die eine mRNA enthält, die durch Sequenzmodifikationen in der translatierten Region stabilisiert ist. Eine solche Sequenzmodifikation macht sich die Degeneration des genetischen Codes zunutze. Dementsprechend können Codons, die eine ungünstigere Nukleotidkombination enthalten (weniger günstig im Hinblick auf die RNA-Stabilität), durch alternative Codons ersetzt werden, ohne dass die kodierte Aminosäuresequenz verändert wird. Dieses Verfahren der RNA-Stabilisierung ist durch die spezifische Nukleotidsequenz jedes einzelnen RNA-Moleküls begrenzt, die den Raum der gewünschten Aminosäuresequenz nicht verlassen darf. Außerdem ist dieser Ansatz auf die kodierenden Regionen der RNA beschränkt.
  • Als alternative Möglichkeit der mRNA-Stabilisierung hat man festgestellt, dass natürlich vorkommende eukaryotische mRNA-Moleküle charakteristische stabilisierende Elemente enthalten. Sie können beispielsweise so genannte untranslatierte Regionen (UTR) an ihrem 5'-Ende (5'-UTR) und/oder an ihrem 3'-Ende (3'-UTR) sowie andere strukturelle Merkmale, wie zum Beispiel eine 5'-Cap-Struktur oder einen 3'-Poly(A)-Schwanz, aufweisen. Sowohl die 5'-UTR als auch die 3'-UTR werden in der Regel von der genomischen DNA transkribiert und sind somit ein Bestandteil der unreifen mRNA. Charakteristische Strukturmerkmale der reifen mRNA, wie zum Beispiel das 5'-Cap und der 3'-Poly(A)-Schwanz (auch Poly(A)-Schwanz oder Poly(A)-Sequenz genannt), werden der transkribierten (unreifen) mRNA in der Regel während der mRNA-Prozessierung hinzugefügt.
  • Ein 3'-Poly(A)-Schwanz ist typischerweise ein monotoner Sequenzabschnitt aus Adenin-Nukleotiden, der enzymatisch an das 3'-Ende der naszierenden mRNA angefügt wird. Typischerweise enthält der Poly(A)-Schwanz einer Säugetier-mRNA etwa 250 Adenin-Nukleotide. Es wurde festgestellt, dass die Länge eines solchen 3'-Poly(A)-Schwanzes ein potenziell kritisches Element für die Stabilität der einzelnen mRNA ist. In diesem Zusammenhang berichteten Holtkamp et al., dass ein aus 120 Nukleotiden bestehender Poly(A)-Schwanz zu einem stabileren mRNA-Molekül führte, das effizienter exprimiert wurde als ein kürzerer Poly(A)-Schwanz (Holtkamp et al., Modification of antigen-encoding RNA increases stability, translational efficacy, and T-cell stimulatory capacity of dendritic cells, Blood, Vol. 108, pp. 4009-4017, 2006). Nach Holtkamp et al. führt eine weitere Verlängerung des Poly(A)-Schwanzes jedoch nicht zu einer zusätzlichen Erhöhung der mRNA-Stabilität oder -Expression. Ferner wurde berichtet, dass die enzymatische Adenylierung einer einen Poly(A)-Schwanz umfassenden mRNA die Expression der mRNA nach Elektroporation in T-Zellen weiter erhöht (Zhao et al., Multiple Injections of Electroporated Autologous T Cells Expressing a Chimeric Antigen Receptor Mediate Regression of Human Disseminated Tumor, Cancer Res., Vol. 70(22), pp. 9053-9061, 2010).
  • Fast alle eukaryotischen mRNAs enden mit einer Poly(A)-Sequenz, die durch die ubiquitäre Spaltungs-/Polyadenylierungsmaschinerie an ihr 3'-Ende angefügt wird. Das Vorhandensein einer Poly(A)-Sequenz am 3'-Ende ist eines der am besten erkennbaren Merkmale eukaryontischer mRNAs. Nach der Spaltung erhalten die meisten prä-mRNAs, mit Ausnahme der replikationsabhängigen Histontranskripte, einen polyadenylierten Schwanz. In diesem Zusammenhang ist die Prozessierung des 3'-Endes ein nuklearer cotranskriptioneller Prozess, der den Transport von mRNAs aus dem Zellkern in das Zytoplasma fördert und die Stabilität und Translation von mRNAs beeinflusst. Die Bildung dieses 3'-Endes erfolgt in einer zweistufigen Reaktion, die von der Spaltungs-/Polyadenylierungsmaschinerie gesteuert wird und vom Vorhandensein zweier Sequenzelemente in mRNA-Vorläufern (prä-mRNAs) abhängt: einem hochkonservierten Hexanukleotid AAUAAA (Polyadenylierungssignal) und einer stromabwärts gelegenen G/U-reichen Sequenz. In einem ersten Schritt werden die prä-mRNAs zwischen diesen beiden Elementen gespalten. In einem zweiten Schritt, der eng an den ersten Schritt gekoppelt ist, wird das neu gebildete 3'-Ende durch Hinzufügen einer aus 200-250 Adenylaten bestehenden Poly(A)-Sequenz verlängert, die anschließend alle Aspekte des mRNA-Metabolismus, einschließlich mRNA-Export, -Stabilität und -Translation, beeinflusst (Dominski, Z. und W. F. Marzluff (2007), Gene 396(2): 373-90.).
  • Die einzige bekannte Ausnahme von dieser Regel sind die replikationsabhängigen Histon-mRNAs, die mit einem Histon-Stem-Loop anstelle einer Poly(A)-Sequenz enden. Exemplarische Histon-Stem-Loop-Sequenzen sind in Lopez et al. beschrieben (Dávila López, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308.).
  • Auf die Stem-Loops in Histon-Prä-mRNAs folgt in der Regel eine purinreiche Sequenz, das so genannte Histon-Downstream-Element (HDE). Diese prä-mRNAs werden im Zellkern durch eine einzige endonukleolytische Spaltung etwa 5 Nukleotide stromabwärts des Stem-Loops prozessiert, was von dem U7 snRNP durch Basenpaarung der U7 snRNA mit dem HDE katalysiert wird.
  • Da die neu synthetisierte DNA in Chromatin verpackt werden muss, wird die Histonsynthese im Einklang mit dem Zellzyklus reguliert. Die erhöhte Synthese von Histonproteinen während der S-Phase wird durch die transkriptionelle Aktivierung von Histongenen sowie die posttranskriptionelle Regulierung der Histon-mRNA-Mengen erreicht. Es konnte gezeigt werden, dass der Histon-Stem-Loop für alle posttranskriptionellen Schritte der Regulation der Histonexpression wesentlich ist. Er ist notwendig für eine effiziente Prozessierung, den Export der mRNA in das Zytoplasma, das Laden auf Polyribosomen und die Regulation der mRNA-Stabilität.
  • In diesem Zusammenhang wurde ein 32 kDa-Protein identifiziert, das mit dem Histon-Stem-Loop am 3'-Ende der Histon-mRNAs sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma assoziiert ist. Die Expression dieses Stem-Loop-Bindungsproteins (SLBP) wird durch den Zellzyklus reguliert und ist in der S-Phase am höchsten, wenn die Histon-mRNA-Mengen erhöht sind. SLBP ist für eine effiziente Prozessierung des 3'-Endes der Histon-prä-mRNA durch das U7 snRNP erforderlich. Nach Abschluss der Prozessierung bleibt das SLBP mit dem Stem-Loop am Ende der reifen Histon-mRNAs assoziiert und stimuliert deren Translation in Histonproteine im Zytoplasma (Dominski, Z. und W. F. Marzluff (2007), Gene 396(2): 373-90). Interessanterweise ist die RNA-Bindungsdomäne von SLBP in allen Metazoen und Protozoen konserviert (Davila López, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308), und es konnte gezeigt werden, dass seine Bindung an die Histon-Stem-Loop-Sequenz von der Stem-Loop-Struktur abhängt und dass die minimale Bindungsstelle mindestens 3 Nukleotide 5' und 2 Nukleotide 3' des Stem-Loops enthält (Pandey, N. B., et al. (1994), Molecular and Cellular Biology, 14(3), 1709-1720 und Williams, A. S., & Marzluff, W. F., (1995), Nucleic Acids Research, 23(4), 654-662.).
  • Obwohl Histon-Gene im Allgemeinen entweder als „replikationsabhängig“ klassifiziert werden, was zu mRNA führt, die in einem Histon-Stem-Loop endet, oder als „Replacement-Typ“, was zu mRNA führt, die stattdessen einen Poly(A)-Schwanz trägt, wurden in einigen sehr seltenen Fällen natürlich vorkommende mRNAs identifiziert, die sowohl einen Histon-Stem-Loop als auch Poly(A) oder Oligo(A) 3' davon enthalten. Sanchez et al. untersuchten die Wirkung natürlich vorkommender Oligo(A)-Schwänze, die während der Oogenese von Xenopus 3' an den Histon-Stem-Loop der Histon-mRNA angehängt sind, unter Verwendung von Luziferase als Reporterprotein und fanden heraus, dass der Oligo(A)-Schwanz ein aktiver Teil des Translationsrepressionsmechanismus ist, der ein Silencing der Histon-mRNA während der Oogenese bewirkt, und dass seine Entfernung Teil des Mechanismus ist, der die Translation von Histon-mRNAs aktiviert (Sanchez, R. und W. F. Marzluff (2004), Mol Cell Biol 24(6): 2513-25).
  • Darüber hinaus wurden die Voraussetzungen für die Regulierung replikationsabhängiger Histone auf der Ebene der prä-mRNA-Prozessierung und der mRNA-Stabilität mit Hilfe artifizieller Konstrukte untersucht, die für das Markerprotein Alpha-Globin kodieren, wobei die Tatsache ausgenutzt wurde, dass das Globin-Gen im Gegensatz zu den Intron-losen Histon-Genen Introns enthält. Zu diesem Zweck wurden Konstrukte erzeugt, in denen auf die Alpha-Globin kodierende Sequenz ein Histon-Stem-Loop-Signal (Histon-Stem-Loop gefolgt vom Histon-Downstream-Element) und ein Polyadenylierungssignal folgten (Whitelaw, E., et al. (1986). Nucleic Acids Research, 14(17), 7059-7070; Pandey, N. B., & Marzluff, W. F. (1987). Molecular and Cellular Biology, 7(12), 4557-4559; Pandey, N. B., et al. (1990). NucleicAcids Research, 18(11), 3161-3170).
  • Außerdem wurde gezeigt, dass die 3'-UTR der α-Globin-mRNA ein wichtiger Faktor für die bekannte Stabilität der α-Globin-mRNA sein kann (Rodgers et al., Regulated α-globin mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3'-to-5' exosome-dependent decapping, RNA, 8, pp. 1526-1537, 2002). Die 3'-UTR der α-Globin-mRNA ist offensichtlich an der Bildung eines spezifischen Ribonukleoprotein-Komplexes, des α-Komplexes, beteiligt, dessen Vorhandensein mit der mRNA-Stabilität in vitro korreliert (Wang et al., An mRNA stability complex functions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro, Molecular and Cellular Biology, Vol 19, No. 7, July 1999, p. 4552-4560).
  • Unabhängig von den Faktoren, die die mRNA-Stabilität beeinflussen, ist die effektive Translation der verabreichten Nukleinsäuremoleküle durch die Zielzellen oder das Zielgewebe von entscheidender Bedeutung für jeden Ansatz, bei dem Nukleinsäuremoleküle zur Gentherapie oder genetischen Vakzinierung eingesetzt werden. Neben der Regulierung der Stabilität wird auch die Translation der meisten mRNAs durch strukturelle Merkmale wie UTRs, 5'-Cap und 3'-Poly(A)-Schwanz reguliert. In diesem Zusammenhang wurde berichtet, dass die Länge des Poly(A)-Schwanzes ebenfalls eine wichtige Rolle für die Translationseffizienz spielen kann. Stabilisierende 3'-Elemente können aber auch eine Attenuationswirkung auf die Translation haben.
  • Weitere regulative Elemente, die einen Einfluss auf die Expressionsniveaus haben können, finden sich in der 5'-UTR. So wurde beispielsweise berichtet, dass die Synthese bestimmter Proteine, zum Beispiel von Proteinen, die zum Translationsapparat gehören, nicht nur auf der Transkriptions-, sondern auch auf der Translationsebene reguliert werden kann. So kann beispielsweise die Translation von Proteinen, die von so genannten „TOP-Genen“ kodiert werden, durch Translationsrepression herunterreguliert werden. Dabei bezieht sich der Begriff „TOP-Gen“ auf ein Gen, das einer mRNA entspricht, die durch das Vorhandensein einer TOP-Sequenz am 5'-Ende und in den meisten Fällen durch eine wachstumsassoziierte Translationsregulation gekennzeichnet ist (ladevaia et al., All translation elongation factors and the e, f, and h subunits of translation initiation factor 3 are encoded by 5'-terminal oligopyrimidine (TOP) mRNAs; RNA, 2008, 14:1730-1736). In diesem Zusammenhang besteht eine TOP-Sequenz - auch „5'-terminaler OligopyrimidinTrakt“ genannt - typischerweise aus einem C-Rest an der Cap-Stelle, gefolgt von einer ununterbrochenen Sequenz von bis zu 13 oder sogar mehr Pyrimidinen (Avni et al., Vertebrate mRNAs with a 5'-terminal pyrimidine tract are Candidates for translational repression in quiescent cells: characterization of the translational cis-regulatory element, Molecular and Cellular Biology, 1994, S. 3822-3833). Es wird berichtet, dass diese TOP-Sequenzen in vielen mRNAs vorhanden sind, die für Komponenten der Translationsmaschinerie kodieren, und dass sie für die selektive Repression der Translation dieser TOP-enthaltenden mRNAs aufgrund von Wachstumsstillstand verantwortlich sind (Meyuhas, et al., Translational Control of Ribosomal Protein mRNAs in Eukaryotes, Translational Control. Cold Spring Harbor Monograph Archive. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996, S. 363-388).
  • Es ist die Aufgabe der Erfindung, artifizielle Nukleinsäuremoleküle bereitzustellen, die zur Verwendung als Medikament oder Vakzine geeignet sind, vorzugsweise zur Anwendung in der Gentherapie und/oder genetischen Vakzinierung. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, artifizielle Nukleinsäuremoleküle, wie zum Beispiel eine mRNA-Spezies, bereitzustellen, die eine verbesserte Proteinproduktion von den artifiziellen Nukleinsäuremolekülen ermöglichen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung zu stellen, die für eine solche verbesserte mRNA-Spezies kodieren, die zur Verwendung als Medikament oder Vakzine, vorzugsweise in der Gentherapie und/oder genetischen Vakzinierung, geeignet ist. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, vorzugsweise zur Verwendung als Medikament oder Vakzine, vorzugsweise in der Gentherapie und/oder genetischen Vakzinierung. Zusammengefasst ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Nukleinsäurespezies bereitzustellen, die die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik durch einen kostengünstigen und einfachen Ansatz überwinden.
  • Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird durch den beanspruchten Gegenstand gelöst.
  • Der Klarheit und Lesbarkeit halber werden die folgenden Definitionen angegeben. Jedes technische Merkmal, das bei diesen Definitionen erwähnt wird, kann auf jede Ausführungsform der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Zusätzliche Definitionen und Erklärungen können speziell im Zusammenhang mit diesen Ausführungsformen gegeben werden.
  • Adaptive Immunantwort: Unter der adaptiven Immunantwort versteht man typischerweise eine antigenspezifische Antwort des Immunsystems. Die Antigenspezifität ermöglicht die Erzeugung von Antworten, die auf spezifische Pathogene oder pathogeninfizierte Zellen zugeschnitten sind. Die Fähigkeit, diese maßgeschneiderten Reaktionen auszulösen, wird im Körper normalerweise durch „Gedächtniszellen“ aufrechterhalten. Sollte ein Pathogen den Körper mehr als einmal infizieren, werden diese spezifischen Gedächtniszellen genutzt, um ihn schnell zu eliminieren. In diesem Zusammenhang ist der erste Schritt einer adaptiven Immunantwort die Aktivierung naiver antigenspezifischer T-Zellen oder anderer Immunzellen, die in der Lage sind, eine antigenspezifische Immunantwort durch Antigen-präsentierende Zellen auszulösen. Dies geschieht in den lymphatischen Geweben und Organen, die von naiven T-Zellen ständig durchwandert werden. Die drei Zelltypen, die als Antigen-präsentierende Zellen dienen können, sind dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen. Jede dieser Zellen hat eine bestimmte Funktion bei der Auslösung von Immunantworten. Dendritische Zellen können Antigene durch Phagozytose und Makropinozytose aufnehmen und werden zum Beispiel durch den Kontakt mit einem fremden Antigen dazu angeregt, in das lokale lymphatische Gewebe einzuwandern, wo sie zu reifen dendritischen Zellen differenzieren. Makrophagen nehmen partikuläre Antigene, wie beispielsweise Bakterien, auf und werden durch infektiöse Agenzien oder andere geeignete Stimuli zur Expression von MHC-Molekülen veranlasst. Die einzigartige Fähigkeit von B-Zellen, lösliche Proteinantigene über ihre Rezeptoren zu binden und zu internalisieren, kann ebenfalls wichtig für die Induktion von T-Zellen sein. MHC-Moleküle sind in der Regel dafür verantwortlich, dass ein Antigen den T-Zellen präsentiert wird. Die Präsentation des Antigens auf MHC-Molekülen führt zu einer Aktivierung der T-Zellen, was ihre Proliferation und Differenzierung zu bewaffneten Effektor-T-Zellen auslöst. Die wichtigste Funktion der Effektor-T-Zellen ist die Abtötung infizierter Zellen durch zytotoxische CD8+-T-Zellen und die Aktivierung von Makrophagen durch Th1-Zellen, die zusammen die zellvermittelte Immunität ausmachen, sowie die Aktivierung von B-Zellen sowohl durch Th2- als auch durch Th1-Zellen, um verschiedene Klassen von Antikörpern zu produzieren und so die humorale Immunantwort zu steuern. T-Zellen erkennen ein Antigen über ihre T-Zell-Rezeptoren, die das Antigen nicht direkt erkennen und binden, sondern kurze Peptidfragmente, zum Beispiel von pathogenen Proteinantigenen, zum Beispiel so genannte Epitope, erkennen, die an MHC-Moleküle auf der Oberfläche anderer Zellen gebunden sind.
  • Adaptives Immunsystem: Das adaptive Immunsystem hat im Wesentlichen die Aufgabe, pathogenes Wachstum zu eliminieren oder zu verhindern. Es reguliert in der Regel die adaptive Immunantwort, indem es das Immunsystem der Wirbeltiere mit der Fähigkeit ausstattet, spezifische Pathogene zu erkennen und sich an sie zu erinnern (um Immunität zu erzeugen) und bei jedem Auftreten des Pathogens stärkere Angriffe zu fahren. Das System ist aufgrund der somatischen Hypermutation (ein Prozess beschleunigter somatischer Mutationen) und der V(D)J-Rekombination (eine irreversible genetische Rekombination von Antigenrezeptor-Gensegmenten) äußerst anpassungsfähig. Dieser Mechanismus ermöglicht es einer kleinen Anzahl von Genen, eine große Anzahl verschiedener Antigenrezeptoren zu erzeugen, die dann auf jedem einzelnen Lymphozyten einzigartig exprimiert werden. Da die Genumlagerung zu einer irreversiblen Veränderung in der DNA jeder Zelle führt, erben alle Nachkommen einer solchen Zelle die Gene, die für dieselbe Rezeptorspezifität kodieren, einschließlich der B-Gedächtniszellen und T-Gedächtniszellen, die die Schlüssel zu einer langlebigen spezifischen Immunität sind.
  • Adiuvans/Adiuvans-Komponente: Ein Adjuvans oder eine Adjuvanskomponente im weitesten Sinne ist typischerweise ein pharmakologisches und/oder immunologisches Agens, welches die Wirkung anderer Agenzien, wie beispielsweise eines Wirkstoffs oder einer Vakzine, modifizieren, zum Beispiel verstärken, kann. Es sollte im weitesten Sinne interpretiert werden und bezieht sich auf ein breites Spektrum von Substanzen. Typischerweise sind diese Substanzen in der Lage, die Immunogenizität von Antigenen zu erhöhen. Zum Beispiel können Adjuvanzien durch das angeborene Immunsystem erkannt werden und zum Beispiel eine angeborene Immunantwort auslösen. Adjuvanzien lösen typischerweise keine adaptive Immunantwort aus. Insofern qualifizieren sie sich nicht als Antigene. Ihre Wirkungsweise unterscheidet sich von den durch Antigene ausgelösten Wirkungen, die zu einer adaptiven Immunantwort führen.
  • Antigen: Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein Antigen typischerweise eine Substanz, welche durch das Immunsystem, vorzugsweise das adaptive Immunsystem, erkannt werden kann und imstande ist, zum Beispiel durch Bildung von Antikörpern und/oder Antigen-spezifischen T-Zellen als Bestandteil der adaptiven Immunantwort, eine Antigen-spezifische Immunantwort auszulösen. Typischerweise kann ein Antigen ein Peptid oder Protein sein oder umfassen, welches mindestens ein Epitop umfasst und welches durch den MHC den T-Zellen präsentiert werden kann. Im Sinne der vorliegenden Erfindung kann ein Antigen das Produkt der Translation eines bereitgestellten Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise einer mRNA, wie hierin definiert, sein. In diesem Zusammenhang werden ebenso Fragmente, Varianten und Derivate von Peptiden und Proteinen, welche mindestens ein Epitop umfassen, als Antigene verstanden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind Tumorantigene und pathogene Antigene, wie hierin definiert, besonders bevorzugt.
  • Artifizielles Nukleinsäuremolekül: Unter einem artifiziellen Nukleinsäuremolekül kann typischerweise ein Nukleinsäuremolekül, z.B. eine DNA oder eine RNA, verstanden werden, das nicht natürlich vorkommt. Mit anderen Worten, ein artifizielles Nukleinsäuremolekül kann als ein nicht natürliches Nukleinsäuremolekül verstanden werden. Ein solches Nukleinsäuremolekül kann aufgrund seiner individuellen Sequenz (die in der Natur nicht vorkommt) und/oder aufgrund anderer Modifikationen, zum Beispiel struktureller Modifikationen von Nukleotiden, die in der Natur nicht vorkommen, nicht natürlich sein. Ein artifizielles Nukleinsäuremolekül kann ein DNA-Molekül, ein RNA-Molekül oder ein Hybridmolekül, welches DNA- und RNA-Anteile umfasst, sein.
  • Typischerweise können artifizielle Nukleinsäuremoleküle durch gentechnische Verfahren konzipiert und/oder erzeugt werden, um einer gewünschten artifiziellen Sequenz von Nukleotiden (heterologe Sequenz) zu entsprechen. In diesem Zusammenhang ist eine artifizielle Sequenz in der Regel eine Sequenz, die in der Natur nicht vorkommt, d.h. sie unterscheidet sich von der Wildtyp-Sequenz in mindestens einem Nukleotid. Der Begriff „Wildtyp“ kann als eine in der Natur vorkommende Sequenz verstanden werden. Ferner ist der Begriff „artifizielles Nukleinsäuremolekül“ nicht auf „ein einzelnes Molekül“ beschränkt, sondern umfasst in der Regel eine Gesamtheit identischer Moleküle. Dementsprechend kann er sich auf eine Vielzahl identischer Moleküle, die in einem Aliquot enthalten sind, beziehen.
  • Bicistronische RNA, multicistronische RNA: Eine bicistronische oder multicistronische RNA ist typischerweise eine RNA, vorzugsweise eine mRNA, die typischerweise zwei (bicistronisch) oder mehr (multicistronisch) offene Leserahmen (ORF) haben kann. Ein offener Leserahmen ist in diesem Zusammenhang eine Sequenz von Codons, die in ein Peptid oder Protein translatiert werden kann.
  • Träger / polymerer Träger: Ein Träger im Kontext der vorliegenden Erfindung ist typischerweise eine Verbindung, die den Transport und/oder die Komplexierung einer anderen Verbindung (Fracht, Cargo) erleichtert. Ein polymerer Träger ist typischerweise ein Träger, der aus einem Polymer gebildet ist. Ein Träger kann mit seiner Ladung durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkung verbunden sein. Ein Träger kann Nukleinsäuren, zum Beispiel RNA oder DNA, zu den Zielzellen transportieren. Der Träger kann - bei einigen Ausführungsformen - eine kationische Komponente sein.
  • Kationische Komponente: Der Begriff „kationische Komponente“ bezieht sich typischerweise auf ein geladenes Molekül, das bei einem pH-Wert von typischerweise 1 bis 9, bevorzugt bei einem pH-Wert von oder unter 9 (z.B. von 5 bis 9), von oder unter 8 (z.B. von 5 bis 8), von oder unter 7 (z.B. von 5 bis 7), am meisten bevorzugt bei einem physiologischen pH-Wert, z.B. von 7,3 bis 7,4, positiv geladen ist (Kation). Dementsprechend kann eine kationische Komponente jede positiv geladene Verbindung oder jedes positiv geladene Polymer sein, vorzugsweise ein kationisches Peptid oder Protein, das unter physiologischen Bedingungen, insbesondere unter physiologischen Bedingungen in vivo, positiv geladen ist. Ein „kationisches Peptid oder Protein“ kann mindestens eine positiv geladene Aminosäure oder mehr als eine positiv geladene Aminosäure enthalten, zum Beispiel ausgewählt aus Arg, His, Lys oder Orn. Dementsprechend fallen auch „polykationische“ Komponenten darunter, die unter den gegebenen Bedingungen mehr als eine positive Ladung aufweisen.
  • 5'-Cap: Ein 5'-Cap ist eine Einheit, typischerweise eine modifizierte Nukleotideinheit, welche im Allgemeinen das 5'-Ende einer reifen DNA „cappt“. Ein 5'-Cap kann typischerweise durch ein modifiziertes Nukleotid, insbesondere durch ein Derivat eines Guanin-Nukleotids, gebildet werden. Vorzugsweise ist das 5'-Cap mit dem 5'-Terminus über eine 5'-5'-Triphosphatbindung verknüpft. Ein 5'-Cap kann methyliert sein, z.B. m7GpppN, wobei N das terminale 5'-Nukleotid der Nukleinsäure, die das 5'-Cap trägt, typischerweise das 5'-Ende einer RNA, ist. Zu weiteren Beispielen für 5'-Cap-Strukturen zählen Glycerin, invertierter abasischer Desoxy-Rest (Einheit), 4',5'-Methylen-Nukleotid, 1-(beta-D-Erythrofuranosyl)-Nukleotid, 4'-Thio-Nukleotid, carbozyklisches Nukleotid, 1,5-Anhydrohexitol-Nukleotid, L-Nukleotide, alpha-Nukleotid, Nukleotid mit modifizierter Base, Threo-Pentofuranosyl-Nukleotid, azyklisches 3',4'-Seco-Nukleotid, azyklisches 3,4-Dihydroxybutyl-Nukleotid, azyklisches 3,5-Dihydroxypentyl-Nukleotid, 3'-3'-invertierte Nukleotid-Gruppe, 3'-3'-invertierte abatische Einheit, 3'-2'-invertierte Nukleotid-Einheit, 3'-2'-invertierte abatische Einheit, 1,4-Butandiolphosphat, 3'-Phosphoramidat, Hexylphosphat, Aminohexylphosphat, 3'-Phosphat, 3'-Phosphorthioat, Phosphordithioat oder überbrückende oder nicht-überbrückende Methylphosphonat-Einheit.
  • Zelluläre Immunität/zelluläre Immunantwort: Zelluläre Immunität bezieht sich typischerweise auf die Aktivierung von Makrophagen, natürlichen Killerzellen (NK), Antigen-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten und die Freisetzung verschiedener Zytokine als Antwort auf ein Antigen. Generell basiert zelluläre Immunität nicht auf Antikörpern, sondern auf der Aktivierung von Zellen des Immunsystems. Typischerweise kann eine zelluläre Immunantwort durch zum Beispiel die Aktivierung Antigen-spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten charakterisiert werden, die imstande sind, in Zellen Apoptose auszulösen, zum Beispiel spezielle Immunzellen, wie dendritische Zellen oder andere Zellen, welche Epitope fremder Antigene auf ihrer Oberfläche präsentieren. Solche Zellen können mit einem Virus oder intrazellulären Bakterien infizierte Zellen oder Krebszellen, welche Tumorantigene präsentieren, sein. Weitere Charakteristika können die Aktivierung von Makrophagen und natürlichen Killerzellen, wodurch diese zur Zerstörung von Pathogenen befähigt werden, und die Stimulation von Zellen zur Sekretion einer Vielzahl von Zytokinen, welche die Funktion anderer Zellen, die in adaptive Immunantworten und angeborene Immunantworten involviert sind, sein.
  • DNA: DNA ist die übliche Abkürzung für Desoxyribonukleinsäure. Es handelt sich dabei um ein Nukleinsäuremolekül, d.h., ein aus Nukleotiden bestehendes Polymer. Diese Nukleotide sind üblicherweise Desoxyadenosinmonophosphat-, Desoxythymidinmonophosphat-, Desoxyguanosinmonophosphat- und Deoxycytidinmonophosphat-Monomere, welche jeweils aus einer Zuckereinheit (Desoxyribose), einer Baseneinheit und einer Phosphateinheit bestehen und unter Bildung einer charakteristischen Rückgratstruktur (Backbone) polymerisieren. Die Rückgratstruktur wird typischerweise durch Phosphodiesterbindungen zwischen der Zuckereinheit des Nukleotids, d.h., der Desoxyribose, eines ersten Monomers und einer Phosphateinheit eines zweiten benachbarten Monomers gebildet. Die spezifische Reihenfolge der Monomere, d.h., die Reihenfolge der mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat verknüpften Basen, wird als DNA-Sequenz bezeichnet. DNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. In der doppelsträngigen Form hybridisieren die Nukleotide des ersten Stranges typischerweise mit den Nukleotiden des zweiten Stranges, zum Beispiel durch A/T-Basenpaarung und G/C-Basenpaarung.
  • Epitop: Epitope (auch als „Antigendeterminanten“ bezeichnet) können in T-Zell-Epitope und B-Zell-Epitope unterschieden werden. T-Zell-Epitope oder Teile der Proteine im Kontext der vorliegenden Erfindung können Fragmente umfassen, die bevorzugt eine Länge von etwa 6 bis etwa 20 oder auch mehr Aminosäuren aufweisen, zum Beispiel Fragmente, wie sie durch MHC-Klasse-I-Moleküle prozessiert und präsentiert werden, die bevorzugt eine Länge von etwa 8 bis etwa 10 Aminosäuren, zum Beispiel 8, 9 oder 10 (oder auch 11 oder 12 Aminosäuren), aufweisen, oder Fragmente, wie sie durch MHC-Klasse-II-Moleküle prozessiert und präsentiert werden, die bevorzugt eine Länge von etwa 13 oder mehr Aminosäuren, z.B. 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder auch mehr Aminosäuren, aufweisen, wobei diese Fragmente aus einem beliebigen Teil der Aminosäuresequenz ausgewählt sein können. Diese Fragmente werden typischerweise durch T-Zellen in Form eines Komplexes, welcher aus einem Peptidfragment und einem MHC-Molekül besteht, erkannt, d.h., die Fragmente werden typischerweise nicht in ihrer nativen Form erkannt. B-Zell-Epitope sind typischerweise Fragmente, die auf der äußeren Oberfläche (nativer) Peptid- oder Proteinantigene, wie hierin definiert, vorliegen und bevorzugt 5 bis 15 Aminosäuren, bevorzugter 5 bis 12 Aminosäuren, noch bevorzugter 6 bis 9 Aminosäuren, aufweisen, welche durch Antikörper, d.h., in ihrer nativen Form, erkannt werden können. Solche Epitope von Peptiden oder Proteinen können ferner aus allen der hierin erwähnten Varianten solcher Proteine oder Peptide ausgewählt sein. In diesem Zusammenhang können antigene Determinanten konformationelle oder diskontinuierliche Epitope, die aus Segmenten der Proteine oder Peptide, wie hierin definiert, bestehen, die in der Aminosäuresequenz der Proteine oder Peptide, wie hierin definiert, diskontinuierlich sind, jedoch in der dreidimensionalen Struktur zusammengebracht werden, oder kontinuierliche oder lineare Epitope, welche aus einer einzelnen Polypeptidkette bestehen, sein.
  • Fragment einer Sequenz: Ein Fragment einer Sequenz kann typischerweise ein kürzerer Teil einer Vollängensequenz, zum Beispiel eines Nukleinsäuremoleküls oder einer Aminosäuresequenz, sein. Dementsprechend besteht ein Fragment typischerweise aus einer Sequenz, die identisch zu dem entsprechenden Abschnitt innerhalb der Volllängensequenz ist. Ein bevorzugtes Fragment einer Sequenz im Kontext der vorliegenden Erfindung besteht aus einem kontinuierlichen Abschnitt von Einheiten, wie beispielsweise Nukleotiden oder Aminosäuren, die einem kontinuierlichen Abschnitt von Einheiten in dem Molekül, von dem das Fragment abgeleitet ist, entsprechen, welches mindestens 5%, 10%, 20%, bevorzugt mindestens 30%, bevorzugter mindestens 40%, bevorzugter mindestens 50%, noch bevorzugter mindestens 60%, noch bevorzugter mindestens 70% und am meisten bevorzugt mindestens 80% des gesamten (d.h. Vollängen-) Moleküls, von dem das Fragment abgeleitet ist, darstellt.
  • G/C-modifiziert: Eine G/C-modifizierte Nukleinsäure kann typischerweise eine Nukleinsäure, vorzugsweise ein artifizielles Nukleinsäuremolekül, wie hierin definiert, sein, welches auf einer modifizierten Wildtyp-Sequenz basiert und eine vorzugsweise erhöhte Anzahl von Guanosin- und/oder Cytosin-Nukleotiden gegenüber der Wildtyp-Sequenz umfasst. Eine solche erhöhte Anzahl kann durch Substitution von Codons, welche Adenosin- oder Thymidin-Nukleotide enthalten, durch Codons, welche Guanosin- oder Cytosin-Nukleotide enthalten, erzeugt werden. Wenn der angereicherte G/C-Gehalt in einer kodierenden Region der DNA oder RNA auftritt, wird dabei die Degeneration des genetischen Codes ausgenutzt. Entsprechend werden durch die Codon-Substitutionen vorzugsweise nicht die kodierten Aminosäurereste verändert, sondern ausschließlich der G/C-Gehalt des Nukleinsäuremoleküls erhöht.
  • Gentherapie: Unter Gentherapie kann typischerweise eine Behandlung des Körpers eines Patienten oder einzelner Teile des Körpers des Patienten, zum Beispiel isolierter Gewebe/Zellen, mit Nukleinsäuren, welche ein Peptid oder Protein kodieren, verstanden werden. Sie kann typischerweise mindestens einen der Schritte a) direkte Verabreichung einer Nukleinsäure, vorzugsweise eines artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hierin definiert, an einen Patienten auf irgendeinem Verabreichungsweg oder in vitro an isolierte Zellen/Gewebe des Patienten, was zu einer Transfektion der Zellen des Patienten entweder in vivo, ex vivo oder in vitro führt; b) Transkription und/oder Translation des eingeführten Nukleinsäuremoleküls; und optional c) Wiederverabreichung isolierter, transfizierter Zellen an den Patienten, wenn die Nukleinsäure nicht direkt an den Patienten verabreicht wurde, umfassen.
  • Genetische Vakzinierung: Unter genetischer Vakzinierung kann typischerweise Vakzinierung durch Verabreichung eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein Antigen oder ein Immunogen oder Fragmente davon kodiert, verstanden werden. Das Nukleinsäuremolekül kann dem Körper eines Individuums oder isolierten Zellen eines Individuums verabreicht werden. Nach Transfektion bestimmter Körperzellen oder nach Transfektion der isolierten Zellen kann das Antigen oder Immunogen durch diese Zellen exprimiert und anschließend dem Immunsystem präsentiert werden, wodurch eine adaptive, d.h., antigenspezifische, Immunantwort ausgelöst wird. Demgemäß umfasst genetische Vakzinierung typischerweise mindestens einen der Schritte a) Verabreichung einer Nukleinsäure, vorzugsweise eines artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hierin definiert, an ein Individuum, vorzugsweise einen Patienten, oder an isolierte Zellen eines Individuums, vorzugsweise eines Patienten, was üblicherweise zur Transfektion der Zellen des Individuums entweder in vivo oder in vitro führt; b) Transkription und/oder Translation des eingeführten Nukleinsäuremoleküls; und optional c) Wiederverabreichung der isolierten, transfizierten Zellen an das Individuum, vorzugsweise den Patienten, wenn die Nukleinsäure nicht direkt an den Patienten verabreicht wurde.
  • Heterologe Sequenz: Zwei Sequenzen gelten typischerweise als heterolog, wenn sie nicht von demselben Gen stammen. Das heißt, obwohl heterologe Sequenzen von demselben Organismus stammen können, treten sie natürlicherweise (in der Natur) nicht in demselben Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise derselben mRNA, auf.
  • Humorale Immunität/humorale Immunantwort: Humorale Immunität bezieht sich typischerweise auf Antikörperproduktion und optional auf akzessorische Prozesse, welche die Antikörperproduktion begleiten. Eine humorale Immunantwort kann typischerweise durch zum Beispiel Th2-Aktivierung und Zytokinproduktion, Keimzentrumbildung und Isotypen-Switching, Affinitätsreifung und Erzeugung von Gedächtniszellen gekennzeichnet sein. Humorale Immunität kann sich ebenso typischerweise auf die Effektorfunktionen von Antikörpern beziehen, was Pathogen- und Toxinneutralisierung, klassische Komplementaktivierung und Opsonin-Förderung der Phagozytose und Pathogeneliminierung einschließt.
  • Immunogen: Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann unter einem Immunogen typischerweise eine Verbindung verstanden werden, die imstande ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Vorzugsweise ist ein Immunogen ein Peptid, Polypeptid oder Protein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Immunogen im Sinne der vorliegenden Erfindung das Produkt der Translation eines bereitgestellten Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise eines artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hierin definiert. Typischerweise ruft ein Immunogen mindestens eine adaptive Immunantwort hervor.
  • Immunostimulatorische Zusammensetzung: Im Kontext der Erfindung kann unter einer immunstimulatorischen Zusammensetzung typischerweise eine Zusammensetzung verstanden werden, die mindestens eine Komponente enthält, die imstande ist, eine Immunantwort auszulösen, oder aus der eine Komponente, die imstande ist, eine Immunantwort auszulösen, abgeleitet werden kann. Eine solche Immunantwort kann vorzugsweise eine angeborene Immunantwort oder eine Kombination aus einer adaptiven und einer angeborenen Immunantwort sein. Vorzugsweise enthält eine immunstimulatorische Zusammensetzung im Kontext der vorliegenden Erfindung mindestens ein artifizielles Nukleinsäuremolekül, bevorzugter eine RNA, zum Beispiel ein mRNA-Molekül. Die immunstimulatorische Komponente, wie beispielsweise die mRNA, kann mit einem geeigneten Träger komplexiert sein. Somit kann die immunstimulatorische Zusammensetzung einen mRNA/Träger-Komplex umfassen. Des Weiteren kann die immunstimulatorische Zusammensetzung ein Adjuvans und/oder ein geeignetes Vehikel für die immunstimulatorische Komponente, wie beispielsweise die mRNA, umfassen.
