DE102006061015A1

DE102006061015A1 - Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC

Info

Publication number: DE102006061015A1
Application number: DE102006061015A
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr. Ketterer; Florian von der Mülbe; Ladislaus Reidel; Thorsten Mutzke
Original assignee: Curevac AG
Current assignee: Curevac SE
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2008-06-26
Also published as: CA2670727A1; CN101563457B; EP2092064B1; WO2008077592A1; CN101563457A; KR20090098968A; JP2010512767A; DE602007009295D1; PL2092064T3; EP2092064A1; ATE481482T1; JP5307724B2; AU2007338360A1; US20100048883A1; KR101183173B1; AU2007338360B2; DK2092064T3; US8383340B2; CA2670727C; ES2352306T3

Abstract

In der Anmeldung wird ein Verfahren zur präparativen Reinigung von RNA beschrieben, das sich dadurch auszeichnet, dass die RNA mittels HPLC unter Verwendung einer porösen Umkehrphase als stationäre Phase gereinigt wird. Ferner wird die Verwendung der porösen Umkehrphase in diesem HPLC-Verfahren beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC sowie auf die Verwendung einer porösen Umkehrphase als stationäre Phase in diesem Verfahren.
HPLC (Abkürzug für englisch „High Performance (High Pressure) Liquid Chromatography") ist ein etabliertes Verfahren zur Trennung von Substanzgemischen, das in der Biochemie, der analytischen Chemie und der klinischen Chemie weit verbreitet Ist.
Eine HPLC-Apparatur besteht im einfachsten Fall aus einer Pumpe mit Elutionsmittelreservoir mit der mobilen Phase, dem Probenaufgabensystem, der Trennsäule mit der stationären Phase, und dem Detektor. Zusätzlich kann noch ein Fraktionssammler vorgesehen sein, mit dem die einzelnen Fraktionen nach der Trennung separat aufgefangen werden können und somit für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen.
Aus Azarani A. und Hecker K.H., (Nucleic Acids Research, Vol 29, Nr. 2 e7) ist die RNA-Analyse mittels Ionenpaar-Umkehrphasen-HPLC bekannt. Dabei besteht die stationäre Phase aus einer nicht-porösen alkylierten Polystyroldivinylbenzol-Matrix. Die Elution erfolgt mit einem Puffersystem aus zwei Eluenten. Puffer A besteht aus einer wässrigen Lösung von 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA), pH 7,0, und Puffer B besteht aus einer wässrigen Lösung aus 0,1 M TEAA, pH 7,0, mit 25% Acetonitril. Zur Elution wurden folgende drei Gradientensysteme eingesetzt: 38–40% B über 1 Minute, auf 60% B über 15 Minuten, auf 66% B über 6 Minuten, auf 70% B über 0,5 Minuten, auf 100% B über 0,5 Minuten, Halten bei 100% B für 1 Minute, auf 38% über 1 Minute, Halten bei 38% B für 2 Minuten. Alternativ wurde folgendes Gradientenprogramm benutzt: 38–60% über 30 Minuten, auf 100% B über 2 Minuten, auf 38% B über 3 Minuten. Als drittes Gradientenprogramm wurde eingesetzt: 38–40% B über 1 Minute, auf 60% B über 3 Minuten, auf 100% B über 1 Minute, Halten bei 100% B über 6 Minuten, auf 38% B über 1 Minute, Halten bei 38% B über eine 1 Minute.
Bei diesem HPLC-Verfahren wurden also relativ komplizierte und aufwendige Gradientenprogramme benutzt. Ferner können mit diesem Verfahren nur analytische Mengen der RNA bis maximal 1 000 ng (1 μg oder 0,001 mg) getrennt und analysiert werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren dieser Art dahingehend zu verbessern, dass es die Nachteile des Standes der Technik nicht mehr aufweist.
Erfindungsgemäß wird dies erreicht durch ein Verfahren zur Reinigung von RNA in präparativem Maßstab, das sich dadurch auszeichnet, dass die RNA mittels HPLC unter Verwendung einer porösen Umkehrphase als stationäre Phase gereinigt wird. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kommt es also wesentlich darauf an, dass eine poröse Umkehrphase eingesetzt wird.
Unter dem Ausdruck „Reinigung" im Sinn der vorliegenden Erfindung wird verstanden, dass die gewünschte RNA aus einer Probe von den darin vorliegenden Verunreinigungen abgetrennt und/oder isoliert wird. Somit liegt im Vergleich zu der ursprünglich vor der HPLC-Reinigung eingesetzten RNA-haltigen Probe die RNA nach der HPLC-Reinigung in reinerer Form vor. Unerwünschte und deshalb abzutrennende Bestandteile von RNA-haltigen Proben können insbesondere degradierte Fragmente oder Fragmente, die durch zu frühen Abbruch der Transkription entstanden sind, oder auch zu lange Transkripte sein, wenn Plasmide nicht vollständig linearisiert sind. Ferner können Verunreinigungen, wie Enzyme, z. B. RNasen und Polymerasen, und Nucleotide abgetrennt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird RNA gereinigt, die nach der Reinigung im Vergleich zum Ausgangsmaterial eine höhere Reinheit aufweist. Dabei ist es wünschenswert, wenn der Reinheitsgrad so nahe wie möglich bei 100% liegt. Ein Reinheitsgrad von mehr als 70%, insbesondere 80%, ganz besonders 90% und am günstigsten 99% oder mehr kann auf diese Weise erreicht werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt eine präparative Reinigung der RNA. Dies ist im Unterschied zu einem analytischen HPLC-Verfahren zu verstehen, das in vorstehendem Stand der Technik (Azarani & Hecker) beschrieben ist. In einem analytischen HPLC-Verfahren wird eine deutlich geringere Menge als in einem präparativen HPLC-Verfahren eingesetzt und getrennt. Bei dem in obigem Stand der Technik diskutierten Verfahren wurden Mengen von 8 ng bis 1000 ng eingesetzt. Im Gegensatz dazu soll unter einem präparative HPLC-Verfahren ein HPLC-Verfahren verstanden werden, bei dem größere Mengen an RNA gereinigt werden. Solche größeren Mengen sind z. B. Mengen von 0,5 mg oder mehr, insbesondere 1,0 mg bis 1 000 mg oder mehr, ganz besonders etwa 1,5 mg oder mehr, wobei sogar ein Upscaling bis in den kg-Bereich möglich ist. Die vorstehenden Angaben sind daher so zu verstehen, dass sich diese Mengen auf einen einzigen durchgeführten HPLC-Lauf beziehen. Werden mehrere HPLC-Läufe ausgeführt, so erhöht sich die Menge direkt proportional mit der Anzahl der HPLC-Läufe.
Das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere die nachstehend ausführlich geschilderten bevorzugten Ausführungsformen, weisen eine Reihe von Vorteilen auf: Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können wesentlich größere Mengen von RNA getrennt werden als dies mit dem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren möglich ist. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können diese höheren Mengen in hoher Reinheit erhalten werden. Die Abtrennung von degradierten Fragmenten oder zu langen Fragmenten oder von Fragmenten, die durch zu frühen Abbruch der Transkription entstanden sind, ist möglich. Ferner können weitere in RNA-Proben vorliegende Kontaminationen, wie Enzyme, z. B. RNase und Polymerasen, und Nucleotide gut abgetrennt werden. Die Gewinnung dieser größeren Mengen von RNA kann innerhalb von Minuten erfolgen, und zwar selbst aus hochgradig mit Verunreinigungen kontaminierten Proben. Die RNA-Gewinnung erfolgt zuverlässig, d. h. es besteht eine große Zuverlässigkeit, dass hoch reine RNA gewonnen wird. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine hohe Auflösung erreicht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zudem leicht automatisch betrieben werden. Es eignet sich somit bestens, routinemäßig RNA in präparativem Maßstab zu reinigen. Die RNA ist bei den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens stabil, d. h. ein Abbau während der HPLC-Reinigung in RNA-Fragmente und somit die Entstehung von neuen Verunreinigungen und die Verminderung der Ausbeute an gewünschter RNA während der HPLC-Reinigung wird vermieden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit in einfacher, schneller, kostengünstiger Weise, genau und mit sicheren Ergebnissen durchgeführt werden. Die Isolierung der RNA nach der HPLC-Trennung kann mit einem Fraktionssammler in einfacher Weise erfolgen, d. h. die Wiedergewinnung der RNA ist sehr einfach möglich, wobei eine direkte Weiterverarbeitung der RNA ebenfalls erfolgen kann. Die Detektion kann schließlich sehr sensitiv durchgeführt werden.
Unter „RNA", die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt werden soll, wird Ribonucleinsäure jeglicher Art verstanden. Besonders bevorzugt ist die RNA ausgewählt aus tRNA, rRNA, mRNA oder Gesamt-Zell-RNA. Ferner kann die RNA auch Aptamere und Ribozyme umfassen. Die zu isolierende RNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Einzelsträngige RNA kann ggf. Sekundärstrukturen durch Rückfaltung ausbilden, typischerweise ist die aufzutrennende RNA einzelsträngig. Die RNA kann unmarkiert oder auch markiert (mit einem Fluoreszenz-, oder Radiolabel oder einem Antikörper-Epitop) sein. Ein Beispiel einer markierten RNA ist Digoxigeninmarkierte β-Actin-RNA.

