CN102559663B - 一种草鱼基因组dna快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种草鱼基因组DNA提取方法，包括步骤：1)裂解：草鱼鳍条组织经无菌水清洗后，吸干水分，剪成小碎块，置于无菌离心管中，加入裂解液，颠倒混匀，45-65℃下，裂解1-2.5小时至澄清，裂解过程中将离心管来回颠倒数次；2)离心：将草鱼鳍条组织裂解液在离心机上离心；3)吸附：吸取草鱼鳍条组织裂解液离心后的上清液，加入用NaAc溶液滤洗过的吸附柱中，其下面附收集管，静置后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；4)漂洗：向吸附柱中加入洗涤液后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；5)溶解：将漂洗后的吸附柱放置在离心管中，静置，加入无菌水，再静置后离心，离心管中即为收集的DNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物组织DNA提取的方法，更具体的说涉及一种草鱼基因组DNA的提取方法。
背景技术
基因组DNA提取作为一项最基础的分子生物学技术，是开展诸多分子生物学研究的成功保证。对于水产动物育种研究，基础群体遗传多样性研究及早期选育工作，要求尽量保证在不处死并需要大量的研究个体。伴随高通量测序技术及各种基因芯片的发展应用，大规模基因组DNA的提取已成为现在科研工作的必要，而目前许多DNA提取方法已经不能很好的满足这种要求。
常规使用的酚/氯仿的基因组DNA提取方法，不仅操作复杂、耗时长，而且抽提过程中多次使用挥发性试剂，并产生大量的有毒废液，既不安全也不环保。而采用试剂盒进行大规模提取DNA，昂贵的价格不适于大规模作业。本发明提供一种简便快捷并健康安全的草鱼基因组DNA的提取方法。
发明内容DNA
本发明的目的是提供一种草鱼基因组DNA的快速提取方法，以克服现有DNA提取方法存在的缺陷，本发明的提取方法操作简单，快速、安全。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案是：
一种草鱼基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
1)裂解：草鱼鳍条组织经无菌水清洗后，吸干水分，剪成小碎块，置于无菌离心管中，加入裂解液，颠倒混匀，45-65℃下，裂解1-2.5小时至澄清得草鱼鳍条组织裂解液，裂解过程中将离心管来回颠倒数次；
2)离心：将草鱼鳍条组织裂解液在离心机上离心；
3)吸附：吸取草鱼鳍条组织裂解液离心后的上清液，加入用NaAc溶液滤洗过的吸附柱中，其下面附收集管，静置2-4min后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；
4)漂洗：向吸附柱中加入洗涤液后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；
5)溶解：将漂洗后的吸附柱放置在无菌离心管中，静置1-2min，加入无菌水，静置2-4min后离心，离心管中即为收集的DNA。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤1)中裂解液由pH值为8.0，摩尔浓度为1M的Tris·HCl水溶液，pH值为8.0，摩尔浓度为0.5M的EDTANa2水溶液，质量含量为10％的SDS水溶液，无菌水，蛋白酶K按体积比5∶20∶10∶64∶1混合而成。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤1)中裂解液的其用量为：1mg鳍条组织加入20μl裂解液。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤3)中NaAc溶液为3M，冰醋酸调节pH值至5.2。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤4)中洗涤液由pH值为7.4，摩尔浓度为1M的Tris·HCl水溶液，pH值为8.0，摩尔浓度为0.5M的EDTA水溶液，无水乙醇，无菌水按体积比4∶1∶350∶235混合而成。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤4)中洗涤液的体积为步骤3)中加入到吸附柱中上清液体积的1-3倍。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤5)中无菌水的体积为步骤3)中加入到吸附柱中上清液体积的0.5-1.2倍。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)-5)中，离心温度为4-8℃下，离心转速为3000-5000rpm，离心时间为1-5min。
本发明的草鱼基因组DNA提取方法与传统的酚/氯仿的基因组DNA提取方法相比，不仅操作简便、耗时短，减低繁琐操作导致出错的概率，而且抽提过程中避免了使用大量的有毒试剂，更加健康环保；与试剂盒提取基因组DNA的方法相比，本发明的方法成本大大降低。
附图说明
图1是本发明的方法和传统酚/氯仿法提取的草鱼基因组DNA电泳结果，其中1-4为本发明的方法提取获得的DNA样，5-8为传统酚/氯仿法提取获得的DNA样，M为分子量标准D2000。
图2是本发明的方法和传统酚/氯仿法提取的草鱼基因组DNA的PCR扩增产物电泳结果，其中1-4为以本发明提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，5-8为以传统酚/氯仿法提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，M为分子量标准D2000。
