DE69530183T2

DE69530183T2 - Herstellung von plasmid dns von pharmazeutischer güte

Info

Publication number: DE69530183T2
Application number: DE69530183T
Authority: DE
Inventors: Magda Marquet; Nancy Horn; Jennifer Meek; Gregg Budahazi
Original assignee: Vical Inc
Current assignee: Fresh Tracks Therapeutics Inc
Priority date: 1994-02-01
Filing date: 1995-01-09
Publication date: 2004-01-08
Anticipated expiration: 2015-01-10
Also published as: DE69530183D1; WO1995021250A2; CA2179603A1; JPH09509313A; EP0742820A1; US5561064A; CA2179603C; EP0742820B1; JP3782104B2; EP1319711A3; EP1319711A2; WO1995021250A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNA. Das Verfahren befasst sich im Besonderen mit einem Prozess zur Isolierung und Reinigung von Milligramm-, Gramm- und Kilogrammmengen an Plasmid-DNA aus rekombinanten Zellen in pharmazeutischer Reinheit. Das Verfahren der Erfindung kann im Gebiet der Gentherapie nützlich eingesetzt werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
A. Hintergrund Hierin wird ein neues Herstellungsverfahren zur Produktion von pharmazeutischer DNA bereitgestellt. Der Stand der Technik im Gebiet der Reinigung von Plasmid-DNA beruht auf der Verwendung von labormäßiger Zentrifugation, Extraktion mittels toxischer organischer Lösemittel und von tierischen Enzymen (Lysozym, RNase, Proteinase K). Die Endreinigung von Plasmid-DNA aus einem Lysat wird durch die Anwendung von Verfahren vorgenommen, zu denen Ultrazentrifugation im Labormaßstab, präparative Gelelektrophorese sowie forschungsmäßiger Chromatographie gehören. Keines dieser Verfahren eignet sich zur Massenproduktion von pharmazeutischer Plasmid-DNA. Die Nachteile des Standes der Technik werden nachstehend erläutert.
Gegenwärtige Laborverfahren können nicht zur Herstellung von Plasmid-DNA herangezogen werden. Es gibt zwei weit verbreitete Laborverfahren zur Herstellung eines mit Plasmid-DNA angereicherten Rohlysats: das Siede-Verfahren und das alkalische Lyse-Verfahren. Beide verwenden üblicherweise Hühnereiweiß-Lysozyme, um die Bakterienzellwand zu zerstören. Zentrifugation im Labormaßstab wird häufig zur Trennung von Zelltrümmern vom Rohlysat eingesetzt. Pankreas-RNase kommt oft bei der Reduktion von Wirts-RNA zum Einsatz, die etwa 75% der Nucleinsäure im Rohlysat ausmacht. Organische Extraktion mittels Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol oder Variationen dieses Gemischs wird herkömmlicherweise zur Reduktion verunreinigender Proteine ver wendet. Nach Anwendung dieser Verfahren besitzt das Rohlysat immer noch wesentliche Bestandteile verunreinigender, chromosomaler Wirts-DNA, und weitere Behandlung ist notwendig.
Das oben beschriebene Verfahren zur Gewinnung partiell gereinigter DNA aus einem Rohlysat stellt kein optimales Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer DNA dar. Tierische Enzyme, wie z. B. Lysozyme und RNase, bringen Probleme mit sich. Da sie von Tieren stammen, können sie virale Verunreinigungen in das endgültige Plasmid-Produkt einschleusen. Auch organische Lösemittel sind problematisch. Diese Chemikalien sind stark toxisch und müssen daher zur pharmazeutischen Verwendung des Produkts aus der schlussendlichen Dosierungsform entfernt werden. Darüber hinaus erhöht der Einsatz von Lösemitteln die Kosten des Verfahrens im Bezug auf Lagerung, sichere Verwendung, Entsorgung gefährlichen Abfalls sowie die Validierung ihrer Beseitigung wesentlich.
Die aus dem Rohlysat isolierte Plasmid-DNA wird fast immer durch Cäsiumchlorid/Ethidiumbromid- (CsCl/EtBr-) Gleichgewichts-Ultrazentrifugation weiter gereinigt. Aufgrund von Dichteunterschieden, die durch die unterschiedlichen Bindungsfähigkeiten von EtBr an kovalent ringgeschlossene Plasmid-DNA, RNA und chromosomale DNA entstehen, können diese drei verschiedenen Nucleinsäuren mittels CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation in angereicherte Fraktionen aufgelöst werden.
CsCl/EtBr-Gradienten-Zentrifugation ist als Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch verwendbarer DNA ebenso unerwünscht, da es kein wirtschaftliches Verfahren darstellt. Auch EtBr ist ein hochtoxisches, mutagenes und teratogenes Reagens, dessen Gegenwart in einem pharmazeutischen Produkt selbst in Spurenmengen nicht toleriert wird und das wesentliche Probleme bei seiner sicheren Entsorgung aufwirft.
Es gibt Variationen der oben beschriebenen Verfahrensweise, bei denen das Rohlysat zuerst mit Pankreas-RNase und dann mit Base/Detergens behandelt wird, um die chro mosomale DNA zu reduzieren. Auf organische Extraktion mittels Phenol/Chloroform folgt die Fällung der DNA durch Ethanol, Resuspension und eine Polyethylenglykol-Fällung (PEG) der DNA. Hierbei handelt es sich wieder um eine zeitintensive Verfahrensweise im Labormaßstab, die in der pharmazeutischen Produktion nicht eingesetzt werden kann, da tierische Enzyme, toxische Lösemittel und Reagenzien verwendet werden, die vom amerikanischen Bundesgesundheitsamt (FDA, Food and Drug Administration) nicht allgemein als unbedenklich (GRAS, generally recognized as safe) anerkannt sind.
Das hierin offenbarte neue Verfahren eignet sich zur Herstellung pharmazeutischer DNA zu Verwendungszwecken wie etwa Gentherapie. Das Verfahren ist in der Lage, verschiedene Formen von Plasmid-DNA, darunter Superhelix-, entspannte und Concatemer-DNA, zu trennen. Die in diesem Herstellungsverfahren produzierte DNA ist im Wesentlichen frei von vom Wirt stammenden Verunreinigungen wie Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten, Endotoxinen, chromosomaler DNA und RNA, oder enthält nur Spurenmengen davon. Bei der Herstellung werden zudem keine von Tieren oder Sonstigem stammende Enzyme verwendet. Bei der Reinigung werden ausnahmslos Reagenzien eingesetzt, die von der FDA als unbedenklich anerkannt sind. Das Herstellungsverfahren der Erfindung setzt sich aus einer neuartigen Abfolge von Grundoperationen zusammen, die auf große Mengen von DNA (Milligramm, Gramm, Kilogramm) umgelegt werden können und weitaus wirtschaftlicher als herkömmliche Verfahren sind. Die Abfolge der Grundoperationen, die in diesem Herstellungsverfahren kombiniert sind, umfasst ein abschließendes steriles Abfüllen der Produkt-DNA in geeignete Phiolen. Diese Merkmale grenzen das beschriebene Herstellungsverfahren deutlich von Verfahren nach dem Stand der Technik ab, und machen es für die Produktion pharmazeutischer DNA besonders geeignet.
B. Vorteile
Wesentliche Bemühungen sind unternommen worden, um alternative Verfahren zur oben erläuterten CsCl/EtBr-Gradienten-Ultrazentrifugation für die Reinigung von DNA zu entwickeln. All diese Verfahren basieren auf einer Ersetzung des letzten Ultrazentri fugationsschritts durch sicherere und wirtschaftlichere Verfahren. Ziel ist es, dieselben Qualitätsstandards wie das CsCl/EtBr-Gradienten-Verfahren zu erreichen. Keines dieser Verfahren einschließlich des Standard-CsCl/EtBr-Verfahrens schafft es jedoch, die für ein im Handel erhältliches pharmazeutisches Medikament notwendigen Qualitätsstandards, nämlich Identität, Reinheit, Sicherheit und Wirksamkeit, zu erfüllen.
Die Herstellung pharmazeutischer Proteine mittels Rekombinationsverfahren hat gezeigt, dass bei der Lizenzvergabe an diese Proteine Wirtsverunreinigungen (z. B. Escherichia coli-DNA, Escherichia coli-Proteine, Escherichia coli-RNA, Endotoxine) widerwillig toleriert werden und ihr Vorkommen in Spurenmengen streng geregelt ist. Bei der Herstellung von pharmazeutischen Standardmedikamenten hat sich gezeigt, dass Rückstände von Verfahrensreagenzien, die nicht als allgemein unbedenklich anerkannt sind, ebenso strikten Standards entsprechen müssen.
Das hierin offenbarte Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Plasmid-DNA erfüllt alle von der FDA und ähnlichen Organisationen in anderen Ländern gestellten Anforderungen für an ein aus rekombinanten Zellen, wie z. B. Escherichia coli, hergestelltes pharmazeutisches Produkt.
Die Vorteile, die dieses Verfahren gegenüber existierenden Verfahren nach dem Stand der Technik aufweist, sind, dass es: - aus wirtschaftlichen Grundoperationen zusammengestellt ist, die sich für die Produktion in großem Maßstab eignen; - Wirtsverunreinigungen wie RNA, Wirts-DNA, Proteine und Lipopolysaccharide zuverlässig entfernt; - nicht vom Zusatz fremder, von Tieren stammender Proteine wie RNase, Lysozym und Proteinase K abhängig ist; - nicht auf die Verwendung toxischer, organischer Extraktionsmittel angewiesen ist; - keine mutagenen Reagenzien wie Ethidiumbromid benötigt; - nur Reagenzien verwendet, die von Arzneimittelbehörden wie der FDA als allgemein unbedenklich anerkannt sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Plasmid-DNA, das sämtliche von der FDA und ähnlichen Organisationen in anderen Ländern vorgegebenen Standards für ein aus rekombinanten Zellen – einschließlich Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, Hefe und Fungi, Säugetier- sowie Insektenzellen – gewonnenes pharmazeutisches Produkt erfüllt.
Früher verwendete DNA-Isolierungsverfahren basieren auf dem Ersetzen des letzten Zentrifugationsschritts durch sicherere und wirtschaftlichere Verfahren, mit dem Ziel, dieselben Qualitätsstandards wie das CsCl/EtBr-Gradienten-Verfahren zu erreichen. Keines dieser Verfahren einschließlich des Standard-CsCl/EtBr-Verfahrens schafft es jedoch, die für ein im Handel erhältliches pharmazeutisches Medikament notwendigen Qualitätsstandards, nämlich Identität, Reinheit, Sicherheit und Wirksamkeit, zu erfüllen. Die hierin dargestellte Verfahrenserfindung geht einen Schritt weiter und ermöglicht die Produktion von qualitativ hochwertigerer DNA, steriles Abfüllen bis hin zu einem zur Verabreichung geeigneten Endprodukt.
Die neuartige Kombination von Grundoperationen gemäß der Erfindung resultiert in einem Verfahren, das sich deutlich von jedem anderen der vorherigen Verfahren unterscheidet. Hierin wird ein Verfahren für die Reinigung von Plasmid-DNA offenbart, das:

– keine toxischen oder tierischen Substanzen verwendet,
– sich aus Grundoperationen zusammensetzt, die auf Milligramm-, Gramm- und Kilogrammmengen aufskaliert werden können,
– umfassend ist, in dem Sinne, dass es alle Schritte von der Zellpaste bis zum letztendlichen sterilen Abfüllen beinhaltet, und
– Qualitätskriterien (Identität, Reinheit, Wirksamkeit) erfüllt, die zur Lizenzerteilung für ein pharmazeutisches Produkt erforderlich sind, jedoch von früheren Plasmid-Reinigungsverfahren nie erreicht wurden.

Die Vorteile dieser Erfindung beruhen auf einem deutlich unterschiedlichen intellektuellen Vorstoß als sämtliche frühere DNA-Isolierungsverfahren.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA von Wirtszellen-Verunreinigungen bereitgestellt, folgende Schritte umfassend:

(a) Lysieren von Wirtszellen, welche die Plasmid-DNA enthalten, um ein Lysat zu erhalten und Behandlung des Lysats mit einem Salz, um chromosomale Wirts-DNA zu fällen;
(b) Zugabe von Polyethylenglykol zum Lysat, um einen Niederschlag der Plasmid-DNA zu erhalten;
(c) Lösen des Niederschlags, um eine Lösung zu erhalten, und Zugabe eines Salzes zur Lösung, um die Wirtszellen-Verunreinigung zu fällen;
(d) Verwendung der Lösung für Größenausschluss- oder Anionenaustausch-Chromatographie;

Ebenso bereitgestellt wird ein Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA von Wirtszell-Verunreinigungen, folgende Schritte umfassend:

(a) Lysieren von Wirtszellen, welche die Plasmid-DNA enthalten, in einer Base, um ein Lysat zu erhalten, und anschließende Behandlung mit einem Salz und einer Säure, um chromosomale Wirts-DNA zu fällen;
(b) Zugabe von etwa 10% (Gew./Vol.) Polyethylenglykol zum Lysat, um einen Niederschlag der Plasmid-DNA zu erhalten;
(c) Lösen des Niederschlags in einem Puffer, um eine Lösung zu erhalten, und Einstellen der Lösung auf etwa 2,5 M Ammoniumacetat, um die Wirtszellen-Verunreinigungen zu fällen;
(d) Verwendung der Lösung für Größenausschluss- oder Anionenaustausch-Chromatographie;

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung wird die Plasmid-DNA mit GRAS-Reagenzien hergestellt; die Plasmid-DNA wird in Abwesenheit von organischen Extraktionsmitteln hergestellt; die Plasmid-DNA wird in Abwesenheit von Mutagenen hergestellt; die Lysier-, Behandlungs- und Verwendungsschritte können auf die Großproduktion von Plasmid-DNA umgelegt werden; und die Lysier-, Behandlungs- und Verwendungsschritte führen zur Bereitstellung von pharmazeutisch verwendbarem Material.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren einen weiteren Schritt (d), in welchem die Plasmid-DNA zubereitet, sterilisiert und in Phiolen eingefüllt wird, wodurch ein zur therapeutischen Verabreichung geeignetes Produkt erzeugt wird. Die Sterilisation kann eine Filtration umfassen.
