EP1633868A1 - Verfahren zur gewinnung von plasmid-dna mittels eines wässrigen 2-phasensystems - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von plasmid-dna mittels eines wässrigen 2-phasensystems

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Publication number
EP1633868A1
EP1633868A1 EP04739434A EP04739434A EP1633868A1 EP 1633868 A1 EP1633868 A1 EP 1633868A1 EP 04739434 A EP04739434 A EP 04739434A EP 04739434 A EP04739434 A EP 04739434A EP 1633868 A1 EP1633868 A1 EP 1633868A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peg
plasmid dna
phase
biomass
salt component
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04739434A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Markus Müller
Jürgen HUBBUCH
Andreas Frerix
Maria-Regina Kula
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH, Qiagen GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP1633868A1 publication Critical patent/EP1633868A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the invention relates to a shortened and simplified method for isolating plasmid DNA from biomass, such as e.g. Bacteria, using an aqueous 2-phase system with a polymer and a salt component and the use of the plasmid DNA obtained in this way in gene therapy and in genetic vaccination.
  • biomass such as e.g. Bacteria
  • the invention further relates to a kit for carrying out the method.
  • One of the ways to isolate plasmid DNA from biomass is to lyse the biomass and then separate the clarified lysates of the biomass in an aqueous 2-phase system.
  • the Dutch microbiologist Beijerinck discovered as early as 1896 that after mixing agar and soluble starch in water, two aqueous phases develop after some time. This property of some polymers was rediscovered and followed up by Per Albertson around 1960. He recognized the potential of such a system for the purification of viruses, cells and also cell components. Due to the high water content of the biocompatible environment and the stabilizing properties of the phase components, such phase systems are particularly suitable for the purification of sensitive biomolecules.
  • Aqueous 2-phase systems are obtained either by adding two different polymers (polymer / polymer system; e.g. polyethylene glycol (PEG) and dextran) or by a polymer (e.g. polyethylene glycol) and a highly concentrated salt (e.g. citrates, sulfates, phosphates).
  • polymer / polymer system e.g. polyethylene glycol (PEG) and dextran
  • a polymer e.g. polyethylene glycol
  • a highly concentrated salt e.g. citrates, sulfates, phosphates.
  • Plasmid DNA obtained for therapeutic use are therefore alternative methods, such as centrifugation in cesium chloride (CsCI) density gradients or phenol extraction, due to the toxicity of the Substances inconceivable, as is the amount of toxic or flammable substances that can be used for industrial-scale production.
  • CsCI cesium chloride
  • the prior art also includes methods for isolating plasmid DNA in which aqueous 2-phase systems with a salt and a polymer component are used.
  • Cole (Biotechniques. 1991 Jul; 11 (1): 18, 20, 22-24) published an aqueous 2-phase system for the isolation of plasmids using PEG as a polymer component and e.g. Ammonium sulfate or sodium dihydrogen phosphate as a salt component.
  • the isolation of the plasmid pTZ 18U from E. coli DH5 ⁇ is specifically described.
  • the corresponding cell pellet was disrupted using a lysis buffer containing SDS and NaOH.
  • the lysate was placed in an appropriate phase-forming system, the mixture was mixed and then centrifuged. This was repeated twice with the lower phase and a fresh upper phase containing no lysate.
  • the lower phase was then dialyzed against a Tris / EDTA buffer and the plasmid was finally isolated.
  • the clarified lysate was used in the above-mentioned aqueous 2-phase system.
  • this method has the disadvantages that it is very expensive in terms of equipment and time.
  • the time involved is due to the fact that in this system the biomass is first lysed in a separate batch and therefore more than one reaction vessel is necessary for such a method.
  • the present invention is intended to overcome the disadvantages of the methods known from the prior art, in particular the purpose of the invention is to simplify and shorten the time required from the prior art known method for isolating plasmid DNA from biomass.
  • the object of the present invention is to provide a method which can be carried out not only on a laboratory scale but also on an industrial scale and which can be used, for example, to produce plasmid DNA for clinical use in gene therapy or genetic vaccination .
  • Another object of the present invention is to provide a method that can be easily automated.
  • the object is achieved according to the invention by a method for isolating plasmid DNA from biomass by means of an aqueous 2-phase system with a
  • Neutralization of the alkaline lysis mixture and separation of the plasmid DNA from the contaminants is carried out in a single reaction vessel (one-pot method).
  • This is made possible according to the invention in that the neutralization of the alkaline lysis batch takes place in one and the same container by adding potassium phosphate and thus a component of the aqueous 2-phase system is already present, and in that the second component of the aqueous 2-phase system is a PEG with a molecular weight from a calculated average of about 600 g / mol to 1000 g / mol, but is preferably formed from a mixture of PEG 600 and PEG 1000.
  • the method according to the invention comprises the following steps:
  • the method according to the invention advantageously represents an automatable method for isolating plasmid DNA.
  • automatability of such methods can only be achieved with difficulty with the known 2-phase systems.
  • Such automation can only be easily achieved with the method according to the invention.
  • the claimed process for the production of plasmid DNA on an industrial scale can also be used advantageously. This is due to the simplicity, the low expenditure on equipment and the use of non-toxic and inexpensive components.
  • One of the features of this method that is essential to the invention is that the resuspension of the biomass used, the alkaline lysis of the biomass, the neutralization of the lysis batch and the separation of the plasmid DNA from the contaminants in an aqueous 2-phase system in succession in a single container, i.e. as one -Pot process, take place without there being an intermediate centrifugation step with subsequent separation of a precipitate.
  • the method according to the invention is greatly simplified in this way, is significantly less complex in terms of apparatus and is greatly shortened in time compared to the methods known from the prior art.
  • the method according to the invention uses a 2-phase system consisting of a polymer and a salt component. This has the advantage that the salts used are relatively inexpensive compared to a second polymer component (e.g. dextran) in a 2-phase system with two different polymer components.
  • a second polymer component e.g. dextran
  • plasmid DNA includes not only plasmids but also cosmids and phasmids, but also eukaryotic vectors, such as, for example, yeast vectors such as yeast artificial chromosomes (YAC's) and similar structures.
  • yeast vectors such as yeast artificial chromosomes (YAC's) and similar structures.
  • biomass includes all Life forms that are able to carry and multiply this plasmid DNA or pass it on to their descendants, such as bacteria, yeast, etc.
  • the biomass which carries the plasmid DNA is obtained by centrifuging an appropriate incubation batch or by any other suitable method for concentrating the biomass. Such methods and their implementation are familiar to the person skilled in the art.
  • the resuspension of the biomass, e.g. of the bacterial pellet and the alkaline lysis of the biomass then also take place in a manner known to those skilled in the art, e.g. by means of the commercially available QIAGEN plasmid kits and the resuspension buffers P1 contained therein and lysis buffer P2 (QIAGEN, Hilden, Germany) or other suitable buffers, in a container which appears suitable to the person skilled in the art. Up to this point, the usual procedure is usually followed.
  • the lysis buffer preferably contains sodium dodecyl sulfate (SDS) as one of the components.
  • the lysis of the biomass and the lysate with and after addition of the salt component can also be carried out with movement of the lysis batch or lysate, such as vigorous shaking and / or stirring or the like.
  • the methods known from the prior art have the disadvantage that the fragments of gDNA which inevitably result from shearing in such a treatment of the lysis batch or lysate cannot be separated to a satisfactory extent from the plasmid DNA to be isolated. Such treatment of the lysis batch or lysate is therefore usually avoided by the person skilled in the art.
  • the fragments of gDNA thus formed are also separated from the plasmid DNA.
  • > 90% of the gDNA sheared by movement of the lysis batch or lysate is removed from the plasmid DNA, particularly preferably> 95% and very particularly preferably, after the lysis of the biomass in comparison to the usual potassium acetate precipitation > 99%.
  • the alkaline lysis batch is advantageously neutralized with the salt component according to the invention.
  • the salt component in the sense of the invention is potassium phosphate, according to the invention meaning tripotassium phosphate (K 3 PO 4 ), dipotassium hydrogen phosphate (K 2 HPO) and / or potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ).
  • the alkaline lysis batch is preferably mixed exclusively with one of these or a mixture of these potassium phosphates.
  • K 2 HPO 4 and / or KH 2 PO 4 is particularly preferably used.
  • the method according to the invention also enables the precipitation of proteins in the form of potassium dodecyl sulfate (KDS) -protein complexes from the lysis batch.
