KR100470803B1

KR100470803B1 - 형질전환 어류의 피씨알 분석을 위한 신속한 디앤에이 추출 방법

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Publication number: KR100470803B1
Application number: KR10-2002-0058029A
Authority: KR
Inventors: 남윤권; 노재구; 김동수; 김경길; 이정호; 김영옥
Original assignee: 대한민국(관리부서:국립수산과학원); 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2002-09-25
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2005-03-10
Also published as: KR20040026519A

Abstract

본 발명은 형질전환 어류를 신속하고 경제적으로 분석할 수 있도록 소형의 형질전환 어류로부터 미량의 조직을 대상으로 PCR에 사용될 수 있는 양질의 DNA를 추출하는 방법에 관한 것으로, 어류로부터 채취한 조직을 도데실황산나트륨 (sodium dodecyl sulfate; SDS)을 포함하는 염기성 완충용액 중에서 배양하고, 배양액에 비이온성 계면활성제를 포함하는 완충용액을 첨가하여 중화시키고, 이를 원심분리한 후 상등액을 회수하는 단계를 포함하는 DNA 추출 방법에 의하면, 소량의 어류 지느러미로부터 PCR에 이용할 수 있는 주형 DNA를 20 분 이내에 신속히 확보할 수 있으며, 동시에 순수 분리된 DNA와 전혀 차이 없는 양질의 PCR 주형 DNA를 제공하므로, 종래 기술에서 요구되는 복잡한 DNA 분리 과정, 고가의 단백질 제거 효소 및 수 시간에 걸친 반응시간이 필요 없게 되어, 종래의 형질전환 어류 분석에 소요되던 시간, 경비와 노력을 획기적으로 줄일 수 있다.

Description

형질전환 어류의 피씨알 분석을 위한 신속한 디앤에이 추출 방법{A RAPID DNA EXTRACTION METHOD FOR PCR-BASED ANALYSIS OF TRANSGENIC FISH}

본 발명은 형질전환 어류를 신속하고 경제적으로 분석할 수 있도록 소형의 형질전환 어류로부터 미량의 조직을 대상으로 PCR에 사용될 수 있는 양질의 DNA를 추출하는 방법에 관한 것이다.

형질전환 어류 개발에 있어서, 요구되는 목적 형질을 획득한 형질전환 어류는 척추동물의 유전자 발현 조절 연구의 귀중한 자료가 될 뿐 아니라, 경제적으로는 유용한 양식 생산물 확보라는 면에서 매우 중요시된다. 이러한 점에서, 형질전환체의 효과적이고 정확한 동정은 필수적이다(Devlin et al., 1995. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 52, 1376-1384; Nam et al., 1999. Aquaculture 172, 229-245). 효율적인 형질전환 연구를 위해서는 형질전환 처리구로부터 이식한 유전자를 포함하는 형질전환 개체만을 빠른 시일내에 선발할 수 있어야 하며, 이는 형질전환체와 비형질전환체가 혼재해 있는 실험구를 분석까지 유지하는데 소요되는 시간과 노력을 최소화시킨다는 점에서 매우 중요하다(Lahm et al., 1998. Transgenic Res. 7, 131-134). 특히, 대부분의 어류종들은 포유류에 비해 높은 산란력을 갖기 때문에 종종 많은 수의 개체를 대상으로 형질전환 검색을 수행해야 할 필요가 있으며, 분석이 끝날 때까지 많은 수의 어체를 살려둔 채로 각각 따로 관리해야 한다는 문제가 있다. 따라서, 형질전환 어류 연구에서는 유전자 이식 또는 형질전환 후대 생산 후 소형의 어체를 살려둔 채로 최소한의 조직 시료만을 이용하여 가능한 신속하게 형질전환 여부를 분석할 수 있는 기술이 반드시 요구되고 있다.