  • Immunantwort: Eine Immunantwort kann typischerweise eine spezifische Reaktion des adaptiven Immunsystems auf ein bestimmtes Antigen (sogenannte spezifische oder adaptive Immunantwort) oder eine unspezifische Reaktion des angeborenen Immunsystems (sogenannte unspezifische oder angeborene Immunantwort) oder eine Kombination aus beiden sein.
  • Immunsystem: Das Immunsystem kann einen Organismus vor Infektionen schützen. Wenn ein Pathogen erfolgreich eine physikalische Barriere eines Organismus passiert und in den Organismus gelangt, stellt das angeborene Immunsystem eine unmittelbare, jedoch unspezifische Antwort bereit. Wenn sich die Pathogene dieser angeborenen Antwort entziehen, besitzen Vertebraten einen zweiten Schutzschild, das adaptive Immunsystem. Hierbei passt das Immunsystem seine Antwort während einer Infektion an, um seine Erkennung des Pathogens zu verbessern. Diese verbesserte Antwort wird dann, nachdem das Pathogen eliminiert wurde, in Form eines immunologischen Gedächtnisses beibehalten, was es dem adaptiven Immunsystem erlaubt, jedes Mal, wenn es mit diesem Pathogen zusammentrifft, schnellere und stärkere Angriffe zu initiieren. Demgemäß umfasst das Immunsystem das angeborene und das adaptive Immunsystem. Jeder dieser beiden Bestandteile enthält typischerweise sogenannte humorale und zelluläre Komponenten.
  • Immunstimulatorische RNA: Eine immunstimulatorische RNA (isRNA) im Kontext der vorliegenden Erfindung kann typischerweise eine RNA sein, die imstande ist, eine angeborene Immunantwort zu induzieren. Sie besitzt üblicherweise keinen offenen Leserahmen und liefert somit kein Peptid-Antigen oder Immunogen, sondern löst eine Immunantwort zum Beispiel durch Binden an eine spezielle Art eines Toll-like Rezeptors (TLR) oder andere geeignete Rezeptoren aus. Jedoch können selbstverständlich auch mRNAs, die einen offenen Leserahmen aufweisen und für ein Peptid oder Protein kodieren, eine angeborene Immunantwort auslösen und somit immunstimulatorische RNAs sein.
  • Angeborenes Immunsystem: Das angeborene Immunsystem, ebenso als nichtspezifisches (oder unspezifisches) Immunsystem bekannt, umfasst typischerweise die Zellen und Mechanismen, die den Wirt vor Infektion durch andere Organismen in unspezifischer Art und Weise schützen. Das heißt, dass die Zellen des angeborenen Immunsystems Pathogene auf einem allgemeinen Weg erkennen und auf diese reagieren, im Gegensatz zu dem adaptiven Immunsystem jedoch dem Wirt keine lang andauernde oder schützende Immunität verleihen. Das angeborene Immunsystem kann beispielsweise durch Liganden der Toll-like Rezeptoren (TLRs) oder andere Hilfssubstanzen, wie beispielsweise Lipopolysaccharide, TNF-alpha, CD40-Ligand, oder Zytokine, Monokine, Lymphokine, Interleukine oder Chemokine, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alpha, IFN-beta, IFNgamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta, TNF-alpha, Wachstumsfaktoren und hGH, einen Liganden des humanen Toll-like Rezeptors TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, einen Liganden des murinen Toll-like Rezeptors TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 oder TLR13, einen Liganden eines NOD-like Rezeptors, einen Liganden eines RIG-I-like Rezeptors, eine immunstimulatorische Nukleinsäure, eine immunstimulatorische RNA (isRNA), eine CpG-DNA, ein antibakterielles Agens oder ein antivirales Agens, aktiviert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere solcher Substanzen umfassen. Typischerweise beinhaltet eine Antwort des angeborenen Immunsystems das Rekrutieren von Immunzellen zu den Stellen der Infektion durch die Produktion chemischer Faktoren, einschließlich spezialisierter chemischer Mediatoren, sogenannte Zytokine; die Aktivierung der Komplement-Kaskade; die Identifizierung und das Beseitigen fremder Substanzen, die in Organen, Geweben, dem Blut und der Lymphe vorliegen, durch spezialisierte weiße Blutkörperchen; die Aktivierung des adaptiven Immunsystems und/oder die Wirkung als physikalische und chemische Barriere gegenüber infektiösen Agenzien.
  • Kionierungsstelle: Unter einer Klonierungsstelle wird typischerweise ein Abschnitt eines Nukleinsäuremoleküls verstanden, der für das Einfügen einer Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, welche einen offenen Leserahmen umfasst, geeignet ist. Das Einfügen kann durch ein beliebiges molekularbiologisches Verfahren, welches der fachkundigen Person bekannt ist, zum Beispiel durch Restriktion und Ligation, durchgeführt werden. Eine Klonierungsstelle umfasst typischerweise ein oder mehrere Restriktionsenzymerkennungsstellen (Restriktionsstellen). Diese eine oder mehreren Restriktionsstellen können durch Restriktionsenzyme, welche die DNA an diesen Stellen spalten, erkannt werden. Eine Klonierungsstelle, welche mehr als eine Restriktionsstelle umfasst, kann auch als multiple Klonierungsstelle (MCS) oder Polylinker bezeichnet werden.
  • Nukleinsäuremolekül: Ein Nukleinsäuremolekül ist ein Molekül, welches Nukleinsäure-Komponenten umfasst und vorzugsweise aus diesen besteht. Der Ausdruck Nukleinsäuremolekül bezieht sich bevorzugt auf DNA- oder RNA-Moleküle. Er wird vorzugsweise synonym mit dem Ausdruck „Polynukleotid“ verwendet. Vorzugsweise ist ein Nukleinsäuremolekül ein Polymer, welches Nukleotid-Monomere umfasst oder aus diesen besteht, die durch Phosphodiesterbindungen eines Zucker-/Phosphat-Rückgrats (Backbone) kovalent miteinander verknüpft sind. Der Ausdruck „Nukleinsäuremolekül“ schließt ebenso modifizierte Nukleinsäuremoleküle, wie beispielsweise Basenmodifizierte, Zucker-modifizierte oder Backbone-modifizierte etc., DNA- oder RNA-Moleküle ein.
  • Offener Leserahmen: Ein offener Leserahmen (ORF) im Kontext der vorliegenden Erfindung kann typischerweise eine Sequenz von mehreren Nukleotid-Tripletts sein, die in ein Peptid oder Protein translatiert werden kann. Ein offener Leserahmen enthält vorzugsweise ein Start-Codon, d.h., eine Kombination von drei aufeinander folgenden Nukleotiden, die üblicherweise für die Aminosäure Methionin kodieren (ATG oder AUG), an seinem 5'-Ende und eine sich daran anschließende Region, die üblicherweise eine Länge aufweist, die ein Vielfaches von drei Nukleotiden ist. Ein ORF wird vorzugsweise durch ein Stopp-Codon (z.B. TAA, TAG, TGA) terminiert. Typischerweise ist dies das einzige Stopp-Codon des offenen Leserahmens. Somit ist ein offener Leserahmen im Kontext der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die aus einer Anzahl von Nukleotiden besteht, die durch drei teilbar ist, welche mit einem Start-Codon (z.B. ATG oder AUG) beginnt und welche vorzugsweise mit einem Stopp-Codon (z.B. TAA, TGA oder TAG bzw. UAA, UAG, UGA) endet. Der offene Leserahmen kann isoliert vorliegen oder in eine längere Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel in einen Vektor oder eine mRNA, eingebunden sein. Ein offener Leserahmen kann ebenso als „Proteinkodierende Region“ bezeichnet werden.
  • Peptid: Ein Peptid oder Polypeptid ist typischerweise ein Polymer aus Aminosäure-Monomeren, die durch Peptidbindungen verknüpft sind. Es enthält typischerweise weniger als 50 Monomer-Einheiten. Nichtsdestotrotz schließt der Ausdruck „Peptid“ Moleküle, welche mehr als 50 Monomer-Einheiten aufweisen, nicht aus. Lange Peptide werden auch als Polypeptide bezeichnet, die typischerweise zwischen 50 und 600 Monomer-Einheiten aufweisen.
  • Pharmazeutisch wirksame Menge: Unter einer pharmazeutisch wirksamen Menge im Kontext der vorliegenden Erfindung wird typischerweise eine Menge verstanden, die ausreichend ist, um eine pharmazeutische Wirkung hervorzurufen, wie beispielsweise eine Immunantwort zu induzieren, ein pathologisches Niveau eines exprimierten Peptids oder Proteins zu verändern oder ein fehlendes Genprodukt, beispielsweise im Falle einer pathologischen Situation, zu substituieren.
  • Protein: Ein Protein umfasst typischerweise ein oder mehrere Peptide oder Polypeptide. Ein Protein ist typischerweise in eine dreidimensionale Form gefaltet, welche erforderlich sein kann, damit das Protein seine biologische Funktion ausüben kann.
  • Polv(A)-Sequenz: Unter einer Poly(A)-Sequenz, ebenso als Poly(A)-Schwanz oder 3'-Poly(A)-Schwanz bezeichnet, wird typischerweise eine Sequenz von Adenin-Nukleotiden, zum Beispiel von bis zu etwa 400 Adenosin-Nukleotiden, z.B. von etwa 20 bis etwa 400, bevorzugt von etwa 50 bis etwa 400, bevorzugter von etwa 50 bis etwa 300, noch bevorzugter von etwa 50 bis etwa 250, am meisten bevorzugt von etwa 60 bis etwa 250 Adenosin-Nukleotiden, verstanden, die vorzugsweise an das 3'-Ende einer mRNA angefügt ist. Eine Poly(A)-Sequenz befindet sich typischerweise am 3'-Ende einer mRNA. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann sich eine Poly(A)-Sequenz innerhalb einer mRNA oder irgendeines anderen Nukleinsäuremoleküls, wie beispielsweise in einem Vektor, zum Beispiel in einem Vektor, der als Matrize (Template) für die Erzeugung einer RNA, vorzugsweise einer mRNA, zum Beispiel durch Transkription des Vektors, dient, befinden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „Poly(A)-Sequenz“ ferner auch Sequenzelemente, vorzugsweise artifizielle Sequenzelemente, die Teil der 3'-UTR sind oder sich am 3'-Terminus des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls befinden, und die bevorzugt bis zu 1100 Adenin-Nukleotide, bevorzugter mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder mindestens 1000 Adenin-Nukleotide umfassen.
  • Polyadenylierung: Unter Polyadenylatierung wird typischerweise das Anfügen einer Poly(A)-Sequenz an ein Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise ein RNA-Molekül, zum Beispiel an eine unreife mRNA, verstanden. Polyadenylierung kann durch ein sogenanntes Polyadenylierungssignal induziert werden. Dieses Signal befindet sich vorzugsweise innerhalb eines Abschnitts von Nukleotiden nahe dem oder am 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls, wie beispielsweise eines RNA-Moleküls, welches Polyadenylierung unterzogen werden soll. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann ein Polyadenylierungssignal auch von der 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls umfasst werden. Ein Polyadenylierungssignal umfasst typischerweise ein Hexamer bestehend aus Adenin- und Uracil-/Thymin-Nukleotiden, vorzugsweise die Hexamer-Sequenz AAUAAA. Andere Sequenzen, vorzugsweise Hexamer-Sequenzen, sind ebenso denkbar. Polyadenylierung findet typischerweise während der Prozessierung einer Prä-mRNA (auch als unreife mRNA bezeichnet) statt. Typischerweise umfasst RNA-Reifung (von Prä-mRNA zu reifer mRNA) den Schritt der Polyadenylierung. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann sich der Begriff sowohl auf die Polyadenylierung von RNA als zellulären Prozess als auch auf die Polyadenylierung beziehen, die durch enzymatische Reaktion in vitro oder durch chemische Synthese erfolgt.
  • Restriktionsstelle: Eine Restriktionsstelle, ebenso als „Restriktionsenzymerkennungsstelle“ bezeichnet, ist eine Nukleotidsequenz, die durch ein Restriktionsenzym erkannt wird. Eine Restriktionsstelle ist typischerweise eine kurze, bevorzugt palindromische Nukleotidsequenz, z.B. eine Sequenz, welche 4 bis 8 Nukleotide umfasst. Eine Restriktionsstelle wird vorzugsweise spezifisch durch ein Restriktionsenzym erkannt. Das Restriktionsenzym spaltet typischerweise eine Nukleotidsequenz, welche eine Restriktionsstelle umfasst, an dieser Stelle. In einer doppelsträngigen Nukleotidsequenz, wie beispielsweise einer doppelsträngigen DNA-Sequenz, schneidet das Restriktionsenzym typischerweise beide Stränge der Nukleotidsequenz.
  • RNA, mRNA: RNA ist die übliche Abkürzung für Ribonukleinsäure. Es handelt sich um ein Nukleinsäuremolekül, d.h., ein Polymer, welches aus Nukleotiden besteht. Diese Nukleotide sind üblicherweise Adenosinmonophosphat-, Uridinmonophosphat-, Guanosinmonophosphat- und Cytidinmomophosphat-Monomere, welche miteinander entlang eines sogenannten Rückgrats (Backbone) verbunden sind. Das Rückgrat wird durch Phosphodiesterbindungen zwischen dem Zucker, d.h., der Ribose, eines ersten Monomers und dem Phosphatanteil eines zweiten benachbarten Monomers gebildet. Die spezifische Abfolge der Monomeren wird als RNA-Sequenz bezeichnet. Üblicherweise kann RNA durch Transkription einer DNA-Sequenz, zum Beispiel innerhalb einer Zelle, erhalten werden. In eukaryotischen Zellen erfolgt die Transkription typischerweise im Nukleus oder den Mitochondrien. In vivo führt die Transkription von DNA üblicherweise zu der sogenannten unreifen RNA, die zu sogenannter Messenger-RNA, abgekürzt mRNA, prozessiert werden muss. Die Prozessierung der unreifen RNA, zum Beispiel in einem eukaryotischen Organismus, umfasst eine Vielzahl verschiedener posttranskriptioneller Modifikationen, wie beispielsweise Splicing, 5'-Capping, Polyadenylierung, Export vom Nukleus oder den Mitochondrien und dergleichen. Die Summe dieser Prozesse wird auch als Reifung der RNA bezeichnet. Die reife Messenger-RNA stellt üblicherweise die Nukleotidsequenz bereit, die in eine Aminosäuresequenz eines bestimmten Peptids oder Proteins translatiert werden kann. Typischerweise umfasst eine reife mRNA ein 5'-Cap, eine 5'-UTR, einen offenen Leserahmen, eine 3'-UTR und eine Poly(A)-Sequenz. Neben der Messenger-RNA existieren verschiedene nicht-kodierende RNA-Typen, welche in die Regulation der Transkription und/oder Translation involviert sein können.
  • Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls: Unter der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls wird typischerweise die spezielle und individuelle Reihenfolge, d.h., die Abfolge, ihrer Nukleotide verstanden. Unter der Sequenz eines Proteins oder Peptids wird typischerweise die Reihenfolge, d.h., die Abfolge, der Aminosäuren verstanden.
  • Sequenzidentität: Zwei oder mehr Sequenzen sind identisch, wenn sie die gleiche Länge und Abfolge von Nukleotiden oder Aminosäuren aufweisen. Die prozentuale Identität beschreibt typischerweise den Umfang, in dem zwei Sequenzen identisch sind, d.h., sie beschreibt typischerweise den Prozentsatz von Nukleotiden, die in ihrer Sequenzposition mit identischen Nukleotiden einer Bezugssequenz übereinstimmen. Zur Bestimmung des Grads der Identität wird angenommen, dass die beiden zu vergleichenden Sequenzen die gleiche Länge, d.h., die Länge der längsten der zu vergleichenden Sequenzen, aufweisen. Das bedeutet, dass eine erste Sequenz, welche aus 8 Nukleotiden besteht, zu 80% identisch mit einer zweiten, aus 10 Nukleotiden bestehenden Sequenz ist, welche die erste Sequenz umfassen. Anders ausgedrückt, bezieht sich im Kontext der vorliegenden Erfindung die Identität von Sequenzen bevorzugt auf den Prozentsatz von Nukleotiden einer Sequenz, welche die gleiche Position in zwei oder mehr Sequenzen gleicher Länge aufweisen. Lücken („Gaps“) werden üblicherweise als nicht-identische Positionen, ungeachtet ihrer tatsächlichen Position in einem Alignment, betrachtet.
  • Stabilisiertes Nukleinsäuremolekül: Ein stabilisiertes Nukleinsäuremolekül ist ein Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise ein DNA- oder RNA-Molekül, welches so modifiziert ist, dass es stabiler gegen Zerfall oder Abbau, zum Beispiel durch Umweltfaktoren oder Enzymverdau, wie beispielsweise durch Exo- oder Endonukleaseabbau, ist als das Nukleinsäuremolekül ohne die Modifikation. Vorzugsweise ist ein stabilisiertes Nukleinsäuremolekül im Kontext der vorliegenden Erfindung in einer Zelle, wie beispielsweise einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, vorzugsweise in einer Säugetierzelle, wie beispielsweise einer humanen Zelle, stabilisiert. Die Stabilisierungswirkung kann auch außerhalb von Zellen, zum Beispiel in einer Pufferlösung, zum Beispiel in einem Herstellungssverfahren für eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche das stabilisierte Nukleinsäuremolekül enthält, ausgeübt werden.
  • Transfektion: Der Ausdruck „Transfektion“ bezeichnet das Einführen von Nukleinsäuremolekülen, wie beispielsweise DNA- oder RNA- (zum Beispiel mRNA-) Molekülen, in Zellen, vorzugsweise in eukaryotische Zellen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung schließt der Ausdruck „Transfektion“ jedes der fachkundigen Person bekannte Verfahren zum Einführen von Nukleinsäuremolekülen in Zellen, vorzugsweise in eukaryotische Zellen, wie beispielsweise in Säugetierzellen, ein. Solche Verfahren umfassen zum Beispiel Elektroporation, Lipofektion, zum Beispiel basierend auf kationischen Lipiden und/oder Liposomen, Calciumphosphat-Präzipitation, auf Nanopartikeln basierende Transfektion, auf Viren basierende Transfektion oder Transfektion basierend auf kationischen Polymeren, wie beispielsweise DEAE-Dextran oder Polyethylenimin usw. Vorzugsweise geschieht die Einführung nicht über ein Virus.
  • Vakzine: Unter einer Vakzine wird typischerweise ein prophylaktisches oder therapeutisches Material verstanden, welches mindestens ein Antigen, vorzugsweise ein Immunogen, bereitstellt. Das Antigen oder Immunogen kann von irgendeinem Material abgeleitet sein, das für eine Vakzinierung geeignet ist. Zum Beispiel kann das Antigen oder Immunogen von einem Pathogen, wie beispielsweise von Bakterien- oder Viruspartikeln etc., oder von einem Tumor- oder Krebsgewebe abgeleitet sein. Das Antigen oder Immunogen stimuliert das adaptive Immunsystem des Körpers, wodurch eine adaptive Immunantwort bereitgestellt wird.
  • Vektor: Der Ausdruck „Vektor“ bezeichnet ein Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise ein artifizielles Nukleinsäuremolekül. Ein Vektor im Kontext der vorliegenden Erfindung ist zur Aufnahme oder Beherbergung einer gewünschten Nukleinsäuresequenz, wie beispielsweise einer Nukleinsäuresequenz, welche einen offenen Leserahmen umfasst, geeignet. Solche Vektoren können Aufbewahrungsvektoren, Expressionsvektoren, Klonierungsvektoren, Transfervektoren etc. sein. Ein Aufbewahrungsvektor ist ein Vektor, welcher die bequeme Aufbewahrung/Lagerung eines Nukleinsäuremoleküls, zum Beispiel eines mRNA-Moleküls, ermöglicht. Somit kann der Vektor eine Sequenz umfassen, die zum Beispiel einer gewünschten mRNA-Sequenz oder einem Teil davon entspricht, wie beispielsweise eine Sequenz, die dem offenen Leserahmen und der 3'-UTR einer mRNA entspricht. Ein Expressionsvektor kann zur Herstellung von Expressionsprodukten, wie beispielsweise RNA, zum Beispiel mRNA, oder Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen, eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein Expressionsvektor Sequenzen umfassen, die für die Transkription eines Sequenzabschnitts des Vektors notwendig sind, wie beispielsweise eine Promotorsequenz, zum Beispiel eine RNA-Polymerase-Promotorsequenz. Ein Klonierungsvektor ist typischerweise ein Vektor, der eine Klonierungsstelle enthält, die dazu verwendet werden kann, um Nukleinsäuresequenzen in den Vektor einzufügen. Ein Klonierungsvektor kann zum Beispiel ein Plasmidvektor oder ein Bakteriophagenvektor sein. Ein Transfervektor kann ein Vektor sein, der für die Überführung von Nukleinsäuremolekülen in Zellen oder Organismen geeignet ist, zum Beispiel ein viraler Vektor. Ein Vektor im Kontext der vorliegenden Offenbarung kann zum Beispiel ein RNA-Vektor oder ein DNA-Vektor sein. Vorzugsweise ist ein Vektor ein DNA-Molekül. Bevorzugt umfasst ein Vektor im Sinne der vorliegenden Anmeldung eine Klonierungsstelle, einen Selektionsmarker, wie beispielsweise einen Antibiotikaresistenz-Faktor, und eine Sequenz, die für die Vervielfältigung des Vektors geeignet ist, wie beispielsweise einen Replikationsursprung (Origin). Vorzugsweise ist ein Vektor im Kontext der vorliegenden Anmeldung ein Plasmidvektor.
  • Vehikel: Unter einem Vehikel wird typischerweise ein Material verstanden, das zur Lagerung, zum Transport und/oder zur Verabreichung einer Verbindung, wie beispielsweise einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, geeignet ist. Zum Beispiel kann es sich um eine physiologisch akzeptable Flüssigkeit handeln, die zur Lagerung, zum Transport und/oder zur Verabreichung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung geeignet ist.
  • 3'-untranslatierte Region (3'-UTR): Im Allgemeinen bezeichnet der Begriff „3'-UTR“ einen Teil des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, der 3' (d.h. stromabwärts) eines offenen Leserahmens gelegen ist und der nicht in ein Protein translatiert wird. Eine 3'-UTR ist typischerweise der Teil einer mRNA, der sich zwischen der Protein-kodierenden Region (offener Leserahmen (ORF) oder kodierende Sequenz (CDS)) und der Poly(A)-Sequenz der mRNA befindet. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann eine 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls mehrere 3'-UTR-Elemente umfassen, die unterschiedlichen Ursprungs sein können, wie zum Beispiel Sequenzelemente, die von der 3'-UTR mehrerer (nicht verwandter) natürlich vorkommender Gene stammen. Dementsprechend kann der Begriff 3'-UTR auch Elemente umfassen, die nicht in dem Template kodiert sind, von der eine RNA transkribiert wird, sondern die nach der Transkription während der Reifung hinzugefügt werden, zum Beispiel eine Poly(A)-Sequenz. Eine 3'-UTR der mRNA wird nicht in eine Aminosäuresequenz translatiert. Die 3'-UTR-Sequenz wird im Allgemeinen von dem Gen kodiert, das während des Genexpressionsprozesses in die entsprechende mRNA transkribiert wird. Die genomische Sequenz wird zunächst in eine unreife mRNA transkribiert, die optionale Introns enthält. Die unreife mRNA wird dann in einem Reifungsprozess zu reifer mRNA prozessiert. Dieser Reifungsprozess umfasst die Schritte 5'-Capping, Spleißen der unreifen mRNA, um optionale Introns zu entfernen, und Modifikationen des 3'-Endes, wie zum Beispiel Polyadenylierung des 3'-Endes der unreifen mRNA und optionale Endo- und/oder Exonuklease-Spaltungen usw. Im Kontext der vorliegenden Erfindung entspricht eine 3'-UTR der Sequenz einer reifen mRNA, die sich zwischen dem Stoppcodon der Protein-kodierenden Region, vorzugsweise unmittelbar 3' des Stoppcodons der Protein-kodierenden Region, und der Poly(A)-Sequenz der mRNA befindet. Der Begriff „entspricht“ bedeutet, dass es sich bei der 3'-UTR-Sequenz um eine RNA-Sequenz, wie in der zur Definition der 3'-UTR-Sequenz verwendeten mRNA-Sequenz, oder um eine DNA-Sequenz handeln kann, die einer solchen RNA-Sequenz entspricht. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist der Begriff „3'-UTR eines Gens“, wie z. B. „3'-UTR eines Gens eines ribosomalen Proteins“, die Sequenz, die der 3'-UTR der von diesem Gen abgeleiteten reifen mRNA entspricht, d.h. der mRNA, die durch Transkription des Gens und Reifung der unreifen mRNA erhalten wird. Der Begriff „3'-UTR eines Gens“ umfasst die DNA-Sequenz und die RNA-Sequenz (sowohl Sense- als auch Antisense-Strang und sowohl reife als auch unreife) der 3'-UTR. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „3'-UTR-Element“ typischerweise auf ein Fragment einer 3'-UTR, wie hierin definiert. Insbesondere umfasst der Begriff jedes Nukleinsäuresequenzelement, das 3' zum ORF in dem hierin offenbarten artifiziellen Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise der hierin offenbarten mRNA, gelegen ist. Dementsprechend umfasst der Begriff z.B. Sequenzelemente, die von der 3'-UTR eines heterologen Gens abgeleitet sind, sowie Elemente wie zum Beispiel eine Poly(C)-Sequenz oder einen Histon-Stem-Loop.
  • 5'-untranslatierte Region(5'-UTR): Unter einer 5'-UTR wird typischerweise ein bestimmter Abschnitt einer Messenger-RNA (mRNA) verstanden. Sie befindet sich 5' des offenen Leserahmens der mRNA. Typischerweise beginnt die 5'-UTR mit der Transkriptionsstartstelle und endet ein Nukleotid vor dem Sart-Codon des offenen Leserahmens. Die 5'-UTR kann Elemente für die Kontrolle der Genexpression, die auch als regulatorische Elemente bezeichnet werden, umfassen. Solche regulatorischen Elemente können zum Beispiel ribosomale Bindungsstellen sein. Die 5'-UTR kann posttranskriptionell modifiziert sein, zum Beispiel durch Anfügen eines 5'-Cap. Im Kontext der vorliegenden Erfindung entspricht eine 5'-UTR der Sequenz einer reifen mRNA, die sich zwischen dem 5'-Cap und dem Start-Codon befindet. Vorzugsweise entspricht die 5'-UTR der Sequenz, die sich von einem Nukleotid, das sich 3' von dem 5'-Cap befindet, bevorzugt von einem Nukleotid, das unmittelbar 3' vom 5'-Cap gelegen ist, zu einem Nukleotid, das sich 5' vom Start-Codon der Protein-kodierenden Region befindet, vorzugsweise zu einem Nukleotid, das unmittelbar 5' zu dem Start-Codon der Protein-kodierenden Region gelegen ist, erstreckt. Das Nukleotid, das unmittelbar 3' zu dem 5'-Cap einer reifen mRNA gelegen ist, entspricht typischerweise der Transkriptionsstartstelle. Der Ausdruck „entspricht“ bedeutet, dass die 5'-UTR-Sequenz eine RNA-Sequenz, wie beispielsweise eine mRNA-Sequenz, die zum Definieren der 5'-UTR-Sequenz verwendet wird, oder eine DNA-Sequenz, welche einer solchen RNA-Sequenz entspricht, sein kann. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist der Ausdruck „eine 5'-UTR eines Gens“ die Sequenz, welche der 5'-UTR der reifen mRNA, die von diesem Gen abgeleitet ist, d.h., der mRNA, die durch Transkription des Gens und Reifung der unreifen mRNA erhalten wird, entspricht. Der Ausdruck „5'-UTR eines Gens“ umfasst die DNA-Sequenz und die RNA-Sequenz der 5'-UTR.
  • 5'-terminaler Oligopyrimidintrakt (TOP): Der 5'-terminale Oligopyrimidintrakt (TOP) ist typischerweise einen Abschnitt von Pyrimidin-Nukleotiden, der sich in der 5'-terminalen Region eines Nukleinsäuremoleküls, wie beispielsweise der 5'-terminalen Region bestimmter mRNA-Moleküle oder der 5'-terminalen Region einer funktionellen Einheit, wie beispielsweise der transkribierten Region, bestimmter Gene befindet. Die Sequenz beginnt mit einem Cytidin, welches üblicherweise der Transkriptionsstartstelle entspricht, an das sich ein Abschnitt von gewöhnlich etwa 3 bis 30 Pyrimidin-Nukleotiden anschließt. Das TOP-Gen kann beispielsweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder auch mehr Nukleotide umfassen. Der Pyrimidin-Abschnitt und somit der 5'-TOP, endet ein Nukleotid 5' zu dem ersten Purin-Nukleotid, das sich stromabwärts des TOP befindet. Messenger-RNA, welche einen 5'-terminalen Oligopyrimidintrakt enthält, wird oftmals als 5'-TOP-mRNA bezeichnet. Dementsprechend werden Gene, die derartige Messenger-RNAs bereitstellen, als TOP-Gene bezeichnet. TOP-Sequenzen wurden beispielsweise in Genen und mRNAs gefunden, welche Peptidverlängerungsfaktoren und ribosomale Proteine kodieren.
  • TOP-Motiv: Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein TOP-Motiv eine Nukleinsäuresequenz, welche einem 5'-TOP, wie oben definiert, entspricht. Somit ist ein TOP-Motiv im Kontext der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein Abschnitt von Pyrimidin-Nukleotiden, welcher eine Länge von 3 bis 30 Nukleotiden aufweist. Vorzugsweise besteht das TOP-Motiv aus mindestens 3 Pyrimidin-Nukleotiden, bevorzugt mindestens 4 Pyrimidin-Nukleotiden, bevorzugt mindestens 5 Pyrimidin-Nukleotiden, bevorzugter mindestens 6 Nukleotiden, bevorzugter mindestens 7 Nukleotiden, am meisten bevorzugt mindestens 8 Nukleotiden, wobei der Abschnitt von Pyrimidin-Nukleotiden vorzugsweise am 5'-Ende mit einem Cytosin-Nukleotid beginnt. In TOP-Genen und TOP-mRNAs beginnt das TOP-Motiv vorzugsweise am 5'-Ende mit der Transkriptionsstartstelle und endet ein Nukleotid 5' zu dem ersten Purinrest in dem Gen oder der mRNA. Ein TOP-Motiv im Sinne der vorliegenden Erfindung befindet sich vorzugsweise am 5'-Ende einer Sequenz, welche eine 5'-UTR darstellt, oder am 5'-Ende einer Sequenz, welche für eine 5'-UTR kodiert. Daher wird bevorzugt ein Abschnitt von 3 oder mehr Pyrimidin-Nukleotiden als „TOP-Motiv“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet, wenn sich der Abschnitt am 5'-Ende der jeweiligen Sequenz, wie beispielsweise dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, dem 5'-UTR-Element des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder der Nukleinsäuresequenz, welche von der 5'-UTR eines TOP-Gens, wie hierin beschrieben, abgeleitet ist, befindet. Anders ausgedrückt, wird ein Abschnitt von 3 oder mehr Pyrimidin-Nukleotiden, welche sich nicht am 5'-Ende einer 5'-UTR oder eines 5'-UTR-Elements, sondern irgendwo anders innerhalb einer 5'-UTR oder eines 5'-UTR-Elements befindet, vorzugsweise nicht als TOP-Motiv bezeichnet.
  • TOP-Gen: TOP-Gene sind typischerweise gekennzeichnet durch die Anwesenheit eines 5'-terminalen Oligopyrimidintrakts. Des Weiteren sind die meisten TOP-Gene durch eine wachstumsassoziierte Translationsregulation gekennzeichnet. Es sind jedoch auch TOP-Gene mit einer gewebespezifischen Translationsregulation bekannt. Wie oben definiert, entspricht die 5'-UTR eines TOP-Gens der Sequenz einer 5'-UTR einer reifen mRNA, die von einem TOP-Gen abgeleitet ist, welche sich vorzugsweise von dem Nukleotid, welches sich 3' zu dem 5'-Cap befindet, zu dem Nukleotid, welches sich 5' zu dem Start-Codon befindet, erstreckt. Eine 5'-UTR eines TOP-Gens umfasst typischerweise keinerlei Start-Codons, vorzugsweise keine Upstream-AUGs (uAUGs) oder Upstream-Open-Reading-Frames (uORFs). Hierbei werden unter Upstream-AUGs und Upstream-Open-Reading-Frames typischerweise AUGs und offene Leserahmen verstanden, die 5' des Start-Codons (AUG) des zu translatierenden offenen Leserahmens vorliegen. Die 5'-UTRs der TOP-Gene sind im Allgemeinen eher kurz. Die Längen der 5'-UTRs der TOP-Gene können zwischen 20 Nukleotiden bis zu 500 Nukleotiden variieren, und sie betragen typischerweise weniger als etwa 200 Nukleotide, bevorzugt weniger als etwa 150 Nukleotide, bevorzugter weniger als etwa 100 Nukleotide. Beispielhafte 5'-UTRs von TOP-Genen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, die sich von dem Nukleotid an Position 5 zu dem Nukleotid, welches sich unmittelbar 5' zu dem Start-Codon (z.B. ATG) in den Sequenzen gemäß den SEQ ID NOs. 1-1363 der Patentanmeldung WO 2013/143700 als Bestandteil der vorliegenden Offenbarung befindet. In diesem Zusammenhang ist ein besonders bevorzugtes Fragment einer 5'-UTR eines TOP-Gens eine 5'-UTR eines TOP-Gens, der das 5'-TOP-Motiv fehlt. Die Begriffe „5'-UTR eines TOP-Gens“ oder „5'-TOP-UTR“ beziehen sich vorzugsweise auf die 5'-UTR eines natürlich vorkommenden TOP-Gens.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein artifizielles Nukleinsäuremolekül, umfassend
    1. a) mindestens einen offenen Leserahmen (ORF); und
    2. b) eine 3'-untranslatierte Region (3'-UTR), umfassend mindestens zwei separate Poly(A)-Sequenzen, wobei eine Poly(A)-Sequenz eine Sequenz aus 20 bis 400 Adenin-Nukleotiden ist und wobei die Gesamtzahl an Adenin-Nukleotiden, die von den mindestens zwei separaten Poly(A)-Sequenzen umfasst werden, mindestens 70 beträgt,
    wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül ein mRNA-Molekül ist, welches mindestens einen offenen Leserahmen aufweist, der für ein Antigen kodiert, das von einem mit einer Infektionskrankheit assoziierten viralen Pathogen abgeleitet ist,
    zur Verwendung als Medikament, zur Verwendung als Vakzine oder zur Verwendung in der Gentherapie,
    wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül mit einer kationischen oder polykationischen Verbindung assoziiert oder komplexiert ist, und
    wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül, das Medikament oder die Vakzine intramuskulär verabreicht wird.
  • Darüber hinaus wird hierin ein artifizielles Nukleinsäuremolekül offenbart (nicht beansprucht), welches umfasst:
    1. a) mindestens einen offenen Leserahmen (ORF); und
    2. b) eine 3'-untranslatierte Region (3'-UTR), umfassend
      • b) i) mindestens eine Poly(A)-Sequenz, wobei die mindestens eine Poly(A)-Sequenz mindestens 70 Adenin-Nukleotide umfasst, oder
      • b) ii) ein Polyadenylierungssignal.
  • Das artifizielle Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Offenbarung kann eine RNA, wie beispielsweise eine mRNA, eine DNA, wie beispielsweise ein DNA-Vektor, oder ein modifiziertes RNA- oder DNA-Molekül sein. Es kann als doppelsträngiges Molekül mit einem Sense-Strang und einem Anti-Sense-Strang bereitgestellt werden, zum Beispiel als DNA-Molekül mit einem Sense-Strang und einem Anti-Sense-Strang.
  • Vorzugsweise ist das artifizielle Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung durch eine erhöhte Proteinexpression gegenüber einem Referenz-Nukleinsäuremolekül gekennzeichnet.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein „Referenz-Nukleinsäuremolekül“ ein Nukleinsäuremolekül, das typischerweise den gleichen ORF wie das artifizielle Nukleinsäuremolekül umfasst und dem eine 3'-UTR fehlt oder das eine Referenz-3'-UTR umfasst. Vorzugsweise umfasst das Referenz-Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR (d.h. eine „Referenz-3'-UTR“), die entweder keine Poly(A)-Sequenz umfasst oder die eine Poly(A)-Sequenz umfasst, wobei die Gesamtzahl der Adenin-Nukleotide, die in einer oder mehreren Poly(A)-Sequenzen der 3'-UTR enthalten sind, geringer als die Gesamtzahl der Adenin-Nukleotide, die in der mindestens einen Poly(A)-Sequenz der 3'-UTR des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls enthalten sind, vorzugsweise geringer als 70, ist. Vorzugsweise weist das Referenz-Nukleinsäuremolekül - abgesehen von dem unterschiedlichen Gehalt an Adenin-Nukleotiden in einer Poly(A)-Sequenz - die gleiche Gesamtstruktur auf, d.h. umfasst die gleichen Strukturmerkmale, wie zum Beispiel eine 5'-Cap-Struktur, eine 5'-UTR oder eine 3'-UTR. Noch bevorzugter umfasst das Referenz-Nukleinsäuremolekül - abgesehen von dem unterschiedlichen Gehalt an Adenin-Nukleotiden in einer Poly(A)-Sequenz - die gleiche Nukleinsäuresequenz wie das artifizielle Nukleinsäuremolekül oder besteht daraus. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann die natürlich vorkommende Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel eine mRNA), die den ORF des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls umfasst, auch das Referenz-Nukleinsäuremolekül sein.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst ein RNA-Molekül eine 5'-UTR-, eine ORF- und eine 3'-UTR-Sequenz, wobei die 5'-UTR-Sequenz oder die 3'-UTR-Sequenz in Bezug auf den ORF der mRNA heterolog ist (zum Beispiel wobei die RNA nicht die 5'-UTR-Sequenz und/oder die 3'-UTR-Sequenz einer Wildtyp-RNA umfasst, die den ORF kodiert).