  • the salt component is used in such a way that a 2-phase system is formed in conjunction with one of the polymer component compositions and concentrations according to the invention, but the concentration of the salt component at which the plasmid DNA from the lower phase ( Salt phase), in which it is at lower concentrations, changes to the upper phase (polymer phase), is not exceeded and contaminants such as RNA and gDNA remain in the upper phase or in the interphase.
  • concentration of the salt component at which the plasmid DNA from the lower phase ( Salt phase), in which it is at lower concentrations, changes to the upper phase (polymer phase) is not exceeded and contaminants such as RNA and gDNA remain in the upper phase or in the interphase.
  • 2-phase systems only occur when limit concentrations are exceeded. The course of such limit concentrations can be shown in a phase diagram. This is easy for the person skilled in the art to do.
  • the depletion of the contaminant RNA is> 80% from the plasmid DNA compared to the commonly used potassium acetate precipitation after the lysis of the biomass, the depletion of the contaminant RNA is> 85% and the depletion of the contaminant RNA> 90% is very particularly preferred.
  • the potassium phosphate is preferably supplied in the form of a buffer.
  • the buffer particularly preferably contains a mixture of K 2 HPO 4 and KH 2 PO.
  • the buffers according to the invention are used with a pH in the range from pH 5.8 to pH 8.5 and preferably with a pH in the range from pH 6.5 to pH 8.
  • a composition of 3.83 MK 2 HPO 4 and 2.45 M KH 2 PO 4 (a pH of approximately 7 results) can be used particularly preferably in the process according to the invention.
  • K 2 HPO 4 and KH 2 P0 4 are used in a total concentration of 5 - 30% (w / w), preferably in a total concentration of 10 - 25% (w / w) and particularly preferably in a total concentration of 20% (w / w).
  • the potassium phosphate is usually added in a temperature range between ice-cooled and room temperature. Room temperature in the sense of the present invention denotes a temperature range from 18 to 25 ° C.
  • An ice-cooled phosphate buffer is preferably used in the process according to the invention.
  • a long incubation time is advantageously not necessary after the addition of the potassium phosphate; the decisive factor is thorough and even mixing of the solution after the addition.
  • the incubation period is usually about 5 to 15 minutes.
  • the batch is preferably agitated during and / or after the addition of the salt component, for example shaken vigorously, stirred or the like.
  • the polymer component in the sense of the invention is PEG.
  • Another essential feature of the method according to the invention is that polyethylene glycol with a molecular weight of on average 600 to 1000 g / mol, preferably of on average 700 - 900 g / mol and particularly preferably of on average 750 - 880 g / mol, is used as one of the two components of the 2-phase system.
  • the PEG used in the present invention preferably consists of a mixture of polyethylene glycol with an average molecular weight of 600 g / mol (PEG 600) and polyethylene glycol with an average molecular weight of 1000 g / mol (PEG 1000). Both PEG are commercially available (e.g. Fluka, Buchs, Switzerland).
  • the ready-to-use PEG mixture consists of 30 - 50% (w / w) PEG 600 and 50 - 70% (w / w) PEG 1000, preferably 33 - 45% (w / w) PEG 600 and 55 - 67% ( w / w) PEG 1000, particularly preferably from 36 - 40% (w / w) PEG 600 and 60 - 64% (w / w) PEG 1000 and very particularly preferably from 38% (w / w) PEG 600 and 62% (w / w) PEG 1000.
  • the concentration of the PEG in the aqueous 2-phase system according to the invention is chosen so that two phases form with the salt component, but the PEG concentration at which the plasmid DNA from the lower phase in which they are located at lower concentrations , switch to the upper phase, is not exceeded.
  • the PEG content is preferably at least 10% (w / w) and is capped by the concentration of PEG at which the plasmid DNA changes from the lower phase, in which they are at lower concentrations, to the upper phase.
  • the solution should preferably have a temperature of 10 to 50 ° C, particularly preferably a temperature of 15 to 40 ° C.
  • the plasmid DNA is found in the saline lower phase.
  • the formation of the phases can optionally be accelerated by centrifugation of the mixture, which advantageously leads to a further reduction in the time of the method according to the invention.
  • the conditions under which such a centrifugation step is carried out are familiar to the person skilled in the art.
  • Aqueous 2-phase systems have the advantage over phase systems that operate on the basis of matrices or other solid phases that they have a much higher capacity for the plasmid DNA to be purified, which is practically only limited by the solubility in the phases. Furthermore, the process can be dimensioned almost arbitrarily due to extremely simple apparatus. However, it is only with the simplifications claimed here that both automation and, independently of this, production on an industrial scale, for example for the production of more than 2 g of plasmid DNA per lysis batch, can easily be achieved. Likewise, with the present invention, the plasmid DNA can very advantageously be derived from proteins, RNA and gDNA are exempt.
  • plasmid DNA which is isolated by the process according to the invention can be used without problems in gene therapy or genetic vaccination.
  • large amounts of high-purity plasmid DNA can advantageously be produced with very little outlay on equipment, using non-toxic substances and, in the event of a comparatively low cost.
  • the substances used in the 2-phase system according to the invention for example in comparison to other isolation methods, such as CsCI density gradient centrifugation or phenol extraction, are harmless and can be completely and easily removed from the purified plasmid DNA.
  • ocDNA open circular plasmid DNA
  • the plasmid DNA isolated using the method according to the invention has a smaller proportion of the contaminant ocDNA compared to plasmid DNA which was isolated using methods known from the prior art, compared to the preferred supercoiled form (scDNA).
  • This method thus shows a selectivity for the separation of plasmid topoisomers, that is to say of ocDNA and scDNA.
  • the lower phase containing the plasmid DNA is separated in step d) from the upper phase containing the contaminants.
  • the lower phase is formed by the addition of the salt component in such a way that a concentration of the salt component results in step c), and then by the addition of the polymer component in step d) to form a 2-phase system aligned.
  • this is after the addition of the polymer component Mix the mixture again and wait for the phase formation.
  • the plasmid DNA is also found in the lower phase.
  • This step can optionally be carried out once or in a number that appears reasonable to the person skilled in the art. Carrying out this optional step leads to repeated purification of the plasmid DNA and thus to a further depletion of contaminants, such as RNA, from the plasmid DNA.
  • the additional cleaning step (s) comprise the following steps:
  • step c) addition of the salt component in such a way that a concentration of the salt component results in step c)
  • the plasmid DNA must still be obtained from the lower phase which arises in step d).
  • the plasmid DNA is usually isolated and desalted from the lower phase formed in step d) by ultrafiltration / diafiltration.
  • any other method for isolating and / or desalting the plasmid DNA from the lower phase that appears useful to the person skilled in the art can also be used.
  • a clarified lysate which contains the plasmid DNA to be isolated, can also be used as the starting material in the method according to the invention instead of the biomass.
  • the lysis step is naturally omitted or, after the lysis step, the lysate is additionally clarified. All methods which appear suitable to the person skilled in the art can be used to produce a clarified lysate.
  • a common method in the prior art is to clarify the Lysate by precipitation with potassium acetate and subsequent centrifugation of the mixture to separate the resulting precipitate.
  • the clarified lysate is first mixed with potassium phosphate according to the information given above and then mixed with PEG according to the invention.
  • Figure 1 shows the results of the isolation of pCMVß from E.coli DH5 ⁇ by the method according to the invention (see Example 1) in the form of a gel electrophoresis (0.8% agarose).
  • a length standard can be seen in lane 1, lane 2 shows the untreated upper phase, in which there is massive RNA. Plasmid DNA could not be detected in the upper phase.
  • Lane 3 shows the untreated lower phase, in which the plasmid is highly enriched (large unsharp band), RNA could not be detected here.
  • Lane 4 shows the lower phase after desalination using ultrafiltration.
  • plasmid DNA can be detected, for the most part the plasmid is in the desired supercoiled form (scDNA), traces of open circular plasmid DNA (ocDNA) could also be detected.
  • Lane 5 shows a pCMVß standard (18 ug / ml) and lane 6 shows a gDNA standard (23 ug / ml).
  • Example 1 Obtaining pCMVß from E.coli DH5
  • K 2 HP0 4 / KH 2 P0 4 buffer 2.5 g KH 2 P0 4 , 5 g K 2 HP0, 7.5 ml H 2 0; pH 7; ice-cooled
  • the entire batch was then warmed to room temperature, PEG (2.137 g PEG 600, 3.488 g PEG 1000, 1.875 ml H 2 O) was added and mixed gently. The phase separation lasted a few minutes.