현재까지 형질전환 유전자 포함 여부를 확인하는 분자생물학적 방법으로서는 PCR(polymerase chain reaction)이 가장 널리 이용되고 있다. 특히 PCR의 경우 순수 분리된 DNA 뿐만 아니라 부분적으로 간단히 추출된 DNA 역시 사용 가능하다는 장점으로 인해 포유류 및 어류를 위시한 여러 형질전환체 검색에 사용되고 있다 (Devlin et al., 1995. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 52, 1376-1384; Nancy et al., 1996. Transgenic Res. 5, 209-211; Nam et al., 2000. Transgenic Res. 9, 463-469). 형질전환 어류의 PCR 분석을 위해서는 분석하고자 하는 어체로부터 PCR 반응의 주형으로 사용될 게놈 DNA(genomic DNA) 확보가 필수적이다. 현재 다음 두 가지 DNA 추출 방법을 통해 PCR 주형용 게놈 DNA를 확보하고 있다.

첫 번째 DNA 추출 기술은 현재 가장 빈번히 사용되고 있는 방법으로서 다음과 같은 공통적인 과정에 따라 행하여진다: 어류 조직을 단백질 분해효소와 계면활성제 도데실황산나트륨(SDS)을 포함하는 특정 완충용액에서 12 시간 이상 동안 37∼55 ℃ 범위의 항온 조건에서 소화 반응을 수행한다. 소화 반응이 종료되면, 다음날 페놀 및 클로로포름 등의 유기용매 반응과 원심분리를 이용하여 DNA 추출을 수행하고, 에탄올 또는 이소프로판올을 이용한 DNA 침전을 유도한다. 얻어진 DNA 파이버(또는 DNA 펠렛)를 70 % 에탄올로 세척 후 건조시킨 다음 증류수나 저염(low-salt)의 완충용액에 녹여 사용한다(Culp et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7953-7957; Bayer and Compos-Ortega, 1992. Development 115, 421-426; Ivics et al., 1993. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 2, 162-173; Kavumpurath et al., 1993. Bamidgeh 45, 154-163; Lin et al., 1994. Science 265, 666-669; Symond et al., 1994. Aquaculture 119, 313-327; Moav et al., 1995. Aquaculture 137, 179-185; Martinez et al. 1996. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 5, 62-70; Kang et al ., 1999. Aquaculture 173, 285-296; Hinits and Moav, 1999. Aquaculture 173, 285-296). 이 방법은 양질의 순수한 DNA를 추출할 수 있다는 장점은 있으나 소요되는 경비와 노력이 크고, 또 장시간의 다단계 분리 과정이 필요하기 때문에 다량의 형질전환체 검색에는 매우 비효율적이라는 단점이 있다. 이와 같은 불편함과 비효율성을 보완하기 위해 다른 몇 가지 간단한 방법들이 형질전환 어류 검색에 사용되고 있다.

종래의 두 번째 기술은 어체 조직들을 대상으로 SDS를 포함하지 않는 완충용액 중에 단백질 제거 효소를 첨가하여 55∼65 ℃에서 1∼2 시간 동안 소화반응시킨 후, 95 ℃에서 단백질 제거 효소를 불활성화시키고 원심분리를 통해 얻어진 상등용액을 PCR 반응에 직접 사용하는 비교적 간단한 방법이다(Du et al., 1992. Bio/Technology 10, 176-181; Devlin et al., 1995. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 52, 1376-1384). 그러나 이 방법에서는 SDS가 PCR 반응에 포함되는 DNA 중합효소 (Taq DNA polymerase)에 강력한 저해 효과를 나타내기 때문에, 현재 DNA 추출시 조직의 용해를 위해 가장 효과적인 것으로 알려져 있는 이온성 계면활성제(ionic detergent)인 SDS를 사용할 수 없다는 단점이 있다(Kawasaki, 1990. PCR protocols. Academic Press. CA. pp. 146-152). 이러한 이유로, SDS가 아닌 Tween 20 또는 NP 40 등 비이온성 계면활성제(non-ionic detergent)들을 사용하고 있으나, 이들은 SDS에 비해 용해능력이 낮아 DNA 추출 효율이 떨어지게 된다는 단점이 있다. 또한, 여기에서는 프로테이나제 K(proteinase K) 등 고가의 단백질 제거 효소를 반드시 사용해야만 하고, 사용 후에는 반드시 그 활성을 고온에서 제거해야 한다는 번거로움이 있다. 이로 인해 이 방법이 실제로 형질전환 어류의 PCR 검색을 위해 사용된 예는 아직 그리 많지 못한 실정이다.