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Gesamtzahl der Adenin-Nukleotide“ typischerweise auf die Summe aller Adenin-Nukleotide, die in einer oder mehreren Poly(A)-Sequenzen in der 3'-UTR des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls enthalten sind. Insbesondere in dem Fall, in dem die 3'-UTR mehr als eine Poly(A)-Sequenz umfasst, bezieht sich der Begriff auf die Summe der Adenin-Nukleotide, die in allen Poly(A)-Sequenzen enthalten sind, die von der 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls umfasst werden.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das hierin offenbarte artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, wobei die Gesamtzahl der Adenin-Nukleotide, die in zwei oder mehreren Poly(A)-Sequenzen der 3'-UTR enthalten sind, mindestens 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 oder 1100 Adenin-Nukleotide beträgt. Gemäß dieser Ausführungsform kann die 3'-UTR beispielsweise zwei, vorzugsweise getrennte, Poly(A)-Sequenzen umfassen, wobei die Summe der in den beiden Poly(A)-Sequenzen enthaltenen Adenin-Nukleotide mindestens 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, oder 800 beträgt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Vielzahl von RNA-Molekülen der Ausführungsformen in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst, wobei mindestens etwa 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr der RNA-Moleküle in der Zusammensetzung eine Poly(A)-Sequenz umfassen, die sich in der Länge um nicht mehr als 10 Nukleotide unterscheiden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen mindestens etwa 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr der RNA-Moleküle in der Zusammensetzung eine Poly(A)-Sequenz mit identischer Länge. In bestimmten Ausführungsformen ist die Poly(A)-Sequenz am 3'-Ende der RNA positioniert, wobei keine anderen Nukleotide 3' relativ zur Poly(A)-Sequenz angeordnet sind. In einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Vielzahl von RNA-Molekülen der Ausführungsformen in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst, wobei die Vielzahl von RNA-Molekülen sowohl gecappte als auch ungecappte RNAs umfasst. In einigen Aspekten umfasst eine Zusammensetzung beispielsweise eine Vielzahl von RNA-Molekülen, wobei nicht mehr als 95%, 90%, 80%, 70% oder 60% der RNAs ein Cap aufweisen und die verbleibenden RNA-Moleküle ohne Cap vorliegen.
  • In einer hierin offenbarten Ausführungsform (nicht beansprucht) umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens eine Poly(A)-Sequenz umfasst, wobei die mindestens eine Poly(A)-Sequenz mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, oder 400 Adenin-Nukleotide umfasst.
  • Die Gesamtzahl der in zwei oder mehreren Poly(A)-Sequenzen enthaltenen Adenin-Nukleotide kann bis zu etwa 1200 Adenin-Nukleotide betragen, z.B. von etwa 70 bis etwa 1100, bevorzugt von etwa 80 bis etwa 800, bevorzugter von etwa 90 bis etwa 700, noch bevorzugter von etwa 100 bis etwa 500, am meisten bevorzugt von etwa 120 bis etwa 450 Adenosin-Nukleotiden. Bevorzugt umfasst die 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls mindestens 75, 80, 85, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220 oder mindestens 225, bevorzugter mindestens 220, Adenin-Nukleotide, die in den zwei oder den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind. Bevorzugt umfasst die 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls 180 bis 1100 Adenin-Nukleotide, die in den zwei oder den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind, bevorzugter 200 bis 1100 Adenin-Nukleotide, noch bevorzugter 210 bis 250 Adenin-Nukleotide, am meisten bevorzugt 215 bis 240 Adenin-Nukleotide. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die 3'-UTR etwa 220 Nukleotide, vorzugsweise etwa 224 Nukleotide. Alternativ dazu umfasst die 3'-UTR mindestens 300 Adenin-Nukleotide, die in den zwei oder den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind, vorzugsweise mindestens 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430 oder mindestens 440 Adenin-Nukleotide, die in den zwei oder den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind. In dieser Ausführungsform umfasst die 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls bevorzugt 300 bis 650 Adenin-Nukleotide, die in den zwei oder den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind, bevorzugter 400 bis 500 Adenin-Nukleotide, noch bevorzugter 420 bis 470 Adenin-Nukleotide, am meisten bevorzugt 430 bis 460 Adenin-Nukleotide. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die 3'-UTR eine Gesamtzahl von etwa 440 Adenin-Nukleotiden, vorzugsweise etwa 444 Adenin-Nukleotiden, die in den zwei oder den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind. Alternativ umfasst die 3'-UTR mindestens 900 Adenin-Nukleotide, die in den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind, bevorzugt mindestens 900, 950 oder mindestens 1000 Adenin-Nukleotide, die in den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind. In dieser Ausführungsform umfasst die 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls vorzugsweise 900 bis 1100 Adenin-Nukleotide, die in den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die 3'-UTR eine Gesamtzahl von etwa 1064 Adenin-Nukleotiden, die in den mehreren Poly(A)-Sequenzen enthalten sind.
  • In einer hierin offenbarten Ausführungsform (nicht beansprucht) umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens eine Poly(A)-Sequenz umfasst, die mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 oder 250 Adenin-Nukleotide, bevorzugter mindestens 150 Adenin-Nukleotide, noch bevorzugter mindestens 160 Adenin-Nukleotide umfasst. Vorzugsweise beträgt die Anzahl der Adenin-Nukleotide in der mindestens einen Poly(A)-Sequenz 110 bis 200, 120 bis 200, 130 bis 190, 140 bis 180 oder 150 bis 170. Alternativ dazu umfasst die 3'-UTR mindestens eine Poly(A)-Sequenz, die bevorzugt mindestens 300 Adenin-Nukleotide, bevorzugter mindestens 350 Adenin-Nukleotide, noch bevorzugter mindestens 380 Adenin-Nukleotide umfasst. Vorzugsweise umfasst die mindestens eine Poly(A)-Sequenz 350 bis 400, 360 bis 400 oder 370 bis 390 Adenin-Nukleotide.
  • In nicht beanspruchten Ausführungsformen kann sich die mindestens eine Poly(A)-Sequenz an jeder beliebigen Position innerhalb der 3'-UTR befinden. So kann sich die mindestens eine Poly(A)-Sequenz am 3'-Terminus der 3'-UTR befinden, d.h. die 3'-UTR enthält vorzugsweise nicht mehr als 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Nukleotid(e), die sich 3' von der Poly(A)-Sequenz befinden; noch bevorzugter enthält die 3'-UTR keine weiteren Elemente, die sich 3' von der Poly(A)-Sequenz befinden. In einer hierin offenbarten Ausführungsform (nicht beansprucht) befindet sich die mindestens eine Poly(A)-Sequenz am 3'-Terminus des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, d.h. das artifizielle Nukleinsäuremolekül enthält vorzugsweise nicht mehr als 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Nukleotid(e), die sich 3' der Poly(A)-Sequenz befinden. Alternativ kann die mindestens eine Poly(A)-Sequenz am 5'-Terminus der 3'-UTR, d.h. unmittelbar 3' des ORF des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, oder innerhalb der 3'-UTR, d.h. flankiert auf der 5'- und der 3'-Seite von anderen 3'-UTR-Elementen, angeordnet sein. Vorzugsweise wird die mindestens eine Poly(A)-Sequenz auf der 3'-Seite von einer Poly(C)-Sequenz und/oder einer Histon-Stem-Loop-Sequenz flankiert. Zusätzlich oder alternativ wird die mindestens eine Poly(A)-Sequenz auf der 5'-Seite von einem 3'-UTR-Element flankiert, das von einem, vorzugsweise humanen, Albumin- oder Globin-Gen, vorzugsweise Albumin7, wie hier definiert, stammt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen umfasst, wobei sich mindestens eine Poly(A)-Sequenz am 3'-Terminus der 3'-UTR befindet und wobei die Poly(A)-Sequenz am 3'-Terminus der 3'-UTR mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, oder 350Adenin-Nukleotide, bevorzugter mindestens 150 Adenin-Nukleotide, noch bevorzugter mindestens 160 Adenin-Nukleotide umfasst. Vorzugsweise beträgt die Anzahl der Adenin-Nukleotide in der Poly(A)-Sequenz, die sich am 3'-Terminus der 3'-UTR befindet, 110 bis 200, 120 bis 200, 130 bis 190, 140 bis 180 oder 150 bis 170. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die am 3'-Terminus der 3'-UTR gelegene Poly(A)-Sequenz etwa 160 oder 380 Adenin-Nukleotide.
  • Erfindungsgemäß umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR mit mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen. Vorzugsweise befindet sich eine erste Poly(A)-Sequenz am 5'-Terminus der 3'-UTR oder an einer Position innerhalb der 3'-UTR, d.h. flankiert auf der 5'- und auf der 3'-Seite von anderen UTR-Elementen, während sich eine zweite Poly(A)-Sequenz an einer Position innerhalb der 3'-UTR oder am 3'-Terminus der 3'-UTR befindet. Vorzugsweise wird die erste Poly(A)-Sequenz auf der 3'-Seite von einer Poly(C)-Sequenz und/oder einer Histon-Stem-Loop-Sequenz flankiert. Zusätzlich oder alternativ wird die erste Poly(A)-Sequenz auf der 5'-Seite von einem 3'-UTR-Element flankiert, das von einem, vorzugsweise humanen, Albumin- oder Globin-Gen, vorzugsweise Albumin7, wie hier definiert, stammt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen, die voneinander durch eine Nukleotidsequenz getrennt sind, die mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 oder 150 Nukleotide umfasst oder daraus besteht, wobei die Nukleotidsequenz vorzugsweise nicht mehr als 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 aufeinanderfolgende Adenin-Nukleotide umfasst. Vorzugsweise umfasst die Nukleotidsequenz, die die erste und die zweite Poly(A)-Sequenz trennt, 1 bis etwa 200 Nukleotide, bevorzugt 10 bis 90, 20 bis 85, 30 bis 80, 40 bis 80, 50 bis 75 oder 55 bis 85 Nukleotide, bevorzugter 55 bis 80 Nukleotide, wobei die Nukleotidsequenz vorzugsweise nicht mehr als 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 aufeinanderfolgende Adenin-Nukleotide umfasst.
  • Vorzugsweise umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen umfasst, wobei die erste und/oder die zweite Poly(A)-Sequenz bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, oder 400 Adenin-Nukleotide, bevorzugter mindestens 150 Adenin-Nukleotide, noch bevorzugter mindestens 160 Adenin-Nukleotide umfasst/umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Poly(A)-Sequenz mindestens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Adenin-Nukleotide, aber nicht mehr als 400 Adenin-Nukleotide. Die erste Poly(A)-Sequenz kann ferner 20 bis 90, 25 bis 85, 35 bis 80 oder 45 bis 75, bevorzugt 60 bis 70, Adenin-Nukleotide umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Poly(A)-Sequenz etwa 60 Adenin-Nukleotide. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Poly(A)-Sequenz etwa 64 Adenin-Nukleotide oder besteht aus diesen. Die zweite Poly(A)-Sequenz umfasst bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, oder 400 Adenin-Nukleotide, bevorzugter mindestens 150 Adenin-Nukleotide, noch bevorzugter mindestens 160 Adenin-Nukleotide. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Poly(A)-Sequenz etwa 160 Adenin-Nukleotide. Alternativ dazu umfasst die zweite Poly(A)-Sequenz bevorzugt mindestens 300 Adenin-Nukleotide, bevorzugter mindestens 350 Adenin-Nukleotide, oder noch bevorzugter mindestens 380 Adenin-Nukleotide, aber nicht mehr als 400 Adenin-Nukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Poly(A)-Sequenz etwa 380 Adeninreste. Vorzugsweise beträgt die Anzahl der in der zweiten Poly(A)-Sequenz enthaltenen Adenin-Nukleotide 110 bis 200, 120 bis 200, 130 bis 190, 140 bis 180 oder 150 bis 170. Alternativ dazu beträgt die Anzahl der Adenin-Nukleotide in der zweiten Poly(A)-Sequenz vorzugsweise 350 bis 400, 360 bis 400 oder 370 bis 390.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen umfasst, wobei die erste Poly(A)-Sequenz am 5'-Terminus der 3'-UTR oder an einer Position innerhalb der 3'-UTR angeordnet ist, d.h. an der 5'- Seite und der 3'-Seite von anderen UTR-Elementen flankiert wird, und mindestens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Adenin-Nukleotide, aber nicht mehr als 400 Adenin-Nukleotide, vorzugsweise 20 bis 90, 25 bis 85, 35 bis 80 oder 45 bis 75, bevorzugt 60 bis 70, bevorzugter etwa 64 Adenin-Nukleotide umfasst. In dieser Ausführungsform umfasst die zweite Poly(A)-Sequenz bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400 Adenin-Nukleotide, aber nicht mehr als 400 Adenin-Nukleotide, bevorzugter mindestens 150 Adenin-Nukleotide, noch bevorzugter mindestens 160 Adenin-Nukleotide, vorzugsweise 110 bis 200, 120 bis 200, 130 bis 190, 140 bis 180 oder 150 bis 170 Adenin-Nukleotide. Dabei ist die zweite Poly(A)-Sequenz bevorzugt 3' von der ersten Poly(A)-Sequenz angeordnet, bevorzugter am 3'-Terminus der 3'-UTR, wie hierin definiert, oder noch bevorzugter am 3'-Terminus des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hierin definiert, wobei die erste und die zweite Poly(A)-Sequenz vorzugsweise getrennt sind, noch bevorzugter getrennt, wie hierin definiert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen umfasst, wobei die erste Poly(A)-Sequenz am 5'-Terminus der 3'-UTR oder an einer Position innerhalb der 3'-UTR angeordnet ist, d.h. an der 5'-Seite und der 3'-Seite von anderen UTR-Elementen flankiert wird, und mindestens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Adenin-Nukleotide, aber nicht mehr als 400 Adenin-Nukleotide, vorzugsweise 20 bis 90, 25 bis 85, 35 bis 80 oder 45 bis 75, bevorzugt 60 bis 70, bevorzugter etwa 64 Adenin-Nukleotide umfasst. In dieser Ausführungsform umfasst die zweite Poly(A)-Sequenz bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, aber nicht mehr als 400 Adenin-Nukleotide, besonders bevorzugt 300 Adenin-Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens 350 Adenin-Nukleotide, bevorzugter mindestens 380 Adenin-Nukleotide, aber nicht mehr als 400 Adenin-Nukleotide, 350 bis 400, 360 bis 400 oder 370 bis 390 Adenin-Nukleotide. Dabei ist die zweite Poly(A)-Sequenz bevorzugt 3' von der ersten Poly(A)-Sequenz angeordnet, bevorzugter am 3'-Ende der 3'-UTR des hierin offenbarten artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wobei die erste und die zweite Poly(A)-Sequenz vorzugsweise getrennt sind, mehr bevorzugt getrennt, wie hierin definiert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen umfasst, wobei die erste Poly(A)-Sequenz am 5'-Terminus der 3'-UTR oder an einer Position innerhalb der 3'-UTR angeordnet ist, d.h. an der 5'-Seite und der 3'-Seite von anderen UTR-Elementen flankiert wird, und mindestens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Adenin-Nukleotide, aber nicht mehr als 400 Adenin-Nukleotide, vorzugsweise 20 bis 90, 25 bis 85, 35 bis 80 oder 45 bis 75, vorzugsweise 60 bis 70, besonders bevorzugt etwa 64 Adenin-Nukleotide umfasst. In dieser Ausführungsform umfasst die zweite Poly(A)-Sequenz vorzugsweise mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, aber nicht mehr als 400 Adenin-Nukleotide. Dabei befindet sich die zweite Poly(A)-Sequenz bevorzugt 3' von der ersten Poly(A)-Sequenz, bevorzugter am 3'-Ende der 3'-UTR des hierin offenbarten artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wobei die erste und die zweite Poly(A)-Sequenz bevorzugt getrennt sind, noch bevorzugter getrennt, wie hierin definiert.
  • Ein hierin offenbartes artifizielles Nukleinsäuremolekül, wie z.B. ein DNA-Molekül, das einen ORF gefolgt von einer 3'-UTR umfasst, kann mindestens einen Abschnitt von Thymidin-Nukleotiden enthalten, der der mindestens einen Poly(A)-Sequenz, wie hier definiert, entspricht und der in eine Poly(A)-Sequenz, wie hier definiert, in der resultierenden mRNA transkribiert werden kann.
  • Zum Beispiel kann das artifizielle Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Offenbarung eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die folgender DNA-Sequenz entspricht:
    Figure DE202015009961U1_0001
  • Die Transkription solcher Sequenzen kann zu artifiziellen Nukleinsäuremolekülen führen, die folgende Sequenz umfassen:
    Figure DE202015009961U1_0002
  • Solche artifiziellen RNA-Moleküle, d.h. artifizielle Nukleinsäuremoleküle, die eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 umfassen, können auch in vitro durch übliche chemische Syntheseverfahren hergestellt werden, ohne dass sie notwendigerweise von einem DNA-Vorläufer transkribiert werden müssen.
  • Alternativ oder zusätzlich können einem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül mehrere Adenin-Nukleotide durch jede andere auf dem Gebiet bekannte Technik angegefügt werden, zum Beispiel durch chemische Synthese oder durch eine Adenylierungsreaktion. Vorzugsweise werden Adenin-Nukleotide einem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, wie hier beschrieben, durch eine enzymatische Adenylierungsreaktion angefügt. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes RNA-Molekül durch Inkubation mit einem geeigneten Enzym, wie zum Beispiel der Poly(A)-Polymerase von E. coli, enzymatisch polyadenyliert werden.
  • In einer Ausführungsform umfasst das hierin offenbarte artifizielle Nukleinsäuremolekül einen ORF und eine 3'-UTR, wobei die 3'-UTR ein Polyadenylierungssignal umfasst. Im Kontext der vorliegenden Offenbarung befindet sich das Polyadenylierungssignal innerhalb der 3'-UTR, am 3'-Terminus der 3'-UTR oder stromabwärts des 3'-Terminus des 3'-UTR-Elements. Vorzugsweise wird das Polyadenylierungssignal, wie es hier verwendet wird, von der 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls umfasst. Noch bevorzugter ist das Polyadenylierungssignal am 3'-Terminus der 3'-UTR angeordnet, d.h. die 3'-UTR enthält bevorzugt nicht mehr als 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Nukleotid(e), die 3' von dem Polyadenylierungssignal angeordnet sind; bevorzugter enthält die 3'-UTR keine weiteren Elemente, die 3' von dem Polyadenylierungssignal angeordnet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich das Polyadenylierungssignal am 3'-Terminus des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, d.h. das artifizielle Nukleinsäuremolekül enthält bevorzugt nicht mehr als 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Nukleotid(e), die 3' von der Poly(A)-Sequenz angeordnet sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das hierin offenbarte artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens eine Poly(A)-Sequenz, vorzugsweise wie hier definiert, und ein Polyadenylierungssignal umfasst. Dabei ist das Polyadenylierungssignal vorzugsweise 3' von der mindestens einen Poly(A)-Sequenz, die in der 3'-UTR enthalten ist, bevorzugter 3' von der äußersten 3'-Poly(A)-Sequenz in der 3'-UTR, angeordnet. Noch bevorzugter befindet sich das Polyadenylierungssignal 3' von der mindestens einen Poly(A)-Sequenz, bevorzugter 3' von der äußersten 3'-Poly(A)-Sequenz, und ist von der Poly(A)-Sequenz durch eine Nukleotidsequenz getrennt, die mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 oder 150 Nukleotide umfasst oder aus diesen besteht, wobei die Nukleotidsequenz bevorzugt nicht mehr als 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 aufeinanderfolgende Adenin-Nukleotide umfasst. Vorzugsweise umfasst die Nukleotidsequenz, die die mindestens eine Poly(A)-Sequenz und das Polyadenylierungssignal trennt, 1 bis etwa 200 Nukleotide, bevorzugt 10 bis 90, 20 bis 85, 30 bis 80, 40 bis 80, 50 bis 75 oder 55 bis 85 Nukleotide, bevorzugter 55 bis 80 Nukleotide, wobei die Nukleotidsequenz vorzugsweise nicht mehr als 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 aufeinanderfolgende Adenin-Nukleotide umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das hierin offenbarte artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen, vorzugsweise wie hierin definiert, und ein Polyadenylierungssignal umfasst, wobei das Polyadenylierungssignal 3' von den mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen angeordnet ist, und wobei bevorzugt jede der mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen und das Polyadenylierungssignal von einer anderen Poly(A)-Sequenz bzw. von dem Polyadenylierungssignal getrennt ist, wobei die trennenden Nukleotidsequenzen wie oben definiert sind. Dabei befindet sich das Polyadenylierungssignal bevorzugt am 3'-Terminus der 3'-UTR, wie hierin definiert, bevorzugter am 3'-Terminus des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hierin definiert.
  • Das artifizielle Nukleinsäuremolekül kann in einer nicht beanspruchten Ausführungsform ein RNA-Molekül, das eine 3'-UTR umfasst, die ein Polyadenylierungssignal, vorzugsweise wie hierin definiert, umfasst, sein, wobei das RNA-Molekül optional außerdem mindestens eine Poly(A)-Sequenz, vorzugsweise wie hierin definiert, umfasst.
  • Das Polyadenylierungssignal umfasst vorzugsweise die Konsensussequenz NN(U/T)ANA, mit N = A oder U, bevorzugt AA(U/T)AAA oder A(U/T)(U/T)AAA Eine solche Konsensussequenz kann von den meisten tierischen und bakteriellen Zellsystemen erkannt werden, zum Beispiel von den Polyadenylierungsfaktoren, wie beispielsweise dem Spaltungs-/Polyadenylierungsspezifitätsfaktor (CPSF), der mit CstF, PAP, PAB2, CFI und/oder CFII zusammenarbeitet. Vorzugsweise befindet sich das Polyadenylierungssignal, bevorzugt die Konsensussequenz NNUANA, weniger als etwa 50 Nukleotide, noch bevorzugter weniger als etwa 30 Basen, am meisten bevorzugt weniger als etwa 25 Basen, beispielsweise 21 Basen, stromabwärts des 3'-Endes des optionalen 3'-UTR-Elements, wie hier definiert. Weiter bevorzugt ist das Polyadenylierungssignal, vorzugsweise die oben definierte Konsensussequenz, wie oben beschrieben angeordnet.
  • Die Transkription eines hierin offenbarten artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, zum Beispiel eines artifiziellen DNA-Moleküls, das ein Polyadenylierungssignal stromabwärts (d.h. in 3'-Richtung) der 3'-UTR umfasst, führt zu einer unreifen RNA, die das Polyadenylierungssignal stromabwärts ihrer 3'-UTR enthält.
  • Die Verwendung eines geeigneten Transkriptionssystems führt dann zum Anhängen einer Poly(A)-Sequenz an die unreife RNA. Bei dem hierin offenbarten artifiziellen Nukleinsäuremolekül kann es sich beispielsweise um ein DNA-Molekül handeln, das eine 3'-UTR, wie hier beschrieben, umfasst, die ein Polyadenylierungssignal umfasst, was bei der Transkription dieses DNA-Moleküls zur Polyadenylierung einer RNA führen kann. Dementsprechend kann eine resultierende RNA eine 3'-UTR umfassen, die mindestens eine Poly(A)-Sequenz umfasst, wobei auf die 3'-UTR eine zusätzliche Poly(A)-Sequenz folgt.
  • Mögliche Transkriptionssysteme sind In-vitro-Transkriptionssysteme oder zelluläre Transkriptionssysteme usw. Dementsprechend kann die Transkription eines hierin offenbarten artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, z.B. die Transkription eines artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, das einen offenen Leserahmen, eine 3'-UTR, wie hierin definiert, und ein Polyadenylierungssignal umfasst, zu einem mRNA-Molekül führen, das einen offenen Leserahmen, eine 3'-UTR, wie hierin definiert, und eine zusätzliche Poly(A)-Sequenz umfasst.
  • Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass die 3'-UTR, die mindestens eine Poly(A)-Sequenz, wie hierin definiert, oder ein Polyadenylierungssignal, wie hierin definiert, umfasst, zu einer erhöhten Expression des Proteins führt, das durch den ORF des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls kodiert wird.
  • „Erhöhte Proteinexpression“ oder „verstärkte Proteinexpression“ bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine erhöhte/verstärkte Proteinexpression zu einem Zeitpunkt nach Initiation der Expression oder eine erhöhte/verstärkte Gesamtmenge des exprimierten Proteins gegenüber der Expression, die durch ein Referenznukleinsäuremolekül induziert wird. Somit ist die Proteinmenge, die zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Initiation der Expression, zum Beispiel nach der Transfektion, des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder nach Verabreichung, zum Beispiel durch Injektion, des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls in ein Gewebe, zum Beispiel nach Transfektion oder Verabreichung einer erfindungsgemäßen mRNA, zum Beispiel 6, 12, 24, 48 oder 72 Stunden nach Transfektion bzw. Verabreichung, beobachtet wird, vorzugsweise höher als die Proteinmenge, die zum gleichen Zeitpunkt nach Initiation der Expression, zum Beispiel nach Transfektion oder Verabreichung, eines Referenz-Nukleinsäuremoleküls, wie zum Beispiel einer Referenz-mRNA, die eine Referenz-3'-UTR umfasst oder der eine 3'-UTR fehlt, beobachtet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die maximale Proteinmenge (bestimmt zum Beispiel durch die Proteinaktivität oder -masse), die von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül exprimiert wird, gegenüber der Proteinmenge, die von einer Referenznukleinsäure exprimiert wird, die eine Referenz-3'-UTR umfasst oder der eine 3'-UTR fehlt, erhöht. Die Spitzenwerte der Expression werden bevorzugt innerhalb von 48 Stunden, bevorzugter innerhalb von 24 Stunden und noch bevorzugter innerhalb von 12 Stunden nach zum Beispiel Transfektion oder Verabreichung an ein Gewebe erreicht.
  • Vorzugsweise ist die Gesamtproteinproduktion von einem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül gegenüber einer Referenznukleinsäure erhöht oder verstärkt. Insbesondere ist die Proteinproduktion vorzugsweise über die Zeitspanne, in der Protein von einem artifiziellen Nukleinsäuremolekül produziert wird, vorzugsweise in einem Zielgewebe oder in einem Säugetier-Expressionssystem, wie zum Beispiel in Säugetierzellen, zum Beispiel in HeLa- oder HDF-Zellen, gegenüber einem Referenz-Nukleinsäuremolekül, dem eine 3'-UTR fehlt oder das eine Referenz-3'-UTR umfasst, erhöht oder verstärkt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die kumulative Menge an exprimiertem Protein über die Zeit erhöht, wenn das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül verwendet wird.
  • Das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise gekennzeichnet durch eine erhöhte Expression des kodierten Proteins im Vergleich zu einem entsprechenden Nukleinsäuremolekül, dem das mindestens eine 3'-UTR-Element fehlt oder das ein Referenz-3'-UTR-Element umfasst („Referenznukleinsäure“), das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die von der 3'-UTR eines Gens für ein ribosomales Protein oder von einer Variante der 3'-UTR eines Gens für ein ribosomales Protein abgeleitet ist.
  • Um die In-vivo-Proteinproduktion durch das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül zu beurteilen, wird die Expression des kodierten Proteins nach Injektion/Transfektion des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls in Zielzellen/-gewebe bestimmt und mit der durch die Referenznukleinsäure induzierten Proteinexpression verglichen. Quantitative Methoden zur Bestimmung der Proteinexpression sind im Fachgebiet bekannt (zum Beispiel Western-Blot, FACS, ELISA, Massenspektometrie). Besonders zweckdienlich ist in diesem Zusammenhang die Bestimmung der Expression von Reporterproteinen wie Luziferase, grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder sekretierter alkalischer Phosphatase (SEAP). So wird eine erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäure oder eine Referenznukleinsäure in das Zielgewebe oder die Zielzelle eingebracht, z.B. durch Transfektion oder Injektion. Einige Stunden oder mehrere Tage (zum Beispiel 6, 12, 24, 48 oder 72 Stunden) nach Initiation der Expression oder nach Einführung des Nukleinsäuremoleküls wird eine Zielzellprobe gewonnen und mittels FACS gemessen und/oder lysiert. Anschließend können die Lysate zum Nachweis des exprimierten Proteins (und damit zur Bestimmung der Effizienz der Proteinexpression) unter Anwendung verschiedener Methoden, zum Beispiel Western-Blot, FACS, ELISA, Massenspektrometrie oder durch Fluoreszenz- oder Lumineszenzmessung, verwendet werden.
  • Wenn also die Proteinexpression von einem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül mit der Proteinexpression von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül zu einem bestimmten Zeitpunkt (z.B. 6, 12, 24, 48 oder 72 Stunden nach Initiation der Expression oder nach Einführung des Nukleinsäuremoleküls) verglichen wird, werden beide Nukleinsäuremoleküle getrennt in das Zielgewebe/die Zielzellen eingeführt, eine Probe aus dem Gewebe/den Zellen nach einem bestimmten Zeitpunkt entnommen, Proteinlysate nach dem jeweiligen Protokoll hergestellt, das an die jeweilige Nachweismethode angepasst ist (zum Beispiel Western Blot, ELISA usw., wie in der Fachwelt bekannt), und das Protein wird mit dem gewählten Detektionsverfahren nachgewiesen. Als Alternative zur Messung der exprimierten Proteinmengen in Zelllysaten - oder zusätzlich zur Messung der Proteinmengen in Zelllysaten vor der Lyse der gesammelten Zellen oder unter paralleler Verwendung eines Aliquots - können die Proteinmengen auch mit Hilfe einer FACS-Analyse bestimmt werden.
  • Wenn die Gesamtproteinmenge für einen bestimmten Zeitraum gemessen werden soll, können Gewebe oder Zellen nach mehreren Zeitpunkten nach Einführung des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls (zum Beispiel 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach Initiation der Expression oder nach Einführung des Nukleinsäuremoleküls; in der Regel von verschiedenen Versuchstieren) entnommen werden, und die Proteinmenge pro Zeitpunkt kann wie oben erläutert bestimmt werden. Zur Berechnung der kumulativen Proteinmenge kann eine mathematische Methode zur Bestimmung der Gesamtproteinmenge verwendet werden, zum Beispiel kann die Fläche unter der Kurve (AUC) nach der folgenden Formel bestimmt werden: AUC = ∫ b f ( x ) d ( x )
    Figure DE202015009961U1_0003
  • Um die Fläche unter der Kurve für die Gesamtproteinmenge zu berechnen, wird das Integral der Gleichung der Expressionskurve von jedem Endpunkt (a und b) berechnet.
  • Somit bezieht sich die „Gesamtproteinproduktion“ vorzugsweise auf die Fläche unter der Kurve (AUC), die die Proteinproduktion über die Zeit darstellt.
  • Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen, wie hierin definiert, und optional außerdem mindestens ein weiteres 3'-UTR-Element, das sich von einer Poly(A)-Sequenz unterscheidet, umfasst. Dabei erhöht das mindestens eine weitere 3'-UTR-Element vorzugsweise die Proteinexpression von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül.
  • In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „3'-UTR-Element“ typischerweise auf ein optionales Element der 3'-UTR des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wobei das 3'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz ist, die sich von einer Poly(A)-Sequenz unterscheidet, d.h. keine Poly(A)-Sequenz ist. Insbesondere bezieht sich der Begriff auf eine Nukleinsäuresequenz, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die von einer 3'-UTR oder von einer Variante einer 3'-UTR abgeleitet ist. Ein „3'-UTR-Element“ bezieht sich vorzugsweise auf eine Nukleinsäuresequenz, die eine 3'-UTR - oder einen Teil davon - einer artifiziellen Nukleinsäuresequenz, wie z.B. einer erfindungsgemäßen artifiziellen mRNA, darstellt oder die für eine 3'-UTR eines artifiziellen Nukleinsäuremoleküls kodiert. Dementsprechend kann ein 3'-UTR-Element im Sinne der vorliegenden Offenbarung vorzugsweise die 3'-UTR einer mRNA, vorzugsweise einer erfindungsgemäßen artifiziellen mRNA, sein, oder es kann die Transkriptionsmatrize (Template) für eine 3'-UTR einer mRNA sein. Ein 3'-UTR-Element ist also vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die der 3'-UTR einer mRNA, vorzugsweise der 3'-UTR einer erfindungsgemäßen artifiziellen mRNA, wie beispielsweise einer mRNA, die durch Transkription eines gentechnisch erzeugten Vektorkonstrukts erhalten wurde, entspricht. Vorzugsweise fungiert ein 3'-UTR-Element im Sinne der vorliegenden Offenbarung als 3'-UTR oder kodiert für eine Nukleotidsequenz, die die Funktion einer 3'-UTR erfüllt.
  • Vorzugsweise sind der mindestens eine offene Leserahmen und die 3'-UTR heterolog. Der Begriff „heterolog“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der offene Leserahmen und die 3'-UTR oder das 3'-UTR-Element in dieser Kombination nicht natürlich (in der Natur) vorkommen. Vorzugsweise stammt die 3'-UTR oder das 3'-UTR-Element von einem anderen Gen als der offene Leserahmen. Beispielsweise kann der ORF von einem anderen Gen als die 3'-UTR abgeleitet sein, zum Beispiel für ein anderes Protein oder dasselbe Protein - aber von einer anderen Spezies - kodieren, usw. Vorzugsweise kodiert der offene Leserahmen nicht für ein ribosomales Protein. In bestimmten Ausführungsformen kodiert der offene Leserahmen bevorzugt nicht für ein Reporterprotein, das zum Beispiel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Globin-Proteinen (insbesondere Beta-Globin), Luciferase-Protein, GFP-Proteinen oder Varianten davon, zum Beispiel Varianten, die mindestens 70% Sequenzidentität mit einem Globin-Protein, einem Luciferase-Protein oder einem GFP-Protein aufweisen.
  • Vorzugsweise ist die mindestens eine 3'-UTR funktionell mit dem ORF verbunden. Das bedeutet vorzugsweise, dass die 3'-UTR mit dem ORF so verbunden ist, dass sie eine Funktion ausüben kann, wie zum Beispiel eine erhöhende, verstärkende oder stabilisierende Funktion auf die Expression des kodierten Peptids oder Proteins oder eine stabilisierende Funktion auf das artifizielle Nukleinsäuremolekül. Vorzugsweise sind der ORF und die 3'-UTR in 5'-3'-Richtung verbunden. Somit umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül vorzugsweise die Struktur 5'-ORF-(optional)-Linker-3'-UTR-3', wobei der Linker vorhanden sein oder fehlen kann. Der Linker kann beispielsweise aus einem oder mehreren Nukleotiden bestehen, wie zum Beispiel einem Abschnitt von 1 bis 50 oder 1 bis 20 Nukleotiden, der zum Beispiel eine oder mehrere RestriktionsenzymErkennungsstellen (Restriktionsstellen) umfasst oder daraus besteht.
  • In einer Ausführungsform umfasst die 3'-UTR des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls optional ein 3'-UTR-Element, das von einem Gen abgeleitet sein kann, das sich auf eine mRNA mit erhöhter Halbwertszeit bezieht (die eine stabile mRNA bereitstellt), zum Beispiel ein 3'-UTR-Element, wie unten definiert und beschrieben.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das optionale 3'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die von einer 3'-UTR eines Gens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Albumin-Gen, einem α-Globin-Gen, einem β-Globin-Gen, einem Gen eines ribosomalen Proteins, einem Tyrosinhydroxylase-Gen, einem Lipoxygenase-Gen und einem Kollagen-alpha-Gen, wie zum Beispiel einem Kollagen-alpha-1 (I)-Gen, oder von einer Variante einer 3'-UTR eines Gens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Albumin-Gen, einem α-Globin-Gen, einem β-Globin-Gen, einem Gen eines ribosomalen Proteins, einem Tyrosinhydroxylase-Gen, einem Lipoxygenase-Gen und einem Kollagen-Alpha-Gen, wie zum Beispiel einem Kollagen-Alpha-1 (I)-Gen gemäß SEQ ID NO. 1369-1390 der Patentanmeldung WO 2013/143700 (dessen Offenbarung einbezogen ist) abgeleitet ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das 3'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die von einer 3'-UTR eines Albumin-Gens, bevorzugt eines Vertebraten-Albumin-Gens, bevorzugter eines Säugetier-Albumin-Gens, am meisten bevorzugt eines humanen Albumin-Gens gemäß SEQ ID NO. 3 abgeleitet ist.
  • 3'-UTR Humanes Albumin SEQ ID NO. 3:
CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA
 AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC
 ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA
 GAATCT
(entspricht SEQ ID NO: 1369 der Patentanmeldung WO 2013/143700 ).
  • In diesem Zusammenhang umfasst besonders bevorzugt die 3'-UTR des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls optional ein 3'-UTR-Element, das eine entsprechende RNA-Sequenz umfasst, die von den Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 1369-1390 der Patentanmeldung WO 2013/143700 oder einem Fragment, Homolog oder einer Variante davon abgeleitet ist.