  • Example 2 Obtaining pCMVß from E.coli DH5 (20% PEG: 12% Phosphate)
  • a 10% (w / w) biomass suspension (E.coli DH5 ⁇ ) in resuspension buffer P1 (QIAGEN, Hilden, Germany) was prepared by shaking vigorously at room temperature. After complete resuspension, 10 g of this batch were mixed with 10 ml of lysis buffer P2 (QIAGEN, Hilden, Germany; room temperature) and inverted several times. After 5 min, the entire batch was treated with ⁇ HPO K ⁇ PO ⁇ buffer (2 g KH 2 PO 4 ; 4 g K 2 HP0 4 ; 6 ml H 2 0; pH 7.4; ice-cooled), and opened for 10 min one Incubated overhead shaker at room temperature.
  • a 10% (w / w) biomass suspension (E.coli DH5 ⁇ ) in resuspension buffer P1 (QIAGEN, Hilden, Germany) was prepared by shaking vigorously at room temperature. After more complete Resuspension, 10 g of this batch was mixed with 10 ml of lysis buffer P2 (QIAGEN, Hilden, Germany; room temperature) and inverted several times. After 5 min, the entire batch was mixed with K 2 HP0 KH 2 P0 4 buffer (2.666 g KH 2 P0 4 ; 5.333 g K 2 HP0 4 ; 8 ml H 0; pH 7.4; ice-cooled) and 10 min on a Incubated overhead shaker at room temperature.
  • K 2 HP0 KH 2 P0 4 buffer 2.666 g KH 2 P0 4 ; 5.333 g K 2 HP0 4 ; 8 ml H 0; pH 7.4; ice-cooled
  • Example 4 Obtaining pCMVß from E.coli DH5 (30% PEG. 10% Phosphate)
  • a 10% (w / w) biomass suspension (E.coli DH5 ⁇ ) in resuspension buffer P1 (QIAGEN, Hilden, Germany) was prepared by shaking vigorously at room temperature. After complete resuspension, 10 g of this batch were mixed with 10 ml of lysis buffer P2 (QIAGEN, Hilden, Germany; room temperature) and inverted several times.
  • K 2 HP0 4 / KH 2 P0 4 buffer (1.666 g KH 2 P0 4 ; 3.333 g K 2 HP0 4 ; 5 ml H 2 0; pH 7.4; ice-cooled) and incubated for 10 min on an overhead shaker at room temperature.
  • the entire batch was subsequently warmed to room temperature, PEG (5.7 g PEG 600; 9.3 g PEG 1000; 5 ml H 2 O) was added and the temperature was controlled in a water bath at 40 ° C. for 15 min and with repeated inverting.
  • the phase separation was accelerated by centrifugation for 5 min at 1300 xg.
  • the resulting lower phase had a volume of approximately 11 ml.
  • the biomass used contained 710 ⁇ g plasmid DNA per g biomass and 11 mg RNA per g biomass in the clarified lysate. Based on the initial values of the biomass in the clarified lysate, the 2-phase system results in 96% plasmid yield and 83% RNA depletion.
  • a 20% biomass suspension was prepared by weighing in 4 g of resuspension buffer P1 (QIAGEN, Hilden, Germany) and 1 g of biomass (E.coli DH5 ⁇ , not containing a plasmid). This was digested on ice using ultrasound (Branson Sonifier 250, with converter type 102, settings: Cylce 40%; intensity 4, 2 times 3 min). The gDNA was thereby released from the cell and severely sheared or fragmented. The mixture was then centrifuged at 5000 ⁇ g and 4 ° C. for 10 min. 300 ⁇ g of the supernatant were mixed with 300 ⁇ l of lysis buffer P2 (QIAGEN, Hilden, Germany; room temperature) and mixed.
  • lysis buffer P2 QIAGEN, Hilden, Germany; room temperature
  • K 2 HP0 4 / KH 2 P0 4 buffer 100 ⁇ g KH 2 P0 4 ; 200 ⁇ g K 2 HP0 4 ; 300 ⁇ l H 2 0; pH 7.4; ice-cooled
  • PEG 85.5 ⁇ g PEG 600; 139.5 ⁇ g PEG 1000; 75 ⁇ l H20
  • the phase separation was accelerated by centrifugation for 5 min at 1300 xg.
  • the lower phase had a volume of approximately 0.75 ml.
  • the analysis was carried out by means of HPLC (HP1090, Agilent, Waldbronn, Germany) and Source 15PHE 4.6 / 100 (Amersham Bioscience, Freiburg, Germany) using an (NH 4 ) S0 gradient. The detection was carried out by absorption measurement at 260 nm. The gDNA concentration in the digestion supernatant (centrifugation after ultrasound treatment) was determined to be 433 ⁇ g gDNA / ml. In the lower phase of the 2-phase system, a residual concentration of 1.7 ⁇ g gDNA / ml was determined by HPLC, which corresponds to a depletion of> 99% of strongly sheared gDNA.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Biomasse mittels eines wässrigen 2-Phasensystems mit einer Polymer- und einer Salz-Komponente, dadurch gekennzeichnet, dass die Resuspension der eingesetzten Biomasse, die alkalische Lyse der Biomasse, die Neutralisation des alkalischen Lyseansatzes und die Trennung der Plasmid-DNA von den Kontaminanten (wie z.B. Zelltrümmer, RNA, gDNA) in einem einzigen Reaktionsgefäß (Ein-Topf-Verfahren) durchgeführt wird. Dies wird erfindungsgemäss dadurch ermöglicht, dass die 10 Neutralisation des alkalischen Lyseansatzes in ein und demselben Behältnis durch Zugabe von Kaliumphosphat erfolgt und damit bereits eine Komponente des wässrigen 2-Phasensystems vorhanden ist, und dass die zweite Komponente des wässrigen 2-Phasensystems ein PEG mit einem Molekulargewicht von im rechnerischen Mittel etwa 600 g/mol bis 1000 g/mol ist, vorzugsweise aber von einem Gemisch aus PEG 600 und PEG 1000 gebildet wird.

Description

Verfahren zur Gewinnung von Plasmid-DNA mittels eines wässrigen 2- Phasensystems.
Die Erfindung betrifft ein zeitlich verkürztes und vereinfachtes Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Biomasse, wie z.B. Bakterien, mittels eines wässrigen 2-Phasensystems mit einer Polymer- und einer Salz-Komponente sowie die Verwendung der so gewonnenen Plasmid-DNA in der Gentherapie und in der genetischen Vakzinierung. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Kit zur Durchführung des Verfahrens.
Eine der Möglichkeiten, Plasmid-DNA aus Biomasse zu isolieren, ist die Lyse der Biomasse und die sich anschließende Trennung der geklärten Lysate der Biomasse in einem wässrigen 2-Phasensystem. Der niederländische Mikrobiologe Beijerinck entdeckte bereits 1896, dass sich nach dem Vermischen von Agar und löslicher Stärke in Wasser nach einiger Zeit zwei wässrige Phasen ausbilden. Diese Eigenschaft einiger Polymere wurde von Per Albertson um 1960 wiederentdeckt und weiterverfolgt. Er erkannte das Potential eines solchen Systems zur Aufreinigung von Viren, Zellen und auch Zellbestandteilen. Aufgrund des hohen Wasseranteils des biokompatiblen Milieus sowie der stabilisierenden Eigenschaften der Phasenkomponenten eignen sich solche Phasensysteme entsprechend besonders zur Aufreinigung von sensiblen Biomolekülen. Wässrige 2-Phasensysteme werden entweder durch Zugabe zweier unterschiedlicher Polymere (Polymer/Polymer- System; z.B. Polyethylenglykol (PEG) und Dextran) erhalten oder durch ein Polymer (z.B. Polyethylenglykol) und ein hochkonzentriertes Salz (z.B. Citrate, Sulfate, Phosphate).
Die weitverbreiteten Techniken zur Herstellung rekombinanter DNA sowie das immer weiter steigende Interesse an der Gentherapie zur Behandlung unterschiedlichster Krankheiten und genetischer Vakzinierung hat den Bedarf an einem Verfahren zur Aufreinigung von Plasmid-DNA, welches auch im industriellen Maßstab genutzt werden kann, steigen lassen. Für einen therapeutischen Einsatz gewonnene Plasmid-DNA sind daher alternative Methoden, wie Zentrifugation im Cäsiumchlorid (CsCI)-Dichtegradienten oder Phenolextraktion, aufgrund der Toxizität der Substanzen nicht vorstellbar, ebenso wie die für eine Produktion im industriellen Maßstab einzusetzende Menge der toxischen oder brennbaren Substanzen.