Die Zellen können in einem Puffer suspendiert und in einer verdünnten Base oder einer verdünnten Base plus Detergens lysiert werden. Als Puffer kann Natriumacetat, als Base Natriumhydroxid und als Detergens ein nichtionisches Tensid verwendet werden. Die Zellen können in einem Natriumacetat-Puffer suspendiert werden, um eine homogene Zellsuspension zu erzielen, und in einer Lösung aus Natriumhydroxid und nichtioni schem Tensid lysiert werden, um ein Lysat zu erhalten. Das Lysat kann vor der weiteren Behandlung mit einer Säure neutralisiert werden.
Bei weiteren Ausführungsformen der Erfindung folgt auf die selektiven PEG-Fällungen die Chromatographie; die selektiven PEG-Fällungen umfassen eine erste Fällung mit PEG, um einen Niederschlag der Verunreinigungen zu erhalten, und einen zweite Fällung mit PEG, um eine Plasmid-DNA zu fällen; die erste Fällung findet vor der zweiten Fällung statt; und die erste Fällung umfasst die Zugabe von PEG zu einer ersten Plasmid-DNA enthaltenden Lösung, um eine niedrige PEG-Konzentration zu erhalten, während die zweite Fällung eine Zugabe von PEG zu einer zweiten Plasmid-DNA enthaltenden Lösung beinhaltet, um eine hohe PEG-Konzentration zu erreichen.
Die Chromatographie kann Ionenaustausch-Chromatographie oder Gelfiltration oder eine Kombination der beiden umfassen; die Gelfiltration kann das Kontaktierenlassen einer Plasmid-DNA enthaltenden Lösung mit einem Größenausschluss-Medium, das eine DNA-Ausschlussgrenze von etwa 20.000 bp aufweist, bei einem pH von etwa 8,0 und einer Salzkonzentration von etwa 150 mM, und die Gewinnung von mit Plasmid-DNA angereicherten Fraktionen umfassen; und die Ionenaustausch-Chromatographie kann ein Kontaktierenlassen einer Plasmid-DNA enthaltenden Lösung mit einem Anionenaustausch-Medium bei einem pH von etwa 8,0, die Bildung von eines Salzgradienten zwischen etwa 0,7 M und etwa 0,9 M und die Gewinnung von Plasmid-DNA angereicherten Fraktionen umfassen.
Das Verfahren kann darüber hinaus die Gewinnung eines Plasmid-DNA-Niederschlags aus dem gelösten Stoff oder aus einer Lösung, die die aus dem gelösten Stoff erhaltene Plasmid-DNA enthält, durch die Behandlung mit Alkohol oder PEG umfassen. Entsprechend kann das Verfahren zudem das Entfernen eines Verunreinigungsniederschlags aus dem gelösten Stoff oder aus einer Lösung, die die aus dem gelösten Stoff erhaltene Plasmid-DNA enthält, durch Behandlung mit Hochsalz umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden als Zellen Escherichia coli-Zellen verwendet.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt eine Plasmidkarte des Plasmids VCL-1005.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren, das sich zur Herstellung pharmazeutisch einsetzbarer DNA für Verwendungszwecke wie Gentherapie eignet. Dieses Verfahren ersetzt das Standard-CsCl/EtBr-Gradienten-Verfahren und führt zu einem qualitativ hochwertigeren Produkt. Es ist in der Lage, verschiedene Plasmid-DNA-Formen zu trennen, die dieselbe Sequenz aufweisen, darunter Superhelix-, entspannte und Concatemer-DNA. Die durch diesen Herstellungsprozess erzeugte DNA ist im Wesentlichen frei von vom Wirt stammenden Verunreinigungen oder enthält nur Spurenmengen davon. Bei der Reinigung kommen lediglich Reagenzien zum Einsatz, die von der FDA als allgemein unbedenklich anerkannt sind (GRAS). Das in Phiolen abgefüllte Produkt erfüllt Qualitätskriterien (Identität, Reinheit, Wirksamkeit), die von früheren Plasmidreinigungsverfahren niemals erreicht wurden, jedoch zu Lizenzerteilung für ein pharmazeutisches Produkt notwendig sind.
Dieses Herstellungsverfahren führt zur Produktion von Milligramm-, Gramm- und Kilogrammmengen an pharmazeutisch verwendbarer Plasmid-DNA. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren: das Lysieren von Zellen (z. B. Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Säugetier-, Insekten- oder andere Zellen), die mittels Schüttelkolben-Kultur, Bioreaktor- oder Fermentervermehrung erhalten wurden und die Plasmid-DNA enthalten, um ein Rohlysat zu erzeugen; das Konzentrieren und Trennen eines partiell gereinigten DNA-Zwischenpro dukts, das deutlich an Plasmid-DNA angereichert ist, aus Wirtsverunreinigungen, wie z. B. Zelltrümmern, mittels Filtration, Zentrifugation, jegliche Art von Chromatographiel und/oder selektiver Fällungsverfahren; das Entfernen restlicher Verunreinigungen, wie z. B. Proteinen, RNA, Lipiden und chromosomaler DNA, aus dem partiell gereinigten DNA-Zwischenprodukt durch Chromatographie und/oder selektive Fällungsverfahren; das Erreichen einer genauen Trennung der Restverunreinigungen und der übrigen DNA-Formen durch Chromatographie und/oder selektive Fällungen; das Entfernen luftübertragener Mikroben, die während der Bearbeitung der gewünschten Plasmid-Fraktion durch Sterilisation eingeführt wurden, sowie das aseptische Abfüllen in Phiolen, um eine geeignete pharmazeutische Verabreichungsform bereitzustellen.
Die bei diesem Herstellungsverfahren angewendeten Schritte durch Salze, Puffer, Lösemittel, Extraktionsmittel und Fällungsmittel ausgeführt, die von der FDA allgemein als unbedenklich anerkannt sind. Endotoxine/Pyrogene werden vom Produkt in einem für die FDA akzeptablen Ausmaß effektiv getrennt. Die chromosomale Wirts-DNA wird von der Produkt-DNA abgetrennt. Die Wirtsproteine werden von der Produkt-DNA isoliert. Unterschiedliche DNA-Formen werden voneinander abgesondert: Superhelix, entspannte Formen und Concatemere. Das Verfahren setzt sich aus skalierbaren Grundoperationen zusammen und führt zu keinen gefährlichen organischen Abfallprodukten.
Während die Reinigung von Plasmid-DNA mittels herkömmlicher Laborverfahren häufig unvollständig ist und inakzeptable Mengen an RNA, Protein, Endotoxinen und chromosomaler Wirts-DNA zurücklässt, ist sie beim Verfahren der Erfindung vollständig abgeschlossen. Die Mengen an Wirts-DNA, Endotoxinen/Pyrogenen, RNA und Protein sind nicht mehr nachweisbar oder auf Spurenmengen reduziert.
In der folgenden Tabelle werden Standardlaborverfahren mit einer Ausführungsform des hierin beschriebenen Herstellungsverfahrens verglichen:
Nach der Reinigung wird die Plasmid-DNA von der Qualitätskontrolle analysiert, um sicherzustellen, dass sie alle Anforderungen erfüllt. Sobald die Plasmid-DNA von der Qualitätskontrolle freigegeben wird, wird sie zur sterilen Abfüllung in Phiolen formuliert.
Von der FDA und ähnlichen Organisationen gesetzte Standards Die nationale Gesetzgebung in den USA erfordert, dass die Verwendung pharmazeutischer Wirkstoffe bei der Behandlung von Menschen von einer nationalen Regierungsbehörde genehmigt ist. Die Verantwortung für die Umsetzung dieses Gesetzes liegt bei der FDA (Food and Drug Administration), die geeignete Richtlinien herausgibt, um eine solche Genehmigung sicherzustellen, die detailliert im Gesetzbuch der USA (U.S.C., United States Code) unter Title 21, Section 301-392 ausgeführt sind. Die Richtlinie für biologische Materialien, wozu auch Produkte zählen, die aus tierischem Gewebe herge stellt werden, ist unter Title 42 des U.S.C. Section 262 vorgesehen. In den meisten anderen Ländern wird eine ähnliche Genehmigung verlangt. Die Bestimmungen sind zwar von Land zu Land unterschiedlich, die jeweilige Vorgehensweise Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung jedoch gut bekannt.
Plasmid-DNA Die Plasmid-DNA der vorliegenden Erfindung ist nicht ein eingrenzend zu verstehen. Diese Plasmide sollen auch z. B. prokaryotische und eukaryotische Vektoren, Klon- und Expressionsvektoren, pBR322- und pUC-Vektoren sowie ihre Ableitungen, etc. umfassen, und verschiedene Replikationsursprünge, z. B. prokaryotische Replikationsursprünge, wie z. B. pMB1 und ColE1, und eukaryotische Replikationsursprünge, die z. B. die Replikation von Hefe-, Pilz-, Insekten- und Säugetierzellen (z. B. SV40 ori) ermöglichen, umfassen. Zudem sollen sie zahlreiche genetische Elemente einschließen, die Klonen und Expression fördern, wie z. B. ausgewählte Gene, Polylinker, Promotoren, Enhancer, Leitsequenz-Peptide, Introns, Polyadenylierungssignale, etc. Die Auswahl der Vektoren, Ursprünge und genetischen Elemente variiert je nach Anforderungen, liegt jedoch innerhalb des Kompetenzbereichs von Fachleuten auf dem Gebiet. Auf ähnliche Weise kann auch ein Wirt unter Prokaryoten und Eukaryoten, einschließlich Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Insekten- und Säugetierzellen, ausgewählt werden. Bevorzugte Wirte sind Mikrobenzellen, im Besonderen Mikroorganismen wie Escherichia coli. Jeder geeignete Stamm von Escherichia coli kann in Betracht gezogen werden. Ebenso können verschiedene Gene, die Strukturproteine (oder auch Peptide, Polypeptide, Glykoproteine, Phosphoproteine, amidierte Proteine, etc.) codieren, in das Plasmid eingeführt werden, deren Gene genomische DNA-, cDNA-, synthetische DNA-, Polynucleotid- und Oligonucleotid-Sequenzen etc. bilden können. Diese Sequenzen können entweder durch chemische Synthese oder Genmanipulationsverfahren (siehe Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, sowie Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. & Wiley, 1987, die beide ausdrücklich hierin durch Verweis aufgenommen sind) gewonnen werden, und können zudem in die Plasmide eingeführt werden, die folglich wiederum unter Anwendung zusätzlicher Genmanipulationsverfahren (ebenda) in Wirtszellen eingeführt werden. Was das Kultivieren eines Plasmid-DNA enthaltenden Wirt betrifft, so kann dies mittels bekannter Verfahren, wie die in den vorher erwähnten Verweisen offenbarten, erfolgen, wozu auch Inkubator, Bioreaktor, Fermenter, etc. gehören gemäß Batch-Fermentation, Fed-Batch-Fermentation, kontinuierliche Fermentation, Typ-I-, Typ-II- und Typ-III-Fermentation, aseptische Fermentation, Konsortium-Fermentation, geschützte Fermentation, etc. Es liegt im Kompetenzbereich der Fachleute auf dem Gebiet, die Bedingungen (z. B. Medium, Temperatur, pH, Stunden, Bewegung, Belüftung, etc.) für die Kultivierung erfahrungsgemäß an Gegebenheiten anzupassen.
Bei einer Anwendungsform der Erfindung wird pharmazeutisch verwendbare Plasmid-DNA erzeugt, die zur Behandlung von soliden Tumoren im Menschen (VCL-1005) bestimmt ist. Eine klinische Methode besteht darin, dem Tumor einen Komplex, der in einer Ringer-Lactat-Lösung eines kationischen Lipidgemisches (z. B. DMRIE und DOPE) formuliert ist, sowie ein Gen, das ein menschliches Haupt-Histokompatibilitäts-Antigen (HLA-B7, Nabel, Gary J., et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90, 11307-11311 (1993)) codiert, zu injizieren. Dieses Antigen kommt nur bei wenigen Menschen vor und ist für heftige Immunreaktionen, wie etwa die Abstoßung eines Transplantationsorgans, verantwortlich. Das HLA-B7-Gen ist für die Produktion des HLA-B7-Proteins zuständig. Die Expression des Proteins soll den Körper dazu anregen, eine starke zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktion gegen die Tumorzellen auszubilden. Eine Beschreibung des VCL-1005 ist in Beispiel 1, eine Erklärung seines Aufbaus in Beispiel 2 und eine Darstellung eines Verfahrens zur Fermentation von VCL-1005 in Beispiel 3 vorgesehen.
Zellpaste
Nach abgeschlossener Kultivierung von Plasmid-DNA enthaltenden Wirtszellen, werden die Recombinants auf übliche Art und Weise, z. B. durch labormäßige, halbtechnische, oder großtechnische Zentrifugation und/oder Filtration je nach gewählter Anwendung, gewonnen. Die Zellen können unter Verwendung eines Standardverfahrens eingefroren oder sofort weiterverarbeitet werden.
Resuspendieren der Zellen in einem Puffer
Die resultierende Zellpaste wird in einem Puffer mittels Resuspensionsverfahren zur Resuspension von Zellen resuspendiert, wobei der Puffer nicht eingeschränkt ist. Vorzugsweise handelt es sich um ein Reagens, das von der FDA allgemein als unbedenklich anerkannt ist. Solche Puffer sind z. B. Natriumacetat, Kaliumcitrat, einbasiges oder zweibasiges Natriumphosphat oder ein Gemisch davon, etc., wobei Natriumacetat bevorzugt wird. Die Auswahl des pH und der Ionenstärke liegt im Kompetenzbereich der Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung.
Lyse von Zellen
In diesem Schritt werden Zellen mittels Lyse-Verfahren lysiert, um Nicht-Plasmid-Verunreinigungen, wie z. B. chromosomale DNA, hochmolekulare RNA, Protein- und Membrankomplexe zu fällen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen ohne Beigabe von vom Tier oder Sonstigem abstammenden Enzymen, wie z. B. Lysozymen, lysiert. Es ist von Vorteil, die Lyse in einer verdünnten Base oder einer verdünnten Base und einem Detergens durchzuführen. Weder die Base noch das Detergens sind eingeschränkt. Vorzugsweise sind sie jedoch GRAS-Reagenzien. Zu solchen Basen gehören Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumbicarbonat, etc., während derartige Detergenzien pharmazeutisch verwendbare, nichtionische Tenside darstellen, z. B. Polyoxyethylensorbitanester (erhältlich unter der Schutzmarke Tween^®), Polyoxyethylenester der Firma Union Carbide (Triton^®) und dergleichen. Ein Gemisch aus Natriumhydroxid und Tween^® ist vorteilhaft, wobei ein Tween^® 80 bevorzugt wird. Die Optimierung des pH und der Ionenstärke liegt innerhalb des Kompetenzbereichs von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung. Eine alternative Ausführungsform zur alkalischen Lyse ist mechanisches Brechen mit einer Hochdruck-Molekularpresse (French Press), einem Microfluidizer und dergleichen.