  • Am meisten bevorzugt umfasst das optionale 3'-UTR-Element die Nukleinsäuresequenz, die von einem Fragment des humanen Albumin-Gens gemäß SEQ ID NO. 4 abgeleitet ist:
  • Albumin7 3'-UTR
    Figure DE202015009961U1_0004
  • In diesem Zusammenhang umfasst besonders bevorzugt das optionale 3'-UTR-Element des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls eine entsprechende RNA-Sequenz der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4 oder besteht aus dieser.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das 3'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz, die von einer 3'-UTR eines α-Globin-Gens, bevorzugt eines Vertebraten-α- oder -β-Globin-Gens, bevorzugter eines Säugetier-α- oder -β-Globin-Gens, am meisten bevorzugt eines humanen α- oder β-Globin-Gens gemäß SEQ ID NO. 5-7, abgeleitet ist:
    • 3'-UTR von Homo sapiens Hämoglobin, alpha 1 (HBA1)
      Figure DE202015009961U1_0005
    • 3'-UTR von Homo sapiens Hämoglobin, Alpha 2 (HBA2)
      Figure DE202015009961U1_0006
      3'-UTR von Homo sapiens Hämoglobin, beta (HBB)
      Figure DE202015009961U1_0007
  • Beispielsweise kann das optionale 3'-UTR-Element den zentralen, α-Komplex-bindenden Teil der 3'-UTR eines α-Globin-Gens, wie beispielsweise eines humanen α-Globin-Gens, vorzugsweise gemäß SEQ ID NO. 8, umfassen oder daraus bestehen:
  • Zentraler, α-Komplex-bindender Teil der 3'-UTR eines α-Globin-Gens (hier auch als „muag“ bezeichnet)
    Figure DE202015009961U1_0008
  • In diesem Zusammenhang umfasst besonders bevorzugt das 3'-UTR-Element der erfindungsgemäßen mRNA eine entsprechende RNA-Sequenz der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 8 oder ein Homolog, ein Fragment oder eine Variante davon oder besteht daraus.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das (optionale) mindestens eine 3'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz, die von der 3'-UTR eines eukaryotischen Gens eines ribosomalen Proteins, bevorzugt von der 3'-UTR eines Vertebraten-Gens eines ribosomalen Proteins, bevorzugter von der 3'-UTR eines Säugetier-Gens eines ribosomalen Proteins, noch bevorzugter von der 3'-UTR eines Primaten-Gens eines ribosomalen Proteins, insbesondere eines humanen Gens eines ribosomalen Proteins, abgeleitet ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das optionale 3'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder entspricht einer Nukleinsäuresequenz, die von der 3'-UTR-Sequenz eines Transkripts abgeleitet ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NM_000661.4, NM_001024921.2, NM_000967.3, NM_001033853.1, NM_000968.3, NM_000969.3, NM_001024662.1, NM_000970.3, NM_000971.3, NM_000972.2, NM_000975.3, NM_001199802.1, NM_000976.3, NM_000977.3, NM_033251.2, NM_001243130.1, NM_001243131, NM_000978.3, NM_000979.3, NM_001270490.1, NM_000980.3, NM_000981.3, NM_000982.3, NM_000983.3, NM_000984.5, NM_000985.4, NM_001035006.2, NM_001199340.1, NM_001199341.1, NM_001199342.1, NM_001199343.1, NM_001199344.1, NM 001199345.1, NM_000986.3, NM_000987.3, NM_000988.3, NM_000989.3, NM_000990.4, NM_001136134.1, NM_000991.4, NM_001136135.1, NM_001136136.1, NM_001136137.1, NM_000992.2, NM_000993.4, NM_001098577.2, NM_001099693.1, NM_000994.3, NM_001007073.1, NM_001007074.1, NM_000996.2, NM_000997.4, NM_000998.4, NM_000999.3, NM_001035258.1, NM_001000.3, NM_001002.3, NM_053275.3, NM_001003.2, NM_213725.1, NM_001004.3, NM_001005.4, NM_001256802.1, NM_001260506.1, NM_001260507.1, NM_001006.4, NM_001267699.1, NM_001007.4, NM_001008.3, NM_001009.3, NM_001010.2, NM_001011.3, NM_001012.1, NM_001013.3, NM_001203245.2, NM_001014.4, NM_001204091.1, NM_001015.4, NM_001016.3, NM_001017.2, NM_001018.3, NM_001030009.1, NM_001019.4, NM_001020.4, NM_001022.3, NM_001146227.1, NM_001023.3, NM_001024.3, NM_001025.4, NM_001028.2, NM_001029.3, NM_001030.4, NM_002954, NM_001135592.2, NM_001177413.1, NM_001031.4, NM_001032.4, NM_001030001.2, NM_002948.3, NM_001253379.1, NM_001253380.1, NM_001253382.1, NM_001253383.1, NM_001253384.1, NM_002952.3, NM_001034996.2, NM_001025071.1, NM_001025070.1, NM_005617.3, NM_006013.3, NM_001256577.1, NM_001256580.1, NM 007104.4, NM_007209.3, NM_012423.3, NM_001270491.1, NM_033643.2, NM_015414.3, NM_021029.5, NM_001199972.1, NM_021104.1, NM_022551.2, NM_033022.3, NM_001142284.1, NM_001026.4, NM_001142285.1, NM_001142283.1, NM_001142282.1, NM_000973.3, NM_033301.1, NM_000995.3, NM_033625.2, NM_001021.3, NM_002295.4, NM_001012321.1, NM_001033930.1, NM_003333.3, NM_001997.4, NM_001099645.1, NM_001021.3, NM_052969.1, NM_080746.2, NM_001001.4, NM_005061.2, NM_015920.3, NM_016093.2, NM_198486.2, NG_011172.1, NG_011253.1, NG_000952.4, NR_002309.1, NG_010827.2, NG_009952.2, NG_009517.1
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das 3'-UTR-Element des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls von der 3'-UTR-Region eines Gens abgeleitet, das ein ribosomales Protein kodiert, vorzugsweise von der 3'-UTR-Region des ribosomalen Proteins L9 (RPL9), des ribosomalen Proteins L3 (RPL3), des ribosomalen Proteins L4 (RPL4), des ribosomalen Proteins L5 (RPL5), des ribosomalen Proteins L6 (RPL6), des ribosomalen Proteins L7 (RPL7), des ribosomalen Proteins L7a (RPL7A), des ribosomalen Proteins L11 (RPL11), des ribosomalen Proteins L12 (RPL12), des ribosomalen Proteins L13 (RPL13), des ribosomalen Proteins L23 (RPL23), des ribosomalen Proteins L18 (RPL18), des ribosomalen Proteins L18a (RPL18A), des ribosomalen Proteins L19 (RPL19), des ribosomalen Proteins L21 (RPL21), des ribosomalen Proteins L22 (RPL22), des ribosomalen Proteins L23a (RPL23A), des ribosomalen Proteins L17 (RPL17), des ribosomalen Proteins L24 (RPL24), des ribosomalen Proteins L26 (RPL26), des ribosomalen Proteins L27 (RPL27), des ribosomalen Proteins L30 (RPL30), des ribosomalen Proteins L27a (RPL27A), des ribosomalen Proteins L28 (RPL28), des ribosomalen Proteins L29 (RPL29), des ribosomalen Proteins L31 (RPL31), des ribosomalen Proteins L32 (RPL32), des ribosomalen Proteins L35a (RPL35A), des ribosomalen Proteins L37 (RPL37), des ribosomalen Proteins L37a (RPL37A), des ribosomalen Proteins L38 (RPL38), des ribosomalen Proteins L39 (RPL39), des ribosomalen Proteins, large, P0 (RPLP0), des ribosomalen Proteins, large, P1 (RPLP1), des ribosomalen Proteins, large, P2 (RPLP2), des ribosomalen Proteins S3 (RPS3), des ribosomalen Proteins S3A (RPS3A), des ribosomalen Proteins S4, X-linked (RPS4X), des ribosomalen Proteins S4, Y-linked 1 (RPS4Y1), des ribosomalen Proteins S5 (RPS5), des ribosomalen Proteins S6 (RPS6), des ribosomalen Proteins S7 (RPS7), des ribosomalen Proteins S8 (RPS8), des ribosomalen Proteins S9 (RPS9), des ribosomalen Proteins S10 (RPS10), des ribosomalen Proteins S11 (RPS11), des ribosomalen Proteins S12 (RPS12), des ribosomalen Proteins S13 (RPS13), des ribosomalen Proteins S15 (RPS15), des ribosomalen Proteins S15a (RPS15A), des ribosomalen Proteins S16 (RPS16), des ribosomalen Proteins S19 (RPS19), des ribosomalen Proteins S20 (RPS20), des ribosomalen Proteins S21 (RPS21), des ribosomalen Proteins S23 (RPS23), des ribosomalen Proteins S25 (RPS25), des ribosomalen Proteins S26 (RPS26), des ribosomalen Proteins S27 (RPS27), des ribosomalen Proteins S27a (RPS27a), des ribosomalen Proteins S28 (RPS28), des ribosomalen Proteins S29 (RPS29), des ribosomalen Proteins L15 (RPL15), des ribosomalen Proteins S2 (RPS2), des ribosomalen Proteins L14 (RPL14), des ribosomalen Proteins S14 (RPS14), des ribosomalen Proteins L10 (RPL10), des ribosomalen Proteins L10a (RPL10A), des ribosomalen Proteins L35 (RPL35), des ribosomalen Proteins L13a (RPL13A), des ribosomalen Proteins L36 (RPL36), des ribosomalen Proteins L36a (RPL36A), des ribosomalen Proteins L41 (RPL41), des ribosomalen Proteins S18 (RPS18), des ribosomalen Proteins S24 (RPS24), des ribosomalen Proteins L8 (RPL8), des ribosomalen Proteins L34 (RPL34), des ribosomalen Proteins S17 (RPS17), des ribosomalen Proteins SA (RPSA) oder des ribosomalen Proteins S17 (RPS17). In einer alternativen Ausführungsform kann das 3'-UTR-Element von einem Gen abgeleitet sein, das für ein ribosomales Protein kodiert, oder von einem Gen, das ausgewählt ist aus: Ubiquitin-A-52-Rest-ribosomales-Protein-Fusionsprodukt 1 (UBA52), Finkel-Biskis-Reilly murines Sarkomavirus (FBR-MuSV) ubiquitär exprimiert (FAU), ribosomales Protein L22-like 1 (RPL22L1), ribosomales Protein L39-like (RPL39L), ribosomales Protein L10-like (RPL10L), ribosomales Protein L36a-like (RPL36AL), ribosomales Protein L3-like (RPL3L), ribosomales Protein S27-like (RPS27L), ribosomales Protein L26-like 1 (RPL26L1), ribosomales Protein L7-like 1 (RPL7L1), ribosomales Protein L13a-Pseudogen (RPL13AP), ribosomales Protein L37a-Pseudogen 8 (RPL37AP8), ribosomales Protein S10 Pseudogen 5 (RPS10P5), ribosomales Protein S26 Pseudogen 11 (RPS26P11), ribosomales Protein L39 Pseudogen 5 (RPL39P5), ribosomales Protein, large, P0 Pseudogen 6 (RPLP0P6) und ribosomales Protein L36 Pseudogen 14 (RPL36P14).
  • Vorzugsweise umfasst das mindestens eine 3'-UTR-Element des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens etwa 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30 oder 40%, bevorzugt von mindestens etwa 50%, bevorzugt von mindestens etwa 60%, bevorzugt von mindestens etwa 70%, bevorzugt von mindestens etwa 80%, bevorzugter von mindestens etwa 90%, noch bevorzugter von mindestens etwa 95%, noch bevorzugter von mindestens etwa 99%, am meisten bevorzugt von 100% mit der Nukleinsäuresequenz einer 3'-UTR eines Gens für ein ribosomales Protein, wie beispielsweise mit den Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NOs: 10 bis 115, wie in der internationalen Patentanmeldung PCT/ EP2013/003946 definiert, oder der entsprechenden RNA-Sequenz aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das (optionale) mindestens eine 3'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens etwa 40%, bevorzugt von mindestens etwa 50%, bevorzugt von mindestens etwa 60%, bevorzugt von mindestens etwa 70%, bevorzugter von mindestens etwa 80%, bevorzugter von mindestens etwa 90%, noch bevorzugter von mindestens etwa 95%, noch bevorzugter von mindestens etwa 99%, am meisten bevorzugt von 100% mit der 3'-UTR-Sequenz des ribosomalen Proteins Small 9 (RPS9) aufweist. Am meisten bevorzugt umfasst das (optionale) mindestens eine 3'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens etwa 40%, bevorzugt von mindestens etwa 50%, bevorzugt von mindestens etwa 60%, bevorzugt von mindestens etwa 70%, bevorzugter von mindestens etwa 80%, bevorzugter von mindestens etwa 90%, noch bevorzugter von mindestens etwa 95%, noch bevorzugter von mindestens etwa 99%, am meisten bevorzugt von 100% mit SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 aufweist
    Figure DE202015009961U1_0009
    Figure DE202015009961U1_0010
  • Der Begriff „eine Nukleinsäuresequenz, die von der 3'-UTR eines [...] Gens abgeleitet ist“ bezieht sich vorzugsweise auf eine Nukleinsäuresequenz, die auf der 3'-UTR-Sequenz eines [... ] Gens oder eines Teils davon, wie zum Beispiel auf der 3'-UTR eines Albumin-Gens, eines α-Globin-Gens, eines β-Globin-Gens, eines Gens eines ribosomalen Proteins, eines Tyrosinhydroxylase-Gens, eines Lipoxygenase-Gens oder eines Kollagen-alpha-Gens, wie beispielsweise eines Kollagen-alpha-1(I)-Gens, vorzugsweise eines Albumin-Gens oder eines Teils davon, basiert. Dieser Begriff umfasst Sequenzen, die der gesamten 3'-UTR-Sequenz entsprechen, d.h. der Volllängen-3'-UTR-Sequenz eines Gens, und Sequenzen, die einem Fragment der 3'-UTR-Sequenz eines Gens, wie zum Beispiel eines Albumin-Gens, α-Globin-Gens, β-Globin-Gens, eines Gens eines ribosomalen Proteins, eines Tyrosinhydroxylase-Gens, Lipoxygenase-Gens oder Kollagen-Alpha-Gens, wie zum Beispiel eines Kollagen-Alpha-1 (I)-Gens, vorzugsweise eines Albumin-Gens, entsprechen.
  • Der Ausdruck „Nukleinsäuresequenz, die von der 3'-UTR eines [...]-Gens abgeleitet ist“ bezieht sich vorzugsweise auf eine Nukleinsäuresequenz, die auf der 3'-UTR-Sequenz eines [...]-Gens, vorzugsweise eines oben beschriebenen Gens, oder auf einem Fragment oder Teil davon basiert. Dieser Ausdruck umfasst Sequenzen, die der gesamten 3'-UTR-Sequenz, d.h. der Volllängen-3'-UTR-Sequenz des Gens, entsprechen, sowie Sequenzen, die einem Fragment der 3'-UTR-Sequenz des Gens entsprechen. Vorzugsweise besteht ein Fragment einer 3'-UTR eines [...]-Gens aus einem kontinuierlichen Abschnitt von Nukleotiden, der einem kontinuierlichen Abschnitt von Nukleotiden in der Volllängen-3'-UTR des [...] Gens entspricht, der mindestens 5%, 10%, 20%, bevorzugt mindestens 30%, bevorzugter mindestens 40%, bevorzugter mindestens 50%, noch bevorzugter mindestens 60%, noch bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 80% und am meisten bevorzugt mindestens 90% der Volllängen-3'-UTR eines [...]-Gens darstellt. Ein solches Fragment im Sinne der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein funktionelles Fragment, wie hierin beschrieben. Vorzugsweise behält das Fragment eine regulatorische Funktion für die Translation des mit der 3'-UTR oder dem Fragment davon verbundenen ORF bei. Der Begriff „3'-UTR eines [...] Gens“ bezieht sich vorzugsweise auf die 3'-UTR eines natürlich vorkommenden Gens, vorzugsweise wie hier beschrieben.
  • Die Begriffe „Variante der 3'-UTR eines [...] Gens“ und „Variante davon“ beziehen sich in diesem Zusammenhang auf eine Variante der 3'-UTR eines natürlich vorkommenden Gens. Eine solche Variante kann eine modifizierte 3'-UTR dieses Gens sein. Beispielsweise kann eine 3'-UTR-Variante eine oder mehrere Nukleotiddeletionen, - insertionen, -additionen und/oder -substitutionen gegenüber der natürlich vorkommenden 3'-UTR aufweisen, von der die Variante abgeleitet ist. Vorzugsweise ist eine Variante einer 3'-UTR eines Gens, wie sie hier verwendet wird, zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%, bevorzugter zu mindestens 60%, bevorzugter zu mindestens 70%, noch bevorzugter zu mindestens 80%, noch bevorzugter zu mindestens 90%, am meisten bevorzugt zu mindestens 95% identisch mit der natürlich vorkommenden 3'-UTR, von der die Variante abgeleitet ist. Vorzugsweise ist die Variante eine funktionelle Variante, wie hierin beschrieben.
  • Die Begriffe „funktionelle Variante“, „funktionelles Fragment“ und „funktionelles Fragment einer Variante“ (auch als „Fragment einer funktionellen Variante“ bezeichnet) bedeuten im Kontext der vorliegenden Erfindung, dass das Fragment der 3'-UTR eines Gens, die Variante der 3'-UTR eines Gens, oder das Fragment einer Variante der 3'-UTR eines Gens mindestens eine, vorzugsweise mehr als eine, Funktion der natürlich vorkommenden 3'-UTR des jeweiligen Gens erfüllt, von dem die Variante, das Fragment oder das Fragment einer Variante abgeleitet ist. Eine solche Funktion kann beispielsweise die Stabilisierung der mRNA und/oder die Verstärkung, Stabilisierung und/oder Verlängerung der Proteinproduktion von einer mRNA und/oder die Erhöhung der Proteinexpression oder der Gesamtproteinproduktion von einer mRNA sein, vorzugsweise in einer Säugetierzelle, wie z.B. in einer humanen Zelle. Bevorzugt betrifft die Funktion der 3'-UTR eines Gens, wie hier beschrieben, die Translation des von dem ORF kodierten Proteins. Noch bevorzugter schließt die Funktion die Verstärkung der Translationseffizienz des mit der 3'-UTR verbundenen ORF oder eines Fragments oder einer Variante davon ein. Besonders bevorzugt erfüllen die Variante, das Fragment und das Fragment einer Variante im Kontext der vorliegenden Erfindung die Funktion der Stabilisierung einer mRNA, vorzugsweise in einer Säugetierzelle, wie zum Beispiel einer humanen Zelle, im Vergleich zu einer mRNA, die eine Referenz-3'-UTR umfasst oder der eine 3'-UTR fehlt, und/oder die Funktion der Verstärkung, Stabilisierung und/oder Verlängerung der Proteinproduktion von einer mRNA, vorzugsweise in einer Säugetierzelle, wie zum Beispiel in einer humanen Zelle, im Vergleich zu einer mRNA, die eine Referenz-3'-UTR umfasst oder der eine 3'-UTR fehlt, und/oder die Funktion der Erhöhung der Proteinproduktion von einer mRNA, vorzugsweise in einer Säugetierzelle, wie zum Beispiel in einer humanen Zelle, im Vergleich zu einer mRNA, die eine Referenz-3'-UTR umfasst oder der eine 3'-UTR fehlt. Eine Referenz-3'-UTR kann zum Beispiel eine 3'-UTR sein, die natürlicherweise in Kombination mit dem ORF vorkommt. Darüber hinaus hat eine funktionelle Variante, ein funktionelles Fragment oder ein funktionelles Fragment einer Variante einer 3'-UTR eines Gens, wie hierin beschrieben, vorzugsweise keine wesentlich vermindernde Wirkung auf die Effizienz der Translation der mRNA, die eine solche Variante, ein solches Fragment oder ein solches Fragment einer Variante einer 3'-UTR enthält, im Vergleich zu der Wildtyp-3'-UTR, von der die Variante, das Fragment oder das Fragment einer Variante abgeleitet ist. Eine besonders bevorzugte Funktion eines „funktionellen Fragments“, einer „funktionellen Variante“ oder eines „funktionellen Fragments einer Variante“ der 3'-UTR eines Gens im Kontext der vorliegenden Erfindung ist die Erhöhung, Verstärkung, Stabilisierung und/oder Verlängerung der Proteinproduktion durch Expression einer mRNA, die das funktionelle Fragment, die funktionelle Variante oder das funktionelle Fragment einer Variante, wie oben beschrieben, trägt.
  • Vorzugsweise wird die Effizienz der einen oder mehreren Funktionen, die von der funktionellen Variante, dem funktionellen Fragment oder dem Fragment der funktionellen Variante ausgeübt werden, wie z.B. die die mRNA und/oder Proteinproduktion stabilisierende Effizienz und/oder die die Proteinproduktion erhöhende Effizienz, um mindestens 5%, bevorzugter um mindestens 10%, bevorzugter um mindestens 20%, bevorzugter um mindestens 30%, bevorzugter um mindestens 40%, bevorzugter um mindestens 50%, bevorzugter um mindestens 60%, noch bevorzugter um mindestens 70%, noch bevorzugter um mindestens 80%, am meisten bevorzugt um mindestens 90% in Bezug auf die die mRNA und/oder die Proteinproduktion stabilisierende Effizienz und/oder die die Proteinproduktion erhöhende Effizienz, die die natürlich vorkommende 3'-UTR des jeweiligen Gens, von dem die Variante, das Fragment oder das Fragment einer Variante abgeleitet ist, aufweist, erhöht.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung weist ein Fragment der 3'-UTR eines Gens, wie hierin beschrieben, oder einer Variante der 3'-UTR eines solchen Gens vorzugsweise eine Länge von mindestens etwa 3 Nukleotiden, bevorzugt von mindestens etwa 5 Nukleotiden, bevorzugter von mindestens etwa 10, 15, 20, 25 oder 30 Nukleotiden, noch bevorzugter von mindestens etwa 50 Nukleotiden, am meisten bevorzugt von mindestens etwa 70 Nukleotiden auf. Vorzugsweise ist ein solches Fragment der 3'-UTR eines Gens oder einer Variante der 3'-UTR eines Gens ein funktionelles Fragment, wie oben beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die 3'-UTR eines Gens oder eines Fragments oder einer Variante davon eine Länge zwischen 3 und etwa 500 Nukleotiden, bevorzugt zwischen 5 und etwa 150 Nukleotiden, bevorzugter zwischen 10 und 100 Nukleotiden, noch bevorzugter zwischen 15 und 90 Nukleotiden, am meisten bevorzugt zwischen 20 und 70 Nukleotiden auf.
  • Vorzugsweise umfasst das mindestens eine 3'-UTR-Element des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls ein „funktionelles Fragment“, eine „funktionelle Variante“ oder ein „funktionelles Fragment einer Variante“ der 3'-UTR eines Gens, wie hier beschrieben, oder besteht daraus.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erhöht das mindestens eine weitere 3'-UTR-Element, das optional in der 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls enthalten sein kann und das sich von einer Poly(A)-Sequenz unterscheidet, die Stabilität des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, z.B. die Stabilität einer mRNA, im Vergleich zu einer entsprechenden Nukleinsäure (Referenznukleinsäure), der eine 3'-UTR fehlt oder die eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das optionale 3'-UTR-Element fehlt, wie zum Beispiel eine 3'-UTR, die natürlicherweise in Kombination mit dem ORF vorkommt. Vorzugsweise erhöht das mindestens eine 3'-UTR-Element des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls die Stabilität der Proteinproduktion von dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül, z.B. von einer erfindungsgemäßen mRNA, im Vergleich zu einer entsprechenden Nukleinsäure, der ein 3'-UTR-Element fehlt oder die eine Referenz-3'-UTR umfasst, wie z.B. eine 3'-UTR, die natürlicherweise in Kombination mit dem ORF vorkommt. Vorzugsweise verlängert das mindestens eine 3'-UTR-Element des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls die Proteinproduktion von dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül, z.B. von einer erfindungsgemäßen mRNA, im Vergleich zu einer entsprechenden Nukleinsäure, der eine 3'-UTR fehlt oder die eine Referenz-3'-UTR umfasst, wie z.B. eine 3'-UTR, die natürlicherweise in Kombination mit dem ORF vorkommt. Vorzugsweise erhöht das mindestens eine 3'-UTR-Element des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls die Proteinexpression und/oder die Gesamtproteinproduktion von dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül, z.B. von einer erfindungsgemäßen mRNA, im Vergleich zu einer entsprechenden Nukleinsäure, der eine 3'-UTR fehlt oder die eine Referenz-3'-UTR umfasst, wie zum Beispiel eine 3'-UTR, die natürlicherweise in Kombination mit dem ORF vorkommt. Vorzugsweise hat das mindestens eine 3'-UTR-Element des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls keinen negativen Einfluss auf die Translationseffizienz einer Nukleinsäure im Vergleich zu der Translationseffizienz einer entsprechenden Nukleinsäure, der eine 3'-UTR fehlt oder die eine Referenz-3'-UTR umfasst, wie beispielsweise eine 3'-UTR, die natürlicherweise in Kombination mit dem ORF vorkommt. Noch bevorzugter ist die Translationseffizienz durch die 3'-UTR im Vergleich zur Translationseffizienz des durch den jeweiligen ORF kodierten Proteins in seinem natürlichen Kontext erhöht.
  • Der Begriff „jeweiliges Nukleinsäurerholekül“ oder „Referenznukleinsäuremolekül“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass - abgesehen von den unterschiedlichen 3'-UTRs - das Referenznukleinsäuremolekül mit dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül, das das 3'-UTR-Element umfasst, vergleichbar, vorzugsweise identisch ist. Insbesondere kann ein Referenznukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz und Elemente, wie zum Beispiel ORF und 3'-UTR, umfassen, die sich von dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül nur durch das optionale mindestens eine 3'-UTR-Element unterscheiden, das sich von einer Poly(A)-Sequenz unterscheidet.
  • Der Begriff „Stabilisierung und/oder Verlängerung der Proteinproduktion“ von einem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise einer artifiziellen mRNA, bedeutet vorzugsweise, dass die Proteinproduktion von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise der artifiziellen mRNA, im Vergleich zur Proteinproduktion von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel einer Referenz-mRNA, die eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das 3'-UTR-Element fehlt, oder der eine 3'-UTR ganz fehlt, vorzugsweise in einem Säugetier-Expressionssystem, wie zum Beispiel in HeLa- oder HDF-Zellen, stabilisiert und/oder verlängert ist. Auf diese Weise ist das von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, zum Beispiel der artifiziellen mRNA, hergestellte Protein über einen längeren Zeitraum nachweisbar, als dies bei einem von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül hergestellten Protein der Fall ist. Mit anderen Worten: Die Menge des von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise der artifiziellen mRNA, hergestellten Proteins, die im Laufe der Zeit gemessen wird, unterschreitet zu einem späteren Zeitpunkt einen Schwellenwert als die Menge des von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel einer Referenz-mRNA, produzierten Proteins, die im Laufe der Zeit gemessen wird. Ein solcher Schwellenwert kann zum Beispiel die in der Anfangsphase der Expression gemessene Proteinmenge sein, wie zum Beispiel 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Stunden nach Initiation der Expression, wie zum Beispiel nach der Transfektion des Nukleinsäuremoleküls.
  • Zum Beispiel ist die Proteinproduktion von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise einer artifiziellen mRNA, - in einer Menge, die mindestens der in der Anfangsphase der Expression, wie zum Beispiel 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Stunden nach Initiation der Expression, wie zum Beispiel nach der Transfektion des Nukleinsäuremoleküls, beobachteten Menge entspricht - um mindestens etwa 5 Stunden, bevorzugt um mindestens etwa 10 Stunden, bevorzugter um mindestens etwa 24 Stunden im Vergleich zur Proteinproduktion von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel einer Referenz-mRNA, in einem Säugetier-Expressionssystem, wie zum Beispiel in Säugetierzellen, zum Beispiel in HeLa- oder HDF-Zellen, verlängert. Somit ermöglicht das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül vorzugsweise eine verlängerte Proteinproduktion in einer Menge, die mindestens der in der Anfangsphase der Expression, wie zum Beispiel 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Stunden nach Initiation der Expression, wie z.B. nach der Transfektion, beobachteten Menge entspricht, um mindestens etwa 5 Stunden, bevorzugt um mindestens etwa 10 Stunden, bevorzugter um mindestens etwa 24 Stunden im Vergleich zu einem Referenz-Nukleinsäuremolekül, dem eine 3'-UTR fehlt oder das ein Referenz-3'-UTR umfasst, der das 3'-UTR-Element fehlt.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist der Zeitraum der Proteinproduktion von dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül mindestens um das 1,5-fache, bevorzugt mindestens um das 2-fache, bevorzugter mindestens um das 2,5-fache im Vergleich zur Proteinproduktion von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül, dem eine 3'-UTR fehlt oder das ein Referenz-3'-UTR-Element enthält, dem das 3'-UTR-Element fehlt, verlängert.
  • Dieser Effekt der Verlängerung der Proteinproduktion kann bestimmt werden durch (i) Messung der Proteinmengen, die zum Beispiel durch Expression eines kodierten Reporterproteins, wie beispielsweise Luziferase, vorzugsweise in einem Säugetier-Expressionssystem, wie zum Beispiel in HeLa- oder HDF-Zellen, im Laufe der Zeit, erhalten werden, (ii) Bestimmung des Zeitpunkts, zu dem die Proteinmenge die beobachtete Proteinmenge unterschreitet, zum Beispiel, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Stunden nach Initiation der Expression, zum Beispiel 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Stunden nach Transfektion des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, und (iii) Vergleichen des Zeitpunkts, zu dem die Proteinmenge die 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Stunden nach Initiation der Expression beobachtete Proteinmenge unterschreitet, mit dem Zeitpunkt, der für ein Nukleinsäuremolekül bestimmt wurde, dem eine 3'-UTR fehlt oder das eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das 3'-UTR-Element fehlt.
  • Vorzugsweise wird dieser stabilisierende und/oder verlängernde Effekt auf die Proteinproduktion erreicht, während die Gesamtmenge an Protein, die von dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül produziert wird, z.B. innerhalb einer Zeitspanne von 48 oder 72 Stunden, mindestens die Menge an Protein ist, die von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül produziert wird, dem eine 3'-UTR fehlt oder das eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das 3'-UTR-Element fehlt, wie z.B. eine 3'-UTR, die natürlicherweise mit dem ORF des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls vorkommt. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verfügung, das eine verlängerte und/oder stabilisierte Proteinproduktion in einem Säugetier-Expressionssystem, wie z.B. in Säugetierzellen, z.B. in HeLa- oder HDF-Zellen, wie oben spezifiziert, ermöglicht, wobei die Gesamtmenge an Protein, die von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül produziert wird, z.B. innerhalb einer Zeitspanne von 48 oder 72 Stunden, mindestens die Gesamtmenge an produziertem Protein ist, die, zum Beispiel innerhalb der Zeitspanne, von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül produziert wird, dem eine 3'-UTR fehlt oder das eine Referenz-3'-UTR umfasst, wie zum Beispiel eine 3'-UTR, die natürlicherweise mit dem ORF des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls vorkommt.
  • Somit bedeutet „stabilisierte Proteinexpression“ vorzugsweise, dass es eine gleichmäßigere Proteinproduktion von dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül über einen vorbestimmten Zeitraum gibt, wie zum Beispiel über 24 Stunden, bevorzugter über 48 Stunden, noch bevorzugter über 72 Stunden, im Vergleich zu einem Referenz-Nukleinsäuremolekül, zum Beispiel einer mRNA, die eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das 3'-UTR-Element fehlt oder der ein 3'-UTR-Element ganz fehlt. Dementsprechend sinkt das Niveau der Proteinproduktion, zum Beispiel in einem Säugetiersystem, von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, das ein hierin offenbartes 3'-UTR-Element umfasst, zum Beispiel von einer erfindungsgemäßen mRNA, vorzugsweise nicht in dem Ausmaß, das für ein Referenz-Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel eine Referenz-mRNA, wie oben beschrieben, beobachtet wird. Zum Beispiel kann die Menge eines Proteins (kodiert durch den ORF), die 6 Stunden nach Initiation der Expression, z.B. 6 Stunden nach Transfektion des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle, wie zum Beispiel eine Säugetierzelle, beobachtet wird, mit der Menge des Proteins, die 48 Stunden nach Initiation der Expression, z.B. 48 Stunden nach Transfektion, beobachtet wird, vergleichbar sein. Somit beträgt das Verhältnis der Menge des von dem ORF kodierten Proteins, zum Beispiel eines Reporterproteins, zum Beispiel Luciferase, das 48 Stunden nach Initiation der Expression, zum Beispiel 48 Stunden nach der Transfektion, beobachtet wird, zu der Menge des Proteins, die 6 Stunden nach Initiation der Expression, zum Beispiel 6 Stunden nach der Transfektion, beobachtet wird, bevorzugt mindestens etwa 0,4, bevorzugter mindestens etwa 0,5, bevorzugter mindestens etwa 0,6 und noch bevorzugter mindestens etwa 0,7. Vorzugsweise liegt das Verhältnis für ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül zwischen etwa 0,4 und etwa 4, bevorzugt zwischen etwa 0,65 und etwa 3, bevorzugter zwischen etwa 0,7 und 2. Bei einem entsprechenden Referenz-Nukleinsäuremolekül, z.B. einer mRNA, die eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das 3'-UTR-Element fehlt oder der eine 3'-UTR gänzlich fehlt, kann das Verhältnis z.B. zwischen etwa 0,05 und etwa 0,3 liegen.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein artifizielles Nukleinsäuremolekül bereit, das einen ORF und eine 3'-UTR umfasst, die ein optionales 3'-UTR-Element, wie oben beschrieben, umfasst, wobei das Verhältnis der (Reporter- )Proteinmenge, zum Beispiel der Menge an Luziferase, die 48 Stunden nach Initiation der Expression beobachtet wird, zu der (Reporter-)Proteinmenge, die 6 Stunden nach Initiation der Expression beobachtet wird, vorzugsweise in einem Säugetier-Expressionssystem, wie zum Beispiel in Säugetierzellen, z.B. in HeLa-Zellen, bevorzugt bei über etwa 0,4, bevorzugter über etwa 0,5, bevorzugter über etwa 0,6, noch bevorzugter über etwa 0,7, z.B. zwischen etwa 0,4 und etwa 4, bevorzugt zwischen etwa 0,65 und etwa 3, bevorzugter zwischen etwa 0,7 und 2, liegt, wobei vorzugsweise die Gesamtmenge des von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül produzierten Proteins, z.B. innerhalb einer Zeitspanne von 48 Stunden, mindestens die Gesamtmenge an Protein ist, die z.B. innerhalb dieser Zeitspanne von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül produziert wird, dem eine 3'-UTR fehlt oder das eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das optionale 3'-UTR-Element fehlt, wie z.B. eine 3'-UTR, die natürlicherweise mit dem ORF des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls vorkommt. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein artifizielles Nukleinsäuremolekül bereit, das einen ORF und eine 3'-UTR umfasst, die ein optionales 3'-UTR-Element, wie oben beschrieben, umfasst, wobei das Verhältnis der (Reporter-)Proteinmenge, zum Beispiel der Menge an Luziferase, die 72 Stunden nach Initiation der Expression beobachtet wird, zu der (Reporter-)Proteinmenge, die 6 Stunden nach Initiation der Expression beobachtet wird, vorzugsweise in einem Säugetier-Expressionssystem, wie zum Beispiel in Säugetierzellen, z.B. in HeLa-Zellen, bevorzugt bei über etwa 0,4, bevorzugter über etwa 0,5, bevorzugter über etwa 0,6, noch bevorzugter über etwa 0,7, z.B. zwischen etwa 0,4 und 1,5, bevorzugt zwischen etwa 0,65 und etwa 1,15, bevorzugter zwischen etwa 0,7 und 1,0, liegt, wobei vorzugsweise die Gesamtmenge des von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül produzierten Proteins, z.B. innerhalb einer Zeitspanne von 72 Stunden, mindestens die Gesamtmenge an Protein ist, die z.B. innerhalb dieser Zeitspanne von einem Referenz-Nukleinsäuremolekül produziert wird, dem eine 3'-UTR fehlt oder das eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das optionale 3'-UTR-Element fehlt, wie z.B. eine 3'-UTR, die natürlicherweise mit dem ORF des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls vorkommt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erhöht oder verstärkt das mindestens eine weitere 3'-UTR-Element, das optional in der 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls enthalten sein kann und das sich von einer Poly(A)-Sequenz unterscheidet, die Proteinexpression von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, wie hierin definiert.
  • Die Erhöhung der Stabilität des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, die Erhöhung der Stabilität der Proteinproduktion, die Verlängerung der Proteinproduktion und/oder die Erhöhung/Verstärkung der Proteinexpression und/oder der Gesamtproteinproduktion wird vorzugsweise durch Vergleich mit einem entsprechenden Referenz-Nukleinsäuremolekül, dem eine 3'-UTR fehlt, zum Beispiel einer mRNA, der eine 3'-UTR fehlt, oder einem Referenz-Nukleinsäuremolekül, das eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das optionale 3'-UTR-Element fehlt, wie z.B. eine 3'-UTR, die natürlicherweise mit dem ORF, wie oben beschrieben, vorkommt, bestimmt.
  • Die die mRNA- und/oder Proteinproduktion stabilisierende Wirkung und Effizienz und/oder die die Proteinproduktion steigernde Wirkung und Effizienz des mindestens einen (optionalen) 3'-UTR-Elements des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls kann durch jedes für diesen Zweck geeignete, der fachkundigen Person bekannte Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise können artifizielle mRNA-Moleküle erzeugt werden, die eine kodierende Sequenz/einen offenen Leserahmen (ORF) für ein Reporterprotein, wie zum Beispiel Luciferase, und keine 3'-UTR, eine 3'-UTR, der das optionale 3'-UTR-Element fehlt, wie zum Beispiel eine von einem natürlich vorkommenden Gen abgeleitete 3'-UTR oder eine von einem Referenzgen abgeleitete 3'-UTR (d.h. eine Referenz-3'-UTR, wie zum Beispiel eine 3'-UTR, die natürlicherweise mit dem ORF vorkommt) umfassen. Solche mRNAs können zum Beispiel durch In-vitro-Transkription entsprechender Vektoren, wie zum Beispiel Plasmidvektoren, erzeugt werden, die zum Beispiel einen T7-Promotor und eine Sequenz umfassen, die für die jeweiligen mRNA-Sequenzen kodiert. Die erzeugten mRNA-Moleküle können mit jeder für die Transfektion von mRNA geeigneten Transfektionsmethode in Zellen transfiziert werden, zum Beispiel können sie durch Elektroporation in Säugetierzellen, wie zum Beispiel HELA-Zellen, eingeführt werden, und Proben können zu bestimmten Zeitpunkten nach der Transfektion, zum Beispiel 6 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach der Transfektion, analysiert werden. Diese Proben können mit Verfahren, die der fachkundigen Person bekannt sind, auf mRNA-Mengen und/oder Proteinmengen untersucht werden. Beispielsweise können die Mengen an Reporter-mRNA, die in den Zellen zu den Probenzeitpunkten vorhanden sind, durch quantitative PCR-Verfahren bestimmt werden. Die Mengen der von den jeweiligen mRNAs kodierten Reporterproteine können je nach verwendetem Reporterprotein zum Beispiel durch Western Blot, ELISA-Assays, FACS-Analysen oder Reporter-Assays, wie zum Beispiel Luciferase-Assays, bestimmt werden. Die Wirkung der Stabilisierung der Proteinexpression und/oder der Verlängerung der Proteinexpression kann beispielsweise durch Bestimmung des Verhältnisses von dem Proteingehalt, der 48 Stunden nach der Transfektion beobachtet wird, zu dem Proteingehalt, der 6 Stunden nach der Transfektion beobachtet wird, analysiert werden. Je näher dieser Wert bei 1 liegt, desto stabiler ist die Proteinexpression innerhalb dieses Zeitraums. Solche Messungen können natürlich auch nach 72 oder mehr Stunden durchgeführt werden, und das Verhältnis von dem Proteingehalt, der 72 Stunden nach der Transfektion beobachtet wird, zu dem Proteingehalt, der 6 Stunden nach der Transfektion beobachtet wird, kann bestimmt werden, um die Stabilität der Proteinexpression zu ermitteln.
  • In einigen Ausführungsformen kann die 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls zusätzlich zu der mindestens einen Poly(A)-Sequenz und dem optionalen 3'-UTR-Element, wie hier beschrieben, einen Histon-Stem-Loop umfassen. Eine solche 3'-UTR des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls kann beispielsweise in 5'-3'-Richtung ein optionales 3'-UTR-Element, wie hier beschrieben, mindestens eine Poly(A)-Sequenz, eine optionale Poly(C)-Sequenz, eine optionale Histon-Stem-Loop-Sequenz und optional eine weitere Poly(A)-Sequenz oder ein Polyadenylierungssignal umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül mindestens eine Histon-Stem-Loop-Sequenz.
  • Solche Histon-Stem-Loop-Sequenzen sind vorzugsweise ausgewählt aus Histon-Stem-Loop-Sequenzen, wie sie in WO 2012/019780 offenbart sind.