Im Stand der Technik finden sich auch Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA in denen wässrige 2-Phasensysteme mit einer Salz- und einer Polymer-Komponente verwendet werden. Cole (Biotechniques. 1991 Jul;11 (1 ):18, 20, 22-24) veröffentlichte ein wässriges 2-Phasensystem zur Isolierung von Plasmiden unter Verwendung von PEG als Polymer-Komponente und z.B. Ammoniumsulfat oder Natriumdihydrogenphosphat als Salz-Komponente. Konkret beschrieben ist die Isolierung des Plasmids pTZ 18U aus E.coli DH5α. Das entsprechende Zellpellet wurde mittels einem Lyse-Puffer beinhaltend SDS und NaOH aufgeschlossen. Das Lysat wurde in ein entsprechendes Phasen-bildendes System gegeben, das Gemisch wurde gemixt und anschließend zentrifugiert. Dieses wurde noch zweimal mit der Unterphase und einer frischen, kein Lysat enthaltenden Oberphase wiederholt. Anschließend wurde die Unterphase gegen einen Tris/EDTA-Puffer dialysiert und so das Plasmid schließlich isoliert.
Weiterhin beschreiben Ribeiro et al. (Biotechnol Bioeng. 2002 May 20;78(4):376-84) ein wässriges 2-Phasensystem mit PEG als Polymer-Komponente und Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO ) als Salz-Komponente. Berichtet wird die Isolierung des Plasmids pCF1-CFTR aus E.coli DH5α. Hierzu wurden die Zellen zunächst mittels alkalischer Lyse aufgeschlossen (Lyse-Puffer enthaltend NaOH und SDS) und das Lysat anschließend mit 3 M Natriumacetat neutralisiert. Nachfolgend wurden Zelltrümmer, Proteine und genomische DNA (gDNA) durch Zentrifugation des Ansatzes entfernt. Das geklärte Lysat wurde in dem oben erwähnten wässrigen 2-Phasensystem eingesetzt. Dieses Verfahren weist jedoch die Nachteile auf, dass es apparativ und zeitlich sehr aufwendig ist. Der zeitliche Aufwand liegt nicht zuletzt darin begründet, dass in diesem System zunächst eine Lyse der Biomasse in einem getrennten Ansatz durchgeführt wird und damit für ein solches Verfahren mehr als ein Reaktionsgefäß notwendig ist.
Die vorliegende Erfindung soll die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren überwinden, insbesondere bezweckt die Erfindung die Vereinfachung und die zeitliche Verkürzung der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Biomasse. Daneben stellt sich der vorliegenden Erfindung die Aufgabe, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das nicht nur im Labormaßstab, sondern auch im industriellen Maßstab durchführbar ist und mit dem z.B. Plasmid-DNA für den klinischen Einsatz in der Gentherapie oder der genetischen Vakzinierung hergestellt werden kann. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das leicht automatisierbar ist.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Biomasse mittels eines wässrigen 2-Phasensystems mit einer
Polymer- und einer Salz-Komponente, dadurch gekennzeichnet, dass die
Resuspension der eingesetzten Biomasse, die alkalische Lyse der Biomasse, die
Neutralisation des alkalischen Lyseansatzes und die Trennung der Plasmid-DNA von den Kontaminanten (wie z.B. Zelltrümmer, RNA, gDNA) in einem einzigen Reaktionsgefäß (Ein-Topf-Verfahren) durchgeführt wird. Dies wird erfindungsgemäß dadurch ermöglicht, dass die Neutralisation des alkalischen Lyseansatzes in ein und demselben Behältnis durch Zugabe von Kaliumphosphat erfolgt und damit bereits eine Komponente des wässrigen 2-Phasensystems vorhanden ist, und dass die zweite Komponente des wässrigen 2-Phasensystems ein PEG mit einem Molekulargewicht von im rechnerischen Mittel etwa 600 g/mol bis 1000 g/mol ist, vorzugsweise aber von einem Gemisch aus PEG 600 und PEG 1000 gebildet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
a) Resuspension der Biomasse,
b) Zugabe von Lyse-Puffer, Inkubation für einen zur Lyse der Biomasse ausreichend langen Zeitraum,
c) Zugabe der Salz-Komponente, Inkubation für einen ausreichend langen Zeitraum,
d) Zugabe der Polymer-Komponente, durchmischen der Lösung, Phasenausbildung abwarten. Vorteilhafterweise stellt das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund der Einfachheit durch das Ein-Topf-Verfahren ein automatisierbares Verfahrens zur Isolierung von Plasmid-DNA dar. Es besteht ein immer weiter steigender Bedarf an der Automatisierbarkeit solcher Verfahren im kleineren Maßstab, z.B. zur schnellen Identifizierung von Klonen. Eine solche Automatisierbarkeit ist jedoch mit den bekannten 2-Phasensystemen nur schwer realisierbar. Erst mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine solche Automatisierung leicht erreicht werden.
Ebenso vorteilhaft kann das beanspruchte Verfahren zur Produktion von Plasmid- DNA im industriellen Maßstab eingesetzt werden. Dies liegt in der Einfachheit, dem geringen apparativen Aufwand und der Verwendung nicht-toxischer sowie kostengünstiger Komponenten begründet.
Eines der erfindungswesentlichen Merkmale dieses Verfahrens ist, dass die Resuspension der eingesetzten Biomasse, die alkalische Lyse der Biomasse, die Neutralisation des Lyseansatzes und die Trennung der Plasmid-DNA von den Kontaminanten in einem wässrigen 2-Phasensystem nacheinander in einem einzigen Behältnis, also als Ein-Topf-Verfahren, stattfinden, ohne dass es einen zwischenzeitlichen Zentrifugationsschritt mit anschließender Abtrennung eines Präzipitats gibt. Das erfindungsgemäße Verfahren wird hierüber stark vereinfacht, ist apparativ signifikant weniger aufwendig und ist zeitlich stark verkürzt im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren bedient sich eines 2-Phasensystems aus einer Polymer- und einer Salz-Komponente. Dies hat den Vorteil, dass die verwendeten Salze im Vergleich zu einer zweiten Polymer-Komponente (z.B. Dextran) bei einem 2-Phasensystem mit zwei unterschiedlichen Polymer-Komponenten relativ kostengünstig sind.
Im Falle der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff 'Plasmid-DNA' neben Plasmiden auch Cosmide sowie Phasmide, aber auch eukaryotische Vektoren, wie z.B. Hefe-Vektoren wie etwa yeast artificial chromosomes (YAC's) und ähnliche Strukturen. Der Begriff 'Biomasse' umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung alle Lebensformen, die fähig sind, diese Plasmid-DNA zu tragen und zu vermehren bzw. auf ihre Nachfahren weiterzugeben, wie z.B. Bakterien, Hefen, etc.
Die Gewinnung der Biomasse, welche die Plasmid-DNA trägt, erfolgt dabei durch Zentrifugation eines entsprechenden Inkubationsansatzes oder jedwede andere geeignete Methode zur Aufkonzentrierung der Biomasse. Solche Methoden so wie deren Durchführung sind dem Fachmann geläufig. Die Resuspension der Biomasse, z.B. des Bakterienpellets, sowie die alkalische Lyse der Biomasse laufen anschließend ebenfalls in für den Fachmann bekannter Art und Weise ab, z.B. mittels der kommerziell erhältlichen QIAGEN Plasmid Kits und der darin enthaltenden Resuspensions-Puffer P1 sowie Lyse-Puffer P2 (QIAGEN, Hilden, Deutschland) oder sonstiger geeigneter Puffer, in einem dem Fachmann als geeignet erscheinenden Behälter. Üblicherweise wird bis zu diesem Punkt entsprechend der jeweiligen bekannten Vorschriften vorgegangen. Vorzugsweise enthält der Lyse- Puffer als eine der Komponenten Natriumdodecylsulfat (SDS).