이상과 같은 종래 어류에서의 DNA 추출 방법의 문제점을 고려하여 본 발명의 목적은, 극소량의 어류 조직만을 이용하여 최단 시간내 모든 과정이 간단하게 완성되는 신속한 DNA 추출법을 제공함으로써, PCR을 이용한 다량의 형질전환 어류 검색을 보다 간편하고 효율적으로 수행할 수 있도록 하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 형질전환 어류의 PCR 분석을 위한 어류 조직으로부터 DNA 추출 방법은, 어류로부터 채취한 조직을 도데실황산나트륨 (sodium dodecyl sulfate; SDS)을 포함하는 염기성 완충용액 중에서 배양하고, 배양액에 비이온성 계면활성제를 포함하는 완충용액을 첨가하여 중화시키고, 이를 원심분리한 후 상등액을 회수하는 단계를 포함한다.

여기에서, 어류로부터 채취하는 조직은 지느러미인 것이 바람직하고, SDS를 포함하는 염기성 용액 중에서의 배양은 50 ℃ 이상, 바람직하게는 90 ℃에서 10 분 이상 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 비이온성 계면활성제를 포함하는 완충용액은 NP 40(Nonidet P-40; Octylphenoxy polyethoxy ethanol)과 Tween 20을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 DNA 추출방법에서는, 강 염기(alkaline pH) 조건 하에서 이온성 계면활성제인 SDS를 이용하여 소량의 지느러미 조직을 용해한 후, 강염기와 SDS를 동시에 중화시킬 수 있는 완충용액과 혼합하는 것으로 모든 화학 반응을 완료하고 있다. 즉, 소량의 지느러미 조각을 NaOH와 SDS를 포함하는 완충용액 중 약 90 ℃에서 단시간 배양하고, 배양이 완료되면 비이온성 계면활성제인 NP 40과 Tween 20을 포함하는 Tris-완충용액을 첨가하여 반응을 완료한 후, 이어서 간단한 원심분리를 통해 DNA를 포함하는 상등액을 회수하면, 이를 바로 PCR 분석에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 DNA 추출 방법에 사용하기 위한 지느러미 시료 채취, 시료의 용해, SDS 및 강염기의 중화, 그리고 얻어진 DNA의 PCR 분석에 대하여 구체적으로 설명한다.

(1) 시료의 채취

형질전환 어류 및 대조구인 일반 어류를 마취하고 어체에 묻어 있는 물기를 최대한 제거한 후, 예를 들어 꼬리 지느러미로부터 약 0.3∼0.5 ㎎ 정도의 지느러미를 채취한다.

여기에서, 어류로부터 시료를 채취하는 조직으로는 지느러미, 알 등 어류의 모든 조직이 적용 가능하지만, 대상이 되는 어체가 대부분 소형의 치어라는 점과, 이러한 소형의 어체를 살려둔 채로 형질전환 여부를 분석해야 한다는 점을 고려한다면, 지느러미 조직을 가능한 미량으로, 예를 들어 0.5 ㎎ 이내에서 채취하는 것이 바람직하다.

(2) 시료의 용해

채취한 지느러미를 SDS를 포함하는 pH 11.0의 강 염기성 완충용액 약 100 ㎕ 중에 넣고 약 90 ℃에 맞춘 항온 용기에서 약 10 분 이상 배양한다.