图3本发明的方法和DNA提取试剂盒提取的草鱼基因组DNA电泳结果，其中1-4为本发明的方法提取获得的DNA样，5-8为DNA提取试剂盒提取获得的DNA样，M为分子量标准D2000。
图4是本发明的方法和DNA提取试剂盒提取的草鱼基因组DNA的PCR扩增产物电泳结果，其中1-4为以本发明提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，5-8为以DNA提取试剂盒提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，M为分子量标准D2000。
具体实施方式
下面通过实施例和对比例进一步说明本发明。在以下实施例和对比例中，
所用1M Tris·HCl(pH7.4和pH8.0)溶液通过如下方法制备：121.1g Tris碱于800ml水中溶解，加入浓HCl调节pH值至所需值(pH7.4，HCl 70ml；pH8.0，HCl 42ml)，冷却至室温后调节pH值，加水定溶至1L，分装后高压灭菌；
所用0.5M EDTANa2(pH8.0)溶液通过如下方法制备：在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·H2O)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8.0(约需20gNaOH颗粒)然后定容至1L，分装后高压灭菌备用；
所用10％SDS(pH7.2)溶液通过如下方法制备：称取100g电泳级SDS在900ml水中溶解，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸，调节溶液的PH至7.2，加水定容至1L，分装后备用；
所用0.5M EDTA(pH8.0)溶液通过如下方法制备：在800ml水中加入146.1g乙二胺四乙酸，剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8.0(约需20gNaOH颗粒)然后定容至1L，分装后高压灭菌备用；
所用裂解液(500μl)体系由25μl 1M Tris·HCl(pH 8.0)，100μl 0.5MEDTANa2(pH8.0)，50μl 10％SDS，320μl无菌水，5μl蛋白酶K组成；
所用洗涤液(500μl)体系由4μl 1M Tris·HCl(pH 7.4)，1μl 0.5MEDTA(pH8.0)，350μl无水乙醇，235μl无菌水组成；
所用3M NaAc(pH 5.2)溶液可通过如下方法制备：称取40.8gNaAc·3H2O，加水定溶至100ml，用冰醋酸调节pH至5.2；
所用NaAc溶液滤洗吸附柱的过程为：向吸附柱加入300μl 3MNaAc(pH 5.2)溶液，下面附收集管，静置2min，4000rpm(4℃)离心1min，弃去收集管中废液；
所用蛋白酶K，硅胶膜离子吸附柱及收集管子等试剂耗材购置于天根生化科技(北京)有限公司。
所用2×Taq PCR MasterMix 12.5μl由天根生化科技有限公司生产。
所采用微卫星引物序列信息为(Xia J.H.et al.A consensus linkagemap of the grass carp(Ctenopharyngodon idella)based on microsatellitesand SNPs.BMC Genomics 2010，11：135.)：
CID1528F：GCTGGTTTAAACAGGCACACCTTC；
CID1528R：TTGGGACGGAAAGCTGCTCTG。
实施例1
用本发明的方法提取草鱼基因组DNA
1)剪取约25mg鳍条组织，无菌水清洗，用滤纸吸干水分，剪成小碎块，置于1.5ml无菌离心管中，加入500μl裂解液，颠倒混匀，55℃水浴锅或摇床，裂解1.5-2小时至澄清，裂解过程将离心管来回颠倒数次；
2)取出以上步骤1)的裂解液，在离心机上4000rpm(4℃)离心1min；
3)吸取150μl裂解液的上清液，加入到用NaAc溶液滤洗过的吸附柱中，下面附收集管，室温静置3min，4000rpm(4℃)将吸附柱离心2min，弃去收集管中的废液；
4)向每个吸附柱中加入300μl洗涤液，4000rpm(4℃)将吸附柱离心3min，弃去收集管中的废液；
5)将漂洗后的吸附柱转移至无菌的1.5ml离心管中，静置1min，加入120-150μl无菌水，静置3min，4000rpm(4℃)离心3min，弃去吸附柱，离心管中即为收集的DNA，4℃保存备用。
对比例1
传统酚/氯仿法提取草鱼基因组DNA
组织裂解方法依照实施例1中步骤1)，DNA提取过程，经过多次酚/氯仿抽提后收集DNA，4℃保存备用。
对比例2
试剂盒提取草鱼基因组DNA
a.20-50mg组织剪成小碎块，转入装有180μl组织裂解液的1.5ml离心管中，用大口径枪头吹打混匀；
b.加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋震荡充分混匀；
c.将裂解物放置在55℃水浴1-3小时，期间轻柔震荡几次；
d.加入200μl结合液，立刻涡旋震荡充分混匀，70℃放置10min；
e.冷却后加100μl异丙醇，立刻涡旋震荡充分混匀；
f.用1ml的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱中，吸附柱放入收集管，13000rpm离心60s，倒掉收集管中废液；
g.加入500μl抑制物去除液，12000rpm离心30s，弃去废液；
h.加入700μl漂洗液，12000rpm离心30s，弃去废液；
i.将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；