• Es kann sich bei der zu reinigenden RNA um native oder nicht native RNA handeln. Vorzugsweise wird native RNA eingesetzt, die über ein, bspw. zelluläres oder in vitro Expressionssystem bereitgestellt wird. Die RNA wird dann isoliert und das Isolat über das erfindungsgemäße Verfahren aufgereinigt. Ggf. kann auch chemisch synthetisierte RNA über das erfindungsgemäße Verfahren aufgereinigt werden. In jedem Fall kann die RNA auch nicht-native Nukleotide enthalten, wobei die chemischen Modifikationen im Rückgrat der RNA, bspw. Phosphorthioat, in der Struktur der Nukleotid-Base, bspw. Hypoxanthin, Dihydrouracil, Pseudouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Aminouracil, 5-(C1-C6)-Alkyluracil, 5-(C2-C6)-Alkenyluracil, 5-(C2-C6)-Alkynyluracil, 5-(Hydroxymethyl)uracil, 5-Chlorouracil, 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Hydroxycytosin, 5-(C1-C6)-Alkylcytosin, 5-(C2-C6)-Alkenylcytosin, 5-(C2-C6)-Alkynylcytosin, 5-Chlorocytosin, 5-Fluorocytosin, 5-Bromocytosin, N<2>-Dimethylguanin, 2,4-Diaminopurin, 8-Azapurin, ein substituiertes 7-Deazapurin, vorzugsweise 7-Deaza-7-substituiertes und/oder 7-Deaza-8-substituiertes Purin, 5-Hydroxymethylcytosin, N4-Alkylcytosin, z. B. N4-Ethylcytosin, 5-Hydroxydeoxycytidin, 5-Hydroxymethyldeoxycytidin, N4-Alkyldeoxycytidin, z. B. N4-Ethyldeoxycytidin, 6-Thiodeoxyguanosin, und Deoxyribonucleotide von Nitropyrrol, C5-Propynylpyrimidine, und Diaminopurin z. B. 2,6-Diaminopurin, Inosin, 5-Methylcytosin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-chloropurin, oder auch im Zuckerrest liegen können. Weitere Beispiele für modifizierte Nukleotide sind 2-Amino-6-Chloropurinribosid-5'-triphosphat, 2-Aminoadenosin-5'-triphosphat, 2-Thiocytidin-5'-triphosphat, 2-Thiouridin-5'-triphosphat, 4-Thiouridin-5'-triphosphat, 5-Aminoallylcytidin-5'-triphosphat, 5-Aminoallyluridin-5'-triphosphat, 5-Bromocytidin-5'-triphosphat, 5-Bromouridin-5'-triphosphat, 5-Iodocytidin-5'-triphosphat, 5-Iodouridin-5'-triphosphat, 5-Methylcytidin-5'-triphosphat, 5-Methyluridin-5'-triphosphat, 6-Azacytidin-5'-triphosphat, 6-Azauridin-5'-triphosphat, 6-Chloropurinribosid-5'-triphosphat, 7-Deazaadenosin-5'-triphosphat, 7-Deazaguanosin-5'-triphosphat, 8-Azaadenosin-5'-triphosphat, 8-Azidoadenosin-5'-triphosphat, Benzimidazol-ribosid-5'-triphosphat, N1-Methyladenosin-5'-triphosphat, N1-Methylguanosin-5'-triphosphat, N6-Methyladenosin-5'-triphosphat, O6-Methylguanosin-5'-triphosphat, Pseudouridin-5'-triphosphat, Puromycin-5'-triphosphat, Xanthosine-5'-triphosphat.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die aufzutrennende RNA eine Größe von bis zu etwa 15 000 Basenpaare, insbesondere 100 bis 10000 Basenpaare, auf. Für diese Größe der RNA konnten sehr gute Ergebnisse hinsichtlich der Reinigung der RNA erzielt werden, da das erfindungsgemäße Verfahren für RNA dieser Größe besonders gut geeignet ist. Gegebenenfalls können aber auch kleinere RNA-Fragmente, bspw. von 30–1000, 50–1000 oder 100–1000 Nukleotiden Länge auf diesem Weg aufgetrennt werden.
Für den Fall, dass es sich bei der aufzutrennenden RNA um mRNA handelt, wird diese bevorzugt für Proteine codieren, insbesondere solche die Antigencharakter haben, und z. B. aus allen rekombinant erzeugten oder natürlich auftretenden Proteinen, die einem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind und für therapeutische Zwecke, für diagnostische oder für Forschungszwecke eingesetzt werden. Insbesondere handelt es sich bei den Antigenen dann um Tumorantigene oder Antigene von Pathogenen, bspw. viralen, bakteriellen oder protozoologischen Organismen.
Ohne darauf beschränkt zu sein, umfassen solche Proteine u. a. Wachstumshormone oder Wachstumsfaktoren, z. B. zur Förderung des Wachstums in einem (transgenen) Lebewesen wie z. B. TGF und den IGFs („Insuline like growth factors"), Proteine, die den Metabolismus und/oder die Hämatopoese beeinflussen, wie z. B. -anti-Trypsin, LDL-Rezeptor, Erythropoietin (EPO), Insulin, GATA-1, etc., oder Proteine, wie z. B. die Faktoren VIII und XI des Blutgerinnungssystems, etc.. Solche Proteine umfassen weiterhin Enzyme, wie z. B. β-Galactosidase (lacZ), DNA Restriktionsenzyme (z. B. EcoRI, HindIII, etc.), Lysozyme, etc., oder Proteasen, wie z. B. Papain, Bromelain, Keratinasen, Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Rennin (Chymosin), Suizym, Nortase, etc., und Protease-Inhibitoren (z. B. zur Behandlung von HIV-Infektionen), wie z. B. Protease-Inhibitoren, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus AG1776, Amprenavir (141W94 oder VX-478), Atazanavir (BMS-232632), Cathepsin S Proteaseinhibitor, D1927, D9120, Fosamprenavir (GW-433908 oder VX-175), GS 9005, GW640385 (VX-385), HCV Proteaseinhibitor, Indinavir (MK-639), L-756 423, Levoprin-ZG, Lopinavir (ABT-378), Lopinavir/Ritonavir (LPV ABT-378/r), MK-944A, Mozenavir (DMP450), Nelfinavir (AG-1343), NNRTI, P-1946, PL-100, Prinomastat, Ritonavir (ABT-538), RO033-4649, TMC114, Saquinavir (Ro-31-8959), NRTI, Tipranavir (PNU-140690), TLK 19781, TMC-114, Vertex 385, VX-950. Die von der erfindungsgemäß aufgetrennten RNA kodierten Proteine können ebenfalls Proteine umfassen, die die Signalweiterleitung der Zelle stimulieren oder inhibieren, z. B. Cytokine, etc.. Solche Proteine, umfassen daher bspw. auch Cytokine der Klasse I der Cytokinfamilie, die 4 positionsmäßig konservierte Cysteinreste (CCCC) und eine konserviertes Sequenzmotiv Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS) aufweisen, wobei X eine nicht-konservierte Aminosäure darstellt. Cytokine der Klasse I der Cytokinfamilie umfassen die GM-CSF Unterfamilie, z. B. IL-3, IL-5, GM-CSF, die IL-6-Unterfamilie, z. B. IL-6, IL-11, IL-12, oder die IL-2-Unterfamilie, z. B. IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, etc., oder die Cytokine IL-1α, IL-1β, IL-10 etc.. Analog können solche Proteine auch Cytokine der Klasse II der Cytokinfamilie (Interferon-Rezeptor-Familie) umfassen, die ebenfalls 4 positionsmäßig konservierte Cysteinreste (CCCC), jedoch kein konserviertes Sequenzmotiv Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), aufweisen. Cytokine der Klasse II der Cytokinfamilie umfassen z. B. IFN-α, IFN-β, IFN-γ, etc.. Die durch die aufgetrennte RNA kodierten Proteine können weiterhin auch Cytokine der Tumor-Nekrose-Familie umfassen, z. B. TNF-α, TNF-β, CD40-Ligand, Fas-Ligand, etc., oder Cytokine der Chemokin-Familie, inbesondere Interferone, Interleukine, Kolonie-stimulierende Faktoren und Tumor-Nekrose-Faktoren, und mit G-Protein interagieren, z. B. IL-8, MIP-1, RANTES, CCR5, CXR4, etc.. Solche Proteine können auch aus Apoptose-Faktoren oder Apoptose-verwandten oder -verknüpften Proteinen ausgewählt werden, einschließlich AlF, Apaf z. B. Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3, oder APO-2 (L), APO-3 (L), Apopain, Bad, Bak, Bax, BcI-2, BcI-x_L, BcI-x_S, bik, CAD, Calpain, Caspasen z. B. Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-10, Caspase-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A, Cytochrom C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PKcs, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas (Fas-Ligand CD95/fas (Rezeptor)), FLICE/MACH, FLIP, Fodrin, fos, G-Actin, Gas-2, Gelsolin, Granzyme A/B, ICAD, ICE, JNK, Lamin A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORT-1, NEDD, NF-B, NuMa, p53, PAK-2, PARP, Perforin, PITSLRE, PKC, pRb, Presenilin, prICE, RAIDD, Ras, RIP, Sphingomyelinase, Thymidinkinase aus Herpes simplex, TRADD, TRAF2, TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, Transglutaminase, etc.. Die durch die erfindungsgemäß aufgetrennte RNA kodierten Proteine können auch aus Antigenen ausgewählt werden, z. B. aus tumorspezifischen Oberflächenantigenen (TSSA), z. B. 5T4α5β1-Integrin, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β-Catenin/m, Bcr-abl, MN/C IX-Antigen, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, β-Catenin/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD 30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (oder hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MACE, MART-1/Melan-A, MART-2/Ski, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, PAP, Proteinase-3, p190 minor bcr-abl, Pml/RAR, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, Survivin, TEL/AML1, TGF, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF und WT1, oder aus Sequenzen, wie z. B. NY-Eso-1 oder NY-Eso-B. Proteine, die durch die erfindungsgemäß aufgetrennte RNA kodiert werden können, umfassen weiterhin auch solche Proteine oder Proteinsequenzen, die zu einem der oben beschriebenen Proteine eine Sequenzidentität von mindestens 80% oder 85%, bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95% und am stärksten bevorzugt mindestens 99% aufweisen.
Die aufzutrennende mRNA kann gegenüber einer entsprechenden Wildtyp-mRNA folgende Modifikationen aufweisen, die entweder alternativ oder in Kombination vorliegen können. Zum einen kann der G/C-Gehalt des für ein Peptid oder Polypeptid kodierenden Bereichs der modifizierten mRNA größer sein als der G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der für das Peptid oder Polypeptid kodierenden Wildtyp-mRNA, wobei die kodierte Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp unverändert ist. Diese Modifikation beruht auf der Tatsache, dass für eine effiziente Translation einer mRNA die Sequenzabfolge des zu translatierenden Bereichs der mRNA wesentlich ist. Dabei spielt die Zusammensetzung und die Abfolge der verschiedenen Nukleotide eine große Rolle. Insbesondere sind Sequenzen mit erhöhtem G(Guanosin)/C(Cytosin)-Gehalt stabiler als Sequenzen mit einem erhöhten A(Adenosin)/U(Uracil)-Gehalt. Daher werden erfindungsgemäß unter Beibehaltung der translatierten Aminosäureabfolge die Codons gegenüber der Wildtyp-mRNA derart variiert, dass sie vermehrt G/C-Nukleotide beinhalten. Da mehrere Codons für ein und dieselbe Aminosäure kodieren (Degeneration des genetischen Codes), können die für die Stabilität günstigsten Codons ermittelt werden (alternative Codonverwendung, engl. "codon usage"). Andererseits ist es auch möglich, eine translationsoptimierte RNA im erfindungsgemäßen Verfahren bereitzustellen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Umkehrphase als stationäre Phase für die HPLC-Reinigung eingesetzt. Für die Chromatographie mit Umkehrphasen dient als stationäre Phasen eine unpolare Verbindung und zur Elution als mobile Phase ein polares Lösungsmittel, wie Gemische von Wasser, das meistens in Form von Puffern eingesetzt wird, mit Acetonitril und/oder Methanol.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die poröse Umkehrphase eine Partikelgröße von 8,0 μm bis 50 μm, insbesondere 8,0 bis 30, noch stärker bevorzugt 8,0 bis 25 μm. Das Umkehrphasenmaterial kann in Form von Kügelchen vorliegen. Mit einer porösen Umkehrphase mit dieser Partikelgröße, ggf. in Form von Kügelchen, kann das erfindungsgemäße Verfahren in besonders günstiger Weise durchgeführt werden, wobei besonders gute Trennergebnisse erhalten werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Umkehrphase ist porös und weist spezifische Partikelgrößen auf. Mit stationären Umkehrphasen, die nicht porös und damit in bezug auf die Partikelgrößen gänzlich unterschiedlich vom vorliegenden Erfindungsgegenstand sind, wie sie z. B. bei Azarani A. und Hecker K.H. beschrieben sind, werden hingegen zu hohe Drücke aufgebaut, so dass eine präparative Reinigung der RNA, falls überhaupt, nur sehr schwer möglich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Umkehrphase eine Porengröße von 1 000 Å bis 5 000 Å, insbesondere eine Porengröße von 1 000 Å bis 4 000 Å, weiter bevorzugt 1500 Å bis 4000 Å, 2000 Å bis 4000 Å bzw. 2500 Å bis 4000 Å auf. Besonders bevorzugte Porengrößen für die Umkehrphasen sind 1 000–1200 Å und 3500–4500 Å. Mit einer Umkehrphase mit diesen Porengrößen werden hinsichtlich der Reinigung der RNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders gute Ergebnisse erzielt, insbesondere werden die bei dem Verfahren nach Azarani A. und Hecker K.H. aufgebauten hohen Drücke damit vermieden, wodurch eine präparative Trennung in besonders günstiger Weise ermöglicht wird. Bei Porengrößen unter 1 000 Å wird die Trennung der RNA schlechter.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Material für die Umkehrphase ein Polystyroldivinylbenzol, wobei insbesondere nicht alkylierte Polystyroldivinylbenzole eingesetzt werden können. Stationäre Phasen mit Polystyroldivinylbenzol sind an sich bekannt. Für das erfindungsgemäße Verfahren können die an sich bekannten und bereits für HPLC-Verfahren eingesetzten Polystyroldivinylbenzole verwendet werden, die kommerziell erhältlich sind.
Ganz besonders bevorzugt für das erfindungsgemäße Verfahren ist ein nicht alkyliertes poröses Polystyroldivinylbenzol, das insbesondere eine Partikelgröße von 8,0 ± 1,5 μm, insbesondere 8,0 ± 0,5 μm, sowie eine Porengröße von 1 000–1200 Å oder 3500–4500 Å aufweist. Mit diesem Material für die Umkehrphasen können die vorstehend geschilderten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens in besonders günstiger Weise erreicht werden.
Diese vorstehend näher beschriebene stationäre Phase befindet sich üblicherweise in einer Säule. Als Material für die Säule wird herkömmerlicherweise aus V2A-Stahl verwendet, wobei aber auch andere Materialien für die Säule eingesetzt werden können, sofern sie für die bei der HPLC herrschenden Bedingungen geeignet sind. Üblicherweise ist die Säule gerade. Günstigerweise weist die HPLC-Säule eine Länge von 5 cm bis 100 cm und einen Durchmesser von 4 mm bis 25 mm auf. Für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Säulen können insbesondere die folgenden Dimensionen haben: 50 mm lang und 7,5 mm im Durchmesser oder 50 mm lang und 4,6 mm im Durchmesser, oder 50 mm lang und 10 mm im Durchmesser oder jede andere Dimension hinsichtlich Länge und Durchmesser, die für eine präparative Gewinnung von RNA geeignet ist, wobei bei einem Upscaling sogar Längen von mehreren Metern und auch größere Durchmesser denkbar sind. Die Dimensionen orientieren sich dabei an dem, was technisch bei der Flüssigkeitschromatographie möglich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren als Ionenpaarmethode durchgeführt, wobei der mobilen Phase ein Ion mit lipophilem Rest und mit positiver Ladung