Ansäuern der Lysats
Das Lysat kann nun unter Verwendung von Ansäuerungsverfahren optional angesäuert werden, um das nachfolgende Entfernen von unlöslichem, aus der Zell-Lyse stammen dem Material zu erleichtern, indem die während der Basenbehandlung entstandene Viskosität verringert wird. Hierzu kann eine beliebige Säure verwendet werden, vorzugsweise jedoch ein GRAS-Ingrediens, wie z. B. Eisessig, Phosphorsäure, Zitronensäure und dergleichen. Die Abstimmung von pH und Ionenstärke erfolgt erfahrungsgemäß und liegt im Kompetenzbereich von Fachleuten auf diesem Gebiet.
Entfernen von Zelltrümmern und anderen Verunreinigungen In diesem Schritt werden Zelltrümmer und hochmolekulare Verunreinigungen, die während der Zell-Lyse abgegeben wurden, auf übliche Art und Weise durch labormäßige, halbtechnische oder großtechnische Zentrifugation und/oder Filtration entfernt. Filtration ist von Vorteil, um sicherzustellen, dass vor der nächsten positiven Fällung ein geklärtes Lysat vorliegt. Wie Praxisfachleute wissen, kann Filtration dazu verwendet werden, die Fließeigenschaften von heterogenen oder viskosen Lösungen durch die Verwendung von Hilfsmitteln, die Cellulose, Kieselerde, Celite^®-Filterhilfe, etc. umfassen, zu verbessern.
Das Material durch welches das Lysat gemäß dem Verfahren der Erfindung filtriert wird, verfügt über Öffnungen oder Poren, die einen Durchmesser haben, der groß genug ist, um Plasmid-DNA mit dem Filtrat durchzulassen, jedoch auch so klein, dass das eingesetzte Filter einen Großteil des unlöslichen Materials zurückhält. Die Porengröße kann unregelmäßig und unterschiedlich sein, solange im Gesamten ein Zurückhalten des Niederschlags erzielt wird. Dementsprechend liegen die Porengrößen vorzugsweise zwischen 0,1 und 100 μm, speziell zwischen 0,5 und 50 μm. Als Filtermaterial kann ein synthetisches oder ein organisches oder anorganisches natürliches Material verwendet werden. Es sollte sich dabei jedoch nicht um ein natürlich vorkommendes organisches Pflanzen- oder Tierprodukt handeln, das verunreinigendes Kernmaterial enthalten könnte. Das Filtermaterial ist vorzugsweise autoklavierbar, verformbar sowie fest und lässt sich in Schichten anordnen, um verschiedene Filterwirkungsgrade zu erzielen, die an die jeweilige Versuchssituation angepasst werden können. Es ist vorzugsweise nicht absorbierend und kann wasserbindend oder wasserabweisend sein. Die Hydrophobie soll te jedoch das Fließen des Filtrats nicht verlangsamen. Beispiele für geeignete Filtermaterialien sind Glas-, Kunststoff- oder Metallsiebe, poröse Filme, Cellulose- oder Fasermatten, Web- oder Vliesstoffe oder ein Chemiefasergewebe, wie z. B. Nylon oder Reyon, z. B. Miracloth^® (Calbiochem, Cat.# 475855, La Jolla, CA), ein synthetisches Reyon-Vlies mit einer durchschnittlichen Porengröße von 22 bis 25 μm. Obwohl auch Materialien wie poröse Frittglasscheiben verwendet werden können, besteht das Filter vorzugsweise aus flexiblem Material. Die Filtration kann unter Schwerkraft-, Druck- oder Vakuumbedingungen durchgeführt werden.
Fällen von Plasmid-DNA aus geklärtem Filtrat
Das zum Erhalten eines Niederschlags von Plasmid-DNA folgende Verfahren zeichnet sich durch das Lysieren von Zellen und der Gewinnung von Plasmid-DNA durch Alkohol-Fällung, z. B. mit Ethanol oder Isopropanol, aus und umfasst die Variablen Temperatur, die Gegenwart einwertiger Kationen und Zentrifugation. Dieses Verfahren eignet sich für die Verarbeitung in kleinem Maßstab, erweist sich jedoch bei großtechnischer pharmazeutischer Herstellung von Plasmid-DNA als problematisch. Wenn ein Alkohol als Fällungsmittel herangezogen wird, muss zur Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse die Temperatur genau überwacht werden. Die Aufrechterhaltung der Temperatur in dem Ausmaß, wie es die Verwendung von großen Mengen an Alkohol erfordert, ist teuer und schwer umzusetzen. Darüber hinaus benötigen Alkohole, wenn sie in Verfahrens-Scale-Ups (z. B. explosionssicheren Wänden, etc.) verwendet werden, explosionssichere Fällgefäße und Arbeitsbereiche. Dieses Erfordernis kann die Kosten für Bauplanung und Konstruktion dramatisch in die Höhe treiben. Zudem können dadurch die Zonenbereiche, in denen eine solche Anlage gebaut werden kann, eingeschränkt werden. Weiters müssen Ethanol und Isopropanol als Sondermüll entsorgt werden, was sehr teuer werden kann. Es ist ein Vorteil ein Verfahren zu entwickeln, das nicht auf die Verwendung großer Mengen an Alkohol angewiesen ist.
Polyethylenglykole (PEGs) oder andere ähnliche hochmolekulare Poyole können sowohl in der Protein- als auch in der Nucleinsäuregewinnung als Fällmittel und Extrak tionsmittel verwendet werden. PEG-Fällung ist bei der Herstellung von DNA vorteilhaft, und es handelt sich dabei um einen in Arzneimitteln zulässigen Inhaltsstoff. Anders als bei Alkoholfällmitteln muss die Temperatur zur Erreichung reproduzierbarer Ergebnisse nicht genau überwacht werden. PEGs bringen weder die mit Alkoholen verbundenen Probleme wie Explosionsneigung mit sich, noch verursachen sie Sondermüllprobleme.
Aus diesen Gründen wird die Alkoholfällung optional durch eine PEG-Fällung ersetzt. Dafür wird ein PEG dem geklärten Filtrat zugesetzt, um eine hohe PEG-Konzentration zu erzeugen. Es kann von Vorteil sein, letztendlich eine PEG-Konzentration von etwa 10 PEG (Gew./Vol.) zu erreichen (siehe oben). Bevorzugt ist ein PEG-8000. Die Anwendung von Standardfällungsverfahren und die Auswahl von pH und Ionenstärke liegt im Kompetenzbereich von Fachleuten auf diesem Gebiet.
Sammeln partiell gereinigter DNA
Der Niederschlag der Plasmid-DNA, der aus der Alkohol- oder PEG-Fällung hervorgeht, wird auf herkömmliche Art und Weise durch labormäßige, halbtechnische oder großtechnische Zentrifugation und/oder Filtration abgetrennt.
Die Filtration kann mit einem beliebigen Filtermaterial durchgeführt werden, das die an die Porengröße gestellten Anforderungen, nämlich die Gewinnung des Plasmid-DNA-Niederschlags zu ermöglichen, während ein effizientes Durchfließen des Lösemittels gewährleistet ist, erfüllt. Die Porengröße des Filters kann variabel sein, solange eine wirksame Filtrationsleistung erzielt wird. Welcher das effektivste Filter für diese Anwendung ist, hängt von der Größe der zu filtrierenden aggregierten DNA ab, wobei die Aggregatgröße wiederum vom Fällmittel und dem Lösemittel abhängt. Ein Anpassen von Filter, Niederschlag und Lösemittel erfolgt erfahrungsgemäß und liegt innerhalb des Kompetenzbereichs von Fachleuten auf diesem Gebiet. Eine effektive Filtration wird durch die maximale Produktgewinnung sowie die minimale Retention von Verunreinigungen im Filter bestimmt. Geeignete Filter haben Porendurchmesser oder Bereiche von Porendurchmessern, die zwischen etwa 0,1 und 100 μm, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und 50 μm liegen. Das Filtermaterial für die Plasmid-DNA-Filtration in dieser Stufe wird vorzugsweise die oben beschriebenen physikalischen Merkmale für die Abtrennung von Zelltrümmern aufweisen, d. h. es besteht aus synthetischem oder anorganischem Material, oder es handelt sich um Material, das nicht mit Kernbestandteilen verunreinigt, autoklavierbar, fest und verformbar ist.
Lösen partiell gereinigter DNA in Puffer und Fällen von RNA- und Lipopolysaccharid-Verunreinigungen mit hohen Salzkonzentrationen
Sowohl hier wie auch im gesamten Verfahren der Erfindung werden bei der Resuspension des Plasmids in einem Puffer Resuspensionsverfahren angewandt und vorzugsweise Puffer verwendet, die zu GRAS-Pufferwirkstoffen gehören.
In diesem Schritt kann eine Fällung mit hohen Salzkonzentrationen durchgeführt werden, die auf Fällungsverfahren beruht und bei der Fachleuten auf dem Gebiet bekannte pH und Ionenkonzentrationen ausgewählt werden. Eine Fällung mit hohen Salzkonzentrationen wird dazu genutzt, um einen Teil der verunreinigenden RNA sowie einen Großteil der Liposaccharide zu entfernen. Das Salz ist nicht eingeschränkt, ist jedoch vorzugsweise ein GRAS-Inhaltsstoff. Es eignen sich Ammoniumacetat, Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Natriumacetat, etc., wobei Ammoniumacetat bevorzugt wird.
Entfernen gefällter Verunreinigungen Der Verunreinigungsniederschlag, der sich aus der Fällung mit hohen Salzkonzentrationen ergibt, wird mittels Standardverfahren durch labormäßige, halbtechnische oder großtechnische Zentrifugation und/oder Filtration abgetrennt. Die Filtration kann mit jedem beliebigen Filtermaterial durchgeführt werden, das eine erforderliche Porengröße aufweist, um den Verunreinigungsniederschlag effektiv zurückzuhalten und das Plasmid-DNA-Filtrat zu gewinnen. Eine effektive Filtration ist dadurch bestimmt, dass ein Maximum an Verunreinigungen gewonnen und ein Minimum an Plasmid im Filter zurückgehalten wird, d.h. ein optimaler Durchfluss des Produkts gegeben ist. Geeignete Filter besitzen Porendurchmesser oder Bereiche von Porendurchmessern zwischen etwa 0,1 und 100 μm, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und 50 μm. Das Filtermaterial für die Filtration in dieser Stufe wird vorzugsweise die oben beschriebenen Filtrationsmerkmale erfüllen, d. h. aus synthetischem oder anorganischem Material oder aus Material bestehen, das nicht mit Kernbestandteilen verunreinigt, autoklavierbar, fest und verformbar ist.
Fällung hochmolekularer DNA- und RNA-Verunreinigungen mit niedrigen PEG-Konzentrationen
Es wurde gelehrt, dass selektive Polyethylenglykol- (PEG-) Fällung organische Extraktion sowie andere unvorteilhafte Reinigungsverfahren ersetzen könnte, indem sie die Gewinnung von Plasmid-DNA maximiert und die Retention von Verunreinigungen minimiert, um ein hochwertigeres Plasmid-DNA-Zwischenprodukt herzustellen. Beispiel 7: Hier wird eine Titration veranschaulicht, die dazu durchgeführt wurde, um die optimalen Prozentsätze an PEG zu bestimmen, die für ein wirksames selektives Fällungsverfahren notwendig sind. Basierend auf dieser Veranschaulichung können Fachleute auf diesem Gebiet eine ähnliche Titration durchführen, um ebenso optimale Prozentsätze zu erreichen.
Gemäß der Erfindung wird das Herangehen mittels selektiver Fällung mit PEG so vorgenommen, dass sequentiell PEG in unterschiedlichen Konzentrationen zur Plasmid-DNA zugegeben wird, um eine Isolierung des Plasmids von Verunreinigungen und von vom Wirt stammenden Verunreinigungen zu erzielen. Daraufhin wird zu einer Plasmid enthaltenden Lösung PEG zugeführt, und zwar in einem so niedrigen Prozentanteil, dass Verunreinigungen und Schmutzstoffe ausgefällt werden, oder in einem so hohen Prozentanteil, dass ein Niederschlag von Plasmid-DNA erzeugt wird. Auf Fällung mit niedriger Konzentration kann eine Fällung mit hoher Konzentration folgen, oder es kann eine Fällung mit hoher Konzentration einer Fällung mit niedriger Konzentration vorausgehen. Auch eine Reihe von Fällungen in der Abfolge hochprozentiges Fällen, niederprozentiges Fällen, hochprozentiges Fällen kann durchgeführt werden.
Basierend auf einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Fällung mit etwa 4% PEG (Gew./Vol.) und eine Fällung mit etwa 10% PEG (Gew./Vol.) vorgenommen. Das 4-prozentige Fällen ist eine negative Fällung, die Verunreinigungen wie chromosomale DNA und RNA abzieht, während das 10-prozentige Fällen zu einer Fällung von Plasmid-DNA in höchst gereinigtem Zustand führt. Es kann von Vorteil sein, mit einer Fällung mit niedriger PEG-Konzentration zu beginnen, und danach eine Fällung mit hoher PEG-Konzentration vorzunehmen. Es kann z. B. ein 4-prozentiges Fällen einem hochprozentigem Fällen vorausgehen, wobei diese Abfolge je nach Gegebenheiten variieren wird. PEG-8000 wird bevorzugt. Demgemäß wird einer Plasmid-DNA enthaltenden Probe (z. B. dem obigen Filtrat) PEG in einem ausreichenden Maß beigegeben, um eine endgültige PEG-Konzentration von 4% (Gew./Vol.) zu erhalten. Mittels Durchführung von Standardfällungsverfahren und Anpassung von pH und Ionenstärke gemäß der Einschätzung von Fachleuten auf dem Gebiet, wird auf diese Art und Weise eine negative Fällung erzeugt.