  • Eine Histon-Stem-Loop-Sequenz, die für die Verwendung im Kontext der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist vorzugsweise aus mindestens einer der folgenden Formeln (I) oder (II) ausgewählt:
  • Formel (I) (Stem-Loop-Sequenz ohne an den Stamm („stem“) angrenzende Elemente):
  • [ N 0 − 2 GN 3 − 5 ] ︸ stem1 [ N 0 − 4 ( U / T ) N 0 − 4 ] ︸ Loop [ N 3 − 5 CN 0 − 2 ] ︸ stem2
    Figure DE202015009961U1_0011
  • Formel (II) (Stem-Loop-Sequenz mit an den Stamm („stem“) angrenzenden Elementen):
  • N 1 − 6 ︸ stem1 [ N 0 − 2 GN 3 − 5 ] ︸ stem1 [ N 0 − 4 ( U / T ) N 0 − 4 ] ︸ Loop [ N 3 − 5 CN 0 − 2 ] ︸ stem2 N 1 − 6 ︸ stem2 angrenzendes Element angrenzendes Element
    Figure DE202015009961U1_0012
    wobei:
    • das an stem1 oder stem2 angrenzende Element N1-6 eine konsekutive Sequenz von 1 bis 6, bevorzugt von 2 bis 6, bevorzugter von 2 bis 5, noch bevorzugter von 3 bis 5, am meisten bevorzugt von 4 bis 5 oder 5 N ist, wobei jedes N unabhängig von den anderen ausgewählt ist aus einem Nukleotid ausgewählt aus A, U, T, G und C oder einem Nukleotidanalogon davon;
    • stem1 [N0-2GN3-5] revers-komplementär oder teilweise revers-komplementär zu Element stem2 ist, und eine konsekutive Sequenz von 5 bis 7 Nukleotiden ist;
    • wobei N0-2 eine konsekutive Sequenz von 0 bis 2, bevorzugt von 0 bis 1, bevorzugter von 1 N ist, wobei jedes N unabhängig von den anderen ausgewählt ist aus einem Nukleotid, ausgewählt aus A, U, T, G und C oder einem Nukleotidanalogon davon;
    • wobei N3-5 eine konsekutive Sequenz von 3 bis 5, bevorzugt von 4 bis 5, bevorzugter von 4 N ist, wobei jedes N unabhängig von den anderen ausgewählt ist aus einem Nukleotid, ausgewählt aus A, U, T, G und C oder einem Nukleotidanalogon davon, und
    • wobei G Guanosin oder ein Analogon davon ist und optional durch Cytidin oder ein Analogon davon ersetzt sein kann, vorausgesetzt, dass sein komplementäres Nukleotid Cytidin in stem2 durch Guanosin ersetzt ist;
  • Loop-Sequenz [N0-4(U/T)N0-4] zwischen den Elementen stem1 und stem2 gelegen ist und eine konsekutive Sequenz von 3 bis 5 Nukleotiden, bevorzugter von 4 Nukleotiden ist;
    • wobei jedes N0-4 unabhängig von dem anderen eine konsekutive Sequenz von 0 bis 4, bevorzugt von 1 bis 3, bevorzugter von 1 bis 2 N ist, wobei jedes N unabhängig von den anderen ausgewählt ist aus einem Nukleotid ausgewählt aus A, U, T, G und C oder einem Nukleotidanalogon davon; und
    • wobei U/T Uridin oder optional Thymidin darstellt;

    stem2 [N3-5CN0-2] revers-komplementär oder teilweise revers-komplementär zu Element stem1 ist und eine konsekutive Sequenz von 5 bis 7 Nukleotiden ist;
    • wobei N3-5 eine konsekutive Sequenz von 3 bis 5, bevorzugt von 4 bis 5, bevorzugter von 4 N ist, wobei jedes N unabhängig von den anderen ausgewählt ist aus einem Nukleotid ausgewählt aus A, U, T, G und C oder einem Nukleotidanalogon davon;
    • wobei N0-2 eine konsekutive Sequenz von 0 bis 2, bevorzugt von 0 bis 1, bevorzugter von 1 N ist, wobei jedes N unabhängig von den anderen ausgewählt ist aus einem Nukleotid, ausgewählt aus A, U, T, G und C oder einem Nukleotidanalogon davon; und
    • wobei C Cytidin oder ein Analogon davon ist, und optional durch ein Guanosin oder ein Analogon davon ersetzt sein kann, vorausgesetzt, dass sein komplementäres Nukleotid Guanosin in stem1 durch Cytidin ersetzt ist;

    wobei stem1 und stem2 zur Basenpaarung miteinander fähig sind und eine revers-komplementäre Sequenz bilden, wobei zwischen stem1 und stem2 Basenpaarung auftreten kann, zum Beispiel durch Watson-Crick-Basenpaarung der Nukleotide A und U/T oder G und C oder durch Nicht-Watson-Crick-Basenpaarung, z.B. Wobble-Basenpaarung, reverse Watson-Crick-Basenpaarung, Hogsteen-Basenpaarung, reverse Hoogsteen-Basenpaarung, oder zur Basenpaarung miteinander fähig sind und miteinander eine teilweise revers-komplementäre Sequenz bilden, wobei eine unvollständige Basenpaarung zwischen stem1 und stem2 auftreten kann, dadurch, dass ein oder mehrere Basen in einem Stamm keine komplementäre Base in der revers-komplementären Sequenz des anderen Stammes haben.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Histon-Stem-Loop-Sequenz aus mindestens einer der folgenden spezifischen Formeln (la) oder (IIa) ausgewählt sein:
  • Formel (la) (Stem-Loop-Sequenz ohne an den Stamm angrenzende Elemente):
  • [ N 0 − 1 GN 3 − 5 ] ︸ stem1 [ N 1 − 3 ( U / T ) N 0 − 2 ] ︸ Loop [ N 3 − 5 CN 0 − 1 ] ︸ stem2
    Figure DE202015009961U1_0013
  • Formel (IIa) (Stem-Loop-Sequenz mit an den Stamm angrenzenden Elementen):
  • N 2 − 5 ︸ stem1 [ N 0 − 1 GN 3 − 5 ] ︸ stem1 [ N 1 − 3 ( U / T ) N 0 − 2 ] ︸ Loop [ N 3 − 5 CN 0 − 1 ] ︸ stem2 N 2 − 5 ︸ stem2 angrenzendes Element angrenzendes Element
    Figure DE202015009961U1_0014
    wobei N, C, G, T und U wie oben definiert sind.
  • Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts kann die Sequenz des artifiziellen Nukleinsäuremoleküln mindestens eine Histon-Stem-Loop-Sequenz gemäß mindestens einer der folgenden spezifischen Formeln (Ib) oder (IIb) umfassen:
  • Formel (Ib) (Stem-Loop-Sequenz ohne an den Stamm angrenzende Elemente):
  • [ N 1 GN 4 ] ︸ stem1 [ N 2 ( U / T ) N 1 ] ︸ Loop [ N 4 CN 1 ] ︸ stem2
    Figure DE202015009961U1_0015
  • Formel (IIb) (Stem-Loop-Sequenz mit an den Stamm angrenzenden Elementen):
  • N 4 − 5 ︸ stem1 [ N 1 GN 4 ] ︸ stem1 [ N 2 ( U / T ) N 1 ] ︸ Loop [ N 4 CN 1 ] ︸ stem2 N 4 − 5 ︸ stem2 angrenzendes Element angrenzendes Element
    Figure DE202015009961U1_0016
    wobei N, C, G, T und U wie oben definiert sind.
  • Eine besonders bevorzugte Histon-Stem-Loop-Sequenz ist die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 11: CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA oder noch bevorzugter die entsprechende RNA-Sequenz der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 11.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül weitere Elemente, wie beispielsweise ein 5'-Cap, eine Poly(C)-Sequenz und/oder ein IRES-Motiv. Ein 5'-Cap kann während oder nach der Transkription an das 5'-Ende einer RNA angefügt werden. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, insbesondere wenn die Nukleinsäure in Form einer mRNA vorliegt oder für eine mRNA kodiert, durch eine Sequenz von mindestens 10 Cytidinen, bevorzugt mindestens 20 Cytidinen, bevorzugter mindestens 30 Cytidinen (sogenannte „Poly(C)-Sequenz“) modifiziert sein. Insbesondere kann das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, insbesondere wenn die Nukleinsäure in Form einer (m)RNA vorliegt oder für eine mRNA kodiert, eine Poly(C)-Sequenz von typischerweise etwa 10 bis 200 Cytidin-Nukleotiden, bevorzugt etwa 10 bis 100 Cytidin-Nukleotiden, bevorzugter etwa 10 bis 70 Cytidin-Nukleotiden oder noch bevorzugter etwa 20 bis 50 oder auch 20 bis 30 Cytidin-Nukleotiden enthalten. Am meisten bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine Poly(C)-Sequenz mit 30 Cytidinresten. Somit umfasst das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül vorzugsweise in 5'-3'-Richtung einen ORF, mindestens ein 3'-UTR-Element, wie oben beschrieben, mindestens eine Poly(A)-Sequenz, eine Poly(C)-Sequenz, eine Histon-Stem-Loop-Sequenz und gegebenenfalls eine weitere Poly(A)-Sequenz.
  • Eine IRES-Sequenz (interne ribosomale Eintrittsstelle) oder ein IRES-Motiv kann mehrere offene Leserahmen trennen, beispielsweise wenn das artifizielle Nukleinsäuremolekül für zwei oder mehr Peptide oder Proteine kodiert. Eine IRES-Sequenz kann besonders hilfreich sein, wenn das artifizielle Nukleinsäuremolekül ein bi- oder multicistronisches Nukleinsäuremolekül ist.
  • Darüber hinaus kann das artifizielle Nukleinsäuremolekül zusätzliche 5'-Elemente umfassen, vorzugsweise eine 5'-UTR. Ferner kann die 5'-UTR aus der 5'-UTR eines Gens, wie hierin definiert, bestehen oder diese umfassen. Ferner kann die 5'-UTR mit der 3'-UTR des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls interagieren und so die Wirkung der 3'-UTR des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls unterstützen. Solche Elemente können außerdem die Stabilität und die Translationseffizienz unterstützen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül mindestens ein Element der 5'-untranslatierten Region (5'-UTR-Element), das eine Nukleinsäuresequenz umfasst oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die von der 5'-UTR eines TOP-Gens abgeleitet ist oder die von einem Fragment, Homolog oder einer Variante der 5'-UTR eines TOP-Gens abgeleitet ist.
  • Besonders bevorzugt umfasst das 5'-UTR-Element kein TOP-Motiv oder 5'-TOP, wie oben definiert.
  • Die Nukleinsäuresequenz, die von der 5'-UTR eines TOP-Gens abgeleitet ist, stammt vorzugsweise von einem eukaryotischen TOP-Gen, bevorzugt von einem pflanzlichen oder tierischen TOP-Gen, bevorzugter von einem TOP-Gen eines Chordatieres, noch bevorzugter von einem TOP-Gen eines Wirbeltieres, am meisten bevorzugt von einem TOP-Gen eines Säugetieres, wie zum Beispiel einem humanen TOP-Gen.
  • Beispielsweise ist das 5'-UTR-Element vorzugsweise aus 5'-UTR-Elementen ausgewählt, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen oder aus einer Nukleinsäuresequenz bestehen, die von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs. 1-1363, SEQ ID NO. 1395, SEQ ID NO. 1421 und SEQ ID NO. 1422 der Patentanmeldung WO 2013/143700 (Bestandteil der vorliegenden Offenbarung), aus Homologen der SEQ ID NOs. 1-1363, SEQ ID NO. 1395, SEQ ID NO. 1421 und SEQ ID NO. 1422 der Patentanmeldung WO2013/143700 , einer Variante davon oder vorzugsweise einer entsprechenden RNA-Sequenz. Der Begriff „Homologe von SEQ ID NOs. 1-1363, SEQ ID NO. 1395, SEQ ID NO. 1421 und SEQ ID NO. 1422 der Patentanmeldung WO 2013/143700 “ bezieht sich auf Sequenzen anderer Spezies als Homo sapiens, die homolog zu den Sequenzen gemäß SEQ ID NOs. 1-1363, SEQ ID NO. 1395, SEQ ID NO. 1421 und SEQ ID NO. 1422 der Patentanmeldung WO 2013/143700 sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das 5'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist, die sich von der Nukleotidposition 5 (d.h. dem Nukleotid, das sich an Position 5 in der Sequenz befindet) bis zur Nukleotidposition unmittelbar 5' zum Startcodon (das sich am 3'-Ende der Sequenzen befindet) erstreckt, z.B. die Nukleotidposition unmittelbar 5' zur ATG-Sequenz, einer Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus SEQ ID NOs. 1-1363, SEQ ID NO. 1395, SEQ ID NO. 1421 und SEQ ID NO. 1422 der Patentanmeldung WO 2013/143700 , aus Homologen der SEQ ID NOs. 1-1363, SEQ ID NO. 1395, SEQ ID NO. 1421 und SEQ ID NO. 1422 der Patentanmeldung WO 2013/143700 , einer Variante davon, oder einer entsprechenden RNA-Sequenz. Besonders bevorzugt ist das 5'-UTR-Element von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet, die sich von der Nukleotidposition unmittelbar 3' zum 5'-TOP bis zur Nukleotidposition unmittelbar 5' zum Startcodon (das sich am 3'-Ende der Sequenzen befindet) erstreckt, z.B. die Nukleotidposition unmittelbar 5' zur ATG-Sequenz, einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs. 1-1363, SEQ ID NO. 1395, SEQ ID NO. 1421 und SEQ ID NO. 1422 der Patentanmeldung WO 2013/143700 , aus Homologen der SEQ ID NOs. 1-1363, SEQ ID NO. 1395, SEQ ID NO. 1421 und SEQ ID NO. 1422 der Patentanmeldung WO 2013/143700 , einer Variante davon, oder einer entsprechenden RNA-Sequenz.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das 5'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die von einer 5'-UTR eines TOP-Gens, das ein ribosomales Protein kodiert, oder von einer Variante einer 5'-UTR eines TOP-Gens, das ein ribosomales Protein kodiert, abgeleitet ist. Zum Beispiel umfasst das 5'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die abgeleitet ist von einer 5'-UTR einer Nukleinsäuresequenz gemäß einer der SEQ ID NOs: 170, 232, 244, 259, 1284, 1285, 1286, 1287, 1288, 1289, 1290, 1291, 1292, 1293, 1294, 1295, 1296, 1297, 1298, 1299, 1300, 1301, 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307, 1308, 1309, 1310, 1311, 1312, 1313, 1314, 1315, 1316, 1317, 1318, 1319, 1320, 1321, 1322, 1323, 1324, 1325, 1326, 1327, 1328, 1329, 1330, 1331, 1332, 1333, 1334, 1335, 1336, 1337, 1338, 1339, 1340, 1341, 1342, 1343, 1344, 1346, 1347, 1348, 1349, 1350, 1351, 1352, 1353, 1354, 1355, 1356, 1357, 1358, 1359, oder 1360 der Patentanmeldung WO 2013/143700 , einer entsprechenden RNA-Sequenz, einem Homolog davon oder einer Variante davon, wie hierin beschrieben, denen vorzugsweise das 5'-TOP-Motiv fehlt. Wie oben beschrieben, entspricht die Sequenz, die sich von Position 5 bis zu dem Nukleotid unmittelbar 5' zu dem ATG (das sich am 3'-Ende der Sequenzen befindet) erstreckt, der 5'-UTR der genannten Sequenzen.
  • Vorzugsweise umfasst das 5'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die von einer 5'-UTR eines TOP-Gens, das für ein ribosomales Large-Protein (RPL) kodiert, oder von einem Homolog oder einer Variante einer 5'-UTR eines TOP-Gens, das für ein ribosomales Large-Protein (RPL) kodiert, abgeleitet ist. Beispielsweise umfasst das 5'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die von einer 5'-UTR einer Nukleinsäuresequenz gemäß einer der SEQ ID NOs: 67, 259, 1284-1318, 1344, 1346, 1348-1354, 1357, 1358, 1421 und 1422 der Patentanmeldung WO 2013/143700 , einer entsprechenden RNA-Sequenz, einem Homolog davon oder einer Variante davon, wie hierin beschrieben, abgeleitet ist, denen vorzugsweise das 5'-TOP-Motiv fehlt.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das 5'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die von der 5'-UTR eines Gens des ribosomalen Proteins Large 32, bevorzugt von einem Vertebraten-Gen des ribosomalen Proteins Large 32 (L32), bevorzugter von einem Säugetier-Gen des ribosomalen Proteins Large 32 (L32), am meisten bevorzugt von einem humanen Gen des ribosomalen Proteins Large 32 (L32), abgeleitet ist, oder von einer Variante der 5'-UTR eines Vertebraten-Gens des ribosomalen Proteins Large 32 (L32), bevorzugter eines Säugetier-Gens des ribosomalen Proteins Large 32 (L32), am meisten bevorzugt eines humanen Gens des ribosomalen Proteins Large 32 (L32), abgeleitet ist, wobei das 5'-UTR-Element vorzugsweise nicht das 5'-TOP des Gens umfasst.
  • Dementsprechend umfasst in einer besonders bevorzugten Ausführungsform das 5'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens etwa 40%, bevorzugt von mindestens etwa 50%, bevorzugt von mindestens etwa 60%, bevorzugt von mindestens etwa 70%, bevorzugter von mindestens etwa 80%, bevorzugter von mindestens etwa 90%, noch bevorzugter von mindestens etwa 95%, noch bevorzugter von mindestens etwa 99% mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 12 (5'-UTR des humanen ribosomalen Proteins Large 32 ohne den 5'-terminalen Oligopyrimidin-Trakt:
    • GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC; entsprechend SEQ ID NO. 1368 der Patentanmeldung WO 2013/143700 ) oder vorzugsweise mit einer entsprechenden RNA-Sequenz aufweist, oder wobei das mindestens eine 5'-UTR-Element ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz umfasst oder aus einem Fragment einer Nukleinsäuresequenz besteht, das eine Identität von mindestens etwa 40%, bevorzugt von mindestens etwa 50%, bevorzugt von mindestens etwa 60%, bevorzugt von mindestens etwa 70%, bevorzugter von mindestens etwa 80%, bevorzugter von mindestens etwa 90%, noch bevorzugter von mindestens etwa 95%, noch bevorzugter von mindestens etwa 99% mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 12 oder bevorzugter mit einer entsprechenden RNA-Sequenz aufweist, wobei das Fragment vorzugsweise wie oben beschrieben ist, d.h. ein kontinuierlicher Abschnitt von Nukleotiden ist, der mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, bevorzugter mindestens 40% der Volllängen-5'-UTR darstellt. Vorzugsweise weist das Fragment eine Länge von mindestens etwa 20 Nukleotiden oder mehr, bevorzugt von mindestens etwa 30 Nukleotiden oder mehr, bevorzugter von mindestens etwa 40 Nukleotiden oder mehr, auf. Vorzugsweise ist das Fragment ein funktionelles Fragment, wie hier beschrieben.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül ein 5'-UTR-Element, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die von der 5'-UTR eines Vertebraten-TOP-Gens, wie beispielsweise eines Säugetier-TOP-Gens, zum Beispiel eines humanen TOP-Gens, abgeleitet ist, ausgewählt aus RPSA, RPS2, RPS3, RPS3A, RPS4, RPS5, RPS6, RPS7, RPS8, RPS9, RPS10, RPS11, RPS12, RPS13, RPS14, RPS15, RPS15A, RPS16, RPS17, RPS18, RPS19, RPS20, RPS21, RPS23, RPS24, RPS25, RPS26, RPS27, RPS27A, RPS28, RPS29, RPS30, RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL7, RPL7A, RPL8, RPL9, RPL10, RPL10A, RPL11, RPL12, RPL13, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL17, RPL18, RPL18A, RPL19, RPL21, RPL22, RPL23, RPL23A, RPL24, RPL26, RPL27, RPL27A, RPL28, RPL29, RPL30, RPL31, RPL32, RPL34, RPL35, RPL35A, RPL36, RPL36A, RPL37, RPL37A, RPL38, RPL39, RPL40, RPL41, RPLP0, RPLP1, RPLP2, RPLP3, RPLP0, RPLP1, RPLP2, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1G, EEF2, EIF3E, EIF3F, EIF3H, EIF2S3, EIF3C, EIF3K, EIF3EIP, EIF4A2, PABPC1, HNRNPA1, TPT1, TUBB1, UBA52, NPM1, ATP5G2, GNB2L1, NME2, UQCRB oder einem Homolog oder einer Variante davon, wobei das 5'-UTR-Element vorzugsweise kein TOP-Motiv oder den 5'-TOP der genannten Gene umfasst, und wobei das 5'-UTR-Element optional an seinem 5'-Ende mit einem Nukleotid beginnt, das sich an Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 stromabwärts des 5'-terminalen Oligopyrimidin-Trakts (TOP) befindet, und wobei ferner optional das 5'-UTR-Element, das von einer 5'-UTR eines TOP-Gens abgeleitet ist, an seinem 3'-Ende mit einem Nukleotid endet, das sich an Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 stromaufwärts des Startcodons (A(U/T)G) des Gens befindet, von dem es abgeleitet ist.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einigen Ausführungsformen artifizielle Nukleinsäuremoleküle, vorzugsweise mRNA-Moleküle, bereit, die in 5'-3'-Richtung mindestens eine der folgenden Strukturen aufweisen:
    • ORF - Poly(A)-Sequenz - Poly(A)-Sequenz;
    • ORF - 3'-UTR-Element - Poly(A)-Sequenz - Poly(C)-Sequenz - Poly(A)-Sequenz;
    • ORF - 3'-UTR-Element - Poly(A)-Sequenz - Histon-Stem-Loop - Poly(A)-Sequenz;
    • ORF - 3'-UTR-Element - Poly(A)-Sequenz - Poly(C)-Sequenz - Histon-Stem-Loop - Poly(A)-Sequenz;
    • 5'-UTR - ORF - 3'-UTR-Element - Poly(A)-Sequenz - Poly(C)-Sequenz - Histon-Stem-Loop - Poly(A)-Sequenz; oder
    • 5'-Cap - 5'-UTR - ORF - 3'-UTR-Element - Poly(A)-Sequenz - Poly(C)-Sequenz - Histon-Stem-Loop - Poly(A)-Sequenz.
  • Bevorzugt ist das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise der offene Leserahmen, zumindest teilweise G/C-modifiziert. So kann das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül thermodynamisch stabilisiert werden, indem der G (Guanosin)- und/oder C (Cytidin)-Gehalt (G/C-Gehalt) des Moleküls modifiziert wird. Der G/C-Gehalt des offenen Leserahmens eines erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls kann gegenüber dem G/C-Gehalt des offenen Leserahmens einer entsprechenden Wildtypsequenz erhöht werden, vorzugsweise indem die Degeneration des genetischen Codes ausgenutzt wird. Somit wird die kodierte Aminosäuresequenz des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls gegenüber der kodierten Aminosäuresequenz der jeweiligen Wildtypsequenz vorzugsweise nicht durch die G/C-Modifikation verändert. Die Codons der kodierenden Sequenz oder des gesamten artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, zum Beispiel einer mRNA, können daher gegenüber der kodierenden Sequenz des Wildtyps so verändert werden, dass sie eine erhöhte Menge an G/C-Nukleotiden enthalten, während die translatierte Aminosäuresequenz erhalten bleibt. Da mehrere Codons für ein und dieselbe Aminosäure kodieren (sogenannte Degeneration des genetischen Codes), ist es möglich, Codons zu verändern, ohne die kodierte Peptid-/Proteinsequenz zu verändern (sogenannte alternative Codonverwendung). So ist es möglich, gezielt bestimmte Codons (im Austausch gegen die jeweiligen Wildtyp-Codons, die für dieselbe Aminosäure kodieren) einzuführen, die im Hinblick auf die Stabilität der RNA und/oder in Bezug auf die Codonverwendung in einem Subjekt günstiger sind (so genannte Codon-Optimierung).
  • Abhängig von der Aminosäure, für die die kodierende Region des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls kodieren soll, gibt es verschiedene Möglichkeiten, die Nukleinsäuresequenz, z.B. den offene Leserahmen, gegenüber der kodierenden Region des Wildtyps zu verändern. Im Falle von Aminosäuren, die durch Codons kodiert werden, die ausschließlich G- oder C-Nukleotide enthalten, ist keine Modifikation des Codons erforderlich. So erfordern die Codons für Pro (CCC oder CCG), Arg (CGC oder CGG), Ala (GCC oder GCG) und Gly (GGC oder GGG) keine Modifikation, da kein A oder U/T vorhanden ist.
  • Im Gegensatz dazu können Codons, die A- und/oder U/T-Nukleotide enthalten, durch die Substitution anderer Codons, die für dieselben Aminosäuren kodieren, aber kein A und/oder U/T enthalten, modifiziert werden. Zum Beispiel können
    die Codons für Pro von CC(U/T) oder CCA zu CCC oder CCG modifiziert werden;
    die Codons für Arg von CG(U/T) oder CGA oder AGA oder AGG zu CGC oder CGG modifiziert werden;
    die Codons für Ala von GC(U/T) oder GCA zu GCC oder GCG modifiziert werden;
    die Codons für Gly von GG(U/T) oder GGA zu GGC oder GGG modifiziert werden.
  • In anderen Fällen können A- oder (U/T)-Nukleotide zwar nicht aus den Codons eliminiert werden, es ist jedoch möglich, den A- und (U/T)-Gehalt zu verringern, indem Codons verwendet werden, die einen geringeren Gehalt an A- und/oder (U/T)-Nukleotiden aufweisen. Beispiele hierfür sind:
    • Die Codons für Phe können von (U/T)(U/T)(U/T) zu (U/T) (U/T)C modifiziert werden;
    • die Codons für Leu können von (U/T) (U/T)A, (U/T) (U/T)G, C(U/T) (U/T) oder C(U/T)A zu C(U/T)C oder C(U/T)G modifiziert werden;
    • die Codons für Ser können von (U/T)C(U/T) oder (U/T)CA oder AG(U/T) zu (U/T)CC, (U/T)CG oder AGC modifiziert werden;
    • das Codon für Tyr kann von (U/T)A(U/T) zu (U/T)AC modifiziert werden;
    • das Codon für Cys kann von (U/T)G(U/T) zu (U/T)GC modifiziert werden;
    • das Codon für His kann von CA(U/T) zu CAC modifiziert werden;
    • das Codon für Gln kann von CAA zu CAG modifiziert werden;
    • die Codons für Ile können von A(U/T)(U/T) oder A(U/T)A zu A(U/T)C modifiziert werden;
    • die Codons für Thr können von AC(U/T) oder ACA zu ACC oder ACG modifiziert werden;
    • das Codon für Asn kann von AA(U/T) zu AAC modifiziert werden;
    • das Codon für Lys kann von AAA zu AAG modifiziert werden;
    • die Codons für Val können von G(U/T)(U/T) oder G(U/T)A zu G(U/T)C oder G(U/T)G modifiziert werden;
    • das Codon für Asp kann von GA(U/T) zu GAC modifiziert werden;
    • das Codon für Glu kann von GAA zu GAG modifiziert werden;
    • das Stoppcodon (U/T)AA kann zu (U/T)AG oder (U/T)GA modifiziert werden.
  • Bei den Codons für Met (A(U/T)G) und Trp ((U/T)GG) gibt es dagegen keine Möglichkeit der Sequenzmodifikation, ohne die kodierte Aminosäuresequenz zu verändern.
  • Die oben aufgeführten Substitutionen können entweder einzeln oder in allen möglichen Kombinationen verwendet werden, um den G/C-Gehalt des offenen Leserahmens des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hier definiert, gegenüber dem jeweiligen offenen Leserahmen des Wildtyps (d.h. der ursprünglichen Sequenz) zu erhöhen. So können zum Beispiel alle Codons für Thr, die in der Wildtyp-Sequenz vorkommen, zu ACC (oder ACG) modifiziert werden.
  • Bevorzugt wird der G/C-Gehalt des offenen Leserahmens des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hier definiert, um mindestens 7%, bevorzugter um mindestens 15%, besonders bevorzugt um mindestens 20%, gegenüber dem G/C-Gehalt der kodierenden Region des Wildtyps erhöht, ohne die kodierte Aminosäuresequenz zu verändern, d.h. unter Ausnutzung der Degeneration des genetischen Codes. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform sind mindestens 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 80% und am meisten bevorzugt mindestens 90%, 95% oder sogar 100% der substituierbaren Codons im offenen Leserahmen des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder eines Fragments, einer Variante oder eines Derivats davon ersetzt, wodurch der G/C-Gehalt des offenen Leserahmens erhöht wird.
  • In diesem Zusammenhang wird besonders bevorzugt der G/C-Gehalt des offenen Leserahmens des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hierin definiert, auf das Maximum (d.h. 100% der ersetzbaren Codons) gegenüber dem offenen Leserahmen des Wildtyps erhöht, ohne die kodierte Aminosäuresequenz zu verändern.
  • Außerdem ist der offene Leserahmen vorzugsweise zumindest teilweise Codon-optimiert. Die Codon-Optimierung beruht auf der Erkenntnis, dass die Translationseffizienz durch eine unterschiedliche Häufigkeit des Auftretens von Transfer-RNAs (tRNAs) in Zellen bestimmt werden kann. Wenn also sogenannte „seltene Codons“ in der kodierenden Region des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hierin definiert, in erhöhtem Maße vorhanden sind, ist die Translation der entsprechenden modifizierten Nukleinsäuresequenz weniger effizient als in dem Fall, in dem Codons vorhanden sind, die für relativ „häufige“ tRNAs kodieren.
  • So ist der offene Leserahmen des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls vorzugsweise gegenüber der entsprechenden kodierenden Region des Wildtyps so modifiziert, dass mindestens ein Codon der Wildtyp-Sequenz, das von einer in der Zelle relativ seltenen tRNA erkannt wird, gegen ein Codon ausgetauscht wird, das von einer in der Zelle vergleichsweise häufigen tRNA erkannt wird und die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA. Durch diese Modifikation wird der offene Leserahmen des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hierin definiert, so modifiziert, dass Codons, für die häufig vorkommende tRNAs verfügbar sind, Codons ersetzen können, die seltenen tRNAs entsprechen. Mit anderen Worten: Gemäß der vorliegenden Erfindung können durch eine solche Modifikation alle Codons des offenen Leserahmens des Wildtyps, die von einer seltenen tRNA erkannt werden, gegen ein Codon ausgetauscht werden, das von einer tRNA erkannt wird, die in der Zelle häufiger vorkommt und die gleiche Aminosäure trägt wie die seltene tRNA. Welche tRNAs in der Zelle relativ häufig vorkommen und welche dagegen relativ selten sind, ist der fachkundigen Person bekannt; vgl. z.B. Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666. Dementsprechend ist der offene Leserahmen vorzugsweise Codon-optimiert, vorzugsweise in Bezug auf das System, in dem das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül exprimiert werden soll, vorzugsweise in Bezug auf das System, in dem das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül translatiert werden soll. Vorzugsweise ist die Codonverwendung des offenen Leserahmens gemäß der Codonverwendung von Säugetieren, vorzugsweise gemäß der humanen Codonverwendung, Codon-optimiert. Vorzugsweise ist der offene Leserahmen Codon-optimiert und in seinem G/C-Gehalt modifiziert.
  • Zur weiteren Verbesserung der Abbaubeständigkeit, zum Beispiel der Beständigkeit gegenüber dem In-vivo-Abbau durch eine Exo- oder Endonuklease, und/oder zur weiteren Verbesserung der Stabilität der Proteinexpression von dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül kann das artifizielle Nukleinsäuremolekül ferner Modifikationen umfassen, wie zum Beispiel Modifikationen des Rückgrats (Backbone-Modifikationen), Zuckermodifikationen und/oder Basenmodifikationen, zum Beispiel Lipidmodifikationen oder dergleichen. Vorzugsweise wird die Transkription und/oder Translation des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls durch diese Modifikationen nicht wesentlich beeinträchtigt.
  • Generell kann das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül jedes native (= natürlich vorkommende) Nukleotid umfassen, z.B. Guanosin, Uracil, Adenosin und/oder Cytosin oder ein Analogon davon. Unter Nukleotidanaloga versteht man in diesem Zusammenhang nativ und nicht-nativ vorkommende Varianten der natürlich vorkommenden Nukleotide Adenosin, Cytosin, Thymidin, Guanosin und Uridin. Analoga sind demnach z.B. chemisch derivatisierte Nukleotide mit nicht-nativ vorkommenden funktionellen Gruppen, die vorzugsweise an das natürlich vorkommende Nukleotid angefügt oder aus ihm entfernt werden, oder die die natürlich vorkommenden funktionellen Gruppen eines Nukleotids ersetzen. Dementsprechend kann jede Komponente des natürlich vorkommenden Nukleotids modifiziert werden, nämlich die Basenkomponente, die Zuckerkomponente (Ribose) und/oder die Phosphatkomponente, die das Rückgrat (siehe oben) der RNA-Sequenz bildet. Zu den Analoga von Guanosin, Uridin, Adenosin, Thymidin und Cytosin gehören, ohne dass damit eine Einschränkung verbunden ist, alle natürlich vorkommenden oder nicht in der Natur vorkommenden Guanosin-, Uridin-, Adenosin-, Thymidin- oder Cytosin-Nukleotide, die zum Beispiel durch Acetylierung, Methylierung, Hydroxylierung usw. chemisch verändert wurden, einschließlich 1-Methyladenosin, 1-Methylguanosin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanosin, 2,6-Diaminopurin, 2'-Amino-2'-desoxyadenosin, 2'-Amino-2'-desoxycytidin, 2'-Amino-2'-desoxyguanosin, 2'-Amino-2'-desoxyuridin, 2-Amino-6-chlorpurinribosid, 2-Aminopurinribosid, 2'-Araadenosin, 2'-Aracytidin, 2'-Arauridin, 2'-Azido-2'-desoxyadenosin, 2'-Azido-2'-desoxycytidin, 2'-Azido-2'-desoxyguanosin, 2'-Azido-2'-desoxyuridin, 2-Chloradenosin, 2'-Fluor-2'-desoxyadenosin, 2'-Fluor-2'-desoxycytidin, 2'-Fluor-2'-desoxyguanosin, 2'-Fluor-2'-desoxyuridin, 2'-Fluorthymidin, 2-Methyladenosin, 2-Methylguanosin, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenosin, 2'-O-Methyl-2-aminoadenosin, 2'-O-Methyl-2'-desoxyadenosin, 2'-O-Methyl-2'-desoxycytidin, 2'-O-Methyl-2'-desoxyguanosin, 2'-O-Methyl-2'-desoxyuridin, 2'-O-Methyl-5-methyluridin, 2'-O-Methylinosin, 2'-O-Methylpseudouridin, 2-Thiocytidin, 2-Thiocytosin, 3-Methylcytosin, 4-Acetylcytosin, 4-Thiouridin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5,6-Dihydrouridin, 5-Aminoallylcytidin, 5-Aminoallyldesoxyuridin, 5-Bromuridin, 5-Carboxymehtylaminomethyl-2-thiouracil, 5-Carboxymethylamonomethyluracil, 5-Chlor-ara-cytosin, 5-Fluoruridin, 5-loduridin, 5-Methoxycarbonylmethyluridin, 5-Methoxyuridin, 5-Methyl-2-thiouridin, 6-Azacytidin, 6-Azauridin, 6-Chlor-7-deazaguanosin, 6-Chloropurineribosid, 6-Mercaptoguanosin, 6-Methylmercaptopurinribosid, 7-Deaza-2'-desoxyguanosin, 7-Deazaadenosin, 7-Methylguanosin, 8-Azaadenosin, 8-Bromadenosin, 8-Bromguanosin, 8-Mercaptoguanosin, 8-Oxoguanosin, Benzimidazolribosid, Beta-D-Mannosylqueosin, Dihydrouracil, Inosin, N1-Methyladenosin, N6-([6-Aminohexyl]carbamoylmethyl)-adenosin, N6-Isopentenyladenosin, N6-Methyladenosin, N7-Methylxanthosin, N-Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Puromycin, Queosin, Uracil-5-oxyessigsäure, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Wybutoxosin, Xanthosin und Xylo-Adenosin. Die Herstellung solcher Analoga ist der fachkundigen Person bekannt, zum Beispiel aus den US-Patenten 4,373,071 , US 4,401,796 , US 4,415,732 , US 4,458,066 , US 4,500,707 , US 4,668,777 , US 4,973,679 , US 5,047,524 , US 5,132,418 , US 5,153,319 , US 5,262,530 und 5,700,642 . Im Falle eines Analogons, wie oben beschrieben, können gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung solche Analoga besonders bevorzugt sein, die die Proteinexpression des kodierten Peptids oder Proteins erhöhen oder die Immunogenizität des hierin offenbarten artifiziellen Nukleinsäuremoleküls erhöhen und/oder eine weitere eingeführte Modifikation des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls nicht beeinträchtigen.
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül eine Lipidmodifikation enthalten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise in 5'-3'-Richtung, die folgenden Elemente:
    • einen ORF;
    • ein optionales 3'-UTR-Element, wie hier beschrieben;
    • eine Poly(A)-Sequenz, die vorzugsweise 64 Adenosinreste umfasst oder aus diesen besteht;
    • eine Poly(C)-Sequenz, die vorzugsweise 30 Cytosinreste umfasst oder aus diesen besteht;
    • eine Histon-Stem-Loop-Sequenz, die vorzugsweise die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 11 umfasst oder aus dieser besteht; und
    • eine Poly(A)-Sequenz, die vorzugsweise mindestens 160 Adenosinreste umfasst.
  • Vorzugsweise umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül, bei dem es sich vorzugsweise um eine mRNA handelt, optional außerdem eine 5'-UTR, die vorzugsweise ein 5'-UTR-Element umfasst, das eine Nukleinsäure umfasst oder aus einer Nukleinsäure besteht, die von einer 5'-UTR eines TOP-Gens, das für ein ribosomales Large-Protein (RPL) kodiert, oder von einem Homolog, einem Fragment oder einer Variante davon abgeleitet ist, denen vorzugsweise das 5'-TOP-Motiv fehlt. Noch bevorzugter umfasst das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül ferner eine 5'-Cap-Struktur.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert der mindestens eine offene Leserahmen des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls für ein therapeutisches Protein oder Peptid. In einer anderen Ausführungsform kodiert der mindestens eine offene Leserahmen für ein Antigen, wie z.B. ein pathogenes Antigen, ein Tumorantigen, ein allergenes Antigen oder ein Autoimmunantigen. Dabei wird die Verabreichung des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, das für das Antigen kodiert, in einem genetischen Vakzinierungsansatz gegen eine Krankheit verwendet, bei der das Antigen eine Rolle spielt.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird ein Antikörper durch den mindestens einen offenen Leserahmen des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls kodiert.
  • Antigene:
  • Pathogene Antigene:
  • Das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül kann für ein Protein oder ein Peptid kodieren, das ein pathogenes Antigen oder ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat davon umfasst. Solche pathogenen Antigene stammen von pathogenen Organismen, insbesondere bakteriellen, viralen oder protozoologischen (multizellulären) pathogenen Organismen, die eine immunologische Reaktion in einem Subjekt, insbesondere einem Säugetier, vor allem einem Menschen, hervorrufen. Pathogene Antigene sind vorzugsweise Oberflächenantigene, zum Beispiel Proteine (oder Fragmente von Proteinen, zum Beispiel der äußere Teil eines Oberflächenantigens), die sich auf der Oberfläche des Virus oder des bakteriellen oder protozoologischen Organismus befinden.