여기에서 완충용액은, 예를 들어 완충용액-X(20 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0.01 % SDS, pH 11.0)일 수 있다. 또한, 어류 조직을 완충용액 중에서 배양하는 것은 약 50 ℃ 이상에서도 가능하지만, 전체 처리 시간을 단축시키기 위해서는 약 90 ℃ 이상의 온도에서 10 분 이상 처리하는 것이 바람직하다.

(3) 중화

배양이 완료되면 비이온성 계면활성제를 포함하는 완충용액 약 100 ㎕를 첨가하여 잘 혼합한 후, 원심분리(약 13,000 rpm, 2 분)를 수행하여 상등액을 회수한다. 추출된 DNA를 포함하고 있는 이 상등액은 새 튜브로 옮겨 바로 PCR에 바로 사용할 수 있다.

여기에서, 비이온성 계면활성제는 NP 40 및 Tween 20인 것이 바람직하고, 이들을 1:1의 비율로 포함하는 pH 7.2의 완충용액, 예를 들어 완충용액-Y(50 mM Tris-HCl, 2 % Tween 20, 2 % NP 40, 5 mM MgCl₂, pH 7.2)를 사용할 수 있다.

(4) PCR 수행

상기 원심분리 상등액 2 ㎕를 취하여, 형질전환 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 PCR 완충용액 중에서 통상의 방법으로 PCR을 수행한다.

PCR 반응이 완료되면 1.5 % 아가로스겔 전기영동을 통해 형질전환 여부의 정확한 판독이 가능한지를 분석한다.

이상에서 기술된 바와 같은 본 발명의 DNA 추출 방법은 신선한 조직 뿐 아니라 1 년까지 냉동 보관되었던 조직을 대상으로도 잘 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 추출 방법에 따라 확보된 DNA 용액을 1 년간 보관한 후에도 처리 직후와 동일한 PCR 결과를 보여주는 것으로부터, 본 발명에 따른 방법의 안정성을 확인할 수 있다.

이하 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 본 실시예에서는, 형질전환 어류 및 대조구 일반 어류로부터 미량의 지느러미 절편을 채취하여 본 발명의 DNA 추출 방법을 실시하고, 이에 따라 확보한 DNA를 PCR에 적용함으로써 형질전환체의 정확한 판독 가능 여부를 시험하였다.

실시예 1: 지느러미로부터 DNA 추출 및 PCR을 이용한 형질전환 검색

클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT; Chloramphenicol acetyl transferase) 유전자를 포함하는 발현벡터 pFV4CAT이 이식된 평균 체중 3 g의 형질전환 및 대조구 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)(Nam et al., 1999. Aquaculture 172, 229-245)들을 염산 리도카인 300 ppm으로 마취하였다. 마취된 미꾸라지의 표피에 묻어 있는 물기를 최대한 제거한 후 면도칼을 이용하여 꼬리지느러미로부터 0.3∼0.5 ㎎의 지느러미를 채취하였다.

채취된 꼬리지느러미를 1.5 ㎖ microfuge tube 내에 준비된 완충용액-X(20 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0.01 % SDS, pH 11.0)에 넣고 90 ℃로 조정된 항온 용기에서 각각 1 분, 10 분, 20 분, 30 분, 1 시간, 2 시간 및 3 시간 동안 배양하였다.

90 ℃ 배양이 완료된 후 준비된 완충용액-Y(50 mM Tris-HCl, 2 % Tween 20, 2 % NP 40, 5 mM MgCl₂, pH 7.2) 100 ㎕를 넣고 간단한 vortex로 잘 혼합하였다. 본 반응액을 원심분리(13,000 rpm, 2 분)한 후, 상등액을 새로운 1.5 ㎖ microfuge tube로 옮겼다.