Entfernung von gefällten Verunreinigungen
Gefällte Verunreinigungen werden auf herkömmliche Art mittels Zentrifugation und/ oder Filtration, wie oben bei der Entfernung gefällter Verunreinigungen beschrieben, entfernt.
Fällung von Plasmid-DNA mit hohen PEG-Konzentrationen
In Übereinstimmung mit der oben erläuterten selektiven PEG-Fällung wird PEG in so hohen Konzentrationen zu einer Probe mit Plasmid-DNA zugesetzt, um Plasmid von den löslichen Verunreinigungen und Verunreinigungen weg auszufällen. Es kann vorteilhaft sein, PEG zu Filtrat zuzugeben, das aus Fällung mit niedriger PEG-Konzentration entstanden ist. Somit kann ein 4-prozentiges Fällen erreicht werden, auf das ein Fällen mit hoher PEG-Konzentration folgt. Ein 10-prozentiges Fällen kann vorteilhaft sein. In diesem Fall wird PEG zu einer Probe hinzugegeben, um eine endgültige Konzentration von 10% (Gew./Vol.) zu erreichen. PEG 8000 wird bevorzugt. Fachleute auf dem Gebiet wissen, welcher pH, welche Ionenstärke und welches Standardfällungsverfahren gewählt werden muss, um diese Stufe erfolgreich durchzuführen.
Gewinnen von Plasmid-DNA
Plasmid-DNA wird auf herkömmliche Art mittels Zentrifugation oder Filtration, wie oben bei der Gewinnung partiell gereinigter DNA beschrieben, gewonnen.
Lösen von Plasmid-DNA-Pellet in Puffer
Plasmid-DNA wird in einem Puffer, vorzugsweise einem GRAS-Pufferwirkstoff, gelöst und für die endgültige Reinigung vorbereitet.
Nachdem zahlreiche Wirtsverunreinigungen wie chromosomale DNA, RNA, Lipopolysaccharide und Protein abgetrennt wurden, wird eine Probe erhalten, die reich an Plasmid-DNA ist und dennoch kleine RNA-Oligonucleotide, Spurenmengen an chromosomaler DNA, Protein, Endotoxinen sowie Verarbeitungsrückstände enthalten kann. Gemäß der Erfindung kann eine weitere Reinigung als unabhängiger Schritt erfolgen, durch den das Produkt von restlichen Nucleinsäuren, Makromolekülen und kleinen Molekülformen und Rückständen befreit wird, und darüber hinaus kovalent ringgeschlossene DNA, d. h. Superhelix-Monomere, von genickten ringförmigen Plasmiden (entspannten Monomeren) und verketteten Formen (Superhelix-Dimeren, etc.) isoliert wird. Gegen Ende dieses Schrittes wird ein Chromatographieverfahren durchgeführt. Unterschiede in Ionenladung, Molekülgröße und/oder anderen Merkmalen werden dazu genutzt, eine Reinigung der gewünschten Plasmid-DNA-Art herbeizuführen. Chromatographie ist so zu verstehen, dass sie Ionenaustausch-, Größenausschluss-, Umkehrphasen-, Hydrophob-, Affinitätschromatographie oder ähnliche Arten von Chromatographie sowie beliebige Kombinationen dieser Verfahren umfasst, durch die eine endgültige Reinigung der Plasmid-DNA erzielt wird.
Größenausschluss-Chromatographie auf Pharmacia S-1000 entfernt restliche Verunreinigungen (hochmolekulare Formen von DNA, RNA, Protein und Endotoxinen)
Größenausschluss stellt ein einfaches und reproduzierbares chromatographisches Verfahren dar. Es hat sich, dadurch dass es in der Lage ist, präzise und reproduzierbar verunreinigende RNA, chromosomale DNA, Protein und Endotoxine sowie auch verschiedene Plasmid-DNA-Arten zu trennen, als ein geeigneteres Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA erwiesen. Beispiel 8: Größenausschluss, auch bekannt als Gel-Filtration (und sterischer Ausschluss), verkörpert folglich eine bevorzugte Ausführungsform des Chromatographie-Schritts.
Ein Produktplasmid von Interesse weist ein Molekulargewicht auf, das im Bereich des Molekulargewichts von VCL-1005, d. h. 3 × 10⁶ kD, liegt, und obwohl dieses Plasmid eine Größe von etwa 5 kb aufweist und obwohl Plasmide etwa halb so groß oder 3-, 4-oder 5-mal so groß sein können, variiert das Molekulargewicht eines Plasmids nur etwa um eine logarithmische Einheit variieren. Im Gegensatz dazu haben Endotoxine ein durchschnittliches Molekulargewicht von 50.000 kD. Demgemäß wurde angenommen, dass sich das Produkt von den Endotoxinen durch einen Größenausschluss leicht trennen lassen sollte. So zeigte auch Agarose-Gel-Analyse, dass die Hauptverunreinigungen größtenteils durch Unterschiede im Molekulargewicht vom Produkt unterscheidbar waren. Diese Merkmale gemeinsam machen Größenausschluss-Chromatographie zu einer attraktiven Reinigungsalternative.
Chromatographische Reinigung von DNA wirft jedoch neue Probleme auf. Die Oberflächenladungsverteilung auf der DNA unterscheidet sich stark von der auf einem Protein. Proteine weisen Domänen mit einzigartigen Raumladungsmerkmalen auf, die zusammen mit Ionenaustauschmatrices dazu verwendet werden können, hochauflösende Trennungen zu erreichen. Die DNA besitzt jedoch eine einheitlich negativ geladene Oberfläche ohne die für Proteine charakteristischen Domänen. Plasmid-DNA ist zudem, wie oben beschrieben, sehr groß. Die meisten im Handel erhältlichen Ionenaustauschmatrices haben Porengrößen von 300 bis 1000 Å, für Plasmid-DNA werden jedoch zumin dest Poren mit 4000 Å benötigt. DNA bindet sich gut an großporige Anionenaustauschmatrices, und RNA lässt sich leicht mittels eines einfachen Salzgradienten von Plasmid-DNA trennen. Endotoxine, Plasmid-Concatemere und Wirtszellen-DNA verschleifen über den Plasmid-Peak. Aus diesen Gründen ist der Anionenaustausch durch die im Handel erhältlichen Matrices sowie die durch die Struktur/Ladung von DNA gegebenen Grenzen eingeschränkt, obwohl das Verfahren für die partielle Reinigung und/oder Konzentration von Plasmid-DNA nützlich sein kann und auch als solches vorgesehen ist.
Die Vorteile der Größenausschluss-Chromatographie werden zudem durch seine Eignung als letzter Feinreinigungsschritt bei Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln ergänzt. Verunreinigungen mit geringem Molekulargewicht, wie z. B. Metalle und Salze, werden im Allgemeinen verlässlich entfernt, um ein Produkt mit reproduzierbarer Zusammensetzung zu erzeugen. Aus den angeführten Gründen wurde die Entscheidung getroffen, Größenausschluss zu untersuchen.
Als Größenausschluss-Medium wurde Pharmacia S-1000 (Pharmacia, Piscatatway, NJ) ausgewählt, da es eine im Handel erhältliche Matrix mit molekularen Ausschlusseigenschaften ist, die mit einem hochgewichtigen Produkt kompatibel ist. Das Material besitzt laut Pharmacia eine DNA-Ausschlussgrenze von 20.000 bp. Es stellte sich heraus, dass durch Größenausschluss-Chromatographie mittels Pharmacia S-1000 Rest-Verunreinigungen entfernt werden und verschiedene Plasmid-DNA-Arten vorzüglich unterschieden werden konnten (Beispiel 8). Somit ist das Gel-Filtrationsmaterial nicht eingeschränkt, solange es die Trennung eines äußerst hochmolekularen Produkts ermöglicht und sich vorzugsweise auf eine Pharmacia 5-1000 Matrix oder ein Derivat, eine Alternative oder ein Äquivalent davon beläuft.
Gemäß diesem Schritt wird die Probe dann auf eine Chromatographie-Säule geladen. Die Trennung erfolgt üblicherweise isokratisch, d. h. unter Verwendung einer einzigen mobilen Phase. Puffer für Molekültrennungen sind, wie es Fachleute auf dem Gebiet bekannt ist, wässrige Puffer in geeigneter Ionenkonzentration und pH. Das Volumen der Probe sollte sich in einem geeigneten Prozentsatz des Säulenbettvolumens bewegen. Die Durchflussgeschwindigkeiten werden bei geeigneten Geschwindigkeiten gehalten, und die Chromatographie wird mittels üblicher chromatographischer Verfahren durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform des Chromatographie-Schritts werden Plasmid-DNA-Moleküle durch Ionenaustausch-Chromatographie von verunreinigenden Molekülen auf der Basis von molekularer Ionenladung oder des isolelektrischen Punkts (pl) bei einem gegebenen pH getrennt. Ionenaustausch-Säulen können mit positiv geladenen Harzperlen (für Anionenaustauscher) oder negativ geladenen Harzperlen (für Kationenaustauscher) gefüllt werden, um die Trägermatrix auszubilden. Die Ladungsdichte und pl der Moleküle wird die ionische Kapazität der Trägermatrix, die sich für die Trennung der Moleküle eignet, bestimmen.
Ionenaustauschvorgänge können mit zwei unterschiedlichen mobilen Phasen oder Puffern (d. h. unter Gradientenbedingungen) durchgeführt werden. Als Ausgangspuffer kann ein Puffer mit niedriger Salz- oder Ionenkonzentration verwendet werden. Der Elutionspuffer kann eine deutlich höhere Ionenkonzentration als der Ausgangspuffer aufweisen. Der Betriebs-pH kann durch die Probenlöslichkeit und die Stabilität der Trägermatrix bestimmt werden. Ein Ionenaustauscher kann z. B. bei einem pH von etwa 6 bis 11 betrieben werden, und ein linearer Gradient kann bei etwa 0,3 bis 1,0 M NaCl gebildet werden. Mit Wasser mischbare organische Lösemittel (z. B. Acetonitril) können zur Verringerung der Retentionszeit eingesetzt werden, wobei die Verwendung organischer Lösemittel jedoch vorzugsweise vermieden wird, so dass eine Lagerung von organischem Chemieabfall von vornherein ausgeschlossen ist.
In einer anderen Ausführungsform wird Affinitätschromatographie eingesetzt, um Moleküle auf der Basis ihrer spezifischen Aktivität zu trennen. Affinitätschromatographie kann mit einer Reihe unterschiedlicher Matrixarten durchgeführt werden. Zu Affinitätsträgern gehören Träger, die ein Molekül kovalent binden können, sowie Träger, die einen Liganden enthalten, der an den Träger gebunden ist, um durch den Liganden erkennbare Moleküle zu reinigen. Die Selektivität und Bindungseigenschaften des Affinitätsträgers werden durch die zu trennenden Moleküle bestimmt.
Die Bedingungen, die gegeben sein müssen, um Moleküle an eine Affinitätssäule zu binden bzw. sie von dieser zu eluieren, sind auch von Molekül zu Molekül unterschiedlich. Im Allgemeinen kann die Affinitätsreinigung eines Moleküls mit einfachen Stufengradienten erfolgen, was ein Binden an einen Puffer, den Bindungspuffer, sowie das Freisetzen des Moleküls mit einem anderen, dem Elutionspuffer, umfasst. Wenn die Bindungs- und Elutionscharakteristika eines Moleküls unbekannt sind, ist es nützlich, lineare Gradienten mit steigendem Salz- oder pH-Gehalt laufen zu lassen, um die Reinigung zu optimieren. Eine logische Abfolge von Elutionsbedingungen sind Säureelution, Basenelution oder chaotrope Stoffe. Nachdem ein Elutionsmittel ausgewählt worden ist, können die Elutionsbedingungen durch eine Optimierung der Konzentration, Zeit und Temperatur verfeinert werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird Hydrophob-Chromatographie herangezogen, um Moleküle auf Basis von Unterschieden in ihrer Oberflächenhydrophobie zu lösen. (Umkehrphasen-Chromatographie macht sich im Allgemeinen dieselben Eigenschaften zunutze, wird jedoch, da sie ein organisches Elutionslösemittel benötigt, weniger bevorzugt). Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Gruppen und hydrophoben Liganden, die an eine chromatographische Matrix gebunden sind, ermöglichen diese chemische Wirkung, und machen sie besonders geeignet dafür, in einer entsalzenden Kapazität eingesetzt zu werden. Die Matrixart, die Beschaffenheit der hydrophoben Gruppen und die Absorptions- und Elutionsbedingungen können an die einzigartigen Eigenschaften der involvierten Moleküle angepasst werden.
Auswahl und Gebrauch jeder beliebigen Chromatographie-Ausführungsform, die hierin vorgesehen ist, obliegt den Fachleuten auf diesem Gebiet. Chromatographie-Verfahren können Technologien auf Siliciumoxid- oder Polymerbasis anwenden. Diese Anwen dungsformen der Chromatographie sind mit HPLC- und FPLC-Systemen kompatibel. Elutionskurven können kontinuierlich aufgezeichnet werden oder durch die Untersuchung einzelner Fraktionen durch z. B. UV-Absorption, Agar-Gelelektrophorese und andere analytische Verfahren bestimmt werden.
Vereinigung von Fraktionen Produkt enthaltende Fraktionen können vereinigt werden, um pharmazeutisch verwendbares Plasmid-DNA-Material zu erhalten.
Pharmazeutisch verwendbare Plasmid-DNA
Nachdem pharmzeutisch verwendbare Plasmid-DNA erzeugt wurde, kann sie in einem Formulierungspuffer, wie Ringer-Lactat-Injektions-Vehikel oder einem anderen unschädlichen gepufferten Beförderungs-Vehikel, gelöst werden, oder gefällt oder konzentriert werden und dann in einem Formulierungspuffer mittels bekannter Verfahren aufgenommen werden, was Fachleuten auf diesem Gebiet klar ist.
In diesem Stadium kann eine Lösung, die pharmazeutisch verwendbare Plasmid-DNA enthält, sterilisiert werden. Jedes beliebige Sterilisationsverfahren kann dazu herangezogen werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Sterilisation mittels Filtration.