  • Pathogene Antigene sind Peptid- oder Proteinantigene, die vorzugsweise von einem mit einer Infektionskrankheit assoziierten Pathogen stammen und vorzugsweise aus Antigenen ausgewählt sind, die abgeleitet sind von den Pathogenen Acinetobacter baumannii, Gattung Anaplasma, Anaplasma phagocytophilum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, Gattung Aspergillus, Astroviridae, Gattung Babesia, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, BK-Virus, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Gattung Borrelia, Borrelia spp, Gattung Brucella, Brugia malayi, Familie Bunyaviridae, Burkholderia cepacia und andere Burkholderia-Spezies, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Familie Caliciviridae, Gattung Campylobacter, Candida albicans, Candida spp, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, CJD-Prion, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, Clostridium spp, Clostridium tetani, Coccidioides spp, Coronaviren, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, Krim-Kongo-hämorrhagisches Fieber-Virus, Cryptococcus neoformans, Gattung Cryptosporidium, Cytomegalovirus (CMV), Dengue-Viren (DEN-1, DEN-2, DEN-3 und DEN-4), Dientamoeba fragilis, Ebolavirus (EBOV), Gattung Echinococcus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Gattung Ehrlichia, Entamoeba histolytica, Gattung Enterococcus, Gattung Enterovirus, Enteroviren, hauptsächlich Coxsackie-A-Virus und Enterovirus 71 (EV71), Epidermophyton spp, Epstein-Barr-Virus (EBV), Escherichia coli O157:H7, O111 und O104:H4, Fasciola hepatica und Fasciola gigantica, FFI-Prion, Superfamilie Filarioidea, Flaviviren, Francisella tularensis, Gattung Fusobacterium, Geotrichum candidum, Giardia intestinalis, Gnathostoma spp, GSS-Prion, Guanarito-Virus, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Henipavirus (Hendra-Virus, Nipah-Virus), Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), Hepatitis-D-Virus, Hepatitis-E-Virus, Herpes-simplex-Virus 1 und 2 (HSV-1 und HSV-2), Histoplasma capsulatum, HIV (Humanes Immundefizienz-Virus), Hortaea werneckii, Humanes Bocavirus (HBoV), Humanes Herpesvirus 6 (HHV-6) und Humanes Herpesvirus 7 (HHV-7), Humanes Metapneumovirus (hMPV), Humanes Papillomavirus (HPV), Humane Parainfluenzaviren (HPIV), Japanisches Enzephalitis-Virus, JC-Virus, Junin-Virus, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, Kuru-Prion, Lassa-Virus, Legionella pneumophila, Gattung Leishmania, Gattung Leptospira, Listeria monocytogenes, Lymphozytisches Choriomeningitis-Virus (LCMV), Machupo-Virus, Malassezia spp, Marburg-Virus, Masern-Virus, Metagonimus yokagawai, Microsporidia phylum, Molluscum contagiosum-Virus (MCV), Mumps-Virus, Mycobacterium leprae und Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Nocardia spp, Onchocerca volvulus, Orientia tsutsugamushi, Familie Orthomyxoviridae (Influenza), Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus spp, Paragonimus westermani, Parvovirus B19, Gattung Pasteurella, Gattung Plasmodium, Pneumocystis jirovecii, Poliovirus, Rabiesvirus, Respiratorisches Synzytial-Virus (RSV), Rhinovirus, Rhinoviren, Rickettsia akari, Gattung Rickettsia, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, Rifttalfieber-Virus, Rotavirus, Rubella-Virus, Sabia-Virus, Gattung Salmonellen, Sarcoptes scabiei, SARS-Coronavirus, Gattung Schistosoma, Gattung Shigella, Sin-Nombre-Virus, Hantavirus, Sporothrix schenckii, Gattung Staphylococcus, Gattung Staphylococcus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, Gattung Taenia, Taenia solium, Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV), Toxocara canis oder Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophyton spp, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, Varicella-Zoster-Virus (VZV), Varicella-Zoster-Virus (VZV), Variola major oder Variola minor, vCJD-Prion, Venezolanisches Pferdeenzephalitis-Virus, Vibrio cholerae, West-Nil-Virus, Westliches Pferdeenzephalitis-Virus, Wuchereria bancrofti, Gelbfieber-Virus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis und Yersinia pseudotuberculosis.
  • Besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Antigene von Pathogenen, die ausgewählt sind aus Influenzavirus, Respiratorischem Synzytial-Virus (RSV), Herpes Simplex Virus (HSV), Humanem Papilloma-Virus (HPV), Humanem Immundefizienz-Virus (HIV), Plasmodium, Staphylococcus aureus, Dengue-Virus, Chlamydia trachomatis, Cytomegalovirus (CMV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Mycobacterium tuberculosis, Rabiesvirus und Gelbfieber-Virus.
  • Tumor-Antigene:
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül für ein Protein oder ein Peptid kodieren, das ein Peptid oder Protein umfasst, das ein Tumorantigen, ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat des Tumorantigens umfasst, wobei das Tumorantigen vorzugsweise ein Melanozytenspezifisches Antigen, ein Cancer-Testis-Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen, vorzugsweise ein CT-X-Antigen, ein Nicht-X-CT-Antigen, ein Bindungspartner für ein CT-X-Antigen oder ein Bindungspartner für ein Nicht-X-CT-Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen, bevorzugter ein CT-X-Antigen, ein Bindungspartner für ein Nicht-X-CT-Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen oder ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat des Tumorantigens ist; und wobei jede der Nukleinsäuresequenzen für ein anderes Peptid oder Protein kodiert; und wobei mindestens eine der Nukleinsäuresequenzen kodiert für: 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alpha-5-beta-1-lntegrin, alpha-5-beta-6-Integrin, alpha-Actinin-4/m, alpha-Methylacyl-Coenzym-A-Racemase, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta-Catenin/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, Calreticulin, CAMEL, CASP-8/m, Cathepsin B, Cathepsin L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, Coactosin-like Protein, Kollagen XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, Cyclin B1, Cyclin D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, Hepsin, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, Homeobox NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, unreifer Lamininrezeptor, Kallikrein-2, Kallikrein-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, Mammaglobin A, MART-1/Melan-A, MART-2, MART-2/m, Matrixprotein 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, Mesothelin, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-Antigen, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, Myosin Klasse l/m, NA88-A, N-Acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, Osteocalcin, Osteopontin, p15, p190 minor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-Kinase, Pin-1, Pml/PARalpha, POTE, PRAME, PRDX5/m, Prostein, Proteinase-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, Survivin, Survivin-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGFbeta, TGFbetaRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, Tyrosinase, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, WT1 und einen Immunglobulin-Idiotyp einer lymphatischen Blutzelle oder einen T-Zell-Rezeptor-Idiotyp einer lymphatischen Blutzelle oder ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat des Tumorantigens; vorzugsweise Survivin oder ein Homologes davon, ein Antigen aus der MAGE-Familie oder ein Bindungspartner davon oder ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat des Tumorantigens. Besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang die Tumorantigene NY-ESO-1, 5T4, MAGE-C1, MAGE-C2, Survivin, Muc-1, PSA, PSMA, PSCA, STEAP und PAP.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert das artifizielle Nukleinsäuremolekül für ein Protein oder ein Peptid, das ein therapeutisches Protein oder ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat davon umfasst.
  • Therapeutische Proteine, wie sie hier definiert sind, sind Peptide oder Proteine, die für die Behandlung einer vererbten oder erworbenen Krankheit von Nutzen sind oder den Zustand eines Individuums verbessern. Insbesondere spielen therapeutische Proteine eine wichtige Rolle bei der Herstellung von therapeutischen Agenzien, die unter anderem genetische Fehler modifizieren und reparieren, Krebszellen oder mit Pathogenen infizierte Zellen zerstören, Störungen des Immunsystems behandeln, metabolische oder endokrine Störungen behandeln können. So kann beispielsweise Erythropoietin (EPO), ein Proteinhormon, zur Behandlung von Patienten mit Erythrozytenmangel, der eine häufige Ursache für Nierenkomplikationen ist, eingesetzt werden. Zu den therapeutischen Proteinen gehören auch Adjuvans-Proteine, therapeutische Antikörper und die Hormonersatztherapie, die zum Beispiel bei der Behandlung von Frauen in der Menopause eingesetzt wird. In neueren Ansätzen werden somatische Zellen eines Patienten verwendet, um sie in pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren, die die umstrittene Stammzelltherapie ersetzen. Auch diese Proteine, die zur Reprogrammierung somatischer Zellen oder zur Differenzierung von Stammzellen verwendet werden, werden hier als therapeutische Proteine definiert. Darüber hinaus können therapeutische Proteine auch für andere Zwecke eingesetzt werden, zum Beispiel Wundheilung, Geweberegeneration, Angiogenese usw. Außerdem werden antigenspezifische B-Zell-Rezeptoren sowie Fragmente und Varianten davon hier als therapeutische Proteine definiert.
  • Daher können therapeutische Proteine für verschiedene Zwecke verwendet werden, einschließlich der Behandlung verschiedener Krankheiten, wie zum Beispiel Infektionskrankheiten, Neoplasmen (zum Beispiel Krebs- oder Tumorerkrankungen), Erkrankungen des Blutes und der blutbildenden Organe, endokrine, ernährungsbedingte und metabolische Erkrankungen, Erkrankungen des Nervensystems, Erkrankungen des Kreislaufsystems, Erkrankungen des Atmungssystems, Erkrankungen des Verdauungssystems, Erkrankungen der Haut und des Unterhautgewebes, Erkrankungen des Muskel-Skelett-Systems und des Bindegewebes sowie Erkrankungen des Urogenitalsystems, unabhängig davon, ob sie vererbt oder erworben sind.
  • In diesem Zusammenhang sind besonders bevorzugte therapeutische Proteine, die unter anderem bei der Behandlung von metabolischen oder endokrinen Erkrankungen eingesetzt werden können, ausgewählt aus (in Klammern steht die jeweilige Erkrankung, bei der das therapeutische Protein zur Behandlung eingesetzt wird): Saure Sphingomyelinase (Niemann-Pick-Krankheit), Adipotid (Fettleibigkeit), Agalsidase-beta (humane Galaktosidase A) (Fabry-Krankheit; verhindert die Akkumulation von Lipiden, die zu renalen und kardiovaskulären Komplikationen führen können), Alglucosidase (Pompe-Krankheit (Glykogenspeicherkrankheit Typ II)), alpha-Galactosidase A (alpha-GAL A, Agalsidase alpha) (Fabry-Krankheit), alpha-Glucosidase (Glykogenspeicherkrankheit (GSD), Morbus Pompe), alpha-L-Iduronidase (Mukopolysaccharidosen (MPS), Hurler-Syndrom, Scheie-Syndrom), alpha-N-Acetylglucosaminidase (Sanfilippo-Syndrom), Amphiregulin (Krebs, Stoffwechselstörung), Angiopoietin ((Ang1, Ang2, Ang3, Ang4, (IBS), Fettleibigkeit, Prader-Willi-Syndrom, Diabetes mellitus Typ II), PDGF (Platelet Derived Growth Factor) (PDFF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D) (regenerative Wirkung, Wundheilung, Störung der Angiogenese, Arteriosklerose, Fibrose, Krebs), TGF-Beta-Rezeptoren (Endoglin, TGF-Beta-1-Rezeptor, TGF-Beta-2-Rezeptor, TGF-Beta-3-Rezeptor) (Nierenfibrose, Nierenerkrankungen, Diabetes, Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD), Angiogenese), Thrombopoietin (THPO) (Megakaryozyten-Wachstums- und Entwicklungsfaktor (MGDF)) (Blutplättchen-Störungen, Blutplättchen für Spenden, Wiederherstellung der Blutplättchenzahl nach myelosuppressiver Chemotherapie), TGF (Transforming Growth Factor) (TGF-alpha, TGF-beta (TGFbeta1, TGFbeta2 und TGFbeta3)) (regenerative Wirkung, Wundheilung, Immunität, Krebs, Herzerkrankungen, Diabetes, Marfan-Syndrom, Loeys-Dietz-Syndrom), VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F und PIGF) (regenerative Wirkung, Angiogenese, Wundheilung, Krebs, Permeabilität), Nesiritid (akute dekompensierte Herzinsuffizienz), Trypsin (Dekubitus, Ulcus cruris, Debridement von Schorf, dehiszierende Wunde, Sonnenbrand, Mekonium Ileus), adrenocorticotropes Hormon (ACTH) (Addison-Krankheit, Kleinzelliges Karzinom, Adrenoleukodystrophie, kongenitale Nebennierenhyperplasie, Cushing-Syndrom, Nelson-Syndrom, infantile Spasmen), atrialnatriuretisches Peptid (ANP) (endokrine Störungen), Cholecystokinin (diverse), Gastrin (Hypogastrinämie), Leptin (Diabetes, Hypertriglyceridämie, Fettleibigkeit), Oxytocin (Stimulation des Stillens, Stillstand des Geburtsvorgangs), Somatostatin (symptomatische Behandlung des Karzinoid-Syndroms, der akuten Varizenblutung und der Akromegalie, polyzystische Erkrankungen der Leber und der Niere, Akromegalie und durch neuroendokrine Tumoren verursachte Symptome), Vasopressin (antidiuretisches Hormon) (Diabetes insipidus), Calcitonin (postmenopausale Osteoporose, Hyperkalzämie, Paget-Krankheit, Knochenmetastasen, Phantomschmerzen der Gliedmaßen, Spinalkanalstenose), Exenatide (Typ-2-Diabetes, der auf eine Behandlung mit Metformin und einem Sulfonylharnstoff nicht anspricht), Wachstumshormon (GH), Somatotropin (Wachstumsstörungen aufgrund von GH-Mangel oder chronischer Niereninsuffizienz, Prader-Willi-Syndrom, Turner-Syndrom, AIDS-Wasting oder Kachexie unter antiviraler Therapie), Insulin (Diabetes mellitus, diabetische Ketoazidose, Hyperkaliämie), Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 IGF-1 (Wachstumsstörungen bei Kindern mit GH-Gen-Deletion oder schwerem primärem IGF1-Mangel, neurodegenerative Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Herzinsuffizienz), Mecasermin rinfabate, IGF-1-Analogon (Wachstumsstörungen bei Kindern mit GH-Gen-Deletion oder schwerem primärem IGF1-Mangel, neurodegenerative Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, ANGPTL2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6, ANGPTL7) (Angiogenese, Gefäßstabilisierung), Betacellulin (Stoffwechselstörung), Beta-Glucuronidase (Sly-Syndrom), Knochenmorphogenetisches Protein („Bone Morphogenetic Proteins“; BMPs (BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP10, BMP15) (regenerative Wirkung, knochenbezogene Erkrankungen, chronische Nierenerkrankung (CKD)), CLN6-Protein (CLN6-Krankheit - Atypische spätinfantile, spät einsetzende Variante, früh juvenil, neuronale Ceroid-Lipofuszinosen (NCL)), Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) (Wundheilung, Regulierung von Zellwachstum, -proliferation und -differenzierung), Epigen (Stoffwechselstörung), Epiregulin (Stoffwechselstörung), Fibroblasten-Wachstumsfaktor („Fibroblast Growth Factor“, FGF, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23) (Wundheilung, Angiogenese, endokrine Störungen, Geweberegeneration), Galsulphase (Mukopolysaccharidose VI), Ghrelin (Reizdarmsyndrom (IBS), Fettleibigkeit, Prader-Willi-Syndrom, Diabetes mellitus Typ II), Glukozerebrosidase (Gaucher-Krankheit), GM-CSF (regenerative Wirkung, Produktion weißer Blutkörperchen, Krebs), Heparin-bindender EGF-ähnlicher Wachstumsfaktor (HB-EGF) (Wundheilung, Herzhypertrophie und Herzentwicklung und -funktion), Hepatozyten-Wachstumsfaktor HGF (regenerative Wirkung, Wundheilung), Hepcidin (Eisenstoffwechselstörungen, Beta-Thalassämie), Humanes Albumin (Verminderte Albuminproduktion (Hypoproteinämie), erhöhter Albuminverlust (Nephrotisches Syndrom), Hypovolämie, Hyperbilirubinämie), Idursulphase (lduronat-2-Sulfatase) (Mukopolysaccharidose II (Hunter-Syndrom)), Integrine αVβ3, αVβ5 und α5β1 (Bindung von Matrix-Makromolekülen und Proteinasen, Angiogenese), luduronat-Sulfatase (Hunter-Syndrom), Laronidase (Hurler- und Hurler-Scheie-Formen der Mukopolysaccharidose I), N-Acetylgalactosamin-4-Sulfatase (rhASB; Galsulfase, Arylsulfatase A (ARSA), Arylsulfatase B (ARSB)) (Arylsulfatase-B-Mangel, Maroteaux-Lamy-Syndrom, Mukopolysaccharidose VI), N-Acetylglucosamin-6-Sulfatase (Sanfilippo-Syndrom), Nervenwachstumsfaktor (NGF, Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3) und Neurotrophin 4/5 (NT-4/5) (regenerative Wirkung, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, koronare Atherosklerose, Fettleibigkeit, Typ-2-Diabetes, metabolisches Syndrom, akute Koronarsyndrome, Demenz, Depression, Schizophrenie, Autismus, Rett-Syndrom, Anorexia nervosa, Bulimia nervosa, Wundheilung, Hautgeschwüre, Hornhautgeschwüre, Alzheimer-Krankheit), Neuregulin (NRG1, NRG2, NRG3, NRG4) (Stoffwechselstörung, Schizophrenie), Neuropilin (NRP-1, NRP-2) (Angiogenese, Axonführung, Zellüberleben, Migration), Obestatin (Reizdarmsyndrom Herzinsuffizienz), Mecasermin, IGF-1-Analogon (Wachstumsstörungen bei Kindern mit GH-Gen-Deletion oder schwerem primärem IGF1-Mangel, neurodegenerative Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Herzinsuffizienz), Pegvisomant (Akromegalie), Pramlintide (Diabetes mellitus, in Kombination mit Insulin), Teriparatid (humane Parathormonreste 1-34) (schwere Osteoporose), Becaplermin (Debridement-Hilfsmittel für diabetische Geschwüre), Dibotermin-alpha (knochenmorphogenetisches Protein 2) (Spondylodese, Reparatur von Knochenverletzungen), Histrelinacetat (Gonadotropin-Releasing-Hormon; GnRH) (verfrühte Pubertät), Octreotid (Akromegalie, symptomatische Linderung von VIP-sekretierenden Adenomen und metastasierenden Karzinoid-Tumoren) und Palifermin (Keratinozyten-Wachstumsfaktor; KGF) (schwere orale Mukositis bei Patienten unter Chemotherapie, Wundheilung).
  • Diese und andere Proteine sind als therapeutisch zu verstehen, da sie dazu bestimmt sind, das Subjekt zu behandeln, indem sie seine mangelhafte endogene Produktion eines funktionellen Proteins in ausreichender Menge ersetzen. Dementsprechend handelt es sich bei solchen therapeutischen Proteinen in der Regel um Säugetierproteine, insbesondere um humane Proteine.
  • Zur Behandlung von Bluterkrankungen, Krankheiten des Kreislaufsystems, Krankheiten des Atmungssystems, Krebs- oder Tumorerkrankungen, Infektionskrankheiten oder Immundefekten können folgende therapeutische Proteine verwendet werden: Alteplase (Gewebeplasminogenaktivator; tPA) (Lungenembolie, Herzinfarkt, akuter ischämischer Schlaganfall, Verschluss zentraler venöser Zugänge), Anistreplase (Thrombolyse), Antithrombin III (AT-III) (erblicher AT-Ill-Mangel, Thromboembolie), Bivalirudin (Verringerung des Blutgerinnungsrisikos bei Koronarangioplastie und Heparin-induzierter Thrombozytopenie), Darbepoetin-alpha (Behandlung der Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz und chronischem Nierenversagen (+/- Dialyse)), Drotrecogin-alpha (aktiviertes Protein C) (schwere Sepsis mit hohem Sterberisiko), Erythropoetin, Epoetin-alpha, Erythropoetin, Erthropoyetin (Anämie bei chronischen Erkrankungen, Myleodysplasie, Anämie aufgrund von Nierenversagen oder Chemotherapie, präoperative Vorbereitung), Faktor IX (Hämophilie B), Faktor Vlla (Blutungen bei Patienten mit Hämophilie A oder B und Inhibitoren von Faktor VIII oder Faktor IX), Faktor VIII (Hämophilie A), Lepirudin (Heparin-induzierte Thrombozytopenie), Protein-C-Konzentrat (venöse Thrombose, Purpura fulminans), Reteplase (Deletionsmutein von tPA) (Behandlung des akuten Myokardinfarkts, Verbesserung der Herzkammerfunktion), Streptokinase (akuter transmuraler Myokardinfarkt, Lungenembolie, tiefe Venenthrombose, arterielle Thrombose oder Embolie, Verschluss einer arteriovenösen Kanüle), Tenecteplase (akuter Myokardinfarkt), Urokinase (Lungenembolie), Angiostatin (Krebs), Anti-CD22-Immunotoxin (rezidivierte CD33+ akute myeloische Leukämie), Denileukin diftitox (kutanes T-Zell-Lymphom (CTCL)), Immunocyanin (Blasen- und Prostatakrebs), MPS (Metallopanstimulin) (Krebs), Aflibercept (nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC), metastasierender Darmkrebs (mCRC), hormonrefraktärer metastasierender Prostatakrebs, feuchte Makuladegeneration), Endostatin (Krebs, entzündliche Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis sowie Morbus Crohn, diabetische Retinopathie, Psoriasis und Endometriose), Collagenase (Debridement chronischer Hautgeschwüre und schwer verbrannter Bereiche, Dupuytrensche Kontraktur, Peyronie-Krankheit), humane Desoxy-Ribonuklease I, Dornase (Mukoviszidose; verringert Atemwegsinfektionen bei ausgewählten Patienten mit einer FVC von mehr als 40% der vorhergesagten Werte), Hyaluronidase (wird als Adjuvans verwendet, um die Absorption und Dispersion von injizierten Arzneimitteln zu erhöhen, insbesondere von Anästhetika in der Augenchirurgie und bestimmten bildgebenden Mitteln), Papain (Debridement von nekrotischem Gewebe oder Verflüssigung von Schorf bei akuten und chronischen Läsionen, wie zum Beispiel Druckgeschwüren, varikösen und diabetischen Geschwüren, Verbrennungen, postoperativen Wunden, Pilonidalzysten, Karbunkeln und anderen Wunden), L-Asparaginase (akute lymphatische Leukämie, die exogenes Asparagin für die Proliferation benötigt), Peg-Asparaginase (akute lymphatische Leukämie, (Akute lymphatische Leukämie, die exogenes Asparagin für die Proliferation benötigt), Rasburicase (Pädiatrische Patienten mit Leukämie, Lymphomen und soliden Tumoren, die sich einer Antikrebstherapie unterziehen, die ein Tumorlyse-Syndrom verursachen kann), Humanes Choriongonadotropin (HCG) (assistierte Reproduktion), Humanes Follikelstimulierendes Hormon (FSH) (assistierte Reproduktion), Lutropin-alpha (Unfruchtbarkeit bei Mangel an luteinisierendem Hormon), Prolaktin (Hypoprolaktinämie, Prolaktinmangel im Serum, Funktionsstörungen der Eierstöcke bei Frauen, Angstzustände, arteriogene erektile Dysfunktion, vorzeitige Ejakulation, Oligozoospermie, Asthenospermie, Unterfunktion der Samenblasen, Hypoandrogenismus bei Männern), Alpha-1-Proteinase-Inhibitor (angeborener Antitrypsinmangel), Laktase (Blähungen, Krämpfe und Durchfall aufgrund der Unfähigkeit, Laktose zu verdauen), Pankreasenzyme (Lipase, Amylase, Protease) (Mukoviszidose, chronische Pankreatitis, Pankreasinsuffizienz, Magenbypassoperation nach Billroth II, (Pankreasgangobstruktion, Steatorrhoe, schlechte Verdauung, Blähungen, Blähungen), Adenosindesaminase (Pegademase vom Rind, PEG-ADA) (schwere kombinierte Immunschwächekrankheit aufgrund von Adenosindesaminasemangel), Abatacept (rheumatoide Arthritis (insbesondere bei Refraktärität gegenüber TNFalpha-Hemmung)), Alefacept (Plaque-Psoriasis), Anakinra (rheumatoide Arthritis), Etanercept (rheumatoide Arthritis, juvenile rheumatoide Arthritis mit polyartikulärem Verlauf, Psoriasis-Arthritis, Spondylitis ankylosans, Plaque-Psoriasis, Spondylitis ankylosans), Interleukin-1 (IL-1)-Rezeptor-Antagonist, Anakinra (Entzündung und Knorpelabbau im Zusammenhang mit rheumatoider Arthritis), Thymulin (neurodegenerative Erkrankungen, Rheuma, Anorexia nervosa), TNF-alpha-Antagonist (Autoimmunerkrankungen, wie zum Beispiel rheumatoide Arthritis, Spondylitis ankylosans, Morbus Crohn, Psoriasis, Hidradenitis suppurativa, refraktäres Asthma), Enfuvirtide (HIV-1-Infektion) und Thymosin α1 (Hepatitis B und C).
    (In Klammern steht die jeweilige Krankheit, für die das therapeutische Protein zur Behandlung eingesetzt wird.)
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung (nicht beansprucht) einen Vektor bereit, der ein artifizielles Nukleinsäuremolekül umfasst, das einen ORF und eine 3'-UTR umfasst, wobei die 3'-UTR mindestens eine Poly(A)-Sequenz, wie hier definiert, umfasst, wobei die mindestens eine Poly(A)-Sequenz mindestens 70 Adenin-Nukleotide umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das artifizielle Nukleinsäuremolekül eine 3'-UTR, die mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen, wie hier definiert, umfasst.
  • Die 3'-UTR und der ORF sind wie oben für das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül beschrieben. Die Klonierungsstelle kann eine beliebige Sequenz sein, die zur Einführung eines offenen Leserahmens oder einer Sequenz, die einen offenen Leserahmen umfasst, geeignet ist, wie beispielsweise eine oder mehrere Restriktionsstellen. Somit ist der Vektor, der eine Klonierungsstelle umfasst, vorzugsweise geeignet, um einen offenen Leserahmen in den Vektor einzufügen, vorzugsweise um einen offenen Leserahmen 5' zur 3'-UTR einzufügen. Vorzugsweise befindet sich die Klonierungsstelle oder der ORF 5' zur 3'-UTR, vorzugsweise in unmittelbarer Nähe zum 5'-Ende der 3'-UTR. Beispielsweise können die Klonierungsstelle oder der ORF direkt mit dem 5'-Ende der 3'-UTR verbunden sein, oder sie können über einen Nukleotidabschnitt verbunden sein, wie beispielsweise über einen Abschnitt von 2, 4, 6, 8, 10, 20 usw. Nukleotiden, wie oben für das hierin offenbarte artifizielle Nukleinsäuremolekül beschrieben.
  • Vorzugsweise eignet sich der hierin offenbarte Vektor (nicht beansprucht) zur Herstellung des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise zur Herstellung einer erfindungsgemäßen artifiziellen mRNA, beispielsweise durch optionales Einfügen eines offenen Leserahmens oder einer einen offenen Leserahmen umfassenden Sequenz in den Vektor und Transkription des Vektors. Somit umfasst der Vektor vorzugsweise Elemente, die für die Transkription benötigt werden, wie z.B. einen Promotor, z.B. einen RNA-Polymerase-Promotor. Vorzugsweise ist der Vektor für die Transkription unter Anwendung von eukaryotischen, prokaryotischen, viralen oder Phagen-Transkriptionssystemen geeignet, wie zum Beispiel eukaryotischen Zellen, prokaryotischen Zellen oder eukaryotischen, prokaryotischen, viralen oder Phagen-in vitro-Transkriptionssystemen. So kann der Vektor beispielsweise eine Promotorsequenz umfassen, die von einer Polymerase, wie zum Beispiel einer RNA-Polymerase, zum Beispiel einer eukaryotischen, prokaryotischen, viralen oder Phagen-RNA-Polymerase, erkannt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor einen Phagen-RNA-Polymerase-Promotor, wie zum Beispiel einen SP6-, T3- oder T7-Promotor, vorzugsweise einen T7-Promotor. Vorzugsweise ist der Vektor für die In-vitro-Transkription unter Verwendung eines Phagen-basierten In-vitro-Transkriptionssystems, wie zum Beispiel eines T7-RNA-Polymerase-basierten In-vitro-Transkriptionssystems, geeignet.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann der Vektor (nicht beansprucht) direkt zur Expression des kodierten Peptids oder Proteins in Zellen oder Geweben verwendet werden. Zu diesem Zweck enthält der Vektor bestimmte Elemente, die für die Expression in diesen Zellen/Geweben erforderlich sind, zum Beispiel bestimmte Promotorsequenzen, wie zum Beispiel einen CMV-Promotor.
  • Der Vektor (nicht beansprucht) kann ferner ein Polyadenylierungssignal enthalten, wie oben für das hierin offenbarte artifizielle Nukleinsäuremolekül beschrieben.
  • Der Vektor (nicht beansprucht) kann ein RNA-Vektor oder ein DNA-Vektor sein. Vorzugsweise ist der Vektor ein DNA-Vektor. Der Vektor kann jeder der fachkundigen Person bekannte Vektor sein, wie zum Beispiel ein viraler Vektor oder ein Plasmidvektor. Vorzugsweise ist der Vektor ein Plasmidvektor, bevorzugt ein DNA-Plasmidvektor.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Offenbarung einen Vektor (nicht beansprucht) bereit, der das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül umfasst.
  • Vorzugsweise ist der Vektor ein zirkuläres Molekül. Vorzugsweise ist der Vektor ein doppelsträngiges Molekül, wie zum Beispiel ein doppelsträngiges DNA-Molekül. Ein solches zirkuläres, vorzugsweise doppelsträngiges DNA-Molekül kann bequem als Speicherform für das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül verwendet werden. Darüber hinaus kann es für die Transfektion von Zellen, zum Beispiel von kultivierten Zellen, verwendet werden. Er kann auch für die In-vitro-Transkription zum Erhalt eines erfindungsgemäßen artifiziellen RNA-Moleküls verwendet werden.
  • Vorzugsweise ist der Vektor (nicht beansprucht), vorzugsweise der zirkuläre Vektor, linearisierbar, zum Beispiel durch Restriktionsenzymverdau. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor eine Spaltstelle, wie zum Beispiel eine Restriktionsstelle, vorzugsweise eine einzigartige Spaltstelle, die unmittelbar 3' zur 3'-UTR oder 3' zur Poly(A)-Sequenz oder - falls vorhanden - zu einem Polyadenylierungssignal oder - falls vorhanden - 3' zur Poly(C)-Sequenz oder - falls vorhanden - 3' zum Histon-Stem-Loop gelegen ist. Somit endet das durch Linearisierung des Vektors erhaltene Produkt vorzugsweise am 3'-Ende mit dem 3'-Ende der 3'-UTR oder mit dem 3'-Ende der Poly(A)-Sequenz oder - falls vorhanden - mit dem Polyadenylierungssignal oder - falls vorhanden - mit dem 3'-Ende der Poly(C)-Sequenz oder - falls vorhanden - mit dem 3'-Ende des Histon-Stem-Loop. In der Ausführungsform, in der der hierin offenbarte Vektor das hierin offenbarte artifizielle Nukleinsäuremolekül umfasst, befindet sich eine Restriktionsstelle, vorzugsweise eine einzigartige Restriktionsstelle, vorzugsweise unmittelbar 3' zum 3'-Ende des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls. Bevorzugt befindet sich eine Restriktionsstelle zur Linearisierung des zirkulären Vektormoleküls auf der 3'-Seite der 3'-UTR des kodierenden Strangs.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, die das artifizielle Nukleinsäuremolekül, wie in den angefügten Ansprüchen definiert, umfasst. Die Zelle kann eine beliebige Zelle sein, wie z.B. eine Bakterienzelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine Vertebratenzelle, z.B. eine Säugetierzelle. Eine solche Zelle kann z.B. für die Replikation des hierin offenbarten Vektors verwendet werden, zum Beispiel in einer Bakterienzelle. Ferner kann die Zelle zur Transkription des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder des hierin offenbarten Vektors und/oder zur Translation des offenen Leserahmens des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder des hierin offenbarten Vektors verwendet werden. Die Zelle kann zum Beispiel für die rekombinante Proteinproduktion verwendet werden.
  • Die hierin offenbarten Zellen sind zum Beispiel durch Standard-Nukleinsäuretransferverfahren, wie zum Beispiel Standard-Transfektions-, -Transduktions- oder -Transformationsverfahren, erhältlich. Das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül oder der hierin offenbarte Vektor kann beispielsweise durch Elektroporation, Lipofektion, zum Beispiel auf der Basis kationischer Lipide und/oder Liposomen, Calciumphosphat-Präzipitation, Transfektion auf der Basis von Nanopartikeln, Transfektion auf der Basis von Viren oder auf der Basis kationischer Polymere, wie zum Beispiel DEAE-Dextran oder Polyethylenimin usw., in die Zelle transferiert werden.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der Zelle um eine Säugetierzelle, wie zum Beispiel eine Zelle eines humanen Subjekts, eines Haustiers oder eines Labortiers, wie zum Beispiel eine Maus- oder Rattenzelle. Vorzugsweise ist die Zelle eine humane Zelle. Bei der Zelle kann es sich um eine Zelle einer etablierten Zelllinie handeln, wie zum Beispiel CHO, BHK, 293T, COS-7, HELA, HEK usw., oder die Zelle kann eine Primärzelle sein, wie zum Beispiel eine humane dermale Fibroblastenzelle (HDF) usw., vorzugsweise eine aus einem Organismus isolierte Zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine isolierte Zelle eines Säugetieres, vorzugsweise eines Menschen. Bei der Zelle kann es sich beispielsweise um eine Immunzelle, wie zum Beispiel eine dendritische Zelle, eine Krebs- oder Tumorzelle oder irgendeine somatische Zelle usw. handeln, vorzugsweise von einem Säugetier, vorzugsweise von einem Menschen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die das artifizielle Nukleinsäuremolekül oder die Zelle umfasst, wie in den angefügten Ansprüchen definiert. Des Weiteren ist hierin ebenso eine pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, die das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, oder die erfindungsgemäße Zelle umfasst. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann z.B. als Vakzine verwendet werden, z.B. für eine genetische Vakzinierung. So kann der ORF z.B. für ein Antigen kodieren, das einem Patienten zur Vakzinierung verabreicht werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die hierin offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung also eine Vakzine. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zum Beispiel für die Gentherapie verwendet werden.
  • Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ferner einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Vehikel, Verdünnungsmittel und/oder Hilfs- oder Trägerstoffe (Exzipienten) und/oder ein oder mehrere Adjuvanzien. Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfasst ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel typischerweise eine flüssige oder nicht flüssige Basis für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung. In einer Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung in flüssiger Form bereitgestellt. In diesem Zusammenhang basiert das Vehikel vorzugsweise auf Wasser, wie zum Beispiel pyrogenfreiem Wasser, isotonischer Kochsalzlösung oder gepufferten (wässrigen) Lösungen, zum Beispiel Phosphat-, Zitrat- usw. gepufferten Lösungen. Der Puffer kann in Bezug auf das spezifische Referenzmedium hyperton, isoton oder hypoton sein, d.h. der Puffer kann in Bezug auf das spezifische Referenzmedium einen höheren, gleichen oder niedrigeren Salzgehalt aufweisen, wobei vorzugsweise solche Konzentrationen der vorgenannten Salze verwendet werden können, die nicht zu einer Schädigung von Säugetierzellen durch Osmose oder andere Konzentrationseffekte führen. Referenzmedien sind zum Beispiel Flüssigkeiten, die bei „In-vivo“-Verfahren vorkommen, wie zum Beispiel Blut, Lymphe, zytosolische Flüssigkeiten oder andere Körperflüssigkeiten, oder zum Beispiel Flüssigkeiten, die bei „In-vitro“-Verfahren als Referenzmedien verwendet werden können, wie beispielsweise übliche Puffer oder Flüssigkeiten. Solche üblichen Puffer oder Flüssigkeiten sind der fachkundigen Person bekannt. Ringer-Lactat-Lösung ist als flüssige Basis besonders bevorzugt.
  • Für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung können auch ein oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe oder Verdünnungsmittel oder Verkapselungsverbindungen, die für die Verabreichung an einen Patienten geeignet sind, verwendet werden. Der Begriff „kompatibel“, wie er hier verwendet wird, bedeutet vorzugsweise, dass diese Komponenten der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit der artifiziellen Nukleinsäure oder den Zellen, wie hierin definiert, so gemischt werden können, dass keine Wechselwirkungen auftreten, die die pharmazeutische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung unter typischen Anwendungsbedingungen wesentlich verringern würden.
  • Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann optional eine oder mehrere zusätzliche pharmazeutisch aktive Komponenten enthalten. Eine pharmazeutisch aktive Komponente ist in diesem Zusammenhang eine Verbindung, die eine therapeutische Wirkung zur Heilung, Linderung oder Vorbeugung einer bestimmten Indikation oder Krankheit aufweist. Zu solchen Verbindungen gehören, ohne auf diese beschränkt zu sein, Peptide oder Proteine, Nukleinsäuren, (therapeutisch wirksame) organische oder anorganische niedermolekulare Verbindungen (Molekulargewicht unter 5000, vorzugsweise unter 1000), Zucker, Antigene oder Antikörper, im Stand der Technik bereits bekannte therapeutische Agenzien, antigene Zellen, antigene Zellfragmente, Zellfraktionen, Zellwandbestandteile (z.B. Polysaccharide), modifizierte, abgeschwächte oder inaktivierte (z.B. chemisch oder durch Bestrahlung) Pathogene (Viren, Bakterien etc.).
  • Außerdem kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung einen Träger für das artifizielle Nukleinsäuremolekül oder den Vektor umfassen. Ein solcher Träger kann geeignet sein, die Auflösung in physiologisch akzeptablen Flüssigkeiten, den Transport und die zelluläre Aufnahme des pharmazeutisch aktiven artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder des Vektors zu vermitteln. Dementsprechend kann ein solcher Träger eine Komponente sein, die für die Deponierung und Abgabe eines erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls geeignet sein kann. Solche Komponenten können z.B. kationische oder polykationische Träger oder Verbindungen sein, die als Transfektions- oder Komplexierungsmittel dienen können.
  • Besonders bevorzugte Transfektions- oder Komplexierungsmittel in diesem Zusammenhang sind kationische oder polykationische Verbindungen, einschließlich Protamin, Nucleolin, Spermin oder Spermidin, oder andere kationische Peptide oder Proteine, wie zum Beispiel Poly-L-Lysin (PLL), Poly-Arginin, basische Polypeptide, zellpenetrierende Peptide (CPPs), einschließlich HIV-bindende Peptide, HIV-1 Tat (HIV), von Tat abgeleitete Peptide, Penetratin, von VP22 abgeleitete oder analoge Peptide, HSV VP22 (Herpes simplex), MAP, KALA oder Proteintransduktionsdomänen (PTDs), PpT620, prolinreiche Peptide, argininreiche Peptide, lysinreiche Peptide, MPG-Peptid(e), Pep-1, L-Oligomere, Calcitonin-Peptid(e), Antennapedia-abgeleitete Peptide (insbesondere von Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, FGF, Lactoferrin, Transportan, Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, hCT-abgeleitete Peptide, SAP, oder Histone.
