CN102296062B

CN102296062B - 一种公牛冻精基因组dna的提取方法

Info

Publication number: CN102296062B
Application number: CN2011102512161A
Authority: CN
Inventors: 孙东晓; 谢岩; 范学华; 刘锐; 初芹; 张毅; 张沅; 张胜利
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2011-08-29
Filing date: 2011-08-29
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2031-08-29
Also published as: CN102296062A

Abstract

本发明提供了一种公牛冻精基因组DNA的提取方法，其包括公牛精子的清洗、精子的裂解和消化以及基因组DNA的纯化步骤，本发明通过改进消化裂解液成分和配比，确定适宜的消化时间，提高了公牛精子DNA的消化产率；同时摒弃原有的有机溶剂抽提的纯化方法，采用比较简单的高盐法进行DNA纯化，使用的试剂易于配制，成本低，能有效去除杂质，获得产率高、质量好的冻精基因组，适合冻精基因组DNA的高效和批量获取。

Description

一种公牛冻精基因组DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及基因组DNA的提取方法，具体地说，涉及一种公牛冻精基因组DNA的提取方法。

背景技术

荷斯坦奶牛是为人类提供乳品的重要家畜品种，随着人们对奶制品质量要求的更新和提高，为满足市场需求，需要对奶牛选育及提高奶牛群体产奶性能。遗传育种与人工授精技术的实现，使优良公牛的精液被用于制作大量冻精(细管冻精或颗粒冻精)，便于其优良遗传性能的传播，提高群体性能。随着分子生物学和遗传学的发展，从分子生物学角度进行荷斯坦奶牛的选育和提高性能，是当前研究的热点。相对于血样和耳组织样品等，冻精数量多，容易获得和保存，是种用公牛最常见的实验材料。DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了对其进行测序、杂交和基因的表达的研究，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的。基因组DNA提取的主要包含两方面操作：一是细胞裂解和DNA释放，二是DNA的纯化。这两方面决定着基因组提取产物的产率、完整性和纯化度。目前市场上存在着动物不同组织基因组提取试剂盒，最常见的是血液基因组DNA提取的相关产品，采用创新的裂解液成分和纯化方式，给血液样品基因组的提取带来了便利。而相对于冻精，却鲜见商品化的试剂盒。其基因组提取最常见的方法是利用加入β-巯基乙醇的蛋白消化液消化精子，释放DNA后利用酚/氯仿的有机溶剂抽提法纯化产物(萨姆布鲁克J，拉塞尔D.W.分子克隆指南[M]北京，科学出版社，2002)。这种方法在实际应用中存在以下问题：提取时间长，操作繁琐，产物中残留的有机溶剂影响后续实验，冻精消化难度大，给实验室批量提取高质高量的冻精基因组DNA带来困难。

哺乳动物精子DNA是遗传信息的载体，对繁衍后代具有重要意义，这一特殊使命要求精子的染色质具有特殊结构。与其他细胞不同，精子的染色质形成经过了加倍浓缩与组装(蒋欢欢综述，曹云霞，贺小进审校.精子染色质完整性检测与辅助生殖技术.国际生殖健康/计划生育杂志，2011，1，30(1)：58-62；邹喻苹，汪小全，雷一丁，裴颜龙，张志宪.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定3，植物学报，1994，36(7)：528-533)。哺乳动物精子的发生可分为精原细胞、精母细胞、精子细胞三个阶段。在精子细胞阶段，核内与DNA结合的组蛋白(H1、H2a、H2b、H3、H4)逐步被精蛋白取代，这个过程称为组蛋白-精蛋白取代反应(histone-to-protaminereplacement reaction，HPRR)，(吴小芳，陈晖，陈松，曹坚，费仁仁.人与大小鼠精子中精蛋白mRNA的分析，生殖与避孕，2001，08，21(4)：200-206)。精蛋白是一种低分子量碱性蛋白(分子量为4000-7000)含有27-65个氨基酸残基，富含精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)(赵向东综述，黄宇烽审校，精核蛋白的研究进展，Journal of Andrology，1998，11，4：38-41)。精子DNA围绕精蛋白形成染色质基本结构，而后精蛋白分子内外巯基进一步氧化形成的二硫键广泛交联，从而使染色体逐渐浓缩，更加稳定。成熟精子核这一致密化现象对保护精子基因组在精子面临外界应激时保持完整性具有重要作用，能够保证遗传物质完整的传递到后代中(蒋欢欢综述，曹云霞，贺小进审校，精子染色质完整性检测与辅助生殖技术，国际生殖健康/计划生育杂志，2011，1，30(1)：58-62)。正是因为成熟精子细胞的这种致密特性造成精子相对于其它组织细胞的染色体更加致密，基因组DNA不容易与精蛋白脱离。使得精子DNA在消化中释放困难，产率低。另外，冻精中出于对精细胞稀释、营养和保护需要而添加的稀释保护剂，其所含有的糖类、脂类和蛋白等成分也给细胞的消化和基因组的纯化带来障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种公牛冻精基因组DNA的提取方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种公牛冻精基因组DNA的提取方法，包括精子细胞的清洗、精子的裂解消化以及DNA的纯化步骤，其中，