Es kann ein Filtermaterial verwendet werden, das sich dadurch auszeichnet, dass es Poren mit einem Durchmesser besitzt, der einerseits groß genug ist, um das Filtrat effizient durchfließen zu lassen, und andererseits klein genug ist, so dass das Filtermaterial luftübertragene Mikroorganismen und dergleichen, die während der Verarbeitung eingeführt wurden, zurückhält. Dementsprechend liegen die Porengrößen vorzugsweise zwischen 0,01 und 10 μm, noch bevorzugter zwischen 0,1 und 1 μm. Das Material, aus dem das Filter besteht, kann ein synthetisches Material oder ein organisches oder anorganisches natürliches Material sein, das jedoch nicht dazu neigen sollte, die Plasmid-DNA zu binden. Zudem sollte es Substanzen, die mit der Plasmid-DNA durch den Filter fließen sollen, wie z. B. Inhaltsstoffe, aus denen sich der Formulierungspuffer zusammensetzt, und dergleichen, nicht einschränken, und auch nicht pyrogen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das Filtermaterial eine durchschnittliche Porengröße von etwa 0,2 μm. Es ist zudem wichtig, dass das Filter steril ist.
Sterilisation kann vorteilhaft unter aseptischen Bedingungen in einer Klasse-100-Abzugshaube oder dergleichen durchgeführt werden. Es ist zu erwägen, dass die Plasmid-DNA entweder vor oder nach der Sterilfiltration gefällt oder konzentriert werden und in einem Formulierungspuffer resuspendiert werden kann. Es ist ebenfalls zu erwägen, dass schließlich das Endprodukt während der aseptischen Verarbeitung in Phiolen abgefüllt werden kann, die Phiolen versiegelt und etikettiert werden und das Medikamentenprodukt für die therapeutische Verabreichung, z. B. In-vivo- oder Ex-vivo-Gentherapie, vertrieben wird.
Spezielle Aspekte der Erfindung durch Verweis auf die folgenden Beispiele besser verständlich, die dazu dienen, die Erfindung zu veranschaulichen ohne dadurch den Schutzumfang der Erfindung auf die jeweiligen dargestellten Ausführungsformen zu beschränken.
BEISPIEL 1. Beschreibung von VCL-1005.
VCL-1005 bestand aus Plasmid-DNA (eine Plasmidkarte ist als 1 beigefügt). Die Plasmid-DNA wurde aus pBR322-Plasmid gewonnen, und kodierte für ein menschliches MHC-Gen, HLA-B7. Das Plasmid wurde mittels bakterieller Fermentation hergestellt.
Dieses kovalent ringgeschlossene (vorwiegend Supercoiled-) DNA-Makromolekül wurde durch Biosynthese in Bakterienzellen hergestellt, die in einem Auswahlmedium gezüchtet wurden, das die Expression des Kanamycinresistenz-Proteins, für das durch einen Abschnitt der Plasmid-DNA kodiert wird, erfordert. Danach wurde die DNA von im We sentlichen allen anderen Zellmaterialien gereinigt. Das Plasmid hatte ein Größe von etwa 5000 bp, was in einem Molekulargewicht von etwa 3 × 10⁶ g/Mol resultierte.
Zusätzlich zum bakteriell exprimierten, genkodierenden Kanamycinresistenz-Protein (Tn903), kodierte die Plasmid-DNA auch für die schweren (menschliche HLAB7-cDNA) und leichten (Schimpansen-B-2-Mikroglobulin-cDNA) Proteine eines Klasse-l-Haupt-Histokompatibilitätskomplexes, bezeichnet als HLA-B7. Diese zwei Proteine wurden auf bicistronischer mRNA exprimiert. Die eukaryotische Zelltranskription dieser mRNA hing von einer Rous-Sarkom-Virus-Promoter-Sequenz, die aus dem 3' LTR ("Long Terminal Repeat", der langen terminalen Wiederholung) gewonnen wurde, und von einer Transkriptionstermination/Polyadenylierung-Signalsequenz ab, die aus dem Rinderwachstumshormon-Gen gewonnen wurde. Die eukaryotische Zellexpression der schweren Kette wurde durch die 5'-CAP-abhängige Protein-Translations-Startstelle reguliert, die Expression der leichten Kette durch eine CAP-unabhängige Translations-Enhancer-Sequenz, die vom Encephalomyokarditis-Virus abstammte. Die Replikation des Plasmids in Bakterienzellen, letztendlich, wurde durch die Anwesenheit eines Bakterien-Replikationsursprungs kontrolliert.
Die jeweiligen Herstellungen gereinigter Plasmid-DNA wurden nach der Konzentration unterschieden, die auf optischen Dichte-Absorptionsmessungen mittels einem Spektralphotometer mit einer Lichtquelle beruhte, die auf 260 Nanometer eingestellt wurde (1 Absorptionseinheit = 50 μg doppelsträngiger DNA). Plasmid-Größe und Prozentanteil an kovalent geschlossenem kreisförmigem Produkt wurde durch elektrophoretische Migration, entsprechend bekannter Standards, mit Agarose-Gelen. Eine zusätzliche Charakterisierung wurde durch den Einsatz selektiver Restriktions-Endonucleasen-Digestion der Plasmid-DNA mit nachheriger Trennung und Dimensionierung der vorhergesagten DNA-Fragmente durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Die Expression der kodierenden Sequenzen wurde durch das Wachstum der transformierten Bakterienzellen in einem Auswahlmedium (auf Kanamycin-Resistenz) und durch einen FAC-Antigen-Präsentationsansatz von schweren und leichten Ketten des HLAB7 auf VCL1005-Plasmid-DNA- DMRIE/DOPE transfizierten eukaryotischen Zellen, die in einer In-vitro-Zellkultur gezüchtet wurden.
BEISPIEL 2. Konstruktion von VCL-1005.
VCL wurde aus unabhängigen DNA-Segmenten, die in einer Bakterien-Plasmid-DNA mit hoher Kopienanzahl geklont wurden, aufgebaut. Das Plasmid war so gestaltet, dass seine Sequenz ein hohes Replikationsniveau in Bakterienzellen ermöglichen, während der Bakterienzellkultur ein dominierendes, wählbares Resistenzprotein exprimieren, sowie bei der Einführung in eukaryotische Zellen ein hohes Expressionsniveau an den beiden Klasse-1-MHC-Komponenten-Proteinen HLA-B7 und B-2 Mikroglobulin ermöglichen. Jede der Komponenten wurde mittels molekularbiologischer Standardverfahren in das Haupt-Plasmid und im Handel erhältlicher Restriktions-Endonucleasen sowie anderen DNA-Modifikationsenzymen (z. B. Escherichia coli (Klenow-Fragment) DNA-Polymerase, Bakteriophagen-T7-DNA-Polymerasen, Bakteriophagen-T4-Ligase, etc.) subkloniert. Subklonierte Produkte wurden mittels Restriktions-Endonucleasen-Kartierung und DN-Junktions-Sequenzanalyse auf Übereinstimmung und Orientierung untersucht. Das endgültige Plasmid-DNA-Medikament wurde auf beiden DNA-Strängen vollständig sequenziert. Alle nachfolgenden Verweise auf Domänen der VCL-1005 DNA basieren auf dem ersten Nucleotid, das aus dem RSV-Promoter, 5'-Ende, der frei gewählt als #1 bestimmt wurde, gewonnen wurde.
Die Haupt-Plasmid-DNA wurde aus einem in der Molekularbiologie weithin verwendeten Vektor pBR322 gewonnen, dessen Replikationsursprung aus natürlich vorkommendem Bakterien-Plasmid ColiE1 (Bolivar, R., et al. Gene 2, 95-113 (1997)) stammte. Das im VCL-1005-Plasmid verwendete 952 bp Fragment von pBR322 repräsentierte den Bereich von der Basennummer 2244 (Acc1-Restriktions-Endonucleasen-Stelle, stumpfendig) bis zur Basennummer 3193 (BspH1 Restriktions-Endonucleasen-Stelle), wobei die einzigartige EcoR1-Restriktions-Endonucleasen-Stelle als pBR322-Base 1 herangezogen wurde. Dieses Haupt-Plasmid wurde zwischen der Basennummer 4013 und 4965 von VCL-1005-DNA aufgefunden und enthielt einen Bakterien-Replikationsursprung. Es ent hielt keine offenen Leseraster ("open reading frame", ORF), dessen Expression in Bakterien- oder Tierzellen bekannt wäre.
Die eukaryotische Gen-Expression wurde durch die Avian Rous-Sarkom-Virus- (RSV-) 3'-LTR-Promotersequenz reguliert. Diese Sequenz wurde aus dem Schmidt-Ruppin-Strang des RSV (Swanstrom, R., et al., Proc. Nat. Acad. Sci, U.S.A. 78, 124-128 (1981)) gewonnen und durch Isolierung der DNA, die durch die Pvu-11-Stelle bei der viralen Basennummer 8673 und die Bfa-I-Stelle bei der viralen Basennummer 9146 gebunden war, kloniert. Die Verwendung dieser Promotersequenz als Expressionsregulator für heterologe Gene in eukaryotischen Zellen wurde vor mehr als 10 Jahren von Gorman, C., et al. (Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 79, 6777-6781 (1982)) beschrieben. Das in der Konstruktion des VCL-1005-Plasmids eingesetzte RSV DNA-Fragment wurde aus dem pRSVβ-Globin (Gorman, C., et al., Science 221, 551-553 (1983)) genommen. Obwohl diese Regulationssequenz in einem Vogelretrovirus aufgefunden wurde, wurde diese 3'-LTR untersucht, wobei es sich gezeigt hat, dass sie weder in Vogel- noch in Säugetierzellen eigene onkogene Aktivität besitzt (Westphal, C., et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 411-416 (1985)). Der RSV LTR-Promoterbereich repräsentierte im VCL-1005 die Basenpaare 1 bis 529. Dies umfasste eine Basenpaarregion 56 einer chemisch synthetisierten Oligonucleotid-DNA, die diese Regulationssequenz modifizierte, um ein höheres Niveau an eukanotischer Zellexpression der stromab liegenden Kodierungssequenzen zu erzielen. Das Oligonucleotid entfernte eine Poladenylierungs-Signalsequenz (d. h. AATAAA mit TCTAGA, ein Xba I Restriktions-Endonucleasen-Stelle), die ursprünglich in der RSV DNA-Sequenz vorhanden war. Es führte zudem eine starke Translations-Signalsequenz ein (Kozak, M., et al., Nucleic Acids Res. 15, 8125 (1987)), die proximal zum Translations-Initiationscodon ATG war. Darüber hinaus wurde dieses synthetische Oligonucleotid dazu verwendet, um eine Reihe von Restriktions-Endonuclease-Stellen (d. h. SalI, HindIII, NcoI) einzubauen, um das Subklonieren der 5'- und 3'-DNA-Elemente zu erleichtern.
Die Klasse-1-MHC-Kodierungssequenzen für menschliche HLA-B7- und B2- Mikroglobulin-Proteine wurden 3' an die oben beschriebene RSV-LTR angebracht. Die eukaryotische Transkription eines einzigen bicistronischen mRNA-Moleküls wurde durch den RSV-Promoterbereich reguliert. Die Translation dieser bicistronischen mRNA erfolgte sowohl durch eine CAP-abhängige als auch eine CAP-unabhängige Ribosomen-Erkennungssequenz. Das CAP-unabhängige Signal wurde aus dem murinen Encephalomyocarditis- (EMC-) Virus-Genom entnommen und wurde zwischen den schweren und leichten HLA-B7-Ketten kloniert.
BEISPIEL 3. Fermentation von VCL-1005.
Das Fermentationsverfahren wurde in Form einer 10-L Batch-Fermentation in einem TB-Medium (komplett, das antibiotische Kanamycin enthaltend) in einem Braun-Fermenten durchgeführt.
a. Inokulum-Zubereitung
Mittels 0,1 ml einer gefrorenen Aliquote des Escherichia coli-Strangs DH10B als Glycerin-Stammlösung, die das Antibiotikum Kanamycin enthielt, wurde ein 2-L Kolben gefüllt mit 1-L TB-Medium (komplett) inokuliert. Das TB-Medium wurde dadurch zubereitet, dass 24 g Hefeextrakt und 12 g Trypticase-Pepton in einen 2-L Schüttelkolben gegeben wurden. Dann wurden 900 ml entionisiertes Wasser in die Kolben gefüllt und gründlich gemischt. Sobald sämtliche Inhaltsstoffe in Lösung waren, wurden 4 ml Glycerin begegeben und das Ganze gründlich vermischt. Die Kolben wurde verschlossen und der Stöpsel mit Sterigard-Papier überzogen. Die Kolben wurde daraufhin bei nicht weniger als 121°C für 30 min. autoklaviert. Als das Medium abgekühlt war, wurden 50 mg steriles Kanamycin sowie 100 ml sterile Phosphat-Lösung hinzugegeben. Die Phosphat-Lösung wurde durch Lösen von 12,5 g K₂HPO₄ und 2,3 g KH₂PO₄ in 100 ml entionisiertem Wasser in einem 500-ml Kolben hergestellt. Der Kolben wurde verschlossen und der Stöpsel mit Sterigard-Papier überzogen. Der Kolben wurde dann bei nicht weniger als 121°C für 30 min. autoklaviert. Durch die Zugabe des Kanamycins und der Phosphat-Lösung war das TB-Medium komplett. Der inokulierte Kolben wurde bei 37°C und 300-400 U/min für 10-20 Stunden in einer Schüttelinkubatorkammer geschüttelt.
b. Fermenter-Zubereitung
Der Braun-Biostat-ED-Fermenter wurde mit einer Lösung von Natriumhydroxid gereinigt, mit Phosphorsäure gewaschen und dann mit entionisiertem Wasser gründlich ausgespült. Die pH-Probe wurde durch Immersion des Ganzen in einen pH 7,0 Standardpuffer und folglich einen pH 4,0 Standardpuffer kalibriert. Zum Fermenter wurden 6 l entionisiertes Wasser hinzugegeben. Als nächstes wurden 240 g Hefeextraktpulver und 120 g Trypticase-Pepton dem Fermenter zugefügt. Um das Auflösen des Pulvers zu erleichtern wurde der Agitator betätigt. Nun wurden dem Fermenter 40 ml Glycerin und 1,5 ml Demulgator beigegeben. Die Wände des Fermenten wurden mit entionisiertem Wasser abgespült und das Volumen auf 9 l gebracht. Der Fermentrn-Inhalt wurde mittels einem automatischen Batch-Kontrollzyklus sterilisiert, und zwar bei 121°C für 30 min. auf Kontrolleinheit.
c. Fermenationsbedingungen
Der Fermenten wurde durch folgende Regelkreise überwacht: pH, gelöster Sauerstoff (DO) und Temperatur. Die Temperatur wurde auf 30°C ± 0,5°C kontrolliert. Die Schüttelgeschwindigkeit wurde auf 600 U/min festgesetzt, der Luftdurchfluss auf 1 ± 0,1 v/v/m, und der pH lag bei 7,0 ± 0,5.
d. Fermentationsinokulation
Es wurde sichergestellt, dass alle Regelkreise am Fermenten eingeschalten waren und korrekt funktionierten. Ein Septum auf der Deckplatte des Fermenters wurde mit dem sterilisierten Inokulationsverbindungsstück des Herstellers, das zwischen 3,3 und 4 Fuß maß und an dem 3/32-ID Siliconschläche befestigt waren, durchstochen. Ein steriler Schlauch wurde dazu verwendet, 1 l Phosphat-Lösung in den Fermenten einzufüllen. Mit einem zweiten sterilen schlauch wurde das Inokulum in den Fermeter eingeführt. Der dritte sterile Schlauch war für die pH-Kontrolle reserviert, falls nötig. Alle Lösungen wurden mittels einer peristaltischen Pumpe in den Fermenten eingeführt. Die sterile Kanamycin-Lösung (50 mg/ml, d. h. 500 mg/Fermenter) wurde der Phosphat-Lösung zugesetzt.
e. Fermentation und Zellernte
Die Fermentation wurde mit den oben angeführten Parametern unter automatischer Kontrolle durchgeführt. In bestimmten Intervallen wurden Proben der Fermentationsbrühe aus dem Ernteventil entnommen, und die Fermentation war abgeschlossen, wenn die OD600 bei 20 oder darüber lag. Die Zellen wurden dadurch aus dem Fermenten geerntet, dass Brühe aus dem Ernteventil in geteerte 1-L-Zentrifugenkolben gesaugt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bis zu 4900 U/min für 30 min konzentriert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde abgegossen, und das Gewicht der Kolben gemessen, um die Zellausbeute zu bestimmen.