  • Darüber hinaus kann es sich bei solchen kationischen oder polykationischen Verbindungen oder Trägern um kationische oder polykationische Peptide oder Proteine handeln, die vorzugsweise mindestens eine -SH-Einheit umfassen oder zusätzlich so modifiziert sind, dass sie mindestens eine -SH-Einheit umfassen. Vorzugsweise ist ein kationischer oder polykationischer Träger ausgewählt aus kationischen Peptiden mit der folgenden Summenformel (I): {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}; Formel (I) worin I + m + n + o + x = 3-100, und I, m, n oder o unabhängig voneinander eine beliebige Zahl, ausgewählt aus 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 und 91-100, sind, vorausgesetzt, dass der Gesamtgehalt an Arg (Arginin), Lys (Lysin), His (Histidin) und Orn (Ornithin) mindestens 10% aller Aminosäuren des Oligopeptids ausmacht; und Xaa eine beliebige Aminosäure ist, die aus nativen (= natürlich vorkommenden) oder nicht-nativen Aminosäuren mit Ausnahme von Arg, Lys, His oder Orn ausgewählt ist; und x eine beliebige Zahl ist, die aus 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass der Gesamtgehalt an Xaa 90% aller Aminosäuren des Oligopeptids nicht überschreitet. Jede der Aminosäuren Arg, Lys, His, Orn und Xaa kann an jeder beliebigen Stelle des Peptids angeordnet sein. In diesem Zusammenhang sind kationische Peptide oder Proteine im Bereich von 7-30 Aminosäuren besonders bevorzugt.
  • Ferner kann das kationische oder polykationische Peptid oder Protein, wenn es gemäß der Formel {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (Formel (I)), wie oben gezeigt, definiert ist und mindestens eine -SH-Einheit umfasst oder zusätzlich so modifiziert ist, dass es mindestens eine -SH-Einheit umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, aus der Unterformel (la) ausgewählt sein: {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa')x(Cys)y} Unterformel (la) worin (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o; und x wie hierin definiert sind, Xaa' eine beliebige Aminosäure ist, ausgewählt aus nativen (= natürlich vorkommenden) oder nicht-nativen Aminosäuren mit Ausnahme von Arg, Lys, His, Orn oder Cys, und y eine beliebige Zahl ist, ausgewählt aus 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80 und 81-90, vorausgesetzt, dass der Gesamtgehalt an Arg (Arginin), Lys (Lysin), His (Histidin) und Orn (Ornithin) mindestens 10% aller Aminosäuren des Oligopeptids ausmacht. Ferner kann das kationische oder polykationische Peptid aus der Unterformel (Ib) ausgewählt sein: Cys1{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} Cys2 Unterformel (Ib) wobei die empirische Formel {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (Formel (I)) wie hierin definiert ist und einen Kern einer Aminosäuresequenz gemäß der (semiempirischen) Formel (I) bildet, und wobei Cys1 und Cys2 Cysteine sind, die proximal zu oder terminal zu (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x vorliegen.
  • Weitere bevorzugte kationische oder polykationische Verbindungen, die als Transfektions- oder Komplexierungsmittel verwendet werden können, sind kationische Polysaccharide, zum Beispiel Chitosan, Polybren, kationische Polymere, zum Beispiel Polyethylenimin (PEI), kationische Lipide, zum Beispiel DOTMA: 1-(2,3-Sioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, DMRIE, Di-C14-amidin, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleylphosphatidylethanolamin, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: Dioctadecylamidoglycylspermin, DIMRI: Dimyristooxypropyldimethylhydroxyethylammoniumbromid, DOTAP: Dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propan, DC-6-14: O,O-Ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolaminchlorid, CLIP1: rac-(2,3-Dioctadecyloxypropyl)(2-hydroxyethyl)dimethylammoniumchlorid, CLIP6: rac-[2(2,3-Dihexadecyloxypropyloxymethyloxy)ethyl]trimethylammonium, CLIP9: rac-[2(2,3-Dihexadecyloxypropyloxysuccinyloxy)ethyl]trimethylammonium, Oligofectamin, oder kationische oder polykationische Polymere, zum Beispiel modifizierte Polyaminosäuren, wie zum Beispiel β-Aminosäure-Polymere oder reversierte Polyamide, usw., modifizierte Polyethylene, wie zum Beispiel PVP (Poly(N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid)), usw., modifizierte Acrylate, wie zum Beispiel pDMAEMA (Poly(dimethylaminoethylmethylacrylat)), usw., modifizierte Amidoamine, wie zum Beispiel pAMAM (Poly(amidoamin)), usw., modifizierte Polybetaaminoester (PBAE), wie zum Beispiel mit Diaminendgruppen modifizierte 1,4-Butandioldiacrylat-co-5-amino-1-pentanol-Polymere usw., Dendrimere, wie zum Beispiel Polypropylamin-Dendrimere oder Dendrimere auf pAMAM-Basis usw., Polyimin(e), wie zum Beispiel PEI: Poly(ethylenimin), Poly(propylenimin) usw., Polyallylamin, Zuckerrückgrat-basierte Polymere, wie zum Beispiel Polymere auf Cyclodextrinbasis, Polymere auf Dextranbasis, Chitosan usw., Silanrückgrat-basierte Polymere, wie zum Beispiel PMOXA-PDMS-Copolymere usw., Blockpolymere, die aus einer Kombination von einem oder mehreren kationischen Blöcken (zum Beispiel ausgewählt aus einem kationischen Polymer wie oben erwähnt) und einem oder mehreren hydrophilen oder hydrophoben Blöcken (zum Beispiel Polyethylenglykol) bestehen; usw.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ein Adjuvans enthalten, um die immunstimulatorischen Eigenschaften der pharmazeutischen Zusammensetzung zu verstärken. In diesem Zusammenhang kann unter einem Adjuvans jede Verbindung verstanden werden, die geeignet ist, die Verabreichung und Abgabe der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen Komponenten, wie zum Beispiel des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, zu unterstützen. Darüber hinaus kann ein solches Adjuvans, ohne daran gebunden zu sein, eine Immunantwort des angeborenen Immunsystems, d.h. eine unspezifische Immunantwort, auslösen oder verstärken. Mit anderen Worten, wenn die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird, löst sie typischerweise eine adaptive Immunantwort aus, die auf das von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül kodierte Antigen gerichtet ist. Zusätzlich kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine (unterstützende) innate Immunantwort durch Zugabe eines Adjuvans, wie hierin definiert, zu der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung erzeugen.
  • Ein solches Adjuvans kann aus jedem Adjuvans ausgewählt sein, das der fachkundigen Person bekannt und für den vorliegenden Fall, d.h. die Unterstützung der Induktion einer Immunantwort bei einem Säugetier, geeignet ist. Vorzugsweise kann das Adjuvans, ohne darauf beschränkt zu sein, ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus: TDM, MDP, Muramyldipeptid, Pluronics, Alaun-Lösung, Aluminiumhydroxid, ADJUMER™ (Polyphosphazen); Aluminiumphosphat-Gel; Glucanen aus Algen; Algammulin; Aluminiumhydroxid-Gel (Alaun); stark Protein-adsorbierendem Aluminiumhydroxid-Gel; niederviskosem Aluminiumhydroxid-Gel; AF oder SPT (Emulsion von Squalan (5%), Tween 80 (0,2%), Pluronic L121 (1,25%), Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4); AVRIDINE™ (Propandiamin); BAY R1005™ ((N-(2-Deoxy-2-L-leucylamino-b-D-glucopyranosyl)-N-octadecyldodecanoylamidhydroacetat); CALCITRIOL™ (1-alpha-2,5-Dihydroxy-Vitamin D3); Calciumphosphatgel; CAP™ (Calciumphosphat-Nanopartikel); Choleraholotoxin, Choleratoxin-A1-Protein-A-D-Fragment-Fusionsprotein, Untereinheit B des Choleratoxins; CRL 1005 (Blockcopolymer P1205); Zytokin-enthaltenden Liposomen; DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid); DHEA (Dehydroepiandrosteron); DMPC (Dimyristoylphosphatidylcholin); DMPG (Dimyristoylphosphatidylglycerin); DOC/Alaun-Komplex (Desoxycholinsäure-Natriumsalz); komplettem Freundschen Adjuvans; inkomplettem Freundschem Adjuvans; gamma-Inulin; Gerbu-Adjuvans (Mischung aus: i) N-Acetylglucosaminyl-(P1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin (GMDP), ii) Dimethyldioctadecylammoniumchlorid (DDA), iii) Zink-L-Prolin-Salzkomplex (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-Acetylglucosaminyl-(b1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin); Imiquimod (1-(2-Methypropyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amin); ImmTher™ (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-iso-Glu-L-Ala-glyceroldipalmitat); DRVs (Immunoliposomen, hergestellt aus Dehydrations-Rehydrations-Vesikeln); Interferongamma; Interleukin-1-beta; Interleukin-2; Interleukin-7; Interleukin-12; ISCOMS™; ISCOPREP 7.0.3.™; Liposomen; LOXORIBINE™ (7-Allyl-8-oxoguanosin); LT5-Oraladjuvans (labiles Enterotoxin-Protoxin von E.coli); Mikrosphären und Mikropartikeln jedweder Zusammensetzung; MF59™ (Squalen-Wasser-Emulsion); MONTANIDE ISA 51™ (gereinigtes inkomplettes Freundsches Adjuvans); MONTANIDE ISA 720™ (metabolisierbares Öl-Adjuvans); MPL™ (3-Q-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid A); MTP-PE und MTP-PE-Liposomen ((N-Acetyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-(hydroxyphosphoryloxy))ethylamid, Mononatriumsalz); MURAMETIDE™ (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINE™ und DMURAPALMITINE™ (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-glyceroldipalmitoyl); NAGO (Neuraminidase-Galactose-Oxidase); Nanosphären oder Nanopartikeln jedweder Zusammensetzung; NISVs (nicht-ionische Surfactant-Vesikel); PLEURAN™ (beta-Glucan); PLGA, PGA und PLA (Homo- und Copolymere von Milchsäure und Glykolsäure; Mikrosphären/Nanosphären); PLURONIC L121™; PMMA (Polymethylmethacrylat); PODDS™ (Proteinoid-Mikrosphären); Polyethylencarbamat-Derivaten; Poly-rA:Poly-rU (Polyadenylsäure-Polyuridylsäure-Komplex); Polysorbat 80 (Tween 80); Proteincochleaten (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULON™ (QS-21); Quil-A (Quil-A-Saponin); S-28463 (4-Amino-otec-dimethyl-2-ethoxymethyl-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-ethanol); SAF-1™ („Syntex-Adjuvans-Formulierung“); Sendai-Proteoliposomen und Sendaienthaltenden Lipidmatrices; Span-85 (Sorbitantrioleat); Specol (Emulsion von Marcol 52, Span 85 und Tween 85); Squalen oder Robane® (2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan und 2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexan); Stearyltyrosin (Octadecyltyrosinhydrochlorid); Theramid® (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-dipalmitoxypropylamid); Theronyl-MDP (Termurtide™ oder [thr 1]-MDP; N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin); Ty-Partikeln (Ty-VLPs oder Virus-artige Partikel); Walter-Reed-Liposomen (Liposomen, enthaltend Lipid A adsorbiert an Aluminiumhydroxid), und Lipopeptiden, einschließlich Pam3Cys, insbesondere Aluminiumsalzen, wie beispielsweise Adju-phos, Alhydrogel, Rehydragel; Emulsionen, einschließlich CFA, SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin; Copolymeren, einschließlich Optivax (CRL1005), L121, Poloxamer 4010), usw.; Liposomen, einschließlich Stealth, Cochleaten, einschließlich BIORAL; von Pflanzen abgeleiteten Adjuvanzien, einschließlich QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; zur Costimulation geeigneten Adjuvanzien, einschließlich Tomatin, Biopolymeren, einschließlich PLG, PMM, Inulin; von Mikroben abgeleiteten Adjuvanzien, einschließlich Romurtid, DETOX, MPL, CWS, Mannose, CpG-Nukleinsäuresequenzen, CpG7909, Liganden der humanen TLR1-10, Liganden der murinen TLR1-13 ISS-1018, IC31, Imidazoquinolinen, Ampligen, Ribi529, IMOxin, IRIVs, VLPs, Choleratoxin, Hitze-labilem Toxin, Pam3Cys, Flagellin, GPI-Anker, LNFPIII/Lewis X, antimikrobiellen Peptiden, UC-1V150, RSV-Fusionsprotein, cdiGMP; und als Antagonisten geeigneten Adjuvanzien einschließlich CGRP-Neuropeptid.
  • Geeignete Adjuvanzien können auch aus kationischen oder polykationischen Verbindungen ausgewählt sein, wobei das Adjuvans vorzugsweise durch Komplexierung des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls der pharmazeutischen Zusammensetzung mit der kationischen oder polykationischen Verbindung hergestellt wird. Die Assoziation oder Komplexierung des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls der pharmazeutischen Zusammensetzung mit kationischen oder polykationischen Verbindungen, wie hier definiert, liefert vorzugsweise Adjuvans-Eigenschaften und verleiht dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül der pharmazeutischen Zusammensetzung eine stabilisierende Wirkung. Besonders bevorzugt sind solche kationischen oder polykationischen Verbindungen ausgewählt aus kationischen oder polykationischen Peptiden oder Proteinen, einschließlich Protamin, Nucleolin, Spermin oder Spermidin, oder anderen kationischen Peptiden oder Proteinen, wie zum Beispiel Poly-L-Lysin (PLL), Poly-Arginin, basischen Polypeptiden, zellpenetrierenden Peptiden (CPPs), einschließlich HIV-bindende Peptide, Tat, HIV-1 Tat (HIV), von Tat abgeleiteten Peptiden, Penetratin, von VP22 abgeleiteten oder analogen Peptiden, HSV VP22 (Herpes simplex), MAP, KALA oder Proteintransduktionsdomänen (PTDs, PpT620, prolinreichen Peptiden, argininreichen Peptiden, lysinreichen Peptiden, MPG-Peptid(en), Pep-1, L-Oligomeren, Calcitonin-Peptid(en), Antennapedia-abgeleiteten Peptiden (insbesondere von Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, FGF, Lactoferrin, Transportan, Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, hCT-abgeleitete Peptide, SAP, Protamin, Spermin, Spermidin, oder Histone. Weitere bevorzugte kationische oder polykationische Verbindungen können kationische Polysaccharide sein, zum Beispiel Chitosan, Polybren, kationische Polymere, zum Beispiel Polyethylenimin (PEI), kationische Lipide, zum Beispiel DOTMA: [1-(2,3-Sioleyloxy)propyl)]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, DMRIE, Di-C14-amidin, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleylphosphatidylethanolamin, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: Dioctadecylamidoglicylspermin, DIMRI: Dimyristooxypropyldimethylhydroxyethylammoniumbromid, DOTAP: Dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propan, DC-6-14: O,O-Ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolaminchlorid, CLIP1: rac-[(2,3-Dioctadecyloxypropyl)(2-hydroxyethyl)]-dimethylammoniumchlorid, CLIP6: rac-[2(2,3-Dihexadecyloxypropyl-oxymethyloxy)ethyl]-trimethylammonium, CLIP9: rac-[2(2,3-Dihexadecyloxypropyl-oxysuccinyloxy)ethyl]-trimethylammonium, Oligofectamin oder kationische oder polykationische Polymere, zum Beispiel modifizierte Polyaminosäuren, wie zum Beispiel β-Aminosäure-Polymere oder reversierte Polyamide, usw., modifizierte Polyethylene, wie zum Beispiel PVP (Poly(N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid)), usw., modifizierte Acrylate, wie zum Beispiel pDMAEMA (Poly(dimethylaminoethylmethylacrylat)), usw., modifizierte Amidoamine, wie zum Beispiel pAMAM (Poly(amidoamin)), usw., modifizierte Polybetaaminoester (PBAE), wie zum Beispiel mit Diaminendgruppen modifizierte 1,4-Butandioldiacrylat-Co-5-amino-1-pentanol-Polymere usw., Dendrimere, wie zum Beispiel Polypropylamin-Dendrimere oder Dendrimere auf pAMAM-Basis usw., Polyimine, wie zum Beispiel PEI: Poly(ethylenimin), Poly(propylenimin) usw., Polyallylamin, Polymere mit Zuckerrückgrat, wie zum Beispiel Polymere auf Cyclodextrinbasis, Polymere auf Dextranbasis, Chitosan usw., Polymere auf Silanbasis, wie zum Beispiel PMOXA-PDMS-Copolymere usw., Blockpolymere, die aus einer Kombination von einem oder mehreren kationischen Blöcken (zum Beispiel ausgewählt aus einem kationischen Polymer wie oben erwähnt) und einem oder mehreren hydrophilen oder hydrophoben Blöcken (zum Beispiel Polyethylenglykol) bestehen; usw.
  • Zusätzlich können bevorzugte kationische oder polykationische Proteine oder Peptide, die durch Komplexierung einer RNA als Adjuvans der Zusammensetzung verwendet werden können, aus den folgenden Proteinen oder Peptiden mit der folgenden Gesamtformel (I) ausgewählt sein: (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, wobei I + m + n + o + x = 8-15 ist und I, m, n oder o unabhängig voneinander eine beliebige Zahl sein können, die aus 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15 ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass der Gesamtgehalt an Arg, Lys, His und Orn mindestens 50% aller Aminosäuren des Oligopeptids ausmacht; und Xaa eine beliebige Aminosäure sein kann, die aus nativen (= natürlich vorkommenden) oder nicht-nativen Aminosäuren mit Ausnahme von Arg, Lys, His oder Orn ausgewählt ist; und x eine beliebige Zahl sein kann, die aus 0, 1, 2, 3 oder 4 ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass der Gesamtgehalt an Xaa 50% aller Aminosäuren des Oligopeptids nicht übersteigt. Besonders bevorzugte Oligoarginine in diesem Zusammenhang sind zum Beispiel Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R, usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das artifizielle Nukleinsäuremolekül, also ein RNA-Molekül, mit einer kationischen oder polykationischen Verbindung oder einem polymeren Träger, optional in einem Gewichtsverhältnis, das ausgewählt ist aus einem Bereich von etwa 6:1 (Gew./Gew.) bis etwa 0,25:1 (Gew./Gew.), bevorzugter von etwa 5:1 (Gew./Gew.) bis etwa 0,5:1 (Gew./Gew.), noch bevorzugter von etwa 4:1 (Gew./Gew.) bis etwa 1:1 (Gew./Gew.) oder von etwa 3:1 (Gew./Gew.) bis etwa 1:1 (Gew./Gew.), und am meisten bevorzugt einem Verhältnis von etwa 3:1 (Gew./Gew.) bis etwa 2:1 (Gew./Gew.) von RNA zu kationischer oder polykationischer Verbindung und/oder polymerem Träger; oder optional in einem Stickstoff/Phosphat-Verhältnis von RNA zu kationischer oder polykationischer Verbindung und/oder polymerem Träger im Bereich von etwa 0,1 bis 10, bevorzugt in einem Bereich von etwa 0,3 bis 4 oder 0,3 bis 1, und am meisten bevorzugt in einem Bereich von etwa 0,5 bis 1 oder 0,7 bis 1, und sogar am meisten bevorzugt in einem Bereich von etwa 0,3 bis 0,9 oder 0,5 bis 0,9, assoziiert oder komplexiert.
  • Das Verhältnis zwischen der artifiziellen Nukleinsäure oder dem Vektor zu der kationischen oder polykationischen Verbindung kann auf der Grundlage des Stickstoff/Phosphat-Verhältnisses (N/P-Verhältnis) des gesamten Nukleinsäurekomplexes berechnet werden. So enthält beispielsweise 1 µg RNA typischerweise etwa 3 nmol Phosphatreste, sofern die RNA eine statistische Basenverteilung aufweist. Außerdem enthält 1 µg Peptid typischerweise etwa x nmol Stickstoffreste, abhängig vom Molekulargewicht und der Anzahl der basischen Aminosäuren. Beispielhaft für (Arg)9 (Molekulargewicht 1424 g/mol, 9 Stickstoffatome) berechnet, enthält 1 µg (Arg)g etwa 700 pmol (Arg)9 und damit 700 x 9=6300 pmol basische Aminosäuren = 6,3 nmol Stickstoffatome. Für ein Massenverhältnis von etwa 1:1 RNA/(Arg)9 kann ein N/P-Verhältnis von etwa 2 berechnet werden.
  • Beispielhaft für Protamin berechnet (Molekulargewicht etwa 4250 g/mol, 21 Stickstoffatome, bei Verwendung von Protamin aus Lachs), sind bei einem Massenverhältnis von etwa 2:1 mit 2 µg RNA 6 nmol Phosphat für die RNA zu berechnen; 1 µg Protamin enthält etwa 235 pmol Protaminmoleküle und damit 235 x 21 = 4935 pmol basische Stickstoffatome = 4,9 nmol Stickstoffatome. Für ein Massenverhältnis von etwa 2:1 RNA/Protamin kann ein N/P-Verhältnis von etwa 0,81 berechnet werden. Für ein Massenverhältnis von etwa 8:1 RNA/Protamin lässt sich ein N/P-Verhältnis von etwa 0,2 berechnen. Im Kontext der vorliegenden Offenbarung liegt das N/P-Verhältnis vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 10, bevorzugt im Bereich von etwa 0,3 bis 4 und besonders bevorzugt im Bereich von etwa 0,5 bis 2 oder 0,7 bis 2 in Bezug auf das Verhältnis von Nukleinsäure zu Peptid in dem Komplex, und am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 0,7 bis 1,5.
  • Die Patentanmeldung WO 2010/037539 (in die vorliegende Offenbarung einbezogen) beschreibt eine immunstimulatorische Zusammensetzung und Verfahren zur Herstellung einer immunstimulatorischen Zusammensetzung. Dementsprechend wird in einer bevorzugten Ausführungsform die Zusammensetzung in zwei separaten Schritten hergestellt, um sowohl eine effiziente immunstimulatorische Wirkung als auch eine effiziente Translation des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls zu erzielen. Dabei wird eine so genannte „Adjuvans-Komponente“ hergestellt, indem in einem ersten Schritt das artifizielle Nukleinsäuremolekül, also eine RNA, der Adjuvans-Komponente mit einer kationischen oder polykationischen Verbindung in einem bestimmten Verhältnis komplexiert wird, um einen stabilen Komplex zu bilden. Dabei ist es wichtig, dass nach der Komplexierung der Nukleinsäure keine freie kationische oder polykationische Verbindung oder nur eine vernachlässigbar geringe Menge in der Adjuvans-Komponente verbleibt. Dementsprechend wird das Verhältnis von Nukleinsäure und kationischer oder polykationischer Verbindung in der Adjuvanskomponente typischerweise so gewählt, dass die Nukleinsäure vollständig komplexiert wird und keine freie kationische oder polykationische Verbindung oder nur eine vernachlässigbar kleine Menge in der Zusammensetzung verbleibt. Vorzugsweise wird das Verhältnis der Adjuvans-Komponente, d.h. das Verhältnis der Nukleinsäure zu der kationischen oder polykationischen Verbindung, aus einem Bereich von etwa 6:1 (Gew./Gew.) bis etwa 0,25:1 (Gew./Gew.), bevorzugter von etwa 5:1 (Gew./Gew.) bis etwa 0,5:1 (Gew./Gew.), noch bevorzugter von etwa 4:1 (Gew./Gew.) bis etwa 1:1 (Gew./Gew.) oder von etwa 3:1 (Gew./Gew.) bis etwa 1:1 (Gew./Gew.), und am meisten bevorzugt einem Verhältnis von etwa 3:1 (Gew./Gew.) bis etwa 2:1 (Gew./Gew.), ausgewählt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das hierin offenbarte artifizielle Nukleinsäuremolekül, also ein RNA-Molekül, in einem zweiten Schritt zu dem komplexierten Nukleinsäuremolekül, also einer RNA, der Adjuvans-Komponente hinzugefügt, um die erfindungsgemäße (immunstimulatorische) Zusammensetzung zu bilden. Dabei wird das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, also eine RNA, als freie Nukleinsäure zugegeben, d.h. als Nukleinsäure, die nicht durch andere Verbindungen komplexiert ist. Vor der Zugabe ist das freie artifizielle Nukleinsäuremolekül nicht komplexiert und unterliegt vorzugsweise keiner nachweisbaren oder signifikanten Komplexierungsreaktion bei Zugabe der Adjuvanskomponente.
  • Geeignete Adjuvanzien können außerdem aus Nukleinsäuren mit der Formel (II) ausgewählt sein: GlXmGn, wobei: G Guanosin, Uracil oder ein Analogon von Guanosin oder Uracil ist; X Guanosin, Uracil, Adenosin, Thymidin, Cytosin oder ein Analogon der zuvor genannten Nukleotide ist; I eine ganze Zahl von 1 bis 40 ist, wobei, wenn I = 1, G Guanosin oder ein Analogon davon ist, wenn I > 1, mindestens 50% der Nukleotide Guanosin oder ein Analogon davon sind; m eine ganze Zahl ist und mindestens 3 ist; wobei, wenn m = 3, X Uracil oder ein Analogon davon ist, wenn m > 3, mindestens 3 aufeinanderfolgende Uracile oder Analoga von Uracil vorliegen; n eine ganze Zahl von 1 bis 40 ist, wobei, wenn n = 1, G Guanosin oder ein Analogon davon ist, wenn n > 1, mindestens 50% der Nukleotide Guanosin oder ein Analogon davon sind.
  • Andere geeignete Adjuvanzien können darüber hinaus aus Nukleinsäuren mit der Formel (III) ausgewählt sein: ClXmCn, worin: C Cytosin, Uracil oder ein Analogon von Cytosin oder Uracil ist; X Guanosin, Uracil, Adenosin, Thymidin, Cytosin oder ein Analogon der zuvor genannten Nukleotide ist; I eine ganze Zahl von 1 bis 40 ist, wobei, wenn I = 1, C Cytosin oder ein Analogon davon ist, wenn I > 1, mindestens 50% der Nukleotide Cytosin oder ein Analogon davon sind; m eine ganze Zahl ist und mindestens 3 ist; wobei, wenn m = 3, X Uracil oder ein Analogon davon ist, wenn m > 3, mindestens 3 aufeinanderfolgende Uracile oder Analoga von Uracil vorliegen; n eine ganze Zahl von 1 bis 40 ist, wobei, wenn n = 1, C Cytosin oder ein Analogon davon ist, wenn n > 1, mindestens 50% der Nukleotide Cytosin oder ein Analogon davon sind.
  • Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfasst vorzugsweise eine „sichere und effektive Menge“ der Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung, also des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls und/oder der Zellen, wie hier definiert. Wie hierin verwendet, bedeutet eine „sichere und effektive Menge“ eine Menge, die ausreicht, um eine signifikante positive Veränderung einer Krankheit oder Störung, wie hierin definiert, zu bewirken. Gleichzeitig vermeidet eine „sichere und effektive Menge“ jedoch vorzugsweise schwerwiegende Nebenwirkungen und ermöglicht ein vernünftiges Verhältnis zwischen Nutzen und Risiko. Die Festlegung dieser Grenzen liegt typischerweise im Rahmen einer vernünftigen medizinischen Beurteilung.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Medikament, beispielsweise als Vakzine (bei der genetischen Vakzinierung) oder in der Gentherapie zur Verfügung.
  • Das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eignen sich insbesondere für jede medizinische Anwendung, die sich die therapeutische Wirkung oder den Effekt von Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen zunutze macht, oder wenn eine Supplementierung eines bestimmten Peptids oder Proteins erforderlich ist. Somit stellt die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten oder Störungen bereit, die durch die therapeutische Wirkung oder den Effekt von Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen behandelt werden können oder die durch die Supplementierung eines bestimmten Peptids, Polypeptids oder Proteins behandelt werden können. Beispielsweise können das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung von genetischen Krankheiten, Autoimmunkrankheiten, Krebs- oder Tumorerkrankungen, Infektionskrankheiten, chronischen Krankheiten oder dergleichen verwendet werden, zum Beispiel durch genetische Vakzinierung oder Gentherapie.
  • Insbesondere sind solche therapeutischen Behandlungen, die von einer stabilen und verlängerten Anwesenheit von therapeutischen Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen in einem zu behandelnden Subjekt profitieren, als medizinische Anwendung im Kontext der vorliegenden Erfindung besonders geeignet, da das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül für eine stabile, erhöhte und/oder verlängerte Expression des Peptids oder Proteins, das von dem erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremolekül kodiert wird, sorgt. Eine besonders geeignete medizinische Anwendung des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, der erfindungsgemäßen Zelle oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist daher die Vakzinierung. Somit stellt die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung für die Vakzinierung eines Subjekts, vorzugsweise eines Säugetiers, besonders bevorzugt eines Menschen, bereit. Bevorzugte Vakzinierungsbehandlungen sind Vakzinierungen gegen Infektionskrankheiten, wie zum Beispiel bakterielle, protozoische oder virale Infektionen, und Anti-Tumor-Vakzinierungen. Solche Vakzinierungsbehandlungen können prophylaktisch oder therapeutisch sein.
  • Je nach der zu behandelnden oder vorzubeugenden Krankheit kann der ORF ausgewählt werden. Der offene Leserahmen kann beispielsweise für ein Protein kodieren, das einem Patienten zur Verfügung gestellt werden muss, der an einem völligen Fehlen oder einem zumindest teilweisen Funktionsverlust eines Proteins leidet, beispielsweise einem Patienten, der an einer genetischen Krankheit leidet. Außerdem kann der offene Leserahmen aus einem ORF ausgewählt werden, der für ein Peptid oder Protein kodiert, das eine Krankheit oder den Zustand eines Patienten günstig beeinflusst. Darüber hinaus kann der offene Leserahmen für ein Peptid oder Protein kodieren, das zur Herunterregulierung einer pathologischen Überproduktion eines natürlichen Peptids oder Proteins oder zur Eliminierung von Zellen führt, die ein pathologisches Protein oder Peptid exprimieren. Ein solcher Mangel, Funktionsverlust oder eine Überproduktion kann zum Beispiel im Zusammenhang mit Tumoren und Neoplasien, Autoimmunkrankheiten, Allergien, Infektionen, chronischen Krankheiten oder dergleichen auftreten. Darüber hinaus kann der offene Leserahmen für ein Antigen oder Immunogen, zum Beispiel für ein Epitop eines Pathogens oder ein Tumorantigen, kodieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül also einen ORF, der für eine Aminosäuresequenz kodiert, die ein Antigen oder Immunogen, zum Beispiel ein Epitop eines Pathogens oder ein tumorassoziiertes Antigen, umfasst oder daraus besteht, und eine 3'-UTR wie oben beschrieben.
  • Im Zusammenhang mit medizinischen Verwendungen, insbesondere im Zusammenhang mit Vakzinierungen, ist das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül eine mRNA, da DNA das Risiko birgt, eine Anti-DNA-Immunantwort auszulösen, und dazu neigt, in genomische DNA zu inserieren.
  • Erfindungsgemäß und wie in den Ansprüchen definiert wird das artifizielle Nukleinsäuremolekül, das Medikament oder die Vakzine intramuskulär verabreicht. In weiteren beanspruchten und nicht beanspruchten hierin offenbarten Ausführungsformen werden das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung oral, parenteral, durch Inhalationsspray, topisch, rektal, nasal, bukkal, vaginal, über ein implantiertes Reservoir oder per Jet-Injektion verabreicht. Der hier verwendete Begriff parenteral umfasst subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale, intrahepatische, intraläsionale, intrakranielle, transdermale, intradermale, intrapulmonale, intraperitoneale, intrakardiale, intraarterielle und sublinguale Injektions- oder Infusionstechniken. In einer bevorzugten Ausführungsform werden das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung intramuskulär verabreicht, vorzugsweise durch herkömmliche Nadelinjektion oder durch nadelfreie Injektion (zum Beispiel Jet-Injektion).
  • Erfindungsgemäß wird das artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung parenteral verabreicht, nämlich intramuskulär verabreicht, zum Beispiel durch parenterale Injektion. Nicht beansprucht sind Verabreichung durch subkutane, intravenöse, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale, intrahepatische, intraläsionale, intrakraniale, transdermale, intradermale, intrapulmonale, intraperitoneale, intrakardiale, intraarterielle, sublinguale Injektion oder durch Infusionstechniken. Erfindungsgemäß ist die intramuskuläre Injektion. Sterile injizierbare Formen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung können als wässrige oder ölige Suspension vorliegen. Diese Suspensionen können nach bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel formuliert werden. Vorzugsweise werden die Lösungen oder Suspensionen durch herkömmliche Nadelinjektion oder durch nadelfreie Injektion (zum Beispiel Jet-Injektion) verabreicht.
  • Das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung können auch oral in jeder oral akzeptablen Darreichungsform verabreicht werden (nicht beansprucht), einschließlich - aber nicht beschränkt auf - Kapseln, Tabletten, wässrige Suspensionen oder Lösungen.
  • Das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung können auch topisch verabreicht werden (nicht beansprucht), insbesondere wenn das Behandlungsziel Bereiche oder Organe umfasst, die durch topische Anwendung leicht zugänglich sind, zum Beispiel einschließlich Erkrankungen der Haut oder anderer zugänglicher Epithelgewebe. Geeignete topische Formulierungen lassen sich für jeden dieser Bereiche oder Organe leicht herstellen. Für die topische Anwendung können das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in einer geeigneten Salbe, suspendiert oder gelöst in einem oder mehreren Trägern, formuliert werden.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Verwendung als Medikament den Schritt der Transfektion von Säugetierzellen, vorzugsweise die In-vitro- oder Ex-vivo-Transfektion von Säugetierzellen, bevorzugter die In-vitro-Transfektion von isolierten Zellen eines Subjekts, das mit dem Medikament behandelt werden soll. Wenn die Verwendung die In-vitro-Transfektion isolierter Zellen umfasst, kann die Verwendung als Medikament ferner die Wiederverabreichung der transfizierten Zellen an den Patienten umfassen. Die Verwendung der erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküle als Medikament kann ferner den Schritt der Selektion der erfolgreich transfizierten isolierten Zellen umfassen.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt auch die Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder Störung, wie oben beschrieben, bereit, das die Verabreichung des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, der erfindungsgemäßen Zelle oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Subjekt, das diese benötigt, umfasst. Dabei werden das artifizielle Nukleinsäuremolekül, die Zelle oder die pharmazeutische Zusammensetzung auf einem beliebigen Weg (beansprucht: intramuskulär), wie hierin beschrieben, verabreicht. Erfindungsgemäß ist in diesem Zusammenhang die intramuskuläre Verabreichung des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, der Zelle oder der pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Es wird das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül, die erfindungsgemäße Zelle, die erfindungsgemäße Vakzine oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung dem Subjekt intramuskulär verabreicht. Vorteilhafterweise führt die intramuskuläre Verabreichung des hierin offenbarten Nukleinsäuremoleküls, der Vakzine oder der Zusammensetzung zu einer erhöhten Expression des Peptids oder Proteins, das durch den mindestens einen offenen Leserahmen des hier definierten artifiziellen Nukleinsäuremoleküls kodiert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, wie hierin definiert, vorzugsweise des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, das eine 3'-UTR umfasst, die mindestens zwei, Poly(A)-Sequenzen, wie hierin definiert, umfasst, verstärkt, wenn es intramuskulär verabreicht wird. Am meisten bevorzugt führt die intramuskuläre Verabreichung des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise des erfindungsgemäßen artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, das mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen umfasst, zu einer erhöhten Expression und zu einer verbesserten Immunantwort gegen ein Antigen, vorzugsweise ein pathogenes Antigen, wie hierin definiert, besonders bevorzugt ein Antigen, das mit einer Infektionskrankheit assoziiert ist.
  • Wie oben beschrieben, ist die hierin offenbarte 3'-UTR in der Lage, die Proteinproduktion von einem artifiziellen Nukleinsäuremolekül zu erhöhen.
  • Der Begriff „Assoziieren des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder des Vektors mit einer 3'-UTR“ bedeutet im Kontext der vorliegenden Offenbarung vorzugsweise, dass das artifizielle Nukleinsäuremolekül oder der Vektor mit der 3'-UTR funktionell verbunden oder funktionell kombiniert wird. Dies bedeutet, dass das artifizielle Nukleinsäuremolekül oder der Vektor und die 3'-UTR, vorzugsweise die 3'-UTR, wie oben beschrieben, so verbunden oder gekoppelt sind, dass die Funktion der 3'-UTR, z.B. die die Proteinproduktion erhöhende Funktion, ausgeübt wird. Typischerweise bedeutet dies, dass die 3'-UTR in das artifizielle Nukleinsäuremolekül oder den Vektor, vorzugsweise das mRNA-Molekül, 3' zu einem offenen Leserahmen, vorzugsweise unmittelbar 3' zu einem offenen Leserahmen, bevorzugt zwischen dem offenen Leserahmen und einem Polyadenylierungssignal, integriert wird. Vorzugsweise ist die 3'-UTR in das artifizielle Nukleinsäuremolekül oder den Vektor, vorzugsweise die mRNA, als 3'-UTR integriert, d.h. so, dass die 3'-UTR die 3'-UTR des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder des Vektors, vorzugsweise der mRNA, ist, d.h., so, dass sie sich von der 3'-Seite des offenen Leserahmens zum 5'-Terminus des Moleküls oder zur 5'-Seite einer Poly(A)-Sequenz oder eines Polyadenylierungssignals erstreckt, optional verbunden über einen kurzen Linker, wie zum Beispiel eine Sequenz, die eine oder mehrere Restriktionsstellen umfasst oder daraus besteht. Somit bedeutet der Begriff „Assoziieren des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder des Vektors mit einer 3'-UTR“ vorzugsweise, dass die 3'-UTR funktionell mit einem offenen Leserahmen verbunden wird, der sich innerhalb des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls oder des Vektors, vorzugsweise innerhalb des mRNA-Moleküls, befindet. Die 3'-UTR und der ORF sind wie oben für das erfindungsgemäße artifizielle Nukleinsäuremolekül beschrieben, zum Beispiel sind vorzugsweise der ORF und die 3'-UTR heterolog, z.B. von verschiedenen Genen abgeleitet, wie oben beschrieben.