상기 원심분리 상등액 2 ㎕를 취하여 다음 조건에서 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 총 30 ㎕로 수행하고, PCR 완충용액 조성은 아래와 같다. 이때 형질전환 유전자 CAT을 PCR 증폭하기 위해 프라이머 FVC-1 및 FVC-2(Nam et al., 2000. Transgenic Res. 9, 463-469)를 사용하였다.

(PCR 완충용액 조성)

10 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 200 mM dNTPs, 각각의 프라이머 20 pmoles, 및 Taq DNA polymerase(Promega, USA) 2.5 U

(올리고뉴클레오티드 프라이머)

FVC-1 5'-CTATAACCAGACCGTTCAGC-3' (서열번호 1)

FVC-2 5'-CGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAG-3' (서열번호 2)

(열처리 사이클(Thermal cycling))

초기 변성(initial denaturation) 94 ℃ 2 분,

이후 94 ℃ 1 분, 60 ℃ 1 분 및 72 ℃ 1 분의 30 사이클

PCR 반응이 완료되면 1.5 % 아가로스겔 전기영동을 통해 형질전환 여부의 정확한 판독이 가능한지를 분석한다. 이때 본 발명의 효과를 명확히 하기 위해 종래의 방법들에 의해 분리된 DNA를 대조구로 이용하여 PCR을 함께 수행한다.

PCR이 완료된 후 PCR 산물 5 ㎕를 취하여 100 V에서 30 분간 1.5 % 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 5 ㎍/㎖ 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액에 겔을 담가 DNA를 염색하고 자외선 위에서 겔 사진을 촬영하였다.

도 1은 본 발명의 방법에 의해 확보된 DNA를 주형으로 이용하여 형질전환 어류를 PCR 기술로 판독한 결과를 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진으로, 완충용액-X에서의 처리 시간에 따른 PCR 결과이다. 여기에서 보면, 지느러미 조직을 100 ㎕ 완충용액-X에서 1 분간 반응시켜 얻은 상등액은 반응 결과 PCR이 효과적으로 일어나지 않았지만, 이밖에는 10 분 반응구부터 3 시간 반응구까지 모두 형질전환 유전자가 효과적으로 증폭되었으며, 이들 반응 구간 전체에 걸쳐 전기영동상에 큰 차이가 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 DNA 추출 방법에서는 완충용액-X 중에서 단 10 분 동안 용해하는 것만으로도 충분한 양의 PCR용 DNA 추출이 가능한 것을 알 수 있다.

이와 같은 결과를 재확인하기 위해 11 마리의 형질전환 미꾸라지와 동일 마리수의 비형질전환 미꾸라지로부터 각각 지느러미를 채취한 후, 본 발명의 방법에 따라 완충용액-X에서 10 분 동안 반응시키고 완충용액-Y로 중화시켜 동일하게 PCR을 수행하고 아가로스겔 전기영동을 통해 분석하였다.

도 2는 본 발명의 방법에 의해 확보된 DNA를 주형으로 이용하여 형질전환 어류를 PCR 기술로 판독한 결과를 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진으로, 완충용액-X에서 10 분 동안 처리하는 조건에서 형질전환 어류와 비형질전환 어류를 PCR로 판별한 결과이다. 여기에서, 홀수는 형질전환 어류이고 짝수는 비형질전환 어류를 나타내는데, 홀수 군에서만 증폭이 일어난 것을 보여주고 있어, 본 발명의 방법에 따라 정확히 형질전환 어류와 비형질전환 어류가 판별될 수 있음이 관찰되었다.

이상의 실시예 1을 통하여, 본 발명의 방법에 따라 신속한 DNA 추출이 가능하고, 이를 이용하여 정확한 형질전환 어류의 PCR 검색이 가능함을 알 수 있다.