j.取出吸附柱，放入干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。离心管中DNA放置4℃备用。
发明人对实施例1和对比例1提取的草鱼基因组DNA及其相应的SSR扩增产物进行了比较。
分别吸取实施例1和对比例1提取获得的草鱼基因组DNA 3μl同时进行1.0％琼脂糖胶电泳检测，结果如图1所示，其中1-4为本发明提取获得DNA样，5-8为传统酚/氯仿法提取获得DNA样，M为分子量标准D2000。从图中可以看出：相比传统酚/氯仿法在获得量上较少，但存在拖带更少的优点，说明本发明方法能有效获得高质量的草鱼基因组DNA。
对以上DNA样品采用分光光度计检测浓度，再稀释至终浓度10ng/μl，用于SSR扩增，引物为CID1528，25℃ PCR反应体系，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，CID1528F(10μM)1μl，CID1528R(10μM)1μl，DNA(10ng/μl)2μl，ddH2O 8.5μl；程序设置为预变性94℃ 3min，30个循环(94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 30S)，72℃ 5min；吸取PCR产物3μl采用检测1.2％琼脂糖胶电泳检测，结果如图2所示，其中1-4为以本发明提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，5-8为以传统酚/氯仿法提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，M为分子量标准D2000。从图中可以看出：传统酚/氯仿法与本发明方法获得的草鱼基因组DNA均能较好地用于SSR的PCR扩增。
发明人对实施例1和对比例2提取的草鱼基因组DNA及其相应的SSR扩增产物进行了比较。
分别吸取实施例1和对比例2提取获得的草鱼基因组DNA 3μl同时进行1.0％琼脂糖胶电泳检测，结果如图3所示，其中1-4为本发明提取获得DNA样，5-8为DNA提取试剂盒提取获得DNA样，M为分子量标准D2000。从图中可以看出：本发明方法相比试剂盒提取方法在获得量方面稍差，均能有效获得高质量的草鱼基因组DNA。
对以上DNA样品采用分光光度计检测浓度，再稀释至终浓度10ng/μl，用于SSR扩增，引物为CID1528，25℃ PCR反应体系，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，CID1528F(10μM)1μl，CID1528R(10μM)1μl，DNA(10ng/μl)2μl，ddH2O 8.5μl；程序设置为预变性94℃ 3min，30个循环(94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 30S)，72℃ 5min；吸取PCR产物3μl采用检测1.2％琼脂糖胶电泳检测，结果如图2所示，其中1-4为以本发明提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，5-8为以DNA提取试剂盒提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，M为分子量标准D2000。从图中可以看出：本发明方法与试剂盒提取方法获得的草鱼基因组DNA均能较好地用于SSR的PCR扩增。
Claims (3)
1.一种草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 裂解：草鱼鳍条组织经无菌水清洗后，吸干水分，剪成小碎块，置于无菌离心管中，加入裂解液，颠倒混匀，45-65℃下，裂解1-2.5小时至澄清得草鱼鳍条组织裂解液，裂解过程中将离心管来回颠倒数次；
2) 离心：将草鱼鳍条组织裂解液在离心机上离心；
3) 吸附：吸取草鱼鳍条组织裂解液离心后的上清液，加入用NaAc溶液滤洗过的吸附柱中，其下面附收集管，静置2-4min后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；
4) 漂洗：向吸附柱中加入洗涤液后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；
5) 溶解：将漂洗后的吸附柱放置在无菌离心管中，静置0.5-2min，加入无菌水，静置2-4min后离心，离心管中即为收集的DNA；
所述步骤1)中裂解液由pH 值为8.0，摩尔浓度为1M 的Tris?HCl水溶液，pH 值为8.0，摩尔浓度为0.5M 的EDTANa2水溶液，质量含量为10%的SDS水溶液，无菌水，蛋白酶 K按体积比5:20:10:64:1混合而成；其用量为：1mg鳍条组织加入20μl裂解液；
所述步骤3)中NaAc溶液为3M ，冰醋酸调节pH值至5.2；
所述步骤4)中洗涤液由pH值为7.4，摩尔浓度为1M 的Tris?HCl水溶液，pH值为8.0，摩尔浓度为0.5M 的EDTA水溶液，无水乙醇，无菌水按体积比4:1:350:235混合而成；其体积为步骤3）中加入到吸附柱中上清液体积的1-3倍。
2.根据权利要求1所述的草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤5）中无菌水的体积为步骤3）中加入到吸附柱中上清液体积的0.5-1.2倍。
3.根据权利要求1所述的草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤2）-5）中，离心温度为4-8℃下，离心转速为3000-5000 rpm，离心时间为1-5min。
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