精子的裂解和消化步骤为：向清洗后的精子细胞沉淀中加入冻精原液2～3倍体积的精子细胞裂解液和20w/v％SDS(使体系中SDS的终浓度达到3％～5％，w/v)，静置后涡旋混匀，然后向混合体系中加入蛋白酶K(使体系中蛋白酶K浓度达到0.4mg/mL)，混匀，过夜消化；其中，所述精子细胞裂解液的配方为：pH值8.0的EDTA0.01-0.0125mol/L，pH值8.0的Tris·Cl 0.01-0.0125mol/L，SDS1％-1.25％，NaCl 2.9-3.625g/L，DTT 9.6-19.3g/L，以蒸馏水配制。优选地，所述精子细胞裂解液的配方为：pH值8.0的EDTA 0.0125mol/L，pH值8.0的Tris·Cl 0.0125mol/L，SDS 1.25％，NaCl 3.625g/L，DTT9.625g/L，以蒸馏水配制。

基因组DNA的纯化步骤为：向上述消化体系中加入该消化体系总体积0.4～0.6倍的饱和食盐水，混匀后静置5-10min，离心，转移上清，并用无水乙醇沉淀上清液，离心后，洗涤沉淀，最后于4℃将沉淀过夜溶解于TB贮液(购自天根生化科技(北京)有限公司)或ddH2O中，-20℃保存。

优选地，前述方法中精子的裂解和消化步骤为：向清洗后的精子细胞沉淀中加入冻精原液2倍体积的精子细胞裂解液和冻精原液0.5倍体积的20w/v％SDS，静置后涡旋混匀，然后向混合体系中加入蛋白酶K，混匀，过夜消化。

优选地，前述方法中基因组DNA的纯化步骤中是向精子细胞的消化体系中加入该消化体系总体积0.6倍的饱和食盐水。

前述方法中，所述公牛精子的清洗步骤为：将管制冻精置于离心管中，加入生理盐水，涡旋混匀，离心，得沉淀。

前述方法中，所述的公牛冻精为荷斯坦公牛冻精。

本发明还提供公牛冻精基因组DNA提取试剂盒，其包括：

试剂I：pH值8.0的EDTA 0.01-0.0125mol/L，pH值8.0的Tris·Cl0.01-0.0125mol/L，SDS 1％-1.25％，NaCl 2.9-3.625g/L，DTT9.6-19.3g/L，以蒸馏水配制；以及试剂II：饱和食盐水。

前述试剂盒还包括：试剂III：生理盐水；试剂IV：20％SDS；以及试剂V：蛋白酶K。

优选地，所述试剂盒包括：

试剂I：pH值8.0的EDTA 0.0125mol/L，pH值8.0的Tris·Cl0.0125mol/L，SDS 1.25％，NaCl 3.625g/L，DTT 9.625g/L，以蒸馏水配制；

试剂II：饱和食盐水；

试剂III：生理盐水；

试剂IV：20w/v％SDS；以及

试剂V：蛋白酶K。

本发明进一步提供所述试剂盒在提取荷斯坦公牛冻精基因组DNA中的应用。

基于公牛冻精基因组DNA提取中存在的一些关键问题，本发明人有针对性的改进消化裂解液成分和配比，确定适宜的消化时间，提高公牛精子DNA的消化产率；同时摒弃原有的有机溶剂抽提的纯化方法，采用比较简单的高盐法进行DNA纯化，使用的试剂易于配制，成本低，能有效去除杂质，获得产率高、质量好的冻精基因组。本发明试剂盒使用简便、快速、涉及的有毒物质少，提取出的DNA量多、纯度高，适合常规实验室应用的需要。可广泛用于冻精基因组DNA的高效和批量获取。