실시예 2: 장기간 보관된 지느러미 시료의 이용 및 DNA 시료의 장기간 보관

본 발명에 따른 DNA 추출 방법이 신선한 지느러미 조직 뿐 아니라 장기간 냉동 보관 중이던 지느러미를 대상으로도 잘 적용될 수 있는지를 시험하였다. 즉, 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 형질전환 미꾸라지 지느러미 조직을 채취하여 -20 ℃에서 1 일, 1 주일, 1 달, 3 달, 6 달 및 1 년간 보관한 후, 실시예 1에 따라 DNA를 추출한 후 PCR을 수행하였다.

도 3은 장기간 냉동 보관된 지느러미 시료에 대하여 본 발명의 방법을 적용한 결과를 보여주는 아가로스 겔 전기영동사진으로, 시료의 냉동보관 시간별 PCR 결과이다. 여기에서, A는 신선한 지느러미 시료의 경우이고, B, C, D, E, F 및 G는 지느러미를 각각 1 일, 1 주일, 1 달, 3 달, 6 달 및 1 년간 냉동보관한 후의 PCR 결과를 보여준다. 이 결과에서, 대조구로 사용한 신선한 지느러미에 대한 결과와 1 년까지 보관되었던 조직에 대한 결과 모두 PCR의 정확도 및 효율에 있어 큰 차이가 없다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 DNA 추출 방법은 신선한 조직 뿐만 아니라 1 년까지 냉동 보관되었던 지느러미 조직을 대상으로도 잘 적용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 따라 확보된 DNA 추출물이 장기간 냉동 보관에도 안정한지를 시험하였다. 즉, 상기 실시예 1에서와 같이 준비된 상등액 시료를 -20 ℃에서 1 일, 1 주일, 1 달, 3 달, 6 달 및 1 년간 보관한 후, 실시예 1에 따라 PCR을 수행하였다.

도 4는 본 발명의 방법에 의해 얻은 DNA 추출물의 냉동보관 시간별 PCR 결과를 보여주는 아가로스 겔 전기영동사진이다. 여기에서, A는 원심분리 직후의 상등액 시료, B, C, D, E, F 및 G는 상등액 시료를 -20 ℃에서 각각 1 일, 1 주일, 1 달, 3 달, 6 달 및 1 년간 보관한 후의 PCR 결과를 보여준다. 이 결과에서 보듯이, 모든 보관구에서 동일한 PCR 결과를 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명에 따른 방법의 안정성을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따라 확보된 DNA 용액을 냉동보관함으로써 형질전환체의 반복 확인이 가능하고, 이밖에 다른 PCR 분석에도 활용 가능하게 된다.

효과시험예: 종래 기술과의 비교

기존의 어류 형질전환체의 PCR 검색을 위해 사용되고 있는 2 가지 종래의 DNA 추출 방법과 본 발명의 DNA 추출 방법의 비교 실험을 수행하였다. 즉, 형질전환 미꾸라지 3 마리로부터 각 개체별로 0.5 ㎎씩 3 개의 지느러미 조직을 채취하여 본 발명과 종래의 DNA 추출 방법 1, 2에 사용하였다.

먼저, 본 발명에 따라, 상기 실시예 1에서와 같이 지느러미 절편을 100 ㎕ 완충용액-X 중 90 ℃에서 10 분간 반응시키고, 완충용액-Y 100 ㎕와 혼합한 후 원심분리를 통해 DNA를 확보하였다.