  • Die mindestens eine Poly(A)-Sequenz (beansprucht: mindestens zwei Poly(A)-Sequenzen) kann durch eine chemische oder enzymatische Polyadenylierungsreaktion hergestellt. Vorzugsweise wird dabei ein bakterielles Enzym, wie zum Beispiel die Poly(A)-Polymerase von E. coli, verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Länge der mindestens einen Poly(A)-Sequenz - neben anderen Parametern - durch die Dauer der Polyadenylierungsreaktion gesteuert, d.h. eine längere Inkubation einer Nukleinsäure mit einem geeigneten Enzym führt typischerweise zu einer längeren Poly(A)-Sequenz. Vorzugsweise wird das Nukleinsäuremolekül mit einem geeigneten Enzym für mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 oder 90 Minuten inkubiert, vorzugsweise bei einer für das jeweilige Enzym geeigneten Temperatur, z.B. 37 °C. Noch bevorzugter dauert die Polyadenylierungsreaktion etwa 10 bis etwa 120 Minuten, bevorzugt etwa 15, 20, 25 oder 30 bis etwa 90 Minuten, bevorzugter etwa 30 bis etwa 60 Minuten. Um eine Population von Nukleinsäuremolekülen zu erhalten, die annähernd den gleichen Polyadenylierungsgrad aufweisen, d.h. die annähernd die gleiche Anzahl von angehängten Adenylaten an ihren 3'-Enden aufweisen, kann die fachkundige Person aus den auf dem Gebiet bekannten Standardtrennverfahren (zum Beispiel auf der Grundlage des Molekulargewichts oder der Ladung) auswählen, wie zum Beispiel den bestens bekannten Chromatographieverfahren, die typischerweise nach der Polyadenylierung eingesetzt werden, um die Reaktionsprodukte zu trennen oder zu reinigen. Gemäß der vorliegenden Offenbarung wird vorzugsweise eine Population artifizieller Nukleinsäuremoleküle verwendet, die in Bezug auf die Länge der 3'-terminalen Poly(A)-Sequenz mehr oder weniger homogen ist. Bevorzugt wird eine Population artifizieller Nukleinsäuremoleküle verwendet, bei der mindestens 80%, bevorzugter mindestens 85%, 90%, 95% oder 98% der Moleküle durch die gleiche Länge der 3'-terminalen Poly(A)-Sequenz gekennzeichnet sind. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „gleiche Länge“ auf eine Situation, in der die Anzahl der Adenylate in der 3'-terminalen Poly(A)-Sequenz von einem gegebenen Wert (zum Beispiel 160 Adenylate, 380 Adenylate, 430 Adenylate, 1000 Adenylate usw.) um nicht mehr als 10%, bevorzugter nicht mehr als 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% oder nicht mehr als 1% abweicht.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer 3'-UTR zur Erhöhung der Proteinproduktion von einem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, also von einem mRNA-Molekül, bereit, die mindestens einen offenen Leserahmen aufweisen, der der für ein Antigen kodiert, das von einem mit einer Infektionskrankheit assoziierten viralen Pathogen abgeleitet ist, wobei die 3'-UTR mindestens zwei separate Poly(A)-Sequenzen umfasst, wobei eine Poly(A)-Sequenz eine Sequenz aus 20 bis 400 Adenin-Nukleotiden ist und wobei die mindestens zwei separaten Poly(A)-Sequenzen eine Gesamtzahl von mindestens 70 Adenin-Nukleotiden umfassen. Des Weiteren ist hier auch die Verwendung einer 3'-UTR zur Erhöhung der Proteinproduktion von einem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, wie hierin beschrieben, also von einem mRNA-Molekül, offenbart, wobei die 3'-UTR mindestens eine Poly(A)-Sequenz, wobei die mindestens eine Poly(A)-Sequenz mindestens 70 Adenosinreste umfasst, oder ein Polyadenylierungssignal umfasst (nicht beansprucht).
  • Die Verbindungen und Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung können auch getrennt voneinander hergestellt und gehandelt werden. So betrifft die Erfindung ferner ein Kit oder ein Kit von Teilen, wie in den angefügten Ansprüchen definiert. Des Weiteren ist hierin ein Kit oder Kit von Teilen offenbart, das ein erfindungsgemäßes artifizielles Nukleinsäuremolekül, eine erfindungsgemäße Zelle und/oder eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfasst. Vorzugsweise können ein solches Kit oder Kit von Teilen zusätzlich eine Gebrauchsanweisung, Zellen für die Transfektion, ein Adjuvans, ein Mittel zur Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder eine pharmazeutisch akzeptable Lösung zum Auflösen oder Verdünnen des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls, der Zellen oder der pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen.
  • Figurenliste
  • Die im Folgenden gezeigten Figuren sind lediglich illustrativ und sollen die vorliegende Erfindung näher beschreiben. Diese Figuren sind nicht so auszulegen, dass die vorliegende Erfindung dadurch eingeschränkt wird.
    • 1: DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 13), die die mRNA-Sequenz kodiert, die in den Experimenten verwendet wurde und die die Sequenzen umfasst, die die folgenden Elemente kodieren:
      • rpl32 - PpLuc(GC) - Albumin7 - A64 - C30 - Histon-Stem-Loop.
      • Innerhalb der DNA-Sequenz sind die Sequenzelemente hervorgehoben, die den folgenden Elementen in der mRNA entsprechen: PpLuc(GC) (ORF) in Kursivschrift, rpl32 (5'-UTR) unterstrichen und Albumin7 (3'-UTR) unterstrichen.
    • 2: Polyadenylierung der mRNA-Sequenz entsprechend SEQ ID NO: 13:
      1. A. Etwa 160 Adenylate wurden bei einer Charge mRNA (Lot 1) angefügt. Etwa 380 Adenylate wurden bei einer anderen mRNA-Charge (Lot 2) angefügt. Die mRNA, die SEQ ID NO: 13 entspricht, wurde auf die linke Spur geladen, die entsprechende adenylierte mRNA wurde auf die rechte Spur geladen. Zum Größenvergleich wurde ein Molekülgrößenmarker auf die äußersten Spuren geladen (die Zahlen in 2A geben die Anzahl der Nukleotide an, die in den Markermolekülen enthalten sind; der gleiche Marker wurde in 2B und 2C verwendet). B. Etwa 430 Adenylate wurden an die mRNA angegefügt, die SEQ ID NO: 13 entspricht. C. Etwa 1000 Adenylate wurden an die mRNA angegefügt, die SEQ ID NO: 13 entspricht.
    • 3: Proteinexpression von polyadenylierter mRNA in kultivierten Zellen:
      • mRNA entsprechend SEQ ID NO: 13, an die etwa 160 (mRNA-Lot 1) oder etwa 380 (mRNA-Lot 2) Adenylate durch Polyadenylierung angefügt wurden, wurde in humane dermale Fibroblasten (HDF) transfiziert, und die Luziferasespiegel wurden zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen. 3 zeigt die Ergebnisse als mittlere RLU (relative Lichteinheiten) +/-SEM (Standardfehler) für dreifache Transfektionen.
    • 4: Proteinexpression von polyadenylierter mRNA nach intramuskulärer Injektion in Mäuse:
      • 2 µg mRNA entsprechend SEQ ID NO: 13, an die etwa 380 Adenylate durch Polyadenylierung angefügt wurden, wurden Mäusen intramuskulär injiziert. 4 zeigt die Ergebnisse als Median von bis zu 10 Wiederholungen.
    • 5: Proteinexpression von polyadenylierter mRNA nach intramuskulärer Injektion in Mäuse:
      • 10 µg mRNA entsprechend SEQ ID NO: 13, an die etwa 430 Adenylate durch Polyadenylierung angefügt wurden, wurden Mäusen intramuskulär injiziert. 5 zeigt die Ergebnisse als Median von bis zu 10 Wiederholungen.
    • 6: Proteinexpression von polyadenylierter mRNA nach intramuskulärer Injektion in Mäuse:
      • 1 µg mRNA entsprechend SEQ ID NO: 13, an die etwa 1000 Adenylate durch Polyadenylierung angefügt wurden, wurde Mäusen intramuskulär injiziert. 6 zeigt die Ergebnisse als Median von bis zu 10 Wiederholungen.
    • 7: Induktion von HA-neutralisierenden Antikörpern durch polyadenylierte mRNA nach intramuskulärer Injektion in Mäuse.
    • 8: DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 14), die für die mRNA-Sequenz kodiert, die in den Experimenten verwendet wurde, und die die Sequenzen umfasst, die für die folgenden Elemente kodieren:
      • 32L4-H1N1 (Netherlands2009)-HA(GC)-Albumin7-A64-N5-C30-HistonSL
    • 9: Induktion von virusneutralisierenden Titern durch polyadenylierte mRNA nach intramuskulärer Injektion in Mäuse.
    • 10: DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 15), die für die mRNA-Sequenz kodiert, die in den Experimenten verwendet wurde, und die die Sequenzen umfasst, die für die folgenden Elemente kodieren:
    • 32L4-RAVG(GC)-Albumin7- A64-N5-C30-HistonSL
  • Beispiele
  • Die im Folgenden dargestellten Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen die vorliegende Erfindung weitergehend beschreiben. Diese Beispiele sind nicht so auszulegen, dass die vorliegende Erfindung darauf beschränkt ist.
  • 1. Herstellung von DNA-Templates
  • Es wurde ein Vektor für die In-vitro-Transkription konstruiert, der einen T7-Promotor und eine GC-angereicherte Sequenz enthält, die für Photinus pyralis-Luciferase kodiert (PpLuc(GC)). Die 5'-untranslatierte Region (5'-UTR) des ribosomalen Proteins Large 32 wurde 5' von PpLuc(GC) eingefügt. Eine 3'-UTR, die von humanem Albumin abgeleitet ist (Albumin7), wurde 3' von PpLuc(GC) eingefügt. Außerdem wurde eine A64-Poly(A)-Sequenz, gefolgt von C30 und einer Histon-Stem-Loop-Sequenz, 3' von Albumin7 eingefügt. Auf die Histon-Stem-Loop-Sequenz folgte eine Restriktionsstelle, die zur Linearisierung des Vektors vor der In-vitro-Transkription verwendet wurde. Die von diesem Vektor durch In-vitro-Transkription erhaltene mRNA wird als „rpl32 - PpLuc(GC) - Albumin7 - A64 - C30 - HistonSL“ bezeichnet.
  • Zusammengefasst wurde ein Vektor erzeugt, der die Sequenz umfasst, die für die mRNA kodiert, die in weiteren Experimenten verwendet wurde. Die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 13), die für diese mRNA kodiert, ist in 1 dargestellt. Die mRNA, die dieser DNA-Sequenz entspricht, ist durch die folgenden Elemente gekennzeichnet:
    • rpl32 - PpLuc(GC) - Albumin7 - A64 - C30 - HistonSL
  • Dabei werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
    • • PpLuc (GC): GC-angereicherte mRNA-Sequenz, die für Photinus pyralis-Luciferase kodiert
    • • rpl32: 5'-UTR des humanen ribosomalen Proteins Large 32 ohne den 5'-terminalen Oligopyrimidin-Trakt
    • • Albumin7: 3'-UTR des humanem Albumins mit drei Einzelpunktmutationen, die zur Entfernung eines T7-Terminationssignals eingeführt wurden, sowie einer Hindlll- und einer Xbal-Restriktionsstelle
    • • A64: Poly(A)-Sequenz mit 64 Adenylaten
    • • C30: Poly(C)-Sequenz mit 30 Cytidylaten
    • • HistonSL: Histon-Stem-Loop-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 11.
  • Weitere in den Experimenten verwendete Konstrukte:
    • 32L4-H1N1(Netherlands2009)-HA(GC)-Albumin7-A64-N5-C30-HistonSL (SEQ ID NO: 14)
    • 32L4-RAV-G(GC)-Albumin7-A64-N5-C30-HistonSL (SEQ ID NO: 15)
  • Die Templates wurden wie für rpl32 - PpLuc(GC) - Albumin7 - A64 - C30 - HistonSL beschrieben hergestellt.
  • 2. In-vitro-Transkription
  • Das in Beispiel 1 hergestellte DNA-Template wurde linearisiert und in vitro mit T7-Polymerase transkribiert. Das DNA-Template wurde dann durch DNase-Behandlung verdaut. Die mRNA-Transkripte enthielten eine 5'-Cap-Struktur, die durch Zugabe eines Überschusses an N7-Methylguanosin-5'-triphosphat-5'-guanosin zur Transkriptionsreaktion erhalten wurde. Die so erhaltene mRNA wurde gereinigt und in Wasser resuspendiert.
  • 3. Enzymatische Adenylierung
  • RNA wurde mit E. coli-Poly(A)-Polymerase (Cellscript) unter Verwendung von 1 mM ATP bei 37 °C für 30 oder 60 Minuten umgesetzt. Unmittelbar danach wurde die RNA mit einer Spin-Säule (RNeasy mini column, Quiagen) gereinigt. Die RNA wurde auf ein Gel aufgetragen, um die RNA-Verlängerung zu bestimmen.
  • Für Vakzinierungsversuche wurde die mRNA optional mit Protamin komplexiert. Die mRNA-Komplexierung bestand aus einem Gemisch aus 50% nackter mRNA und 50% mit Protamin komplexierter mRNA in einem Gewichtsverhältnis von 2:1. Zunächst wurde die mRNA durch Zugabe von Protamin-Ringer-Laktat-Lösung zur mRNA mit Protamin komplexiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation, bei der die Komplexe stabil gebildet wurden, wurde die nackte mRNA zugegeben und die Endkonzentration der Vakzine mit Ringer-Lactatlösung eingestellt. Die erhaltene formulierte mRNA-Vakzine wurde für In-vivo-Experimente verwendet.
  • 4. Proteinexpression durch mRNA-Lipofektion
  • Humane dermale Fibroblasten (HDF) wurden drei Tage vor der Transfektion in 96-WellPlatten mit einer Dichte von 104 Zellen pro Well ausgesät. Unmittelbar vor der Lipofektion wurden die Zellen in Opti-MEM gewaschen. Die Zellen wurden mit 25 ng PpLuckodierender, mit Lipofectamine2000 komplexierter mRNA pro Well lipofiziert. mRNA, die für Renilla reniformis-Luciferase (RrLuc) kodiert, wurde zusammen mit PpLuc-mRNA transfiziert, um die Transfektionseffizienz zu kontrollieren (2,5 ng RrLuc-mRNA pro Well). 90 Minuten nach Initiation der Transfektion wurde Opti-MEM gegen Medium ausgetauscht. 6, 24, 48 und 72 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium abgesaugt, und die Zellen wurden in 100 µl Lysepuffer (Passive Lysis Buffer, Promega) lysiert. Die Lysate wurden bei -80 °C bis zur Messung der Luziferase-Aktivität gelagert.
  • 5. Messung der Lumineszenz im Zelllysat
  • Die Luziferaseaktivität wurde als relative Lichteinheiten (RLU) in einem Hidex Chameleon-Plattenlesegerät gemessen. Die PpLuc-Aktivität wurde bei 2 Sekunden Messzeit unter Verwendung von 20 µl Lysat und 50 µl Luciferin-Puffer (Beetle-Juice, PJK GmbH) gemessen. Die RrLuc-Aktivität wurde bei einer Messzeit von 2 Sekunden unter Verwendung von 20 µl Lysat und 50 µl Coelenterazin-Puffer (Renilla-Juice, PJK GmbH) gemessen.
  • 6. Proteinexpression durch intramuskuläre mRNA-lniektion
  • Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketavet und Rompun anästhesiert. Nach der Rasur der Unterschenkel der Tiere wurden 2 µg PpLuc-kodierende mRNA in 20 µl Ringer-Lactat (80%) intramuskulär injiziert (M. tibialis oder M. gastrocnemius).
  • 7. In-vivo-Lumineszenz-Bildgebuna
  • Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketavet und Rompun anästhesiert. 150 µl einer Luciferin-Lösung (20 g/l) wurden intraperitoneal injiziert. 10 Minuten nach der Luciferin-Injektion wurde die Lumineszenz mit einem IVIS Lumina II-Bildgebungssystem aufgezeichnet.
  • Ergebnisse
  • 8.1 Zusätzliche Polyadenylierung der artifiziellen mRNA erhöht die Proteinexpression von der artifiziellen mRNA in vitro
  • Um die Wirkung einer zusätzlichen Polyadenylierung der artifiziellen mRNA auf die Proteinexpression von der mRNA zu untersuchen, wurde die artifizielle mRNA durch In-vitro-Transkription synthetisiert (rp132 - PpLuc(GC) - Albumin7 - A64 - C30 - HistonSL). Ein Teil einer mRNA-Charge wurde enzymatisch adenyliert, um einen Poly(A)-Schwanz von etwa 160 Adenylaten anzufügen (Lot 1). Ein Teil einer anderen mRNA-Charge wurde enzymatisch adenyliert, um einen Poly(A)-Schwanz von etwa 380 Adenylaten anzufügen (Lot 2) (siehe 2).
  • Luziferase-kodierende mRNAs wurden in dreifacher Ausführung in humane dermale Fibroblasten (HDF) transfiziert. Die Luziferasekonzentration wurde 6, 24, 48 und 72 Stunden nach der Transfektion gemessen. Aus diesen Daten wurde das von 0 bis 72 Stunden exprimierte Gesamtprotein als Fläche unter der Kurve (AUC) berechnet (siehe folgende Tabelle 1 und 3). Tabelle 1: Gemessene Luziferase-Aktivität in humanen dermalen Fibroblasten (HDF)
    Poly(A)-Schwanz RLU nach 6 Stunden RLU nach 24 Stunden RLU nach 48 Stunden RLU nach 72 Stunden AUC
    Lot 1 enth. A64 37252 59085 29825 14612 2579000
    Lot 1 enth. A64 plus ca. A160 (A224) 81043 246102 89506 41308 8784000
    Lot 2 enth. A64 47959 61053 23001 14053 2578000
    Lot 2 enth. A64 plus ca. A380 (A444) 69780 188560 69269 44478 6993000
  • Die Gesamt-Luziferase-Expression war bei beiden mRNA-Chargen, die eine in vitro transkribierte A64-Sequenz enthielten, identisch. Das Anfügen von etwa 160 Adenylaten an das 3'-Ende der mRNA (was zu einer 3'-UTR mit etwa 224 Adenylaten führt, die in einer Poly(A)-Sequenz enthalten sind) erhöhte die Luziferase-Expression um den Faktor 3,4. Das Anfügen von etwa 380 Adenylaten an das 3'-Ende der mRNA (was zu einer 3'-UTR mit etwa 444 Adenylaten führt, die in einer Poly(A)-Sequenz enthalten sind) erhöhte die Luziferase-Expression nur in ähnlichem Maße, nämlich um den Faktor 2,7.
  • Das Anfügen von (weiteren) Adenylaten an das 3'-Ende der mRNA erhöht also die In-vitro-Expression des von der mRNA kodierten Proteins deutlich. Insbesondere erhöht eine 3'-UTR, die mehr als 64 Adenylate umfasst, die in einer Poly(A)-Sequenz enthalten sind, die Proteinexpression in vitro deutlich.
  • 8.2 Zusätzliche Polyadenylierung der artifiziellen mRNA erhöht die Proteinexpression von der artifiziellen mRNA nach intramuskulärer Injektion stark
  • Um die Wirkung einer zusätzlichen Polyadenylierung der artifiziellen mRNA auf die Proteinexpression von der intramuskulär injizierten mRNA zu untersuchen, wurde die artifizielle mRNA durch In-vitro-Transkription synthetisiert (rpl32 - PpLuc(GC) - Albumin7 - A64 - C30 - HistonSL). Ein Teil dieser mRNA wurde enzymatisch adenyliert, um einen Poly(A)-Schwanz von etwa 380 Adenylaten anzufügen.
  • 2 µg der Luziferase-kodierenden mRNAs wurden intramuskulär (M. tibialis oder M. gastrocnemius) in BALB/c-Mäuse injiziert (10 Wiederholungen pro Gruppe). Die In-vivo-Lumineszenz wurde an den folgenden Tagen aufgezeichnet (siehe 4). Aus diesen Daten wurde das von 0 bis 15 Tagen exprimierte Gesamtprotein als Fläche unter der Kurve berechnet. Die Luziferase wurde eindeutig von intramuskulär injizierter mRNA, welche eine A64-Sequenz enthielt, exprimiert. Auffallend ist jedoch, dass eine zusätzliche Polyadenylierung der artifiziellen mRNA mit 380 Adenylaten die Luciferase-Expression sehr stark erhöhte und die gesamte exprimierte Luciferase um das Achtfache ansteigen ließ. Das Ausmaß des Anstiegs der Expression durch den (zusätzlichen) Poly(A)-Schwanz war angesichts der in kultivierten Zellen beobachteten viel geringeren Wirkung nicht zu erwarten. Das Hinzufügen von (weiteren) Adenylaten, die in einer Poly(A)-Sequenz enthalten sind, erhöht also die Proteinexpression von intramuskulär injizierter mRNA sehr stark und in einem unerwarteten Ausmaß. Parallel dazu wurde die Wirkung der zusätzlichen Polyadenylierung der artifiziellen mRNA mit etwa 430 Adenylaten (siehe 5) bzw. etwa 1000 Adenylaten (siehe 6) getestet. Während die beiden mit etwa 430 Adenylaten bzw. etwa 1000 Adenylaten polyadenylierten mRNAs zu einer erhöhten Proteinexpression im Vergleich zu nicht-polyadenylierter mRNA führten, wurde in Bezug auf die mit 380 Adenylaten polyadenylierte artifizielle mRNA kein weiterer Anstieg beobachtet.
  • 9. Vakzinierung mit mRNA, die für HA kodiert:
  • Balb/c-Mäuse wurden 2 Mal (Tag 0 und Tag 21) in beide M. tibialis vakziniert. 8 Mäuse wurden mit 40 µg R2564 (nackte HA-mRNA) vakziniert, 8 Tiere wurden mit 40 µg polyadenylierter R2564 (SEQ ID NO: 14; nackte, polyadenylierte HA) vakziniert, 8 Tiere wurden mit 40 µg R2630 (formulierte HA-mRNA) vakziniert und 8 Tiere wurden mit 40 µg erst polyadenylierter und dann formulierter R2564 vakziniert. 8 Mäuse, die mit RiLa vakziniert wurden, dienten als Kontrolle. Die Blutentnahme erfolgte an Tag 35.
  • 9.1. Hämagglutinationsinhibitions-Assay (HI)
  • In einer 96-Well-Platte wurden die gewonnenen Seren mit HA H1N1-Antigen (A/California/07/2009 (H1N1); NIBSC) und roten Blutkörperchen (4% Erythrozyten; Lohmann Tierzucht) gemischt. In Gegenwart von HA-neutralisierenden Antikörpern kann eine Hemmung der Hämagglutination von Erythrozyten beobachtet werden. Die niedrigste Menge an getitertem Serum, die zu einer sichtbaren Inhibierung der Hämagglutination führte, war das Testergebnis.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse zeigen, dass durch Polyadenylierung der mRNA höhere HI-Titer erreicht werden konnten. Alle Mäuse, die mit polyadenylierter mRNA behandelt wurden, erreichten ein Niveau über potenziell protektiven virusneutralisierenden Titern (>40).
  • 10. Vakzinierung mit mRNA, die für RAV G kodiert:
  • Balb/c-Mäuse wurden 2 Mal (Tag 0 und Tag 21) mit 20 µg RAV-G mRNA in beide M. tibialis vakziniert. 8 Tiere wurden i.m. mit R2506 (SEQ ID NO: 15; nackte RAV-G mRNA) vakziniert, 8 Tiere wurden i.m. mit polyadenyliertem R2506 (nackte RNA) vakziniert und in 8 Mäuse wurde RiLa als Kontrolle injiziert. Die Blutentnahme erfolgte 28 Tage nach der Vakzinierung. Das Serum wurde auf VNTs analysiert.
  • 10.1. Virusneutralisierungstest
  • Der Nachweis der virusneutralisierenden Antikörperantwort (spezifische B-Zell-Immunantwort) wurde mit einem Virusneutralisations-Assay durchgeführt. Das Ergebnis dieses Tests wird als Virusneutralisationstiter (VNT) bezeichnet. Nach den WHO-Standards gilt ein Antikörpertiter als protektiv, wenn der entsprechende VNT mindestens 0,5 IU/ml beträgt. Daher wurden den vakzinierten Mäusen an Tag 28 Blutproben entnommen und Seren hergestellt. Diese Seren wurden im Fluoreszenz-Antikörper-Virusneutralisationstest (FAVN) unter Verwendung des Zellkultur-adaptierten Challenge-Virusstammes des Rabiesvirus (CVS) verwendet, wie von der OIE (Weltorganisation für Tiergesundheit) empfohlen und erstmals in Cliquet F., Aubert M. & Sagne L. (1998); J. Immunol. Methods, 212, 79-87 beschrieben. Kurz gesagt, wurden hitzeinaktivierte Seren in vierfacher Ausführung in seriellen Zweifachverdünnungen auf ihr Potenzial getestet, 100 TCID50 (Gewebekultur-Infektionsdosen 50%) von CVS in 50 µl Volumen zu neutralisieren. Dazu wurden die Serenverdünnungen mit dem Virus für 1 Stunde bei 37 °C (in einem feuchten Inkubator mit 5% CO2) inkubiert und anschließend trypsinisierte BHK-21-Zellen hinzugefügt (4×105 Zellen/ml; 50 µl pro Well). Die infizierten Zellkulturen wurden 48 Stunden lang in einem feuchten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Die Infektion der Zellen wurde nach Fixierung der Zellen mit 80% Aceton bei Raumtemperatur unter Verwendung von FITC-Anti-Rabies-Konjugat analysiert. Die Platten wurden zweimal mit PBS gewaschen, und der Überschuss an PBS wurde entfernt. Die Zellkulturen wurden im Hinblick auf das Vorhandensein des Rabiesvirus als positiv oder negativ bewertet. Negativ bewertete Zellen in mit Serum behandelten Wells repräsentieren eine Neutralisierung des Rabiesvirus. Jeder FAVN-Test enthielt ein WHO- oder OIE-Standardserum (positives Referenzserum), das als Referenz für die Standardisierung des Assays diente. Die Neutralisationsaktivität der Testseren wurde unter Bezugnahme auf das von der WHO bereitgestellte Standardserum berechnet und in Internationalen Einheiten/ml (IU/ml) angegeben.
  • Ergebnisse
  • Wie in 9 zu sehen ist, induziert die polyadenylierte RAV-G-mRNA höhere neutralisierende Antikörpertiter, die deutlich über dem WHO-Standard von 0,5 lU/ml liegen.
  • SEQUENCE LISTING
    • <110> CureVac AG
    • <120> Artificial nucleic acid molecules for improved protein expression <130> CU01B142W01EPT1DEA
    • <160> 15
    • <170> PatentIn version 3.5
    • <210> 1 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence
    • <220> <223> Exemplary DNA sequence comprising a poly(A) sequence
    • <400> 1
    Figure DE202015009961U1_0017
    • <210> 2 <211> 140 <212> RNA <213> Artificial Sequence
    • <220> <223> Exemplary RNA sequence comprising a poly(A) sequence
    • <400> 2
    Figure DE202015009961U1_0018
    • <210> 3 <211> 186 <212> DNA <213> Homo sapiens
    • <400> 3
    Figure DE202015009961U1_0019
    Figure DE202015009961U1_0020
    • <210> 4 <211> 186 <212> DNA <213> Homo sapiens
    • <400> 4
    Figure DE202015009961U1_0021
    • <210> 5 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens
    • <400> 5
    Figure DE202015009961U1_0022
    • <210> 6 <211> 108 <212> DNA <213> Homo sapiens
    • <400> 6
    Figure DE202015009961U1_0023
    • <210> 7 <211> 132 <212> DNA <213> Homo sapiens
    • <400> 7
    Figure DE202015009961U1_0024
    Figure DE202015009961U1_0025
    • <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens
    • <400> 8
    Figure DE202015009961U1_0026
    • <210> 9 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence
    • <220> <223> 3'-UTR sequence of ribosomal protein Small 9 (RPS9)
    • <400> 9
    Figure DE202015009961U1_0027
    • <210> 10 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence
    • <220> <223> 3'-UTR sequence of ribosomal protein Small 9 (RPS9)
    • <400> 10
    Figure DE202015009961U1_0028
    • <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence
    • <220> <223> histone stem-loop sequence
    • <400> 11
    Figure DE202015009961U1_0029
    • <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence
    • <220> <223> 5'-UTR of human ribosomal protein Large 32 lacking the 5' terminal oligopyrimidine tract
    • <400> 12
    Figure DE202015009961U1_0030
    • <210> 13 <211> 2035 <212> DNA <213> Artificial Sequence
    • <220> <223> rpl32 - PpLuc(GC) - albumin7 - A64 - C30 - histone stem-loop
    • <400> 13
    Figure DE202015009961U1_0031
    Figure DE202015009961U1_0032
    • <210> 14 <211> 2083 <212> DNA <213> Artificial Sequence
    • <220> <223> 32L4-H1N1(Netherlands2009)-HA(GC)-albumin7- A64-N5-C30-histoneSL
    • <400> 14
    Figure DE202015009961U1_0033
    Figure DE202015009961U1_0034
    Figure DE202015009961U1_0035
    • <210> 15 <211> 1957 <212> DNA <213> Artificial Sequence
    • <220> <223> 32L4-RAV-G(GC)-albumin7-A64-N5-C30-histoneSL
    • <400> 15
    Figure DE202015009961U1_0036
    Figure DE202015009961U1_0037
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    Claims (30)

    1. Artifizielles Nukleinsäuremolekül, umfassend a) mindestens einen offenen Leserahmen (ORF); und b) eine 3'-untranslatierte Region (3'-UTR), umfassend mindestens zwei separate Poly(A)-Sequenzen, wobei eine Poly(A)-Sequenz eine Sequenz aus 20 bis 400 Adenin-Nukleotiden ist und wobei die Gesamtzahl an Adenin-Nukleotiden, die von den mindestens zwei separaten Poly(A)-Sequenzen umfasst werden, mindestens 70 beträgt, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül ein mRNA-Molekül ist, das mindestens einen offenen Leserahmen aufweist, der für ein Antigen kodiert, das von einem mit einer Infektionskrankheit assoziierten viralen Pathogen abgeleitet ist, zur Verwendung als Medikament, zur Verwendung als Vakzine oder zur Verwendung in der Gentherapie, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül mit einer kationischen oder polykationischen Verbindung assoziiert oder komplexiert ist, und wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül, das Medikament oder die Vakzine intramuskulär verabreicht wird.
    2. Artifizielles Nukleinsäuremolekül, umfassend a) mindestens einen offenen Leserahmen (ORF); und b) eine 3'-untranslatierte Region (3'-UTR), umfassend zwei separate Poly(A)-Sequenzen, wobei eine Poly(A)-Sequenz eine Sequenz aus 20 bis 400 Adenin-Nukleotiden ist und wobei die Gesamtzahl an Adenin-Nukleotiden, die von den zwei separaten Poly(A)-Sequenzen umfasst werden, mindestens 70 beträgt, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül ein mRNA-Molekül ist, das mindestens einen offenen Leserahmen aufweist, der für ein Antigen kodiert, das von einem mit einer Infektionskrankheit assoziierten viralen Pathogen abgeleitet ist, zur Verwendung als Medikament, zur Verwendung als Vakzine oder zur Verwendung in der Gentherapie, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül mit einer kationischen oder polykationischen Verbindung assoziiert oder komplexiert ist, und wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül, das Medikament oder die Vakzine intramuskulär verabreicht wird.
    3. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die 3'-UTR eine erste und eine zweite Poly(A)-Sequenz umfasst, wobei die erste Poly(A)-Sequenz 20 bis 90 Adenin-Nukleotide umfasst.
    4. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die mindestens zwei oder zwei separaten Poly(A)-Sequenzen eine Gesamtzahl an Adenin-Nukleotiden von 110 bis 200 umfassen.
    5. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mindestens eine Poly(A)-Sequenz am 3'-Terminus des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls gelegen ist.
    6. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die 3'-UTR mindestens ein weiteres 3'-UTR-Element umfasst, das sich von einer Poly(A)-Sequenz unterscheidet und das die Stabilität des artifiziellen Nukleinsäuremoleküls im Vergleich zu einer entsprechenden Nukleinsäure, der eine 3'-UTR fehlt oder die eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das mindestens eine weitere 3'-UTR-Element fehlt, erhöht.
    7. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das mindestens eine weitere 3'-UTR-Element die Proteinexpression von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül im Vergleich zu einer entsprechenden Nukleinsäure, der eine 3'-UTR fehlt oder die eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das mindestens eine weitere 3'-UTR-Element fehlt, verlängert.
    8. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei das mindestens eine weitere 3'-UTR-Element die Proteinexpression und/oder die Gesamtproteinproduktion von dem artifiziellen Nukleinsäuremolekül im Vergleich zu einer entsprechenden Nukleinsäure, der eine 3'-UTR fehlt oder die eine Referenz-3'-UTR umfasst, der das mindestens eine weitere 3'-UTR-Element fehlt, erhöht.
    9. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die 3'-UTR mindestens ein weiteres 3'-UTR-Element umfasst, das eine Nukleinsäuresequenz ist, die von der 3'-UTR eines Gens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem α-Globin-Gen, einem Albumin-Gen, einem β-Globin-Gen, einem Gen eines ribosomalen Proteins, einem Tyrosinhydroxylase-Gen einem Lipoxygenase-Gen und einem Kollagen-alpha-Gen, wie zum Beispiel einem Kollagen-alpha-1(I)-Gen, oder von einer Variante einer 3'-UTR eines Gens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Albumin-Gen, einem α-Globin-Gen, einem β-Globin-Gen, einem Gen eines ribosomalen Proteins, einem Tyrosinhydroxylase-Gen einem Lipoxygenase-Gen und einem Kollagen-alpha-Gen, wie zum Beispiel einem Kollagen-alpha-1(I)-Gen, abgeleitet ist.
    10. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, welches außerdem eine 5'-Cap-Struktur, eine Poly(C)-Sequenz, einen Histon-Stem-Loop, vorzugsweise einen Histon-Stem-Loop, der die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 13 umfasst, und/oder ein IRES-Motiv umfasst.
    11. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Nukleinsäure ein zusätzliches 5'-Element, vorzugsweise eine 5'-UTR, einen Promotor oder eine eine 5'-UTR und einen Promotor enthaltende Sequenz umfasst.
    12. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei die 5'-UTR ein 5'-UTR-Element umfasst oder aus einem 5'-UTR-Element besteht, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die von einer 5'-UTR eines TOP-Gens, das vorzugsweise ein ribosomales Protein kodiert, bevorzugt von einer entsprechenden RNA-Sequenz, einem Homolog, einem Fragment oder einer Variante davon, denen vorzugsweise das 5'-TOP-Motiv fehlt, abgeleitet ist.
    13. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei das 5'-UTR-Element eine Nukleinsäuresequenz umfasst oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die von einer 5'-UTR eines TOP-Gens, das für ein ribosomales Large-Protein (RPL) kodiert, oder von einem Homolog, einem Fragment oder einer Variante davon, denen vorzugsweise das 5'-TOP-Motiv fehlt, abgeleitet ist, und, bevorzugter, eine entsprechende RNA-Sequenz der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 12 umfasst oder aus dieser besteht.
    14. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise der offene Leserahmen, zumindest teilweise G/C-modifiziert ist, wobei vorzugsweise der G/C-Gehalt des offenen Leserahmens gegenüber dem offenen Leserahmen des Wildtyps erhöht ist, und/oder wobei der offene Leserahmen eine Codonoptimierte Region umfasst, wobei vorzugsweise der offene Leserahmen Codonoptimiert ist.
    15. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül mindestens ein Nukleotid-Analogon umfasst.
    16. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei das Nukleotid-Analogon ein Uridin-Analogon ist.
    17. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei das Uridin-Analogon eine chemisch veränderte Form eines nativ oder nicht-nativ vorkommenden Uridins ist.
    18. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei das Uridin-Analogon eine methylierte Form eines nativ oder nicht-nativ vorkommenden Uridins ist.
    19. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die mindestens zwei oder zwei Poly(A)-SequenzElemente durch eine Nukleinsäuresequenz getrennt sind, die ein Poly(C)-Element und/oder ein Histon-Stem-Loop-Element umfasst.
    20. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül in 5'-3'-Richtung mindestens die folgenden Elemente umfasst: a) einen ORF; b) ein 3'-UTR-Element wie in den Ansprüchen 1 oder 6-8 definiert; c) eine Poly(A)-Sequenz, die vorzugsweise 64 Adenosinreste umfasst oder aus diesen besteht; d) eine Poly(C)-Sequenz, die vorzugsweise 30 Cytosinreste umfasst oder aus diesen besteht; e) eine Histon-Stem-Loop-Sequenz, die vorzugsweise die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 umfasst oder aus dieser besteht; und f) eine Poly(A)-Sequenz, die vorzugsweise mindestens 160 Adenosinreste umfasst.
    21. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß Anspruch 20, das ferner eine 5'-Cap-Struktur umfasst.
    22. Artifizielles Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das RNA-Molekül mit einem kationischen Protein oder Peptid, vorzugsweise Protamin, optional in einem Gewichtsverhältnis, das ausgewählt ist aus einem Bereich von etwa 6:1 (Gew./Gew.) bis etwa 0,25:1 (Gew./Gew.), bevorzugter von etwa 5:1 (Gew./Gew.) bis etwa 0,5:1 (Gew./Gew.), noch bevorzugter von etwa 4:1 (Gew./Gew.) bis etwa 1:1 (Gew./Gew.) oder von etwa 3:1 (Gew./Gew.) bis etwa 1:1 (Gew./Gew.), und am meisten bevorzugt einem Verhältnis von etwa 3:1 (Gew./Gew.) bis etwa 2:1 (Gew./Gew.) von RNA zu kationischer oder polykationischer Verbindung und/oder einem polymeren Träger; oder optional in einem Stickstoff/Phosphat-Verhältnis von RNA zu kationischer oder polykationischer Verbindung und/oder polymerem Träger im Bereich von etwa 0,1 bis 10, bevorzugt in einem Bereich von etwa 0,3 bis 4 oder 0,3 bis 1, bevorzugter in einem Bereich von etwa 0,5 bis 1 oder 0,7 bis 1, und am meisten bevorzugt in einem Bereich von etwa 0,3 bis 0,9 oder 0,5 bis 0,9, assoziiert oder komplexiert ist.
    23. Zelle, die das artifizielle Nukleinsäuremolekül, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 definiert, umfasst.
    24. Zelle gemäß Anspruch 23, die eine Säugetierzelle, vorzugsweise eine isolierte Zelle eines Menschen, ist.
    25. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche das artifizielle Nukleinsäuremolekül gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22, oder die Zelle gemäß Anspruch 23 oder 24 umfasst, und die vorzugsweise außerdem ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Vehikel, Verdünnungsmittel und/oder Exzipienten und/oder ein oder mehrere Adjuvanzien umfasst.
    26. Zelle gemäß Anspruch 23 oder 24 oder pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 25 zur Verwendung als Medikament, zur Verwendung als Vakzine oder zur Verwendung in der Gentherapie.
    27. Artifizielles Nukleinsäuremolekül wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 definiert, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Störung, das die Transfektion einer Zelle umfasst, wobei die Transfektion einer Zelle in vitro/ex vivo durchgeführt wird und die transfizierte Zelle einem bedürftigen Subjekt, vorzugsweise einem humanen Patienten, verabreicht wird, wobei die Zelle, die in vitro transfiziert werden soll, vorzugsweise eine isolierte Zelle des Subjekts, vorzugsweise des humanen Patienten, ist.
    28. Verwendung einer 3'-UTR zur Erhöhung der Proteinproduktion von einem artifiziellen Nukleinsäuremolekül, welches ein mRNA-Molekül ist, welches mindestens einen offenen Leserahmen aufweist, der für ein Antigen kodiert, das von einem mit einer Infektionskrankheit assoziierten viralen Pathogen abgeleitet ist, wobei die 3'-UTR zwei separate Poly(A)-Sequenzen umfasst, wobei eine Poly(A)-Sequenz eine Sequenz von 20 bis 400 Adenin-Nukleotiden ist, und wobei die zwei separaten Poly(A)-Sequenzen eine Gesamtzahl von mindestens 70 Adenin-Nukleotiden umfassen.
    29. Verwendung gemäß Anspruch 28, wobei das artifizielle Nukleinsäuremolekül ein artifizielles Nukleinsäuremolekül ist, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 definiert.
    30. Kit oder Kit von Teilen, welches das artifizielle Nukleinsäuremolekül, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 definiert, die Zelle gemäß Anspruch 23 oder 24 oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 25 umfasst.
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