Vorteilhafter- und überraschenderweise kann die Lyse der Biomasse sowie das Lysat bei und nach Zugabe der Salz-Komponente ferner auch unter Bewegung des Lyseansatzes bzw. Lysats, wie starkem Schütteln und/oder Rühren oder ähnlichem, durchgeführt werden. Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weisen den Nachteil auf, dass die bei einer solchen Behandlung des Lyseansatzes bzw. Lysats zwangsläufig durch Scherung entstehenden Fragmente von gDNA nicht in befriedigendem Maße von der zu isolierenden Plasmid-DNA getrennt werden können. Daher wird eine solche Behandlung des Lyseansatzes bzw. Lysats vom Fachmann für gewöhnlich vermieden. In dem erfindungsgemäßen wässrigen 2- Phasensystem werden jedoch auch die so entstehenden Fragmente von gDNA von der Plasmid-DNA abgetrennt. Damit ergibt sich zum einen eine geringere Anfälligkeit des Systems gegenüber Verunreinigungen der Plasmid-DNA durch gDNA, des weiteren erhöht Bewegung des Lyseansatzes, wie z.B. starkes Rühren, Schütteln oder ähnliches, zusätzlich vorteilhafterweise die Freisetzung der Plasmid-DNA aus der Biomasse und die Bewegung des Lysats, wie z.B. starkes Rühren, Schütteln oder ähnliches, bei und/oder nach Zugabe der erfindungsgemäßen Salz- Komponente erhöht zusätzlich vorteilhafterweise die Freisetzung der Plasmid-DNA aus den sich bildenden Präzipitatagglomeraten, was zu einer deutlichen Erhöhung der Ausbeute an Plasmid-DNA führt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die durch Bewegung des Lyseansatzes bzw. Lysats gescherte gDNA im Vergleich zur sonst üblichen Kaliumacetat-Fällung nach der Lyse der Biomasse zu >90% aus der Plasmid-DNA entfernt, besonders bevorzugt zu >95% und ganz besonders bevorzugt zu >99%.
Zur Neutralisation des Ansatzes der alkalischen Lyse und zur Fällung der Proteine wird nicht auf die für den Fachmann üblichen Substanzen, wie z.B. Kaliumacetat, zurückgegriffen. Erfindungsgemäß wird der alkalische Lyseansatz vorteilhafterweise mit der erfindungsgemäßen Salz-Komponente neutralisiert. Die Salz-Komponente im Sinne der Erfindung ist Kaliumphosphat, worunter erfindungsgemäß Trikaliumphosphat (K3PO4), Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO ) und/oder Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) verstanden werden. Vorzugsweise wird der alkalische Lyseansatz ausschließlich mit einem dieser oder einer Mischung dieser Kaliumphosphate versetzt. Besonders bevorzugt wird K2HPO4 und/oder KH2PO4 verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht bei Verwendung von SDS im Lyse-Puffer ferner die Fällung von Proteinen in Form von Kaliumdodecylsulfat (KDS)-Protein-Komplexen aus dem Lyseansatz.
Erfindungsgemäß wird die Salz-Komponente so eingesetzt, dass sich in Verbindung mit einer der erfindungsgemäßen Polymer-Komponenten-Zusammensetzungen und -Konzentrationen ein 2-Phasensystem ausbildet, wobei jedoch die Konzentration der Salz-Komponente, bei der die Plasmid-DNA aus der Unterphase (Salzphase), in der sie sich bei niedrigeren Konzentrationen befindet, in die Oberphase (Polymer-Phase) wechselt, nicht überschritten wird und Kontaminanten wie RNA und gDNA in der Oberphase bzw. in der Interphase verbleiben. Es ist wohlbekannt, dass 2- Phasensysteme erst bei Überschreiten von Grenzkonzentrationen auftreten. Der Verlauf solcher Grenzkonzentrationen kann in einem Phasendiagramm dargestellt werden. Dies ist für den Fachmann leicht zu bewerkstelligen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Abreicherung der Kontaminante RNA >80% aus der Plasmid-DNA im Vergleich zur üblicherweise verwendeten Kaliumacetat-Fällung nach der Lyse der Biomasse, besonders bevorzugt ist die Abreicherung der Kontaminante RNA >85% und ganz besonders bevorzugt ist die Abreicherung der Kontaminante RNA >90%.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird das Kaliumphosphat vorzugsweise in Form eines Puffers zugeführt. Dabei enthält der Puffer besonders bevorzugt ein Gemisch aus K2HPO4 und KH2PO . Die erfindungsgemäßen Puffer werden mit einem pH-Wert im Bereich von pH 5,8 bis pH 8,5 und bevorzugt mit einem pH Wert im Bereich von pH 6,5 bis pH 8 eingesetzt. Beispielsweise ist eine Zusammensetzung 3,83 M K2HPO4 und 2,45 M KH2PO4 (es ergibt sich ein pH-Wert von ca. 7) im erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt anwendbar. Dabei werden K2HPO4 und KH2P04 bezogen auf das 2-Phasensystem in einer Gesamt- Konzentration von 5 - 30 %(w/w) eingesetzt, vorzugsweise in einer Gesamt- Konzentration von 10 - 25 %(w/w) und besonders bevorzugt in einer Gesamt- Konzentration von 20 %(w/w). Die Zugabe des Kaliumphosphats erfolgt für gewöhnlich in einem Temperaturbereich zwischen eisgekühlt und Raumtemperatur. Raumtemperatur im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet einen Temperaturbereich von 18 bis 25 °C. Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein eisgekühlter Phosphatpuffer eingesetzt. Eine lange Inkubationszeit ist vorteilhafterweise nach der Zugabe des Kaliumphosphats nicht erforderlich, entscheidend ist eine möglichst vollständige und gleichmäßige Durchmischung der Lösung nach der Zugabe. Üblicherweise beträgt die Inkubationsdauer etwa 5 bis 15 Minuten. Vorzugsweise wird der Ansatz, wie oben erwähnt, während und/oder nach der Zugabe der Salz-Komponente bewegt, wie z.B. stark geschüttelt, gerührt oder ähnliches.
Bei der Polymer-Komponente im Sinne der Erfindung handelt es sich um PEG. Ein weiteres wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von im rechnerischen Mittel 600 bis 1000 g/mol, vorzugsweise von im rechnerischen Mittel 700 - 900 g/mol und besonders bevorzugt von im rechnerischen Mittel 750 - 880 g/mol, als eine der beiden Komponenten des 2-Phasensystems eingesetzt wird. Das eingesetzte PEG besteht in der vorliegenden Erfindung vorzugsweise aus einem Gemisch aus Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 600 g/mol (PEG 600) und Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 g/mol (PEG 1000). Beide PEG sind kommerziell erhältlich (z.B. Fluka, Buchs, Schweiz). Das einsatzfertige PEG-Gemisch besteht dabei aus 30 - 50 %(w/w) PEG 600 und 50 - 70 %(w/w) PEG 1000, vorzugsweise 33 - 45 %(w/w) PEG 600 und 55 - 67 %(w/w) PEG 1000, besonders bevorzugt aus 36 - 40 %(w/w) PEG 600 und 60 - 64 %(w/w) PEG 1000 und ganz besonders bevorzugt aus 38 %(w/w) PEG 600 und 62 %(w/w) PEG 1000.
Die Konzentration des PEG im erfindungsgemäßen wässrigen 2-Phasensystem wird so gewählt, dass sich mit der Salz-Komponente zwei Phasen ausbilden, wobei jedoch die PEG-Konzentration, bei der die Plasmid-DNA aus der Unterphase, in der sie sich bei niedrigeren Konzentrationen befinden, in die Oberphase wechseln, nicht überschritten wird. Vorzugsweise beträgt der PEG-Gehalt aber mindestens 10 %(w/w) und wird nach oben begrenzt durch die Konzentration von PEG, bei der die Plasmid-DNA aus der Unterphase, in der sie sich bei niedrigeren Konzentrationen befinden, in die Oberphase wechseln. Nach der Zugabe von PEG sollte die Lösung vorzugsweise eine Temperatur von 10 bis 50 °C aufweisen, besonders bevorzugt eine Temperatur von 15 bis 40°C. Die Plasmid-DNA findet sich nach Ausbildung der Phasen, was je nach Volumen des Ansatzes einige Minuten bis Stunden in Anspruch nimmt, in der salzhaltigen Unterphase. Die Ausbildung der Phasen kann optional durch Zentrifugation des Ansatzes beschleunigt werden, wodurch es vorteilhafterweise zu einer weiteren zeitlichen Verkürzung des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt. Die Bedingungen, unter welchen man einen solchen Zentrifugationsschritt durchführt, sind dem Fachmann geläufig.