종래 기술 1에 따른 DNA 추출은 다음과 같이 시행하였다: 지느러미 0.5 ㎎을 400 ㎕ 완충용액(50 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA, pH 8.0; 0.5 % SDS; 100 ㎍/㎖ proteinase K)에 넣고 37 ℃에서 12 시간동안 소화 반응을 수행하였다. 소화 반응이 완료되면 동일량의 TE-포화 페놀(pH 8.0)을 넣고 잘 혼합하여 실온에서 5 분간 방치하였다. 원심분리 (13,000 rpm, 5 분)하여 상등액을 새 튜브로 옮기고 다시 동일량의 TE-포화 페놀:클로로포름(1:1, v:v)을 넣고 다시 잘 혼합하였다. 원심분리(13,000 rpm, 5 분)하여 상등액을 다시 새 튜브로 옮기고, 1/10 용량의 3 M 아세트산나트륨(pH 7.4)을 첨가한 후 2 배 용량의 에탄올을 첨가하여 잘 혼합하였다. 원심분리(13,000 rpm, 10 분)하여 DNA 펠렛을 회수하고 상등액을 버린 후, 70 % 에탄올 1 ㎖를 넣어 펠렛을 세척하였다. 다시 원심분리(13,000 rpm, 3 분)를 수행한 후 에탄올을 버리고 60 ℃에서 3 분간 DNA를 건조시켰다. 건조된 DNA에 20 ㎕ 완충용액(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 넣어 녹인 후 2 ㎕를 취하여 PCR에 사용하였다.

종래 기술 2에 따른 DNA 추출은 다음과 같이 시행하였다: 미꾸라지로부터 채취한 0.5 ㎎의 지느러미 조직을 200 ㎕ 완충용액(20 mM Tris-Cl pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂, 0.5 % Tween 20, 100 ㎍/㎖ proteinase K)에 넣어 65 ℃에서 1 시간 동안 배양하는데, 중간에 30 분 경과시 10 초간 보르텍스를 수행하였다. 배양이 끝나면 95 ℃에서 10 분간 방치하여 proteinase K를 불활성화시키고 원심분리(13,000 rpm, 5 분) 후 상등액 2 ㎕를 취하여 PCR 반응에 이용하였다.

다음 표 1은 본 발명과 종래 기술 1, 2의 PCR 추출 방법을 비교하여 나타낸 것이다.

	종래 기술 1	종래 기술 2	본 발명
사용 시약 종류	- 조직 용해용 완충용액 (Tris, EDTA, SDS) - 단백질 분해효소 - DNA 순수 분리용 시약 (phenol phenol:chloroform, chloroform:isoamyl alcohol, 100% ethanol or isopropanol, 70% ethanol) - DNA 용해 용액 (H₂O 또는 TE 완충용액)	- 조직 용해용 완충용액(Tris, KCl, MgCl₂, Tween 20) - 단백질 분해 효소	- 조직 용해용 완충용액 (NaOH, EDTA, SDS) - 중화용액 (Tris, MgCl₂, NP 40, Tween 20)
효소 사용	- proteinase K- RNase A	- proteinase K	- 사용 안함
필수 반응 온도	- 37∼55℃- 실온	- 55∼65℃- 95℃- 실온	- 90℃- 실온
필수 단계	- 조직용해- 유기용매 혼합, 원심분리 및 상등액 회수 (최소 2반복)- DNA 침전- 원심분리- DNA wash 및 건조- DNA 용해	- 조직용해- 단백질 제거 효소 불활성화- 원심분리 및 상등액 회수	- 조직용해 및 중화- 원심 분리 및 상등액 회수
시료 준비 후총 소용 시간	12 시간 이상	1-3 시간	20분 이내