BEISPIEL 4. Reinigung von VCL-1005
VCL-1005 wurde mittels dem folgenden Verfahren gereinigt:
a. Zell-Lyse
Die Zellpaste wurde in 7 ml Lösung l (61 mM Glucose + 25 mM Tris-Puffer pH 8,0 + 10 mM EDTA pH 8,0) pro Gramm nassen Bakteriengewichts mit einem Magnetrührer bei Raumtemperatur resuspendiert. Dieser Lösung wurden 14 ml Lösung II (0,2 NaOH + 1% SDS) pro nasses Bakteriengewicht hinzugegeben. Diese Lösung wurde dann gerührt bis eine klare viskose Lösung enstand. Diese lysierte Zelllösung wurde für 10 min ohne zusätzliches Rühren auf Eis inkubiert, um ein Verschieben der chromosomalen DNA zu verhindern. Zu der lysierten Zelllösung wurden 10,5 ml eiskalte Lösung III (3 M Kaliumacetat, pH 5,0) pro nasses Bakteriengewicht zugegeben, wobei diese Lösung dann invertiert, stark geschüttelt und für 10 min auf Eis inkubiert wurde.
b. Filtration
Das Lysat wurde vorsichtig durch zwei Schichten Miracloth^® filtriert, um die Bakterienzellwand zu entfernen. Dieser Schritt wurde noch 3-mal mit jeweils 16 Schichten Miracloth^® wiederholt. Das Roh-DNA-Filtrat wurde mit 0,6 Volumen kaltem Isopropanol (etwa -20°C) gefällt, wobei etwa 200 ml auf einmal hinzugegeben, das Ganze gerührt und bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden inkubiert wurde. Der rohe Nucleinsäure-Niederschlag wurde durch Zentrifugation bei 12000 U/min und 5°C für 30 min gesammelt. Nachdem der Flüssigkeitsüberstand abgeschieden worden war, wurde das Pellet für 15 min dräniert und dann aufgerichtet, um für 5 min luftgetrocknet zu werden. Das DNA-Pellet wurde komplett in TE-Puffer (0,01 M Tris-Base + 0,001 M EDTA pH 8,0) resuspendiert, wobei etwa 1 ml TE-Puffer pro ursprünglichem nassen Bakteriengewicht verwendet wurde.
c. Entfernung von RNA und Lipopolysacchariden
Nachdem das Pellet wie oben beschrieben in TE-Puffer resuspendiert worden war, wurden 0,29 g Ammoniumacetat pro ursprünglichem nassen Bakteriengewicht in der DNA/ TE-Resuspension gelöst, so dass die endgültige Konzentration bei 2,5 M lag. Falls nötig wurde zusätzlicher TE-Puffer hinzugegeben, um das Volumen zu korrigieren. Dieses Gemisch wurde für 15 min auf Eis inkubiert, und danach wurde das Verfahren entweder fortgesetzt oder über Nacht bei 4°C aufbewahrt.
Das Gemisch wurde bei 10.000 U/min für 20 min zentrifugiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde durch eine 0,8 μ Membran filtriert, und danach wurde eine gleiche Menge an Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol (25 : 24 : 1) zugegeben. Diese Phenol/usw.-Verbindung einem Magnetrührer für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Verbindung wurde kurz bei 5000 U/min zentrifugiert, um eine Trennung der wässrigen und der organischen Phase zu erreichen. Die obere wässrige Phase wurde gesammelt und die DNA durch Zusatz von 2 Volumen -20°C Ethanol gefällt, gemischt und bei -20°C für mindestens 1 Stunde oder über Nacht inkubiert.
Das Niederschlag enthaltende Material wurde bei 12.000 U/min für 30 min zentrifugiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde abgeschöpft, das übrigbleibende Pellet für 15 min dräniert und dann für 5 min luftgetrocknet. Das Pellet wurde unter in einen TE-Puffer in einer Menge von 0,5 ml pro ursprünglichem nassen Bakteriengewicht resuspendiert.
Zum resuspendierten Pellet wurde Natriumacetat bei einem pH von 5,2 hinzugegeben, bis eine endgültige Konzentration von 1,1 M erreicht wurde. Dann wurden 30% PEG in 1,6 M NaCl zu dieser Lösung beigemengt, so dass die endgültige Konzentration bei 4 PEG lag. Dieses PEG enthaltende Material ließ man bei 4°C für mindestens 8 Stunden inkubieren.
d. Endgültige DNA-Fällung
Nach der 4%igen PEG-Fällung wurde das Material bei 12.000 U/min für 30 min zentrifugiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde in eine saubere Kolben abgeschöpft und zusätzliche 30% PEG in 1,6 M NaCl zugegeben, so dass die endgültige PEG-Konzentration bei 10% lag. Dieses PEG enthaltende Material wurde bei 4°C für zumindest 8 Stunden inkubiert, und danach wie oben dargestellt zentrifugiert. Das Pellet wurde dräniert und anschließend in eine geringe Menge (< 10 ml) TE-Puffer resuspendiert. Zuerst wurde ein Zehntel von 3 M Natriumacetat pH 5,2 und danach 2 Volumen kaltes (etwa -20°C) Ethanol hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde bei -20°C für mindestens 1 Stunde inkubiert. Es wurde bei 12.000 U/min bei 4°C für 30 min zentrifugiert und in einer geringen Menge Säulenpuffer (Details siehe unten) resuspendiert.
e. Gel-Filtrations-Chromatographie
Eine Pharmacia 5-1000 (Pharmacia, Piscataway, NJ) Größenausschluss-Tandemsäule wurde in 2 Pharmacia XK26/100 Säulen gegossen, so dass eine endgültige Betthöhe von 80-85 cm (2,6 × 80 cm) gegeben war und jede der Säulen ein Gesamtsäulenvolumen von etwa 900 ml aufwies. Die Säulen wurden jeweils in eine Richtung druckgepackt, umgedreht und für die Äquilibrierung und Betrieb hintereinandergeschaltet. Die Säule wurde in TE + 150 mM NaCl, pH 8,0 äquilibriert und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,75 ml/min oder 17 cm/h betrieben.
Die partiell gereinigte Plasmid-DNA, die in obigem Puffer bei weniger als 1% des Gesamtsäulenvolumens gelöst war, wurde über ein steriles, nicht-pyrogenes 0,22 μm-Spritzenfilter filtriert und die Säule damit beladen. Der Säulenbetrieb und die Fraktionssammlung wurden automatisch mittels einer Pharmacia FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ) durchgeführt. Die Elution des Produkts (supercoiled Monomer) setzte bei 0,3 bis 0,4 Säulenvolumen mit einer leichten Überlappung direkt nach dem Dimer ein. Je nach Gesamtladung der Säule beendete das Produkt die Elution bei 0,5 bei 0,6 Säulenvolumen.
Fraktionen (etwa 0,5-1% des Säulenvolumens) wurden über die der Produktelutionszone abgenommen und bei 0,8% Agarose-Gel analysiert. Durch die Gel-Analyse wurde der exakte Produktelutionsbereich bestimmt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und mit 2 Volumen kalten Ethanols über Nacht bei -20°C gefällt.
Die mit Ethanol gefällten Fraktionen wurden bei 12.000 U/min bei 4°C für 30 min zentrifugiert. Die Pellets wurden in einer Laminarflusshaube für 15 min dräniert, umgedreht und für 5 min luftgetrocknet. Das Pellet wurde in Ringer-Lactat-Infusionslösung USP resuspendiert, so dass die endgültige Konzentration bei etwa 1 mg/ml lag. Dies ergab pharmazeutisch verwendbare Plasmid-DNA. Eine Probe wurde an die Qualitätskontrolle weitergeleitet und der Rest entweder gelagert oder die Konzentration für eine Verabreichung und sterile Abfüllung angepasst.
Nach der Chromatographie wurden die Säule und FPLC mit einem Säulenvolumen von 0,1 M NaOH sterilisiert.
BEISPIEL 5. Herstellung eines mit Plasmid angereicherten Rohlysats ohne Verwendung von Reagenzien, nicht allgemein als unbedenklich anerkannt sind.
600 ml von 0,2 M Natriumacetat, pH 8,2 wurden zu 200 g nasser Zellpaste zugegeben. Dieses Gemisch wurde für etwa 5 bis 10 min sanft gemischt, um eine homogene Zellsuspension zu erreichen. Zur homogenen Zellsuspension wurden 500 ml einer 0,2 M Natriumhydroxid- und 1% Tween^® 80-Lösung (Gew./Vol.) hinzugefügt. Diese Suspension wurde für etwa 5-10 min leicht gemischt, um ein Lysat zu erhalten. 2000 ml an entionisiertem Wasser wurden zum Lysat hinzugegeben. Dann wurde Eisessig bis zu einem pH von 5,0 zugeführt. Daraufhin wurden Zelltrümmer mittels Filtration entfernt. Zum Filtrat wiederum wurden 1200 ml kaltes (etwa -20°C) Isopropanol beigemengt, um einen mit Plasmid angereicherten, partiell gereinigten DNA-Niederschlag zu erhalten.
BEISPIEL 6. Herstellung partiell gereinigter DNA, die ohne Verwendung von Alkoholen oder Zentrifugation mit Plasmid angereichert ist.
a. Zell-Lyse
Zuerst wurden 200 g (Nassgewicht) Escherichia coli Zellen über Nacht bei etwa 4,8°C aufgetaut. Die aufgetaute Biomasse wurde in einen 10-L-Ballon gegeben. Nun wurden 1,4 Liter der Lösung l mit 0,05 M EDTA zugegeben und die Zellen solange gemischt, bis sie homogen waren. (Lösung l = 0,025 M Tris-Base, 0,061 M Glucose, pH 8,0).
Als nächstes wurden 2,8 Liter der Lösung II mit einer 0,05 M EDTA zu den Zellen im Ballon hinzugefügt. Die resultierende Suspension wurde durch wiederholtes Umkehren des Ballons gemischt. Der Ballon wurde für 10 min auf Nasseis gestellt. (Lösung II = 1 SDS, 0,2 M NaOH).
Nun wurden 2,1 Liter der Lösung III mit 0,05 M EDTA (vor der Zugabe auf 4-8°C gekühlt) hinzugegeben, und die resultierende Lösung durch wiederholtes Umkehren des Ballons gemischt, bis das flockige Material gleichmäßig verteilt war. Der Ballon wurde wieder für 10 min auf Nasseis gestellt. (Lösung III = 3,0 M K-Acetat, pH 5,0).
b. Filtration
Das Lysat wurde durch zwei Schichten Miracloth^® in einen Büchner-Trichter gegossen, um große Trümmerteilchen zu entfernen. Dieser Vorgang wurde weitere 2-mal wiederholt, wobei jedesmal 16 Lagen Miracloth^® verwendet wurden. Das endgültige Volumen des Rohfiltrats betrug 5,05 Liter.
i. Plasmid-DNA-Fällung mit PEG-8000
Als nächstes wurden unter Rühren 600 g PEG-8000 zum Rohfiltrat hinzugefügt. Das Volumen wurde mit 0,01 M Tris-Base, 0,05 M EDTA, 1,6 NaCl, pH 8,0 auf 6,0 Liter ge bracht. Der endgültige pH der Lösung wurde nicht bestimmt. Dieses Gemisch wurde auf eine endgültige PEG-8000-Konzentration von 10% (Gew./Vol.) gebracht. Der Glasballon wurde auf eine Temperatur von 4,8°C gebracht und über Nacht gerührt.
d. Filtration der Plasmid-DNA
Nach der über Nacht erfolgten Inkubation wurden 120 g (20 g/l) analytisch verwendbarer Celite^®-Filterhilfe (Celite Corp., Lompoc, CA) zum 10% PEG-8000 Plasmid-DNA-Niederschlag hinzugegeben und der Rührvorgang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Während dies gemischt wurde, wurde ein 10-Zoll-Büchner-Trichter aufgebaut, der mit einem grobmaschigen Polypropylen-Sieb ausgestattet war, das einen Durchmesser von etwa 8 Zoll hatte und durch einen Whatman No. 1 Filter oder dergleichen mit einem Durchmesser von 10 Zoll zugedeckt war. Dies wurde mit etwa 1 cm Celite in TE-Puffer vorbelegt. Nachdem der Filtervorbelag aufgebracht worden war, wurden die 6 Liter des partiell gereinigten, 10% PEG-8000 DNA-Niederschlags durch Ansaugung in den Büchner-Trichter eingebracht. Nach erfolgter Filtration wurde der Saugvorgang solange fort gesetzt, bis der die Plasmid-DNA enthaltende Celite^®-Filterkuchen relativ trocken war (10 min).
e. Gewinnung von Plasmid-DNA-Niederschlag
Der Celite^®-Filterkuchen wurde entfernt und unter Rühren in einem Liter 0,01 M Tris-Base, 0,05 M EDTA, pH 8,0 für 1 Stunde suspendiert. Durch diesen Schritt wurde der Plasmid-DNA-Niederschlag, der sich auf dem Filterkuchen gesammelt hatte, gelöst. Zum suspendierten Filterkuchen wurde Ammoniumacetat bis zu einer endgültigen Konzentration von etwa 2,5 M beigegeben. Der Rührvorgang wurde bei etwa 4-8°C für 30 min fortgesetzt. Das Volumen betrug zu diesem Zeitpunkt 1,5 Liter. Das Ammoniumacetat fällte einen Teil der Lipopolysaccharide und RNA-Verungreinigungen. Der resultierende Schlamm wurde noch einmal mittels Büchner-Trichter mit einem Whatman No.1 Filter oder dergleichen genau wie oben beschrieben filtriert. In diesem Schritt wurden die durch das Ammoniumacetat gefällten Verunreinigungen im Celite^®-Filterkuchen aufgefangen und die Plasmid-DNA floss durch hinein zum Filtrat.
f. Endgültige Reinigung von Plasmid-DNA
(An diesem Punkt des Experiments wurde entschieden, das Plasmid-DNA-Filtrat durch Isopropanol-Fällung zu konzentrieren, um das Material zur Bestimmung des Ausmaßes und Spektrums der Verunreinigungen so schnell wie möglich in eine Pharmacia 5-1000 Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) laden zu können. In der Praxis würde die Plasmid-DNA durch Anionenaustausch, Ultrafiltration oder eine zweite PEG-8000-Fällung konzentriert werden).