Wässrige 2-Phasensysteme haben gegenüber Phasensystemen, die auf der Basis von Matrizes oder anderen festen Phasen arbeiten, den Vorteil, dass sie eine weitaus höhere Kapazität für die aufzureinigende Plasmid-DNA, welche praktisch nur durch die Löslichkeit in den Phasen begrenzt ist, aufweisen. Weiterhin ist das Verfahren aufgrund extrem simpler Apparaturen nahezu beliebig dimensionierbar. Aber erst mit den hier beanspruchten Vereinfachungen können jedoch sowohl eine Automatisierung als auch unabhängig davon eine Produktion im industriellen Maßstab, beispielsweise zur Produktion von mehr als 2 g Plasmid-DNA pro Lyseansatz, leicht erreicht werden. Ebenso kann mit der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise die Plasmid-DNA in sehr hohem Maße von Proteinen, RNA und gDNA befreit werden. Plasmid-DNA, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert wird, kann nach einem weiteren Reinigungsschritt (beispielsweise über QIAGEN-Resin, QIAGEN, Hilden, Deutschland) problemlos in der Gentherapie oder der genetischen Vakzinierung eingesetzt werden. So können vorteilhafterweise große Mengen hochreiner Plasmid-DNA mit sehr geringem apparativen Aufwand unter Verwendung nicht-toxischer Substanzen und bei Anfall vergleichsweise geringer Kosten produziert werden. Hierzu sei erwähnt, dass die im erfindungsgemäßen 2-Phasensystem eingesetzten Substanzen z.B. im Vergleich zu anderen Isolierungsmethoden, wie z.B. CsCI-Dichtegradienten-Zentrifugation oder Phenolextraktion, jedoch unbedenklich sind und vollständig und leicht aus der aufgereinigten Plasmid-DNA entfernt werden können.
Einer der großen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass es überraschenderweise zu einer Abreicherung von open circular Plasmid-DNA (ocDNA) aus der zu isolierenden Plasmid-DNA kommt. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Plasmid-DNA weist im Vergleich zu Plasmid- DNA, welche mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert wurde, einen kleineren Anteil der Kontaminante ocDNA auf im Vergleich zur bevorzugten supercoiled-Form (scDNA). Dieses Verfahren zeigt somit eine Selektivität zur Trennung von Plasmid-Topoisomeren, also von ocDNA und scDNA. Gerade diese Trennung der Plasmid-Topoisomere sowie die bereits erwähnte Abreicherung der gDNA sind besonders bei einer Isolierung von Plasmid-DNA im industriellen Maßstab und bei nachfolgender klinischer Verwendung der Plasmid-DNA bei einigen Applikationen von großer Bedeutung und mit den bisherigen Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA nicht in befriedigendem Maße zu erreichen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die die Plasmid-DNA enthaltende Unterphase entstehend in Schritt d) von der die Kontaminanten enthaltenden Oberphase getrennt. Darauf hin wird die Unterphase durch die Zugabe der Salz-Komponente in der Form, dass sich eine Konzentration der Salz-Komponente gemäß Schritt c) ergibt, und anschließend durch die Zugabe der Polymer-Komponente gemäß Schritt d) wieder zur Bildung eines 2- Phasensystems ausgerichtet. Bei dieser Wiederholung des letzten Teils des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach der Zugabe der Polymer-Komponente das Gemisch nochmals durchmischt und die Phasenausbildung abgewartet. Die Plasmid- DNA findet sich auch hier in der Unterphase. Dieser Schritt kann optional einmal oder in einer dem Fachmann sinnvoll erscheinenden Anzahl durchgeführt werden. Die Durchführung dieses optionalen Schrittes führt zu einer wiederholten Reinigung der Plasmid-DNA und damit zu einer weiteren Abreicherung von Kontaminanten, wie z.B. RNA, aus der Plasmid-DNA. Der oder die zusätzliche(n) Reinigungsschritt(e) umfassen folgende Schritte:
e) die Trennung der Unterphase entstehend in Schritt d) von der in Schritt d) entstehenden und die Kontaminanten enthaltenden
Oberphase,
f) Zusatz der Salz-Komponente in der Form, dass sich eine Konzentration der Salz-Komponente gemäß Schritt c) ergibt
g) erneuter Zusatz der Polymer-Komponente gemäß Schritt d),
h) durchmischen der Lösung, Phasenausbildung abwarten.
Im Anschluss an das erfindungsgemäße Verfahren muss die Plasmid-DNA noch aus der in Schritt d) entstehenden Unterphase gewonnen werden. Die Isolierung und Entsalzung der Plasmid-DNA aus der in Schritt d) entstehenden Unterphase erfolgt üblicherweise durch Ultrafiltration/Diafiltration. Es kann jedoch im Sinne der vorliegenden Erfindung auch jede weitere dem Fachmann sinnvoll erscheinende Methode zur Isolierung und/oder Entsalzung der Plasmid-DNA aus der Unterphase verwendet werden.
In einer alternativen Ausführungsform kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren auch anstelle der Biomasse als Ausgangsmaterial ein geklärtes Lysat, welches die zu isolierenden Plasmid-DNA enthält, eingesetzt werden. In dieser Ausführungsform der Erfindung entfällt naturgemäß der Lyse-Schritt bzw. findet nach dem Lyse-Schritt zusätzlich ein Klärung des Lysats statt. Alle dem Fachmann als geeignet erscheinenden Methoden können zur Herstellung eines geklärten Lysats angewendet werden. Eine im Stand der Technik übliche Methode ist die Klärung des Lysats durch Fällung mit Kaliumacetat und anschließende Zentrifugation des Gemisches zur Abtrennung des entstehenden Präzipitats. Für diesen Fall wird das geklärte Lysat zunächst mit Kaliumphosphat entsprechend der oben gemachten Angaben versetzt und anschließend erfindungsgemäß mit PEG versetzt. Alle weiteren Schritte sind identisch zu dem erfindungsgemäßen Verfahren, in dem als Ausgangspunkt Biomasse eingesetzt wird. Wird der oben beschriebene Fällungsschritt zur Klärung des Lysats mit Kaliumphosphat durchgeführt, erfolgt die Zugabe von PEG wie beschrieben direkt zum geklärten Lysat. Alle weiteren Schritte sind identisch zu dem erfindungsgemäßen Verfahren, in dem als Ausgangspunkt Biomasse eingesetzt wird. Die Versuchsbedingungen, welche für eine Fällungsreaktion wie oben beschrieben sowohl bei Verwendung von Kaliumphosphat als auch bei Verwendung von Kaliumacetat erforderlich sind, sind dem Fachmann wohlbekannt.
Erläuterung der Abbildung
Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der Isolierung von pCMVß aus E.coli DH5α nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (siehe Beispiel 1 ) in Form einer Gelelektrophorese (0,8% Agarose). In Spur 1 ist ein Längenstandard zu sehen, Spur 2 zeigt die unbehandelte Oberphase, in der sich massiv RNA findet. Plasmid- DNA konnte in der Oberphase nicht nachgewiesen werden. Spur 3 zeigt die unbehandelte Unterphase, in der sich das Plasmid stark angereichert findet (große unscharfe Bande), RNA konnte hier nicht nachgewiesen werden. Spur 4 zeigt die Unterphase nach Entsalzung mittels Ultrafiltration. Auch hier kann nur Plasmid-DNA nachgewiesen werden, größtenteils liegt das Plasmid in der gewünschten supercoiled-Form (scDNA) vor, Spuren von open circular Plasmid-DNA (ocDNA) konnten ebenfalls nachgewiesen werden. Spur 5 zeigt einen pCMVß-Standard (18 μg/ml) und Spur 6 zeigt einen gDNA-Standard (23 μg/ml). Beispiel 1 : Gewinnung von pCMVß aus E.coli DH5
Zur Isolierung des Plasmids pCMVß wurden 0,6 g Biomasse aus einer Übernachtkultur von E. coli DH5α (1 I LB-Medium: 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Trypton, 85,6 mM NaCI) durch Zentrifugation (5000 x g, 10 min, 4°C) gewonnen. 6,9 ml des Resuspensions-Puffers P1 (QIAGEN, Hilden, Deutschland) wurden hinzugefügt und das Bakterienpellet durch kräftiges Schütteln bei Raumtemperatur resuspendiert. Nach vollständiger Resuspension wurden 7,5 ml Lyse-Puffer P2 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; Raumtemperatur) hinzugefügt und durch mehrmaliges Invertieren vermischt. Nach 5 min wurde der gesamte Ansatz mit K2HP04/KH2P04-Puffer (2,5 g KH2P04, 5 g K2HP0 , 7,5 ml H20; pH 7; eisgekühlt) versetzt, vorsichtig invertiert und 10 min auf Eis inkubiert. Nachfolgend wurde der gesamte Ansatz auf Raumtemperatur erwärmt, PEG (2,137 g PEG 600, 3,488 g PEG 1000, 1 ,875 ml H20) wurde zugefügt und vorsichtig vermischt. Die Phasenseparation dauerte wenige Minuten.
In der Unterphase konnte mittels Gelelektrophorese keine gDNA und keine RNA nachgewiesen werden. Die Bande der Plasmid-DNA erscheint in der Abbildung 1 (Spur 3) untypisch groß und unscharf aufgrund der hohen Salzkonzentration in der Unterphase. Entsalzung der Unterphase mittels Ultrafiltration (Spur 4) führte zu einer entsprechend distinkten Bande, welche nahezu dem Plasmid-Standard entspricht (Spur 5). Genomische DNA und Proteine finden sich im Kaliumdodecylsulfat (KDS)- Flockulat und in der Interphase.