도 5는 본 발명의 방법에 따른 효과를 종래의 DNA 추출 기술들과 PCR을 통해 비교 분석한 결과를 보여 주는 아가로스 겔 전기영동 사진이다. 도 5에서, A는 본 발명의 경우, B와 C는 각각 종래 기술 1과 2의 경우를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 본 발명을 통해 신속히 얻은 DNA 시료는 순수분리된 DNA 시료(종래 기술 1)와 전기영동상에서 비교할 때 전혀 차이 없이 PCR 반응에 이용될 수 있는 것으로 나타났으며, 종래 기술 2의 경우는 본 발명 및 종래 기술 1에 비하여 떨어지는 결과를 보여주었다. 따라서 형질전환 어류의 PCR 검색시 종래 기술 1이 요구하는 장시간의 다단계 순수 DNA 분리과정을 필요로 하지 않고, 본 발명의 간단한 처리만으로도 동일한 효과를 얻을 수 있다는 것이 판명되었다. 또한 종래 기술 2와 비교한다면, 본 발명은 종래 기술 2보다 훨씬 짧은 시간내에 단백질 제거 효소를 사용하지 않고도 보다 많은 PCR 산물을 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 소량의 어류 지느러미로부터 PCR에 이용할 수 있는 주형 DNA를 20 분 이내에 신속히 확보할 수 있도록 하며, 동시에 순수 분리된 DNA와 전혀 차이 없는 양질의 PCR 주형 DNA를 제공한다. 따라서 본 발명의 방법에 따르면, 종래 기술에서 요구되는 복잡한 DNA 분리 과정, 고가의 단백질 제거 효소 및 수 시간에 걸친 반응시간이 전혀 필요 없게 되므로, 종래의 형질전환 어류 분석에 소요되던 시간, 경비와 노력을 획기적으로 줄일 수 있음이 명백하다.

도 1은 본 발명의 방법에 의해 확보된 DNA를 주형으로 이용하여 형질전환 어류를 PCR 기술로 판독한 결과를 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진으로, 완충용액-X에서의 처리 시간에 따른 PCR 결과.

도 2는 본 발명의 방법에 의해 확보된 DNA를 주형으로 이용하여 형질전환 어류를 PCR 기술로 판독한 결과를 보여주는 아가로스 겔 전기영동 사진으로, 완충용액-X에서 10 분 동안 처리하는 조건에서 형질전환 어류와 비형질전환 어류를 PCR로 판별한 결과.

도 3은 장기간 냉동 보관된 지느러미 시료에 대하여 본 발명의 방법을 적용한 결과를 보여주는 아가로스 겔 전기영동사진으로, 시료의 냉동보관 시간별 PCR 결과.

도 4는 본 발명의 방법에 의해 얻은 DNA 추출물의 냉동보관 시간별 PCR 결과를 보여주는 아가로스 겔 전기영동사진.

도 5는 본 발명의 방법에 따른 효과를 종래의 DNA 추출 기술들과 PCR을 통해 비교 분석한 결과를 보여 주는 아가로스 겔 전기영동 사진.

<110> REPUBLIC OF KOREA(PUKYOUNG NATIONAL UNIVERSITY) REPUBLIC OF KOREA(NATIONAL FISHERIES RESEARCH AND DEVELOPMENT INSTITUTE) <120> A RAPID DNA EXTRACTION METHOD FOR PCR-BASED ANALYSIS OF TRANSGENIC FISH <130> P2002-925 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying CAT gene <400> 1 ctataaccag accgttcagc 20 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying CAT gene <400> 2 cgccccgccc tgccactcat cgcag 25

Claims

어류의 지느러미 조직을, 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate; SDS)을 포함하는 pH 11의 염기성 완충용액 중 90 ℃ 이상에서 10 분 내지 20 분 동안 배양하고, 배양액에 비이온성 계면활성제로서 NP 40(Nonidet P-40; octylphenoxy polyethoxy ethanol) 및 Tween 20을 1:1의 비율로 포함하는 완충용액을 첨가하여 중화시키고, 이를 원심분리한 후 상등액을 회수하는 단계로 이루어지는, 형질전환 어류의 PCR 분석을 위한 DNA 추출 방법.
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제 1 항에 있어서, SDS를 포함하는 염기성 완충용액은 완충용액-X(20 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0.01 % SDS, pH 11.0)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 비이온성 계면활성제를 포함하는 완충용액은 완충용액-Y(50 mM Tris-HCl, 2 % Tween 20, 2 % NP 40, 5 mM MgCl₂, pH 7.2)인 것을 특징으로 하는 방법.