Es wurden nun 1,5 Liter des Filtrats aus Schritt e gewonnen. Das restliche Celite wurde aus dem Filtrat entfernt, indem es sequentiell durch einen Whatman No. 1 Filter oder dergleichen und dann durch eine 0,8 μm Nitrocellulose-Membran floss.
Anschließend wurden 0,9 Liter kaltes (etwa -20°C) Isopropanol zum endgültigen Filtrat zugegeben, und die resultierende Lösung wurde für 1 Stunde in ein -20°C Gefrierfach gegeben. Die gefällte DNA wurde durch Zentrifugation in einer Sorvall RC3 bei 9000 U/min bei 4°C für 45 min eingesammelt. Der Flüssigkeitsüberstand wurde abgeschöpft, die Pellets dräniert und dann für etwa 15 min luftgetrocknet. Die Pellets, die etwa 1/3 der gewonnenen Plasmid-DNA umfassten, wurden in 5 ml 0,01 M Tris-Base, 0,01 M EDTA, 0,15 M NaCl, pH 8,0 gelöst.
Diese Probe wurde direkt in eine Pharmacia S-1000 Tandemsäule (2,6 cm × 100 cm, Gesamtsäulenvolumen = 900 ml, Pharmacia, Piscataway, NJ) gefüllt, die vorher in 0,01 M Tris-Base, 0,01 M EDTA, 0,15 M NaCl, pH 8,0 äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,75 ml/min oder 17 cm/h betrieben.
Als nächstes wurden beginnend mit 250 ml bis hin zu 650 ml Elutionsvolumen 5 ml an Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden mittels Standard 0,8% Agarose-Gel analysiert und die Fraktionen 28-40 als vorwiegend monomere Supercoiled-Plasmid-DNA vereinigt. Als endgültige Ausbeute lagen 2,1 mg an zu mehr als 95% ringgeschlossener DNA vor.
Diese Schritte wurden mit dem restlichen Plasmid-Konzentrat ebenfalls durchgeführt, wobei 2,4 mg und 3,16 mg gewonnen wurden und die Gesamtausbeute nun bei 7,56 mg lag.
BEISPIEL 7. Verwendung von PEG-8000, um die organische Extraktion durch Phenol/ Chloroform/Isoamyl-Alkohol und ähnlichen organischen Extraktionsmitteln zu ersetzen.
Es wurde festgestellt, dass selektive PEG-Fällung, organische Extraktion und andere Reinigungsverfahren in Bezug auf optimale Gewinnung von Plasmid-DNA und minimale Retention von Verunreinigungen ersetzen kann, um ein höherwertiges partiell gereinigtes Plasmid-DNA-Produkt herzustellen.
a. PEG-8000-Titration
Anhand von mehreren unterschiedlichen PEG-8000-Anteilen wurde die ungefähre Konzentration bestimmt, bei der Plasmid-DNA gefällt werden würde.
Als Ausgangamaterial für dieses Experiment wurde ein geklärtes Lysat herangezogen, das durch Filtration nach Lösung III, wie in obenstehendem Beispiel 6 dargestellt, hergestellt wurde. Die experimentelle Kontrollprobe wurde mit 0,7 Volumen von -20°C Isopropanol behandelt. Eine 30% PEG-8000-Stammlösung, die 1,6 M NaCl umfasste, wurde zubereitet und zum Rohlysat hinzugegeben, um die in der untenstehenden Tabelle angeführten PEG-Konzentrationen zu erhalten.
Die resultierenden Lösungen wurden gut durchmischt und über Nacht in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 10°C gestellt.
Danach wurden die Lösungen für 40 min in einer Sorvall RC3 mittels einem GSA-Rotor bei 10.000 U/min zentrifugiert. Die Kolben wurden dräniert und die Pellets in 5 ml TE + 0,7 M NaCl resuspendiert. Ein ml der Plasmid-DNA-Lösung wurde dann für 2 Stunden bei – 70 °C mit zwei Volumen Ethanol gefällt. (Dies wurde lediglich zum Zweck der Vorbereitung der Probe für die 0,8% Agarose-Gel-Analyse durchgeführt. Rest-PEG in der Probe kann dazu führen, dass die DNA auf dem Gel schleift). Die Nucleinsäure-Konzentration wurde mittels Messung des UV-Absorptionsmaßes bei 260 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind untenstehend angeführt.
Die Gele zeigten, dass bei 5% PEG-8000 nur eine geringe Menge an monomerem Plasmid gefällt wurde. Verunreinigungen mit einem höheren Molekulargewicht jedoch wurden bevorzugt bei niederer PEG-Konzentration gefällt. Bei 10% PEG wurde das Plasmid vollständig gefällt. Diese Ergebnisse sind besonders aussagekräftig, wenn sie in Zusammenhang mit den A260- Werten betrachtet werden.
Beim Standard-Isopropanol-Verfahren wurde deutlich mehr absorbierendes Material (~3-mal so viel) gefällt als mit PEG. Beide wiesen jedoch auf Basis der Agarose-Gel-Experimente dieselbe Menge an gefälltem Produkt (Supercoiled-Plasmid) auf. Die Ergebnisse zeigen, dass PEG das Produkt genauso effektiv fällt wie Alkohol, ohne dass dabei andere Verunreinigungen gefällt werden.
b. PEG-Fällungen
Es wurde eine Reihe von PEG-Fällungen durchgeführt, um die Eigenschaft des PEGs auszunutzen, dass hochmolekulare DNA bevorzugt bei niederen PEG-Konzentrationen gefällt wird.
Partiell gereinigt DNA wurde aus 1000 ml Lysat mit 0,7 Volumen an -20°C Isopropanol für 2 Stunden bei -70°C gefällt. Die Lösung wurde anschließend für 40 min in einem Sorvall RC3 mittels einem GSA-Rotor bei 10.000 U/min zentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden dräniert und luftgetrocknet. Die Pellets wurden daraufhin in TE-Puffer gelöst und zusammen vereinigt. Als Isopropanol-Kontrollprobe wurden 10 ml entfernt. Der Rest des Materials wurde auf 1,1 M Natriumacetat eingestellt und gleichmäßig auf vier konische 50 ml Röhrchen (jeweils ~10 ml) aufgeteilt. Als nächstes wurde in jedes Röhrchen 30% PEG in 1,6 M NaCl hinzugegeben, was zu PEG-8000-Konzentrationen von 3%, 4%, 5% und 6% PEG-8000 führte. Nach dem Mischen wurden die Materialien über Nacht in einem 10°C warmen Wasserbad inkubiert. Die Pellets wurden dräniert und dann in 5 ml TE-Puffer gelöst, wovon 10 Mikroliter für die Agarose-Gel-Analyse entnommen wurden. Das restliche Material, d. h. der Flüssigkeitsüberstand wurde auf 1,11 M Natriumacetat eingestellt und sämtliche Volumen auf 10 ml gebracht. Die beobachteten A260-Werte sind in der auf diesen Abschnitt folgenden Tabelle angeführt.
Als nächster Schritt wurden 30% PEG in 1,6 M NaCl zu jedem Flüssigkeitsüberstand enthaltenden Röhrchen hinzugefügt, wodurch eine endgültige PEG-8000-Konzentration von 10% erhalten wurde. Nach dem Mischen wurden die Inhalte über Nacht in einem 10°C warmen Wasserbad inkubiert. Die resultierenden Pellets wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 10 ml TE-Puffer gelöst. Die erhaltenen A260-Werte sind untenstehend angeführt.
Proben sämtlicher Behandlungen wurden auf einem 0,8% Agarose-Gel analysiert.
Die Agarose-Gel-Analyse zeigte, dass 3% PEG Nick-Plasmid fällten, jedoch kein Produkt. Auch 4% PEG fällte Nick-Plasmid und hochmolekulare DNA. Beide PEG-Konzentrationen fällten einen wesentlichen Anteil verunreinigender DNA. Bei 5% PEG wurden bedeutende Mengen des Produkts gefällt. Aus diesen Ergebnissen schloss man, dass eine 4% PEG-Fällung gefolgt von einer 10% PEG-Fällung den besten Ausbeute an hochqualitativem Produkt bringen würde.
BEISPIEL B. Größenausschluss-Trennung verschiedener DNA-Formen und Trennung von RNA, chromosomaler DNA sowie Protein von Plasmid-DNA.
Es wurde nachgewiesen, dass Größenausschluss-Chromatographie zu einer besseren Trennung von Wirtsverunreinigungen und Plasmid-DNA-Arten.
a. Anfangsexperiment
Ein Pharmacia S-1000 Größenausschluss-Medium mit einer DNA-Ausschlussgrenze von 20.000 bp (Pharmacia, Piscataway, NJ) wurde in eine Pharmacia XK26/100 Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) gegossen, so dass sich eine endgültige Säulenbetthöhe von 80 cm (2,6 × 80 cm) mit einem Gesamtsäulenvolumen von 425 ml ergab. Die Säule wurde in eine Richtung druckgepackt und zur Äquilibrierung und zum Betrieb umgedreht. Die Säule wurde in TE und 150 mM NaCl, pH 8,0, äquilibriert und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,5 ml/min oder 17cm/h betrieben.
Durch die Verwendung von 200 g Zellpaste wurde Plasmid-DNA vorbereitet. Die DNA wurde durch Ethanol-Fällung konzentriert, die Probe in 10 ml TE und 150 mM NaCl, pH 8,0, gelöst und die Säule (1,1% Bettvolumen) damit beladen.
4 Peaks wurden zerlegt und mit Standard-Agarose-Gel-Verfahren analysiert. Peak 1 war chromosomal, Peak 2 eine Mischung aus dimer und supercoiled, Peak 3 war RNA und Peak 4 schien ein Protein zu sein, da auf dem Gel nichts sichtbar war und das Verhältnis A260 : A280 bei 1,3 lag.
b. Verfahrensintegration von PEG-Fällung und S-1000 Größenausschluss-Chromatographie

Nebeneinander wurde das Standard-Protokoll mit drei Verfahrensvarianten, die die 4 PEG-Fällung und die S-1000 Größenausschluss-Säule umfassten, evaluiert. Bevor das Material in die Experimentgruppen eingeteilt wurde, wurden 189 g Zellpaste durch den Ammoniumacetat-Schritt verarbeitet, wie oben in Beispiel 4 beschrieben. Die grundlegenden Unterschiede zwischen den 4 Behandlungen sind in der untenstehenden Tabelle angegeben.

Behandlungsgruppe	Variable
I	Kontroll-Standardverfahren
II	4% PEG-Fällung + RNase + PK + kein Phenol
III	4% PEG-Fällung + RNase + PK + Phenol
IV	4% PEG-Fällung + keine Enzyme + kein Phenol

Die Experimente bestätigten, dass durch die Verwendung einer 4/10 PEG-8000-Fällung (4% PEG-Fällung) Phenol/Chloroform-Extraktion (Phenol), Proteinase K (PK) und RNAse eliminiert werden könnten.
Nach der obigen Behandlung wurde das Material mittels chromatographischer Standard-Verfahren über eine Q-Sepharose-HP-Säule, einen Anionenaustauscher (Pharmacia, Piscataway, NJ), geführt.
Das aus der Q-Säule gefällt Plasmid wurde in TE + 0,15 M NaCl gelöst und über die S-1000-Säule fraktioniert. Die Säulen wurden bei 0,75 ml/min in TE + 0,15 M NaCl betrieben. Die S-1000-Profile dieser Experimente verifizierten, dass die Behandlungsgruppe IV genauso effektiv war wie die Behandlungsgruppen I-III. Es stellte sich also he raus, dass bei einer 4/10 PEG-8000-Fällung die organische Extraktion und Behandlung mit den tierischen Enzymen RNase und Proteinase K überflüssig ist. Ebenso wurde die Implementierung der S-1000-Säule in allen Fällen so eingehalten, dass sie zu einer feinen Auflösung chromosomaler DNA, dimerer und supercoiled Plasmide, RNA und Protein führte.
Agarose-Gel-Elektrophorese bestätigte diese Ergebnisse. Eine geringe Abweichung bei der Trennung von dimerem und supercoiled Plasmid wurde bei der Analyse der vier Behandlungsgruppen festgestellt, insofern, dass die Behandlungsgruppen I und III mehr dimeres Plasmid aufwiesen als die Behandlungsgruppen II und IV. Es war offensichtlich, dass die 4/10 PEG-8000-Fällung unter dem Aspekt, dass andere Verfahren, um zum gleichen Reinigungsniveau zu kommen, organischer Extraktion sowie einer Behandlung mit Proteinase K und RNase bedürfen, vorteilhaft war. Ebenso eindeutig war die wesentliche Fraktionierung, die durch die Verwendung der S-1000-Säule erreicht wurde. Auch Endotoxin- sowie Southern-Blotting-Analysen bekräftigten diese Ergebnisse.