Beispiel 2: Gewinnung von pCMVß aus E.coli DH5 (20% PEG: 12% Phosphat)
Zur Isolierung des Plasmids pCMVß wurde eine 10%ige (w/w) Biomassesuspension (E.coli DH5α) in Resuspensions-Puffer P1 (QIAGEN, Hilden, Deutschland) durch kräftiges Schütteln bei Raumtemperatur hergestellt. Nach vollständiger Resuspension wurden 10 g von diesem Ansatz mit 10 ml Lyse-Puffer P2 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; Raumtemperatur) vermischt und mehrmals invertiert. Nach 5 min wurde der gesamte Ansatz mit ^HPO K^PO^Puf er (2 g KH2PO4; 4 g K2HP04; 6 ml H20; pH 7,4; eisgekühlt) versetzt, und 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wurde der gesamte Ansatz auf Raumtemperatur erwärmt, PEG (3,8 g PEG 600; 6,2 g PEG 1000; 8,003 ml H 0) wurde zugefügt und weitere 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur vermischt. Durch Zentrifugation für 5 min bei 1300 x g wurde die Phasenseparation beschleunigt. Die resultierende Unterphase hatte ein Volumen von etwa 15 ml.
Die Analytik erfolgte mittels HPLC (HP1090, Agilent, Waldbronn, Deutschland) und Source 15PHE 4.6/100 (Amersham Bioscience, Freiburg, Deutschland) unter Einsatz eines (NH4)2S04-Gradienten. Die Detektion erfolgte durch Absorptionsmessung bei 260 nm. Folgende Werte wurden für die Unterphase des 2-Phasensystems ermittelt: 44 μg/ml Plasmid-DNA und 123 μg/ml RNA.
Diese Werte wurden mit den Werten aus einem geklärten Lysat verglichen. Zur Herstellung dieses geklärten Lysats wurde 1 ml der anfangs beschriebenen 10%igen Biomassesuspension mit 1 ml Lyse-Puffer P2 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; Raumtemperatur) durch mehrmaliges Invertieren vermischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 1 ml Neutralisationspuffer P3 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; eisgekühlt) zugegeben und 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation (5 min, 1300 x g, Raumtemperatur) wurde die Plasmid- sowie die RNA-Konzentration im Überstand (geklärtes Lysat) mittels HPLC gemessen. Die eingesetzte Biomasse enthielt im geklärten Lysat 710 μg Plasmid-DNA pro g Biomasse sowie 11 mg RNA pro g Biomasse.
Bezogen auf die Ausgangswerte der Biomasse im geklärten Lysat ergeben sich für das 2-Phasensystem 93% Plasmid-Ausbeute und 83% RNA-Abreicherung.
Beispiel 3: Gewinnung von pCMVß aus E.coli DH5 (13% PEG: 16% Phosphat)
Zur Isolierung des Plasmids pCMVß wurde eine 10%ige (w/w) Biomassesuspension (E.coli DH5α) in Resuspensions-Puffer P1 (QIAGEN, Hilden, Deutschland) durch kräftiges Schütteln bei Raumtemperatur hergestellt. Nach vollständiger Resuspension wurden 10 g von diesem Ansatz mit 10 ml Lyse-Puffer P2 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; Raumtemperatur) vermischt und mehrmals invertiert. Nach 5 min wurde der gesamte Ansatz mit K2HP0 KH2P04-Puffer (2,666 g KH2P04; 5,333 g K2HP04; 8 ml H 0; pH 7,4; eisgekühlt) versetzt und 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wurde der gesamte Ansatz auf Raumtemperatur erwärmt, PEG (2,471 g PEG 600; 4,032 g PEG 1000; 7,498 ml H20) wurde zugefügt und weitere 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur vermischt. Durch Zentrifugation für 5 min bei 1300 x g wurde die Phasenseparation beschleunigt. Die resultierende Unterphase hatte ein Volumen von etwa 25 ml.
Die Analytik erfolgte mittels HPLC (HP1090, Agilent, Waldbronn, Deutschland) und Source 15PHE 4.6/100 (Amersham Bioscience, Freiburg, Deutschland) unter Einsatz eines (NH4) S04-Gradienten. Die Detektion erfolgte durch Absorptionsmessung bei 260 nm. Folgende Werte wurden für die Unterphase des 2-Phasensystems ermittelt: 28,4 μg/ml Plasmid-DNA und 187 μg/ml RNA.
Diese Werte wurden mit den Werten aus einem geklärten Lysat verglichen. Zur Herstellung dieses geklärten Lysats wurde 1 ml der anfangs beschriebenen 10%igen Biomassesuspension mit 1 ml Lyse-Puffer P2 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; Raumtemperatur) durch mehrmaliges Invertieren vermischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 1 ml Neutralisationspuffer P3 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; eisgekühlt) zugegeben und 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation (5 min, 1300 x g, Raumtemperatur) wurde die Plasmid- sowie die RNA-Konzentration im Überstand (geklärtes Lysat) mittels HPLC gemessen. Die eingesetzte Biomasse enthielt im geklärten Lysat 710 μg Plasmid-DNA pro g Biomasse sowie 11 mg RNA pro g Biomasse.
Bezogen auf die Ausgangswerte der Biomasse im geklärten Lysat ergeben sich für das 2-Phasensystem >99% Plasmid-Ausbeute und 58% RNA-Abreicherung. Beispiel 4: Gewinnung von pCMVß aus E.coli DH5 (30% PEG. 10% Phosphat)
Zur Isolierung des Plasmids pCMVß wurde eine 10%ige (w/w) Biomassesuspension (E.coli DH5α) in Resuspensions-Puffer P1 (QIAGEN, Hilden, Deutschland) durch kräftiges Schütteln bei Raumtemperatur hergestellt. Nach vollständiger Resuspension wurden 10 g von diesem Ansatz mit 10 ml Lyse-Puffer P2 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; Raumtemperatur) vermischt und mehrmals invertiert. Nach 5 min wurde der gesamte Ansatz mit K2HP04/KH2P04-Puffer (1 ,666 g KH2P04; 3,333 g K2HP04; 5 ml H20; pH 7,4; eisgekühlt) versetzt und 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wurde der gesamte Ansatz auf Raumtemperatur erwärmt, PEG (5,7 g PEG 600; 9,3 g PEG 1000; 5 ml H20) wurde zugefügt und in einem Wasserbad bei 40°C für 15 min und unter mehrmaligem Invertieren temperiert. Durch Zentrifugation für 5 min bei 1300 x g wurde die Phasenseparation beschleunigt. Die resultierende Unterphase hatte ein Volumen von etwa 11 ml.
Die Analytik erfolgte mittels HPLC (HP1090, Agilent, Waldbronn, Deutschland) und Source 15PHE 4.6/100 (Amersham Bioscience, Freiburg, Deutschland) unter Einsatz eines (NH )2S04-Gradienten. Die Detektion erfolgte durch Absorptionsmessung bei 260 nm. Folgende Werte wurden für die Unterphase ermittelt: 61 ,8 μg/ml Plasmid- DNA und 173 μg/ml RNA.
Diese Werte wurden mit den Werten aus einem geklärten Lysat verglichen. Zur Herstellung dieses geklärten Lysats wurde 1 ml der anfangs beschriebenen 10%igen Biomassesuspension mit 1 ml Lyse-Puffer P2 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; Raumtemperatur) durch mehrmaliges Invertieren vermischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 1 ml Neutralisationspuffer P3 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; eisgekühlt) zugegeben und 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation (5 min, 1300 x g, Raumtemperatur) wurde die Plasmid- sowie die RNA-Konzentration im Überstand (geklärtes Lysat) mittels HPLC gemessen. Die eingesetzte Biomasse enthielt im geklärten Lysat 710 μg Plasmid-DNA pro g Biomasse sowie 11 mg RNA pro g Biomasse. Bezogen auf die Ausgangswerte der Biomasse im geklärten Lysat ergeben sich für das 2-Phasensystem 96% Plasmid-Ausbeute und 83% RNA-Abreicherung.