als Gegenion zur negativ geladenen RNA zugegeben wird. Auf diese Weise entsteht ein Ionenpaar mit lipophilem Charakter, das durch die unpolare stationäre Phase des Umkehrphasen-Systems verlangsamt wird. In der Praxis müssen die genauen Bedingungen für die Ionenpaarmethode für jedes konkrete Trennproblem empirisch erarbeitet werden. Die Größe des Gegenions, seine Konzentration und der pH-Wert der Lösung tragen stark zum Ergebnis der Trennung bei. Dies bedeutet, dass die empirisch gefundenen Bedingungen einer Ionenpaarmethode nicht ohne weitere auf ein anderes Trennproblem übertragen werden können. Ist beispielsweise aus dem Stand der Technik eine Ionenpaarmethode bekannt, bedeutet dies nicht, dass die gleichen Bedingungen zwangsläufig auch für das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Trennproblem angewendet werden können, obwohl dann im Ergebnis vielleicht doch die gleichen oder ähnliche Bedingungen günstig sind. In günstiger Weise werden im erfindungsgemäßen Verfahren der mobilen Phase Alkylammonium-Salze, wie Triethylammoniumacetat, und/oder Tetraalkylammonium-Verbindungen, wie Tetrabutylammonium, zugegeben. Vorzugsweise wird 0,1 M Triethylammoniumacetat zugesetzt und der pH-Wert auf etwa 7 eingestellt. Mit diesem Puffer für die Ionenpaarmethode wird das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Trennproblem, d. h. die Reinigung von RNA in präparativem Maßstab, in besonders günstiger Weise gelöst. Als weitere Pufferlösungen kommen in Betracht: Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Acetat-Puffer, Phosphat-Puffer, Tetrabutylammonium-bisulfat, Tetrabutylammoniumbromid und Tetrabutylammoniumchlorid.
Die Wahl der mobilen Phase hängt von der Art der gewünschten Trennung ab. Dies bedeutet, dass die für eine spezielle Trennung gefundene mobile Phase, wie sie beispielsweise aus dem Stand der Technik bekannt sein kann, nicht auf ein anderes Trennproblem ohne weiteres mit hinreichender Aussicht auf Erfolg übertragen werden kann. Für jedes Trennproblem müssen mit empirischen Versuchen die idealen Elutionsbedingungen, insbesondere die verwendete mobile Phase, bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen HPLC-Verfahrens wird ein Gemisch aus einem wässrigen Lösungsmittel und einem organischen Lösungsmittel als mobile Phase zu Elution der RNA eingesetzt. Dabei ist es günstig, wenn als wässriges Lösungsmittel ein Puffer benutzt wird, der insbesondere einen pH von 6,0–8,0, z. B. von etwa 7, bspw. 7,0 aufweist; vorzugsweise ist der Puffer Triethylammoniumacetat, besonders bevorzugt ein von 0,02 M bis 0,5 M, insbesondere 0,08 M bis 0,12 M, ganz besonders ca. 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, der, wie vorstehend beschrieben, auch als Gegenion zur RNA in der Ionenpaarmethode wirkt.
Das organische Lösungsmittel, das in der mobilen Phase eingesetzt wird, ist in einer bevorzugten Ausführungsform Acetonitril, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol und Aceton oder ein Gemisch von diesen beiden, ganz besonders bevorzugt Acetonitril. Mit diesen organischen Lösungsmitteln, insbesondere Acetonitril, erfolgt die Reinigung der RNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in besonders günstiger Weise.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die mobile Phase ein Gemisch von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7, und Acetonitril.
Als besonders günstig für das erfindungsgemäße Verfahren hat es sich herausgestellt, wenn die mobile Phase 5,0 Vol.-% bis 25,0 Vol.-% organisches Lösungmittel, bezogen auf die mobile Phase, enthält und der Rest auf 100 Vol.-% das wässrige Lösungsmittel ist. Typischerweise wird bei der Gradiententrennung der Anteil an organischem Lösungsmittel erhöht, insbesondere um mindestens 10%, stärker bevorzugt um mindestens 50% und am stärksten bevorzugt um mindestens 100%, ggf. um mindestens 200%, bezogen auf den initialen Vol.-% in der mobilen Phase, erhöht. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt im erfindungsgemäßen Verfahren der Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase im Verlauf der HPLC-Trennung von 3 bis 9, vorzugsweise 4 bis 7,5, insbesondere 5,0 Vol.-%, jeweils bezogen auf die mobile Phase. Stärker bevorzugt wird der Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase im Verlauf der HPLC-Trennung von 3 bis 9, insbesondere 5,0 Vol.-%, auf bis zu 20,0 Vol.-%, jeweils bezogen auf die mobile Phase, erhöht. Noch stärker bevorzugt wird das Verfahren so ausgeführt, dass der Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase im Verlauf der HPLC-Trennung von 6,5 bis 8,5, insbesondere 7,5 Vol.-%, auf bis zu 17,5 Vol.-%, jeweils bezogen auf die mobile Phase, erhöht wird.
Weiter ganz besonders günstig für das erfindungsgemäße Verfahren ist es, wenn die mobile Phase 7,5 Vol.-% bis 17,5 Vol.-% organisches Lösungmittel, bezogen auf die mobile Phase, enthält und der Rest auf 100 Vol.-% das wässrige gepufferte Lösungsmittel ist.
Die Elution kann beim erfindungsgemäßen Verfahren isokratisch oder mittels einer Gradiententrennung erfolgen. Bei einer isokratischen Trennung erfolgt die Elution der RNA mit einem einzigen Elutionsmittel oder einem gleich bleibenden Gemisch mehrerer Elutionsmittel, wobei als Elutionsmittel die vorstehend detailliert beschriebenen Lösungsmittel eingesetzt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Gradiententrennung durchgeführt. Dabei wird die Zusammensetzung des Elutionsmittels mit Hilfe eines Gradientenprogramms geändert. Die für die Gradiententrennung erforderlichen Geräte sind dem Fachmann bekannt. Die Gradientenelution kann dabei entweder auf der Niederdruckseite durch Mischkammern oder auf der Hochdruckseite durch weitere Pumpen erfolgen.
Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren bei der Gradiententrennung der Anteil des organischen Lösungsmittels, wie es vorstehend beschrieben wurde, in Bezug auf das wässrige Lösungsmittel erhöht. Als wässriges Lösungsmittel können dabei die vorstehend beschriebenen Mittel und als organische Lösungsmittel die ebenfalls vorstehend beschriebenen Mittel eingesetzt werden Beispielsweise kann der Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase im Verlauf der HPLC-Trennung von 5,0 Vol.-% auf 20,0 Vol.-%, jeweils bezogen auf die mobile Phase, erhöht werden. Insbesondere kann der Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase im Verlauf der HPLC-Trennung von 7,5 Vol.-% auf 17,5 Vol.-%, insbesondere 9,5 bis 14,5 Vol.-%, jeweils bezogen auf die mobile Phase, angehoben werden.
Als besonders günstig für die Reinigung von RNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hat sich folgendes Gradientenprogrmm herausgestellt:
Elutionsmittel A: 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7
Elutionsmittel B: 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7, mit 25 Vol.-% Acetonitril
Eluentenzusammensetzung:
Start: 62% A und 38% B (1. bis 3. Minute)
Erhöhung auf 58% B (1,67% Zunahme von B pro Minute), (3.–15. Minute)
100% B (15. bis 20. Minute)
Ein anderes Beispiel für ein Gradientenprogramm ist nachfolgend dargestellt, wobei die gleichen Elutionsmittel A und B eingesetzt wurden:
Eluentenzusammensetzung:

• Startplateau: 62% A und 38% B (1.-3. min)
• Trennbereich I: Gradient 38%-49,5% B (5,75% Zunahme von B/min) (3.-5. min)
• Trennbereich II: Gradient 49,5%-57% B (0,83% Zunahme von B/min) (5.-14. min)
• Spülbereich: 100% B (15.-20. min)

Damit die Säule nicht verschmutzt oder verstopft und die Detektion nicht gestört wird, ist es günstig, gereinigte Lösungsmittel für die HPLC einzusetzen. Solche gereinigten Lösungsmittel sind kommerziell erhältlich. Sie können zusätzlich noch mit einem 1- bis 5-μm Mikrofilter filtriert werden, der meist vor der Pumpe im System montiert ist. Zusätzlich ist es günstig, wenn alle Lösungsmittel vor dem Gebrauch entgast werden, da andernfalls in den meisten Pumpen Gasblasen auftreten. Treten Luftblasen im Lösungsmittel auf, kann dies die Trennung aber auch die kontinuierliche Überwachung des Effluenz im Detektor stören. Die Lösungsmittel können durch Erwärmen, durch heftiges Rühren mit einem Magnetrührer, durch kurzzeitiges Evakuieren, durch Ultraschallbehandlung oder durch Durchblasen eines kleinen Heliumstromes durch das Lösungsmittelvorratsgefäß entgast werden.
Der Durchfluss des Elutionsmittels wird so gewählt, dass eine gute Trennung der RNA von den übrigen in der zu untersuchenden Probe enthaltenen Bestandteilen erfolgt. Der für das erfindungsgemäße Verfahren gewählte Fluss des Elutionsmittels kann von 1 ml/min bis mehrere Liter pro Minute (beim Upscaling), insbesondere etwa 1 bis 1000 ml/min, weiter bevorzugt 5 ml bis 500 ml/min, stärker bevorzugt mehr als 100 ml/min betragen, je nach Art und Umfang des Upscalings. Diese Flussgeschwindigkeit kann durch die Pumpe eingestellt und reguliert werden.
Die Detektion erfolgt in günstiger Weise mit einem UV-Detektor bei 254 nm, wobei eine Referenz bei 600 nm erfolgen kann. Es kann aber alternativ jedes andere Detektionsverfahren benutzt werden, mit dem die vorstehend näher beschriebene RNA in ausreichender und zuverlässiger Weise nachgewiesen werden kann.
Für die präparative Reinigung der RNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es sinnvoll, die RNA-haltigen eluierten Lösungsmittelmengen zu sammeln. Dabei ist es günstig, dieses Sammeln so durchzuführen, dass das eluierte Lösungsmittel in einzelnen getrennten Fraktionen gesammelt wird. Dies kann beispielsweise mit einem Fraktionssammler erfolgen. Auf diese Weise können die RNA-haltigen Fraktionen, die hochrein sind, von anderen RNA-haltigen Fraktionen, die noch immer – wenn auch sehr geringe Mengen – unerwünschte Verunreinigungen enthalten, getrennt werden. Die einzelnen Fraktionen können beispielsweise über 1 Minute gesammelt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird günstigerweise unter vollständig denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Dies kann z. B. dadurch erfolgen, dass die Probenaufgabe bei einer Temperatur von 4–12°C erfolgt, aber ansonsten das HPLC- Verfahren bei einer höheren Temperatur, vorzugsweise bei 70°C oder mehr, besonders bevorzugt bei 75°C oder mehr, insbesondere bis 82°C, und ganz besonders bevorzugt bei ca. 78°C durchgeführt wird. Die Erwärmung ist typischerweise wichtig für die Denaturierung der RNA, wodurch letztendlich eine bessere Trennung erreicht wird. Bei niedrigeren Temperaturen verringert sich die Auflösung, d. h. die Trennung der RNA von den Verunreinigungen nimmt ab.
Die Probenauftragung kann mit zwei Verfahren erfolgen, der Stop-flow-Injektion oder der Schleifeninjektion. Bei der Stop-flow-Injektion wird eine Mikrospritze eingesetzt, die den hohen in der HPLC angewendeten Druck aushalten kann. Die Probe wird durch ein Septum in einem Einlassventil entweder direkt auf die Säulenfüllung oder auf einen kleinen Tropfen inerten Materials unmittelbar über die Füllung injiziert. Das System kann dabei unter hohem Druck stehen, oder die Pumpe kann vor der Injektion abgestellt werden. Sie wird dann vorgenommen, wenn der Druck bis nahe zum Normalwert gefallen ist. Bei der Schleifeninjektion benutzt man zur Einführung der Probe einen Schleifeninjektor. Er besteht aus einer Rohrschlaufe, in die man die Probe einsetzt. Mittels eines geeigneten Drehventils wird dann die stationäre Phase aus der Pumpe durch die Schleife, deren Auslass direkt in die Säule führt, geleitet. Die Probe wird so durch die stationäre Phase in die Säule mitgenommen, ohne dass der Lösungsmittelfluss zur Pumpe unterbrochen würde.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung einer porösen Umkehrphase in dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen HPLC-Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung weist die poröse Umkehrphase eine Partikelgröße von 8,0 m bis 50 μm, insbesondere 8,0 bis 30, noch stärker bevorzugt 8,0 bis 25 μm auf. Die Umkehrphase kann in Form von Kügelchen vorliegen. Mit einer porösen Umkehrphase mit dieser Partikelgröße und/oder in Form von Kügelchen kann die erfindungsgemäße Verwendung in besonders günstiger Weise durchgeführt werden, wobei besonders gute Trennergebnisse erhalten werden.
Die in der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzte Umkehrphase ist porös, da mit stationären Umkehrphasen, die nicht porös und damit in bezug auf die Partikelgrößen gänzlich unterschiedlich vom vorliegenden Erfindungsgegenstand sind, wie sie z. B. bei Azarani A. und Hecker K.H. beschrieben sind, zu hohe Drücke aufgebaut werden, so dass eine präparative Reinigung der RNA mittels HPLC falls überhaupt nur sehr schwer möglich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung weist die Umkehrphase eine Porengröße von 1 000 Å bis 5 000 Å, insbesondere eine Porengröße von 1 000 Å bis 4 000 Å, auf bzw. die vorgenannten bevorzugten Angaben. Besonders bevorzugte Porengrößen für die Umkehrphasen sind 1 000–1200 Å und 3500–4500 Å. Mit einer Umkehrphase mit diesen Porengrößen werden hinsichtlich der Reinigung der RNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders gute Ergebnisse erzielt, insbesondere werden die bei dem Verfahren nach Azarani A. und Hecker K.H. aufgebauten hohen Drücke damit vermieden, wodurch eine präparative Trennung in besonders günstiger Weise ermöglicht wird. Bei Porengrößen unter 1 000 Å wird die Trennung der RNA schlechter, weswegen derartige Partikelgrößen weniger bevorzugt sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist das Material für die Umkehrphase ein Polystyroldivinylbenzol, wobei insbesondere nicht alkyliertes Polystyroldivinylbenzol eingesetzt werden kann. Stationäre Phasen mit Polystyroldivinylbenzol sind an sich bekannt. Für das erfindungsgemäße Verfahren können die an sich bekannten und bereits für HPLC-Verfahren eingesetzten Polystyroldivinylbenzole verwendet werden, die kommerziell erhältlich sein können.
Ganz besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Verwendung ist ein nicht alkyliertes poröses Polystyroldivinylbenzol, das insbesondere eine Partikelgröße von 8,0 ± 1,5 μm, insbesondere 8,0 ± 0,5 μm, sowie eine Porengröße von 1 000 Å oder 4 000 Å aufweist. Mit diesem Material für die Umkehrphase können die nachstehend geschilderten Vorteile in besonders günstiger Weise erreicht werden.
Diese vorstehend näher beschriebene stationäre Phase befindet sich zur erfindungsgemäßen Verwendung in einer Säule. Als Material für die Säule wird üblicherweise V2A-Stahl verwendet, wobei aber auch andere Materialien für die Säule eingesetzt werden können, sofern sie für die bei der HPLC-Gewinnung herrschenden Bedingungen geeignet sind. Üblicherweise ist die Säule gerade. Günstigerweise weist die HPLC-Säule eine Länge von 5 cm bis 100 cm und einen Durchmesser von 4 mm bis 25 mm auf. Für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Säulen können insbesondere die folgenden Dimensionen haben: 50 mm lang und 7,5 mm im Durchmesser oder 50 mm lang und 4,6 mm im Durchmesser oder 50 mm lang und 10 mm im Durchmesser oder jede andere Dimension hinsichtlich Länge und Durchmesser, die für eine präparative Reinigung von RNA mittels HPLC geeignet ist, wobei bei einem Upscalin sogar Längen von mehreren Metern und auch größere Durchmesser denkbar sind. Die Dimensionen orientieren sich dabei an dem, was technisch bei der Flüssigkeitschromatographie möglich ist.
Die weiteren Bedingungen für die erfindungsgemäße Verwendung wurden bereits vorstehend in Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben, so dass zur Vermeidung unnötiger Wiederholungen darauf verwiesen wird.
Die erfindungsgemäße Verwendung, insbesondere die nachstehend ausführlich geschilderten bevorzugten Ausführungsformen, weisen eine Reihe von Vorteilen auf: Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung können wesentlich größere Mengen an RNA getrennt werden als dies mit dem aus dem Stand der Technik bekannten Techniken möglich ist. Durch die erfindungsgemäße Verwendung können diese höheren Mengen in hoher Reinheit erhalten werden. Die Abtrennung von degradierten Fragmenten oder von längeren Fragmenten oder von Fragmenten, die durch zu frühen Abbruch der Transkription entstanden sind, ist möglich. Ferner können weitere in RNA-Proben vorliegende Kontaminationen, wie Enzyme, z. B. RNase oder Polymerasen, und Nucleotiden gut abgetrennt werden. Die Gewinnung dieser größeren Mengen von RNA kann innerhalb von Minuten erfolgen, und zwar selbst aus hochgradig mit Verunreinigungen kontaminierten Proben. Die RNA-Gewinnung erfolgt zuverlässig, d. h. es besteht eine große Zuverlässigkeit, dass hochreine RNA gewonnen wird. Durch die erfindungsgemäße Verwendung kann eine hohe Auflösung erreicht werden. Die erfindungsgemäße Verwendung kann leicht automatisch betrieben werden. Sie eignet sich somit bestens, routinemäßig RNA in präparativem Maßstab zu reinigen. Die RNA ist bei den Bedingungen des HPLC-Trennverfahrens stabil, d. h. ein Abbau in RNA-Fragmente und somit die Entstehung von neuen Verunreinigungen bzw. Verminderung der Ausbeute an reiner RNA während der HPLC-Reinigung wird vermieden. Die erfindungsgemäße Verwendung kann in einfacher, schneller, kostengünstiger Weise, genau und mit sicheren Ergebnissen durchgeführt werden. Die Isolierung der RNA nach der HPLC-Trennung kann mit einem Fraktionssammler in einfacher Weise erfolgen, d. h. die Wiedergewinnung der RNA ist sehr einfach möglich, wobei eine direkte Weiterverarbeitung der RNA ebenfalls möglich ist. Die Detektion kann sehr sensitiv erfolgen.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren und ein Ausführungsbeispiel näher erläutert, ohne sie aber darauf einzuschränken.
In den Figuren zeigt
1 ein Chromatogramm einer Auftrennung von 10 μg Luciferase-mRNA (analytisch);
2 ein Chromatogramm einer Auftrennung von 1,5 mg Luciferase-mRNA (präperativ);
3 das Chromatogramm von 2, wobei die aufgefangenen Fraktionen grau unterlegt sind;
4 die Überprüfung der Reinheit der gesammelten mRNA-Fraktionen auf einem Agarose-Gel;
5 ein Chromatogramm einer Auftrennung von 200 μg eines 2 kb und eines 4 kb großen RNA-Fragments mit einer stationären Phase, die eine Proengröße von 1 000 Å aufweist;
6 ein Chromatogramm einer Auftrennung von 100 μg eines 2 kb und eines 4 kb großen RNA-Fragments mit einer stationären Phase, die eine Porengröße von 4 000 Å aufweist;
7 ein Chromatogramm einer Auftrennung von 250 μg eines 2 kb und eines 4 kb großen RNA-Fragments mit einer stationären Matrix, die eine Porengröße von 4 000 Å aufweist, und
8 ein Balkendiagramm, das die Verbesserung der Expression von Luciferase von mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigter RNA belegt.
9 stellt die Sequenz des Wildtyps der Luciferase dar, und zwar die mRNA-Sequenz, die für die Ausführungsbeispiele verwendet wurde.
Beispiel 1:

Aufreinigung von 1,5 mg Luciferase-mRNA mittels des erfindungsgemäßen HPLC-Verfahrens

Zur Trennung wurde Luciferase-mRNA eingesetzt, die eine Größe von 1825 Basenpaaren aufweist. Als stationäre Phase wurde eine poröse, nicht alkylierte Polystyrol/Divinylbenzol-Matrix (handelsübliches Produkt von Polymer Laboratories) benutzt. Es wies eine Partikelgröße von 8 μm und eine Porengröße von 4 000 Å auf. Die verwendete Säule war 5,0 cm lang und hatte einen Durchmesser von 7,5 mm Die Sampler-Temperatur betrug 12°C, die Temperatur für die HPLC-Trennung, insbesondere der Trennsäule, betrug 78°C, d. h. es wurde unter vollständig denaturierenden Bedingungen gearbeitet.
Die Trennung erfolgte über ein Gradientenprogramm:
Elutionsmittel A: 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7
Elutionsmittel B: 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7, mit 25 Vol.-% Acetonitril
Eluentenzusammensetzung:
Start: 62% A und 38% B (1. bis 3. Minute)
Erhöhung auf 58% B (1,67% Zunahme von B pro Minute), (3.–15. Minute)
100% B (15. bis 20. Minute)
Die Detektion erfolgte mit einem UV-Detektor bei 254 nm mit einer Referenz bei 600 nm. Die Fließgeschwindigkeit betrug 3 ml/min.
Um die Verunreinigungen der Luciferase-mRNA zu zeigen, wurde zu erst eine analytische Trennung durchgeführt, bei der nur 10 μg der Luciferase-mRNA auf die Säule aufgetragen wurden. Das Ergebnis dieser analytischen HPLC-Trennung ist in 1 dargestellt (der Gradient ist gestrichelt in das Chromatogramm eingezeichnet). Es ist deutlich zu sehen, dass neben der gewünschten mRNA von Luciferase (Retentionszeit 12,760 Minuten) noch Verunreinigungen vorliegen (Retentionszeiten von 12,398 Minuten und 13,227 Minuten), die den Peak der Luciferase-mRNA flankieren.
Ziel der Reinigung der Luciferase-mRNA in präparativem Maßstab ist es, diese unerwünschten Verunreinigungen zu entfernen.
In den 2 und 3 sind die entsprechenden Chromatogramme der Trennung der Luciferase-mRNA in präparativem Maßstab (1,5 mg) dargestellt, wobei das Gradientenprogramm in 2 gestrichelt eingezeichnet ist. Die aufgefangenen Fraktionen 1 bis 10 sind in den 2 und 3 grau unterlegt; gesammelt wurden die Fraktionen über einen Zeitraum von 1 Minute.
Von den aufgefangenen Fraktionen 2 bis 10 wurden jeweils 1 μg der Luciferase-mRNA auf ein Agarosegel aufgetragen und mit Hilfe von Ethidiumbromid sichtbar gemacht, um die Reinheit der mRNA-Fraktion zu bestimmen.
Das Ergebnis der Agarosegel-Trennung ist in 4 dargestellt (mit M wird ein Größenstandard bezeichnet). Die Fraktionen 5 bis 8 enthalten die gewünschte Luciferase-mRNA ohne unerwünschte Verunreinigungen.
Dieses Ausführungsbeispiel zeigt, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reinigung von mRNA in präparativem Maßstab mittels HPLC möglich ist.
Beispiel 2:

Auftrennung von 200 μg eines 2 kb und eines 4 kb großen RNA-Fragments mit einer stationären Phase, die eine Porengröße von 1 000 Å aufweist;

Zur Trennung wurden 200 μg eines 2 kb und 4 kb großen RNA-Fragments eingesetzt. Als stationäre Phase wurde eine poröse, nicht alkylierte Polystyrol/Divinylbenzol-Matrix (handelsübliches Produkt von Polymer Laboratories) benutzt. Es wies eine Partikelgröße von 8 μm und eine Porengröße von 1 000 Å auf. Die verwendete Säule war 2,5 cm lang und hatte einen Durchmesser von 4,6 mm Die Sampler-Temperatur betrug 12°C, die Temperatur für die HPLC-Trennung, insbesondere der Trennsäule, betrug 78°C, d. h. es wurde unter vollständig denaturierenden Bedingungen gearbeitet.
Die Trennung erfolgt über ein Gradientenprogramm
Eluent A: 0,1 M Triethylammoniumacetat
Eluent B: 0,1 M Triethylammoniumacetat/25% Acetonitril
Eluentenzusammensetzung:

• Startplateau: 62% A und 38% B (1.-3. min)
• Trennbereich I: Gradient 38%-49,5% B (5,75% Zunahme von B/min) (3.-5. min)
• Trennbereich II: Gradient 49,5%-57% B (0,83% Zunahme von B/min) (5.-14. min)
• Spülbereich: 100% B (15.-20. min)
Die Detektion erfolgte mit einem UV-Detektor bei 254 nm mit einer Referenz bei 600 nm. Die Fließgeschwindigkeit betrug 3 ml/min.