BEISPIEL 9. Trennen verschiedener DNA-Formen durch Tandem-Größenausschluss-Säulen.
Plasmid-DNA wurde wie in Beispiel 8 oben beschrieben zubereitet und in eine Tandem-Größenausschluss-Säule gefüllt, die zwei Pharmacia XK26/100 Säulen (Pharmacia, Piscataway, NJ) mit Pharmacia S-1000-Größenausschluss-Medium (Pharmacia, Piscataway, NJ) mit einem Gesamt-Tandemsäulenvolumen von etwa 900 ml umfasste. Die Spaltung verschiedener DNA-Formen wurde durch die erhöhte Trennungsfähigkeit der hintereinander geschalteten Säulen verstärkt.
BEISPIEL 10. Ionenaustausch-Trennung von verschiedenen DNA-Formen und Trennung von RNA von Plasmid-DNA.
Bei diesem Beispiel wurde als stationäre Phase ein Anionenaustausch-Medium Q-Sepharose-HP (Pharmacia, Piscataway, NJ) verwendet. Die Trennung wurde durch die Entwicklung eines Gradienten zwischen 0,7 M und 0,9 M NaCl in tris-Puffer mit EDTA bei pH 8,0 durchgeführt. Die Ladung wurde mittels hierin beschriebener Standard-Laborverfahren vorbereitet. RNA wurde direkt durch die Säule geführt, während verschiedene DNA-Formen (Nick-Plasmid, supercoiled DNA) durch den Salz-Gradienten getrennt wurden.
BEISPIEL 11. Edotoxin-Entfernung durch Größenausschluss-Chromatographie.
Plasmid-DNA wurde mittels Größenausschluss-Chromatographie, wie in Beispiel 8 oben beschrieben, fraktioniert. Die Endotoxin-Konzentration der Probeladung lag bei etwa 300.000 EU/mg Plasmid-DNA, wie durch LAL gemessen wurde. Die Endotoxin-Konzentration in dem Plasmid-Pool belief sich auf etwa 30-100 EU/mg Plasmid-DNA.
BEISPIEL 12. Wirksamkeit des durch pharmazeutische Herstellungsverfahren erzeugten Plasmid-DNA-Produkts.
Die Wirksamkeit der VCL-1005 Plasmid-DNA, die durch die hierin beschriebenen pharmazeutischen Herstellungsverfahren gereinigt wurde, wurde durch HLA-B7 Gen-Expression in HALL-Zellen (menschliche Melanom-Zell-Linie) bestimmt, die nach einer mit Hilfe von Lipiden durchgeführten In-vitro-Tansfektion mittels DMRIE/DOPE erfolgte. Eine Vergleichsprobe von VCL-1005, die durch ein ähnliches Verfahren gereinigt worden war, wurde als positive Kontrollprobe sowie zur Bestimmung der relativen Wirksamkeit der Testprobe verwendet.
Am Tag vor der Transfektion wurden etwa 200.000 bis 400.000 HALL-Zellen pro Napf in eine Platte mit 6 Näpfen gegeben. Die Zellen waren vor der Transfektion zu 80-90 konfluente monomolekulare Schichten. Die DNA wurde auf 10 μg/ml und das DMRIE/DOPE auf 20 μg/ml in einem Serum-reduzierten Medium wie OptiMEM verdünnt. Beide wurden dann in Polystyrol-Röhrchen kombiniert, um einen Komplex für die Transfektion auszubilden. Die Zellen wurden mit 1 ml des Komplexes (5 μg DNA, 5 μg DMRIE, 5 μg DOPE) pro Vertiefung doppelt oder dreifach transfektioniert. Die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Frisches Medium sowie fötales Kalbsserum wurden zu den Zellen hinzugegeben, und zwar 1-4 Stunden und 24 Stunden nach der Transfektion. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion geerntet. HLA-B7 Gen-Expression auf der Zelloberfläche wurde mit Anti-HLA-B7, gefolgt von einem fluoreszierenden zweiten Antikörper (monoklonaler Anti-Maus-IgG-Antikörper, R-Phykoenthrin konjugiert) markiert. Immunfluoreszenzfärbung der Zellen wurde mittels Durchflusscytometrie analysiert.
Im Gegensatz zu der negativen Kontroll-Probe (nicht transfektierte Zellen oder mit irrelevanten Genen transfektierte Zellen) wurde bei den transfektierten Zellen eine Zunahme der durchschnittlichen Fluoreszenz-Intensität festgestellt. Beim Testmaterial war ein zumindest zweifacher Anstieg der durchschnittlichen Fluoreszenz-Intensität gegenüber der negativen Kontroll-Probe zu beobachten, und die relative Wirksamkeit betrug das 0,5- bis 2-fache (50%-200%) der Referenzprobe.
BEISPIEL 13. Herstellungsverfahren für pharmazeutische Plasmid-DNA aus pharmazeutisch verwendbarer Plasmid-DNA-Substanz durch steriles Abfüllen.
Siehe Beispiel 4a-e oben. Dieses Beispiel setzt das Verfahren für pharmazeutisch verwendbares Plasmid-DNA-Material wie folgt fort: Ausgangsmaterial war eine pharmzeutisch verwendbare Plasmid-DNA-Lösung bei 1 mg/ml oder anderer geeignet bestimmter Konzentration in Ringer-Lactat USP oder einem anderen unschädlichem gepufferten Verabreichungsvehikel. Die Plasmid-DNA-Lösung wurde durch ein steriles 0,2 μm-Filter oder dergleichem in einer Klasse 100-Biosicherheitsumgebung filtriert. Das Filtrat wurde in einem sterilen, Pyrogen-freien Behälter gesammelt. In der Klasse 100-Umgebung wurden 0,35 ml steriler Plasmid-DNA-Lösung oder eine andere geeignete Menge aliquot auf Pyrogen-freie, sterile Typ 1 Borosilicatglasphiolen aufgeteilt. In diesem Beispiel enthielt jede Phiole 0,35 mg DNA. Die Phiolen wurden mit sterilen, Teflon-beschichteten grauen Butyl-Stopfen und abziehbaren Aluminium-Abschlüssen verpackt. Die Abschlüsse wurden gekrimpt, so dass sie vollkommen abdichteten. Die Phiolen wurden dann der Qualitätskontrolle übergeben und entsprechend gekennzeichnet.
BEISPIEL 14. Qualitätsrichtlinien für pharmazeutisch verwendbare DNA.
Plasmid VCL-1005 wurde in einen Standard-Strang DH10B Escherichia Coli (BRL, Gaithersburg, MD) transformiert. Die Zellen wurden in einem 10-L-Fermenter (Braun) mittels eines Standard-TB-Mediums gezüchtet. Am Ende der Exponentialphase wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet durch alkalische Lyse (ohne Verwendung von Lysozym) lysiert. Zelltrümmer wurden durch Filtration getrennt. Plasmid-DNA wurde gefällt und durch Standard-Niederdruck-Chromatographie fraktioniert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und die DNA wurde formuliert. Die Konzentration wurde angepasst und die DNA steril filtriert sowie in sterile Phiolen abgefüllt. Mittels des Verfahrens der Erfindung wurde ausreichend Material hergestellt und für präklinische und klinische Untersuchungen gereinigt, das die von der FDA definierten Kriterien für pharmazeutische, aus Escherichia coli gewonnene Produkte, nämlich Identität, Reinheit, Wirksamkeit und Sicherheit erfüllte.
Die Qualitätskontrollkriterien, die erfüllt wurden, und somit das Produkt zu einer pharmazeutisch verwendbaren DNA machen, sind Folgende: VCL-1005 KENNZEICHNUNG QUALITÄTSKONTROLLKRITERIEN
Während die Daten das Entfernen der meisten Wirtsverunreinigungen bewiesen, veranschaulichten sie auch die Trennung unterschiedlicher Plasmid-DNA-Formen, darunter auch Concatemer-Plasmid-DNA und Monomer-Plasmid-DNA.
Zusätzlich wurden akute Toxizitätsversuche mit Wiederholungsdosen bei Mäusen sowie bei Cynomolgus-Affen durchgeführt. Es wurden keine Anzeichen akuter Toxizität oder von Resttoxizität beobachtet.
BEISPIEL 15. Plasmid-DNA kann alleine oder in Kombination mit einem kationischen Lipid-Gemisch verabreicht werden.
Plasmid-DNA, die durch das pharmazeutische Herstellungsverfahren der Erfindung gereinigt wurde, kann dem Patienten alleine oder in Kombination mit einem kationischen Lipid-Gemisch verabreicht werden. Das Arzneimittel ist z. B. VCL-1005 Plasmid-DNA, die mit DMRIE/DOPE Lipid-Gemisch in einem Komplex gebunden ist. Plasmid-DNA und DMRIE/DOPE sind jeweils in getrennten Behältern formuliert. Die DMRIE/DOPE Lipid-Phiole wird zuerst mit Ringer-Lactat Injektionsvehikel rekonstituiert und anschließend mit der VCL-1005 Plasmid-DNA-Phiole in der klinischen Umgebung vor der klinischen Verwendung kombiniert. Nach der Kombination wird der Komplex den Patienten zur pharmazeutischen Behandlung verabreicht.
Obwohl besondere Ausführungsformen der Erfindung detailliert beschrieben wurden, wird es für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass diese Ausführungsformen beispielhaft und nicht einschränkend zu sehen sind, und der wahre Schutzumfang der Erfindung erst in den nachfolgenden Ansprüchen definiert wird.

Claims

Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA von Wirtszellen-Verunreinigungen, folgende Schritte umfassend: (a) Lysieren von Wirtszellen, welche die Plasmid-DNA enthalten, um ein Lysat zu erhalten, und Behandlung des Lysats mit einem Salz, um chromosomale Wirts-DNA zu fällen; (b) Zugabe von Polyethylenglykol zum Lysat, um einen Niederschlag der Plasmid-DNA zu erhalten; (c) Lösen des Niederschlags, um eine Lösung zu erhalten, und Zugabe eines Salzes zur Lösung, um die Wirtszellen-Verunreinigungen zu fällen; (d) Verwendung der Lösung für Größenausschluss- oder Anionenaustausch-Chromatographie; wobei das Verfahren die Entfernung von Verunreinigungen aus dem Lysat nach Schritt (a) und/oder aus der Lösung nach Schritt (c) durch Zentrifugation und/oder Filtration umfasst; wobei das Verfahren in Abwesenheit von Lysozym, exogener RNase, Proteinase K, Phenol, Chloroform und Ethidiumbromid durchgeführt wird.
Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA von Wirtszellen-Verunreinigungen, folgende Schritte umfassend: (a) Lysieren von Wirtszellen, welche die Plasmid-DNA enthalten, in einer Base, um ein Lysat zu erhalten, und anschließende Behandlung mit einem Salz und einer Säure, um chromosomale Wirts-DNA zu fällen; (b) Zugabe von etwa 10% (Gew./Vol.) Polyethylenglykol zum Lysat, um einen Niederschlag der Plasmid-DNA zu erhalten; (c) Lösen des Niederschlags in einem Puffer, um ein Lösung zu erhalten, und Einstellen der Lösung auf etwa 2,5 M Ammoniumacetat, um die Wirtszellen-Verunreinigungen zu fällen; (d) Verwendung der Lösung für Größenausschluss- oder Anionenaustausch-Chromatographie; wobei das Verfahren die Entfernung der Verunreinigungen aus dem Lysat nach Schritt (a) und/oder aus der Lösung nach Schritt (c) durch Zentrifugation und/oder Filtration umfasst; wobei das Verfahren in Abwesenheit von Lysozym, exogener RNase, Proteinase K, Phenol, Chloroform und Ethidiumbromid durchgeführt wird.
Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA von Wirtszellen-Verunreinigungen, folgende Schritte umfassend: (a) Lysieren von Wirtszellen, welche die Plasmid-DNA enthalten, um ein Lysat zu erhalten; (b) Zugabe eines hochmolekularen Polyols oder Salzes zum Lysat, um einen Niederschlag der Plasmid-DNA zu erhalten; (c) Lösen des Niederschlags, um eine Lösung zu erhalten; (d) Zugabe eines hochmolekularen Polyols oder Salzes zur Lösung, um die Wirtszellen-Verunreinigungen zu fällen; und (e) Verwendung der Lösung auf Größenausschluss- oder Anionenaustausch-Chromatographie; wobei das Verfahren die Entfernung von Verunreinigungen aus dem Lysat nach Schritt (a) und/oder aus der Lösung nach Schritt (d) durch Zentrifugation und/oder Filtration umfasst; wobei das Verfahren in Abwesenheit von Lysozym, exogener RNase, Proteinase K, Phenol, Chloroform und Ethidiumbromid durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das hochmolekulare Polyol Polyethylenglykol (PEG) ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das hochmolekulare Polyol PEG 8000 ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Salz aus der aus Ammoniumacetat, Lithiumchlorid, Natriumchlorid und Natriumacetat bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Salz Ammoniumacetat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Verfahren weiters in Abwesenheit jeglicher zugesetzter Enzyme, organischer Extraktionsmittel und mutagener Reagenzien durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Verfahren weiters folgende Schritte umfasst: Sterilisieren, Formulieren und Einfüllen der gereinigten Plasmid-DNA in eine Phiole.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Wirtszellen Bakterien sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin Verunreinigungen durch Filtration entfernt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Chromatographie Größenausschluss-Chromatographie ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Chromatographie Anionenaustausch-Chromatographie ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Größenausschluss-Chromatographie das Kontaktierenlassen des Plasmid-DNA enthaltenden gelösten Materials mit einem Größenausschluss-Medium, das eine DNA-Ausschlussgrenze von etwa 20.000 bp aufweist, bei einem pH von etwa 8,0 und einer Salzkonzentration von etwa 150 mM, und die Gewinnung von mit Plasmid-DNA angereicherten Fraktionen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Anionenaustausch-Chromatographie das Kontaktierenlassen des Plasmid-DNA enthaltenden gelösten Materials mit einem Anionenaustausch-Medium bei einem pH von etwa 8,0, die Bildung eines Salzgradienten zwischen etwa 0,7 M und etwa 0,9 M und die Gewinnung von mit Plasmid-DNA angereicherten Fraktionen umfasst.