附图说明

图1为荷斯坦公牛冻精基因组DNA提取电泳检测结果，其中M为DNA marker(7000、5500、3500、2000、1000、500bp)，1-44代表44个样品。

图2为荷斯坦公牛冻精基因组DNA GHR基因目的片段PCR扩增结果，其中M为DNA marker(600、500、400、300、200、100bp)，1-44代表44个样品。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。除另有说明，实施例中的溶液配制均在20℃下进行。

实施例1荷斯坦公牛冻精基因组DNA的提取

1材料和试剂

生理盐水(0.9％)：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。高压灭菌备用。

精子细胞裂解和消化试剂：

(1)精子细胞裂解液：灭菌蒸馏水60mL，加入0.5mol/LEDTA(pH＝8.0)2mL，1mol/L Tris·Cl(pH＝8.0)1mL和10％SDS 10mL，0.29g NaCl，0.77g DTT(对于难消化样品可以加倍添加DTT)，混匀后加水定容到80mL。配制的混合液常温保存，使用时间不能超过一周。

0.5mol/L EDTA：80mL蒸馏水中加入18.61g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H₂O)，混匀后用NaOH调节溶液pH值至8.0(约20gNaOH颗粒)，然后加水定容至100mL，分装后高压灭菌备用。

1mol/L Tris·Cl：800mL蒸馏水中加入121.1g Tris碱，用盐酸调溶液pH值至8.0(溶液冷至室温后方可最后调定pH值)，然后加水定容至1L，分装后高压灭菌。当溶液变为黄色时，应予丢弃。

10％SDS：900mL蒸馏水中加入100g SDS，加热至68℃用磁力搅拌器搅拌助溶，混匀后用HCl调节溶液pH值至7.2，加水定容至1L。室温保存，无需灭菌。

(2)精子细胞消化液：400μL精子细胞裂解液，100μL 20％SDS，10μL蛋白酶K。

20％的SDS：900mL蒸馏水中加入200g SDS，加热至68℃用磁力搅拌器搅拌助溶，混匀后用HCl调节溶液pH值至7.2，加水定容至1L。室温保存，无需灭菌。如发现溶液凝固，说明室温低，加热溶解后再用。

蛋白酶K(20 mg/mL)：天根生化科技(北京)有限公司，货号RT403-01。

DNA纯化试剂：

饱和食盐水：20℃时，饱和氯化钠浓度为26.47％，即在100mL水中溶解36克氯化钠，适量补加氯化钠，混匀静置10-20min后仍有固体未溶，所得上清即为饱和食盐水。

75％乙醇：取3体积无水乙醇和1体积蒸馏水，混匀备用。

琼脂糖水平电泳检测试剂：

50×TAE：Tris碱242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/L EDTA(pH＝8.0)100mL，加水充分溶解，定容至1L。

溴化乙啶(EB)贮存液(电泳上样时使用)：1g溴化乙啶溶于100mL蒸馏水中。

电泳使用的1％琼脂糖凝胶用50×TAE液配制。琼脂糖干粉购自北京东胜泰博科技公司。

2荷斯坦公牛管制冻精基因组DNA的提取

2.1公牛管制冻精

采用44头荷斯坦种公牛的管制冻精(购自北京奶牛中心)。

管制冻精体积：250μl/管，GB4143-2008中规定每剂量冻精解冻后精子活力≥35％、前进精子数≥800万个。每剂量冻精总精子数约为2000万个左右(总精子数随季节、牛只状况、冻精生产厂家等因素变动范围较大)。