In 5 ist das entsprechenden Chromatogramme dieser Trennung in präparativem Maßstab (200 μg) dargestellt, wobei das Gradientenprogramm in 5 gestrichelt eingezeichnet ist. Die aufgefangenen Fraktionen sind in der 5 grau unterlegt; gesammelt wurden die Fraktionen über einen Zeitraum von 1 Minute.
Beispiel 3:

Auftrennung von 100 μg eines 2 kb und eines 4 kb großen RNA-Fragments mit einer stationären Phase, die eine Proengröße von 4 000 Å aufweist;

Zur Trennung wurden 100 μg eines 2 kb und 4 kb großen RNA-Fragments eingesetzt. Als stationäre Phase wurde eine poröse, nicht alkylierte Polystyrol/Divinylbenzol-Matrix (handelsübliches Produkt von Polymer Laboratories) benutzt. Es wies eine Partikelgröße von 8 μm und eine Porengröße von 4 000 Å auf. Die verwendete Säule war 2,5 cm lang und hatte einen Durchmesser von 4,6 mm Die Sampler-Temperatur betrug 12°C, die Temperatur für die HPLC-Trennung, insbesondere der Trennsäule, betrug 78°C, d. h. es wurde unter vollständig denaturierenden Bedingungen gearbeitet.
Die Trennung erfolgt über ein Gradientenprogramm
Eluent A: 0,1 M Triethylammoniumacetat
Eluent B: 0,1 M Triethylammoniumacetat/ 25% Acetonitril
Eluentenzusammensetzung:

Die Detektion erfolgte mit einem UV-Detektor bei 254 nm mit einer Referenz bei 600 nm. Die Fließgeschwindigkeit betrug 3 ml/min.
In 6 ist das entsprechenden Chromatogramme dieser Trennung in präparativem Maßstab (100 μg) dargestellt, wobei das Gradientenprogramm in 6 gestrichelt eingezeichnet ist. Die aufgefangenen Fraktionen sind in der 6 grau unterlegt.
Beispiel 4:

Auftrennung von 250 μg eines 2 kb und eines 4 kb großen RNA-Fragments mit einer stationären Phase, die eine Proengröße von 4 000 Å aufweist;

Zur Trennung wurden 250 μg eines 2 kb und 4 kb großen RNA-Fragments eingesetzt. Als stationäre Phase wurde eine poröse, nicht alkylierte Polystyrol/Divinylbenzol-Matrix (handelsübliches Produkt von Polymer Laboratories) benutzt. Es wies eine Partikelgröße von 8 μm und eine Porengröße von 4 000 Å auf. Die verwendete Säule war 2,5 cm lang und hatte einen Durchmesser von 4,6 mm Die Sampler-Temperatur betrug 12°C, die Temperatur für die HPLC-Trennung, insbesondere der Trennsäule, betrug 78°C, d. h. es wurde unter vollständig denaturierenden Bedingungen gearbeitet.
Die Trennung erfolgt über ein Gradientenprogramm
Eluent A: 0,1 M Triethylammoniumacetat
Eluent B: 0,1 M Triethylammoniumacetat/ 25% Acetonitril
Eluentenzusammensetzung:

Die Detektion erfolgte mit einem UV-Detektor bei 254 nm mit einer Referenz bei 600 nm. Die Fließgeschwindigkeit betrug 3 ml/min.
In 7 ist das entsprechenden Chromatogramme dieser Trennung in präparativem Maßstab (250 μg) dargestellt, wobei das Gradientenprogramm in 7 gestrichelt eingezeichnet ist. Die aufgefangenen Fraktionen sind in der 7 grau unterlegt.
Die Verbesserung der Expression von Luciferase durch die Aufreinigung mit dem erfindungegemäßen Verfahren ist in 8 dargestellt.

SEQ ID NO: Quelle

1 Figur 9

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Reinigung von RNA in präparativem Maßstab, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA mittels HPLC unter Verwendung einer porösen Umkehrphase als stationäre Phase gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA ausgewählt ist unter tRNA, rRNA, mRNA oder Gesamt-Zell-RNA, insbesondere auch RNA-Varianten, wie bspw. Aptamere oder Ribozyme.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA eine Größe bis etwa 15 000 Basenpaare aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA eine Größe bis zu 100 bis 10 000 Basenpaare aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die poröse Umkehrphase eine Partikelgröße von 8 μm bis 50 μm, insbesondere 8 bis 30 und stärker bevorzugt 8 bis 25 μm aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umkehrphase eine Porengröße von 1 000 Å bis 5 000 Å aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die poröse Umkehrphase eine Porengröße von 1 000 Å bis 4 000 Å aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die poröse Umkehrphase ein Polystyroldivinylbenzol ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die HPLC-Säule eine Länge von mehr als 5 cm, insbesondere bis 100, cm und einen Durchmesser von mehr als 4 mm, insbesondere zu 5 m, bevorzugt bis zu 1 m, stärker bevorzugt bis zu 100 cm aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die HPLC-Reinigung als Ionenpaarmethode durchgeführt wird, wobei der mobilen Phase ein Ion mit positiver Ladung als Gegenion zur negativ geladenen RNA zugegeben wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die HPLC-Reinigung zur Elution ein Gemisch aus einem wässrigen Lösungsmittel und einem organischen Lösungsmittel eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Lösungsmittel ein Puffer ist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer Triethylammoniumacetat, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Acetat-Puffer, Phosphat-Puffer, Tetrabutylammonium-bisulfat, Tetrabutylammoniumbromid und Tetrabutylammoniumchlorid. ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Triethylammoniumacetat-Puffer ein 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Acetonitril, Methanol oder ein Gemisch von diesen beiden ist.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Acetonitril ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die mobile Phase ein Gemisch von 0,1 M Triethylammoniumacetat und Acetonitril ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die mobile Phase 5,0 Vol.-% bis 25,0 Vol.-% organisches Lösungmittel, bezogen auf die mobile Phase, enthält und der Rest auf 100 Vol.-% das wässrige Lösungsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die mobile Phase 7,5 Vol.-% bis 17,5 Vol.-%, insbesondere 9,5 bis 14, 4 Vol.-%, organisches Lösungmittel, bezogen auf die mobile Phase, enthält und der Rest auf 100 Vol.-% das wässrige Lösungsmittel ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung isokratisch erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Gradiententrennung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei bei der Gradiententrennung der Anteil an organischem Lösungsmittel erhöht wird, insbesondere um mindestens 10%, stärker bevorzugt um mindestens 50% und am stärksten bevorzugt um mindestens 100%, ggf. um mindestens 200%, bezogen auf den initialen Vol.-% in der mobilen Phase, erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase im Verlauf der HPLC-Trennung von 3 bis 9, vorzugsweise 4 bis 7,5, insbesondere 5,0 Vol.-%, beträgt.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase im Verlauf der HPLC-Trennung von 3 bis 9, insbesondere 5,0 Vol.-%, auf bis zu 20,0 Vol.-%, jeweils bezogen auf die mobile Phase, erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase im Verlauf der HPLC-Trennung von 6,5 bis 8,5, insbesondere 7,5 Vol.-%, auf bis zu 17,5 Vol.-%, jeweils bezogen auf die mobile Phase, erhöht wird.
Verwendung einer porösen Umkehrphase in einem HPLC-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei die poröse Umkehrphase wie in einem der Ansprüche 5 bis 8 definiert ist.