Beispiel 5: Abreicherung von gDNA
Durch Einwiegen von 4 g Resuspensions-Puffer P1 (QIAGEN, Hilden, Deutschland) und 1 g Biomasse (E.coli DH5α, kein Plasmid enthaltend) wurde eine 20%ige Biomassesuspension hergestellt. Diese wurde mit Ultraschall (Branson Sonifier 250, mit Konverter Typ 102, Einstellungen: Cylce 40%; Intensität 4, 2 mal 3 min) auf Eis aufgeschlossen. Die gDNA wurde hierdurch aus der Zelle freigesetzt und stark geschert bzw. fragmentiert. Anschließend wurde der Ansatz 10 min bei 5000 x g und 4°C zentrifugiert. 300 μg vom Überstand wurden mit 300 μl Lyse-Puffer P2 (QIAGEN, Hilden, Deutschland; Raumtemperatur) versetzt und vermischt. Nach 5 min wurde der gesamte Ansatz mit K2HP04/KH2P04-Puffer (100 μg KH2P04; 200 μg K2HP04; 300 μl H20; pH 7,4; eisgekühlt) vermischt, und 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wurde der gesamte Ansatz auf Raumtemperatur erwärmt, PEG (85,5 μg PEG 600; 139,5 μg PEG 1000; 75 μl H20) wurde zugefügt und weitere 10 min auf einem Uberkopfschüttler bei Raumtemperatur vermischt. Durch Zentrifugation für 5 min bei 1300 x g wurde die Phasenseparation beschleunigt. Die Unterphase hatte ein Volumen von etwa 0.75 ml.
Die Analytik erfolgte mittels HPLC (HP1090, Agilent, Waldbronn, Deutschland) und Source 15PHE 4.6/100 (Amersham Bioscience, Freiburg, Deutschland) unter Einsatz eines (NH4) S0 -Gradienten. Die Detektion erfolgte durch Absorptionsmessung bei 260 nm. Die gDNA-Konzentration im Aufschlussüberstand (Zentrifugation nach Ultraschall-Behandlung) wurde mit 433 μg gDNA/ml bestimmt. In der Unterphase des 2-Phasensystems wurde mittels HPLC eine Restkonzentration von 1 ,7μg gDNA/ml ermittelt, was einer Abreicherung von >99% stark gescherter gDNA entspricht.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Biomasse mittels eines wässrigen 2-Phasensystems mit einer Polymer- und einer Salz-Komponente, dadurch gekennzeichnet, dass die Resuspension der eingesetzten Biomasse, die alkalische Lyse der Biomasse, die Neutralisation des alkalischen Lyseansatzes und die Trennung der Plasmid-DNA von den Kontaminanten in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt wird, umfassend die folgenden Schritte:
a) Resuspension der Biomasse,
b) Zugabe von Lyse-Puffer, Inkubation für einen zur Lyse der Biomasse ausreichend langen Zeitraum,
c) Zugabe der Salz-Komponente, Inkubation für einen ausreichend langen Zeitraum,
d) Zugabe der Polymer-Komponente, durchmischen der Lösung, Phasenausbildung abwarten.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Polymer- Komponente des wässrigen 2-Phasensystems Polyethylenglykol (PEG) verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte PEG ein Molekulargewicht von im rechnerischen Mittel 600 bis 1000 g/mol, vorzugsweise von im rechnerischen Mittel 700 - 900 g/mol und besonders bevorzugt von im rechnerischen Mittel 750 - 880 g/mol, aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte PEG eine Mischung aus 30 - 50 %(w/w) PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 600 g/mol (PEG 600) und 50 - 70 %(w/w) PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 g/mol (PEG 1000), vorzugsweise aus 33 - 45 %(w/w) PEG 600 und 55 - 67 %(w/w) PEG 1000, besonders bevorzugt aus 36 - 40 %(w/w) PEG 600 und 60 - 64 %(w/w) PEG 1000 und ganz besonders bevorzugt aus 38 %(w/w) PEG 600 und 62 %(w/w) PEG 1000 darstellt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des PEG so gewählt wird, dass sie mindestens so hoch ist, dass sich mit der Salz-Komponente des 2-Phasensystems zwei Phasen ausbilden, und maximal so hoch ist, dass die Konzentration, bei der die Plasmid-DNA aus der Unterphase in die Oberphase wechselt, nicht überschritten wird und Kontaminanten wie RNA und gDNA in der Oberphase bzw. in der Interphase verbleiben.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt von PEG mindestens 10 %(w/w) und maximal so hoch ist, dass die Konzentration, bei der die Plasmid-DNA aus der Unterphase in die Oberphase wechselt, nicht überschritten wird und Kontaminanten wie RNA und gDNA in der Oberphase bzw. in der Interphase verbleiben.
7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Salz- Komponente Trikaliumphosphat (K3P04), Dikaliumhydrogenphosphat
(K2HP04) und/oder Kaliumdihydrogenphosphat (KH2P04), bevorzugt K2HP04 und/oder KH2P04, verwendet werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Salz- Komponente in Form einer Pufferlösung zugeführt wird, vorzugsweise als
K2HP04/KH2P04-Puffer.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Salz-Komponente so gewählt wird, dass sie mindestens so hoch ist, dass sich mit der Polymer-Komponente des 2-Phasensystems zwei Phasen ausbilden, und maximal so hoch ist, dass die Konzentration der Salz-Komponente, bei der die Plasmid-DNA aus der Unterphase in die
Oberphase wechselt, nicht überschritten wird und Kontaminanten wie RNA und gDNA in der Oberphase bzw. in der Interphase verbleiben.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass K2HP04 und/oder KH2PO4 in einer Gesamt- Konzentration von 5 - 30 %(w/w), bevorzugt in einer
Gesamt-Konzentration von 10 - 25 %(w/w) und besonders bevorzugt in einer Gesamt-Konzentration von 20 %(w/w) eingesetzt werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Puffersystem der Salz-Komponente einen pH-Wert im Bereich von pH 5,8 bis pH 8,5 und bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von pH 6,5 bis pH 8 aufweist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Neutralisation des alkalischen Lyseansatzes K3P0 ) K2HP04 und/oder
KH2PO4, vorzugsweise ausschließlich die Salz-Komponente(n) des wässrigen 2-Phasensystems, eingesetzt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zu isolierende Plasmid-DNA Plasmide, Cosmide, Phasmide sowie eukaryotische Vektoren umfasst.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryotischen Vektoren Hefe-Vektoren sind.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzte Biomasse alle Lebensformen umfasst, die fähig sind, die Plasmid-DNA zu tragen und zu vermehren bzw. auf ihre Nachfahren weiterzugeben, bevorzugt handelt es sich um Bakterien und/oder Hefen.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzte Biomasse mittels einer alkalischen Lyse, bevorzugt mit einem Puffer enthaltend Natriumdodecylsulfat (SDS), in an sich bekannter Weise aufgeschlossen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse unter Bewegung des Lyseansatzes lysiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass anstelle der Biomasse ein geklärtes Lysat als Ausgangsmaterial verwendet wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterphase entstehend in Schritt d) aus Anspruch 1 zusätzlich mindestens einmal von Kontaminanten gereinigt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die zusätzliche(n) Reinigungsschritt(e) umfassen:
e) die Trennung der Unterphase entstehend in Schritt d) aus Anspruch 1 von der in Schritt d) aus Anspruch 1 entstehenden und die Kontaminanten enthaltenden Oberphase,
f) Zusatz der Salz-Komponente in der Form, dass sich eine Konzentration der Salz-Komponente gemäß Schritt c) aus Anspruch 1 ergibt
g) erneuter Zusatz der Polymer-Komponente gemäß Schritt d) aus Anspruch 1 ,
h) durchmischen der Lösung, Phasenausbildung abwarten.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung und Entsalzung der Plasmid-DNA aus der Unterphase, entstehend in Schritt d) aus Anspruch 1 , durch Ultrafiltration/Diafiltration erfolgt.
22. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbildung der Phasen in Schritt d) aus Anspruch 1 durch Zentrifugation des Ansatzes beschleunigt wird.
23. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch aus
Schritt c) aus Anspruch 1 während und/oder nach der Zugabe der Salz- Komponente bewegt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem automatisierten Prozess eingesetzt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass Plasmid-DNA im industriellen Maßstab, vorzugsweise zur Produktion einer Menge von mehr als 2 g Plasmid-DNA pro Lyseansatz, hergestellt wird.
26. Plasmid-DNA, dadurch gekennzeichnet, dass diese mittels eines Verfahrens gemäß der Ansprüche 1 bis 25 isoliert wurde.
27. Verwendung der Plasmid-DNA gemäß Anspruch 26 in der Gentherapie oder in der genetischen Vakzinierung.
8. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25 enthaltend die Komponenten:
a) PEG und/oder
b) Kaliumphosphat-Puffer und/oder
c) Alkalischer Lyse-Puffer und/oder
d) Resuspensions-Puffer.
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