制备管制冻精中所使用的稀释保护剂，采用GB4143-84中推荐的配方A或B，其配制方法如下：

配方A：柠檬酸钠、果糖、卵黄稀释液：

a液：蒸馏水100毫升，柠檬酸钠2.97克，卵黄10毫升；

b液：取a液41.75毫升，加入果糖2.5克，甘油7毫升，混匀即得。

配方B：脱脂奶、卵黄稀释液：

脱脂奶82毫升，b液10毫升，甘油8毫升，混匀即得。

2.2冻精基因组DNA的提取

步骤1：取2mL离心管，放入约200μL体积冻精原液，加入500μL生理盐水，涡旋混匀，12000rpm离心1min。倒去上清液(去除管制冻精液中的精浆和稀释液)，保留精子细胞沉淀。

步骤2：重复步骤1一次。

步骤3：向沉淀加入400μL精子细胞裂解液和100μL 20％SDS，静置2-3min后涡旋混匀沉淀和溶液。然后向混合液中加入10μL蛋白酶K，颠倒混匀。

步骤4：混匀的样品放入56℃的水浴锅，过夜消化(10个小时左右，难消化样品适当增加消化时间)。

步骤5：取消化好的样品，加入300μL饱和食盐水，颠倒2-3min，放入4℃冰箱静置5-10min，沉淀溶液中蛋白和SDS复合物。然后12000rpm离心10min，将上清(DNA存在于上清中)移到新管中。

步骤6：向上清液加入1000μL冰镇的无水乙醇。颠倒1-2min，出现絮状沉淀(DNA沉淀)，然后12000rpm离心2min。肉眼可见DNA沉淀贴于离心管底部。倒去上清液，保留沉淀。

步骤7：向离心管中加入500μL 75％的乙醇，颠倒混匀，清洗DNA沉淀上的残留杂质和盐离子。然后12000 rpm离心2min，倒去上清，保留沉淀。

步骤8：重复步骤7一次。

步骤9：开盖放置2-3min，使DNA沉淀上残余乙醇挥发。

步骤10：向离心管中加入200μL TB(天根生化科技(北京)有限公司，也可以用ddH₂O，保证溶液浸没DNA沉淀，室温放置半小时或者4度过夜，待沉淀溶解完全后检测提取的基因组质量。

2.3提取纯化的基因组质量检测

水平电泳检测：用1％的琼脂糖水平电泳检测，点2μL样品，130V电泳10min。检测DNA条带的完整性和纯度。电泳检测结果如图1所示，从图1可以看出，44个样品的条带显示呈明显的主带，没有脱尾现象，说明DNA完整性好；点样孔干净，没有蛋白残留；条带清晰，亮度强，说明提取的DNA浓度较高。

分光光度计检测：

采用Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度计，在波长230nm、260nm及280nm处测定光吸收值，根据260nm的光吸收值计算DNA产率，根据260nm/280nm和260nm/280nm光吸收比值判断DNA样品的纯度。检测结果如表1所示。

表1

实施例2公牛冻精基因组DNA提取试剂盒

本发明的公牛冻精基因组DNA提取试剂盒，其包括：

方案一：

试剂I：pH值8.0的EDTA 0.01-0.0125mol/L，pH值8.0的Tris·Cl0.01mol/L，SDS 1％，NaCl 2.9g/L，DTT 9.6g/L，以蒸馏水配制；以及试剂II：饱和食盐水。

方案二：

试剂I：pH值8.0的EDTA 0.0125mol/L，pH值8.0的Tris·Cl0.0125mol/L，SDS 1.25％，NaCl 3.625g/L，DTT 19.3g/L，以蒸馏水配制；以及试剂II：饱和食盐水。

方案三：

试剂I：pH值8.0的EDTA 0.01mol/L，pH值8.0的Tris·Cl0.0125mol/L，SDS 1.25％，NaCl 3.6g/L，DTT 19.3g/L，以蒸馏水配制；以及试剂II：饱和食盐水。

方案四：

试剂I：pH值8.0的EDTA 0.0125mol/L，pH值8.0的Tris·Cl0.01mol/L，SDS 1.25％，NaCl 2.9g/L，DTT 19.3g/L，以蒸馏水配制；以及试剂II：饱和食盐水。

方案五：

试剂I：pH值8.0的EDTA 0.011mol/L，pH值8.0的Tris·Cl0.012mol/L，SDS 1.2％，NaCl 3g/L，DTT 16g/L，以蒸馏水配制；以及试剂II：饱和食盐水。

方案六：

试剂I：pH值8.0的EDTA 0.012mol/L，pH值8.0的Tris·Cl0.01mol/L，SDS 1％，NaCl 3.5g/L，DTT 10g/L，以蒸馏水配制；以及试剂II：饱和食盐水。

方案七：

试剂I：pH值8.0的EDTA 0.0125mol/L，pH值8.0的Tris·Cl0.011mol/L，SDS 1.1％，NaCl 2.9g/L，DTT 9.5g/L，以蒸馏水配制；以及试剂II：饱和食盐水。

方案八：

试剂II：饱和食盐水；

试剂III：生理盐水；

试剂IV：20％SDS；以及

试剂V：蛋白酶K。

实验例采用本发明方法提取出的公牛冻精基因组DNA的应用

GHR基因目的片段PCR扩增：

GHR基因目的片段的扩增引物序列为F：5′-AATACTTGGGCTAGCAGTGACAATAT-3′和R：5′-ACTGGGTTGATGAAACACTTCACTC-3′，产物长度为175bp，反应体系和条件如下。

PCR反应体系(20μL)：10×扩增缓冲液2μL，4种dNTP混合物(2.5mmol/L)1.6μL，引物F(20pmol/μL)0.4μl，引物R(20pmol/μL)0.4μL，模板DNA为实施例1中得到的荷斯坦公牛冻精基因组DNA(100ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，ddH₂O 14μL(缓冲液、dNTP、聚合酶购自TaKaRa公司)。

PCR反应条件：94℃ 5min预变性，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，重复2-4步35个循环，然后72℃继续延伸7min。2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。扩增产物电泳检测结果如图2所示，从该结果可以看出，目的条带清晰明亮，说明模板质量良好，适于扩增。

通过电泳的分光光度计的检测，从条带完整性、浓度和纯度上看，一次操作所提取的44个样品，都能满足分子实验基因组DNA的质量要求，GHR目的片段的扩增也证明了这一点。个别样品的260/230比值稍高，可能是盐离子残留，可将样品DNA再沉淀，用75％酒精洗涤一次后，重新溶解，去除残留物。将提取样品用于SNPs芯片进行个体分型(Illumina公司BovineSNP50 BeadChip芯片)，基因组DNA样品质检合格，可用于分型实验。样品在4℃存放1个月和-20℃冻存1年后，进行水平电泳检测显示样品条带完整，降解不明显。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种公牛冻精基因组DNA的提取方法，包括精子细胞的清洗、精子的裂解和消化以及DNA的纯化步骤，其特征在于，

精子的裂解和消化步骤为：向清洗后的精子细胞沉淀中加入冻精原液2～3倍体积的精子细胞裂解液和20w/v％SDS，静置后涡旋混匀，然后向混合体系中加入蛋白酶K，混匀，过夜消化，获得精子细胞的消化体系；其中，所述精子细胞裂解液的配方为：pH值8.0的EDTA0.0125mol/L，pH值8.0的Tris·Cl 0.0125mol/L，SDS 1.25％，NaCl3.625g/L，DTT 9.625g/L，以蒸馏水配制；

基因组DNA的纯化步骤为：向上述消化体系中加入该消化体系总体积0.4～0.6倍的饱和食盐水，混匀后静置5-10min，离心，转移上清，并用无水乙醇沉淀上清液，离心后，洗涤沉淀，最后将沉淀溶于蒸馏水中，-20℃保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，精子的裂解和消化步骤为：向清洗后的精子细胞沉淀中加入冻精原液2倍体积的精子细胞裂解液和冻精原液0.5倍体积的20w/v％SDS，静置后涡旋混匀，然后向混合体系中加入蛋白酶K，使体系中蛋白酶K浓度达到0.4mg/mL，混匀，过夜消化。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，基因组DNA的纯化步骤中是向精子细胞的消化体系中加入该消化体系总体积0.6倍的饱和食盐水。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，公牛精子的清洗步骤为：将冻精置于离心管中，加入生理盐水，涡旋混匀，离心，得沉淀。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的公牛冻精为荷斯坦公牛冻精。

6.公牛冻精基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，其包括：

试剂II：饱和食盐水；

试剂III：生理盐水；

试剂IV：20w/v％SDS；

试剂V：蛋白酶K。

7.权利要求6所述的试剂盒在提取荷斯坦公牛冻精基因组DNA中的应用。